Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tredimensionellt, serumfritt odlingssystem för lacrimalkörtelstamceller

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63585
Automatic Translation
1, 1, 1
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

Summary

Den tredimensionella, serumfria odlingsmetoden för vuxna lacrimalkörtel (LG) stamceller är väl etablerad för induktion av LG-organoidbildning och differentiering i acinar eller duktaltliknande celler.

Abstract

Lacrimal gland (LG) stamcellsbaserad terapi är en lovande strategi för lacrimal körtel sjukdomar. Avsaknaden av en tillförlitlig, serumfri odlingsmetod för att erhålla ett tillräckligt antal LG-stamceller (LGSC) är dock ett hinder för vidare forskning och tillämpning. Den tredimensionella (3D), serumfria odlingsmetoden för vuxna mus LGSC är väl etablerad och visas här. LGSC: erna kan kontinuerligt passeras och induceras för att differentiera till acinar eller duktalt liknande celler.

För LGSC-primärkulturen smältes LGs från 6-8 veckor gamla möss med dispas, kollagenas I och trypsin-EDTA. Totalt 1 × 104 enskilda celler såddes i 80 μL matrisgel-lacrimal körtelstamcellsmedium (LGSCM) matris i varje brunn på en 24-brunnsplatta, förbelagd med 20 μL matrisgel-LGSCM-matris. Blandningen stelnade efter inkubation i 20 minuter vid 37 °C och 600 μl LGSCM tillsattes.

För LGSC-underhåll delades LGSC odlade i 7 dagar upp i enstaka celler genom dispas och trypsin-EDTA. De enskilda cellerna implanterades och odlades enligt den metod som användes i LGSC-primärkulturen. LGSC kan passeras över 40 gånger och kontinuerligt uttrycka stam- / stamcellsmarkörer Krt14, Krt5, P63 och nestin. LGSC odlade i LGSCM har självförnyelsekapacitet och kan differentieras till acinar eller duktalt liknande celler in vitro och in vivo.

Introduction

Lacrimal körtelstamceller (LGSC) upprätthåller lacrimal gland (LG) cellförnyelse och är källan till acinar och duktala celler. Därför anses LGSC-transplantation vara ett alternativt tillvägagångssätt för behandling av allvarlig inflammatorisk skada och vattenbrist torr ögonsjukdom (ADDED)1,2,3. Flera odlingsmetoder har tillämpats för att berika LGSC: er. Tiwari et al., separerade och odlade primära LG-celler med användning av kollagen I och matrisgel kompletterat med flera tillväxtfaktorer; LG-cellerna kunde dock inte kontinuerligt odlas4. Med hjälp av tvådimensionell (2D) kultur isolerades mus LG-härledda stamceller av You et al.5 och Ackermann et al. 6, som visat sig uttrycka stam-/stamcellsmarkörgenerna, Oct4, Sox2, Nanog och nestin, och kan subkultureras. Det finns emellertid ingen tydlig indikation på att dessa celler kan differentieras till acinar eller duktala celler, och det finns inget transplantationsexperiment för att verifiera differentieringspotentialen in vivo.

Nyligen isolerades c-kit + dim / EpCAM + / Sca1-/ CD34-/ CD45-celler från mus-LGs genom flödescytometri, som visade sig uttrycka LG-stamcellmarkörer, såsom Pax6 och Runx1, och differentierades till kanaler och acini in vitro. Hos möss med ADDED kan ortotopisk injektion med dessa celler reparera skadade LGs och återställa sekretorisk funktion hos LGs2. Antalet stamceller som isolerades med denna metod var dock litet, och det finns inga lämpliga odlingsförhållanden för att expandera de isolerade LGSC: erna. Sammanfattningsvis måste ett lämpligt odlingssystem upprättas för att effektivt isolera och odla vuxna LGSC med stabil och kontinuerlig expansion för studier av LGSC vid behandling av ADDED.

Organoider härledda från stamceller eller pluripotenta stamceller är en grupp celler som histologiskt liknar de besläktade organen och kan upprätthålla sin egen förnyelse. Efter att musens tarmorganoid framgångsrikt odlades av Sato et al.,2009 7 odlades organoider från andra organ i följd, baserat på Satos odlingssystem, såsom gallblåsan8, lever9, bukspottkörteln10, mage11, bröst12, lunga13, prostata14 och spottkörtel15 . På grund av den höga andelen vuxna stamceller före celldifferentiering i organoidkultur anses den tredimensionella (3D) organoidodlingsmetoden vara optimal för isolering och odling av vuxna stamceller från LG.

Ett LGSC-odlingssystem för vuxna möss etablerades i den aktuella studien genom att optimera den 3D-, serumfria odlingsmetoden. Det är bevisat att LGSC odlade från både normala och ADDED-möss visade en stabil kapacitet för självförnyelse och spridning. Efter transplantation till ADD-mus-LGs koloniserade LGSC: erna de nedsatta LGs och förbättrade tårproduktionen. Dessutom isolerades röda fluorescerande LGSC från ROSA26mT / mG-möss och odlades. Detta arbete ger en tillförlitlig referens för LGSC-anrikning in vitro och LGSC autograft i klinisk tillämpning för ADDED-terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment i detta protokoll följde riktlinjerna för djurvård från den etiska kommittén för djurförsök vid Sun Yat-sen University. Alla cellrelaterade operationer ska utföras på den ultrarena arbetsbänken i cellens operationsrum. Alla operationer med xylen ska utföras i dragskåp.

1. LGSC primär kultur

  1. LG-isolering
    1. Skaffa en 6-8 veckor gammal BALB / c manlig mus och skär huden bakom örat för att exponera LG och bindväven runt den. Skala av bindväven genom trubbig dissektion med hjälp av pincett och ta bort LG.
    2. Skölj LGs två gånger med 4 ml steril 10 mM PBS-lösning för att ta bort blod i en 6 cm skål. Sänk ner LGs i en 6 cm skål med 4 ml 75% etanol i 10 s och skölj med 10 mM PBS två gånger omedelbart.
  2. Hämta enskilda celler i LG
    1. Använd HEPES buffertlösning (50 mM HEPES/KOH, pH 7,4; 150 mM NaCl i ultrarent vatten) för att bereda 25 U/ml dispas. Förbered 0,1% kollagenas I-lösningen med ultrarent vatten.
    2. Skär LG i små fragment (ca 1 mm3), överför dem till ett sterilt 15 ml centrifugrör och behandla vävnaderna med 500 μl 25 U/ml dispas och 500 μl 0,1 % kollagenas I i 1 timme vid 37 °C.
    3. Använd 10 mM PBS för att bereda trypsin-EDTA-lösning (0,05 g/L trypsin, 0,04 g/L EDTA). Behandla LG-fragmenten från steg 1.2.2 med 1 ml 0,05% trypsin-EDTA i 10 minuter vid 37 °C och dissociera fragmenten i enstaka celler genom pipettering upprepade gånger.
    4. Filtrera suspensionen genom ett 70 μm filter, samla upp filtratet i ett sterilt 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 150 × g i 5 min.
    5. Efter centrifugering, ta bort supernatanten, tillsätt 10 ml 10 mM PBS för att tvätta cellpelleten och centrifugera suspensionen.
    6. Upprepa steg 1.2.5, ta bort supernatanten och tillsätt 1 ml DMEM/F12 (1:1 blandning av Dulbeccos modifierade Eagles medium och Hams F-12) för att återsuspendera cellpelletsen.
  3. LGSC primär kultur
    1. Förbered lacrimal gland stamcellsmedium (LGSCM) som innehåller DMEM / F12, 1x N2-tillskott, 1x B27-tillskott, 2 mM glutaminsubstitut, 0,1 mM NEAA (icke-essentiella aminosyror), 50 ng / ml murin epidermal tillväxtfaktor (EGF), 100 ng / ml fibroblasttillväxtfaktor 10 (FGF10), 10 ng / ml Wnt3A och 10 μM Y-27632 (ROCK-hämmare).
    2. Tillsätt 20 μL matrisgel-LGSCM-matris (matrisgel: LGSCM = 1: 1) i mitten av brunnen på en 24-brunnsplatta. Använd en pipettspets för att expandera den till en cirkel (6-8 mm diameter) och inkubera blandningen i 20 minuter vid 37 °C för att förbelägga brunnen.
    3. Använd en cellräknare för att bestämma cellnumret och tillsätt 40 μL LGSCM med totalt 1 × 104 celler till 40 μL av matrisgelén. Blanda dem försiktigt med en pipett för att få en matrisgel-LGSCM-blandning (matrisgel: LGSCM = 1: 1).
    4. Använd en pipett för att försiktigt släppa 80 μL av blandningen över det förbelagda området i varje brunn på 24-brunnsplattan i steg 1.3.2.
    5. Inkubera blandningen i 20 minuter vid 37 °C och tillsätt 600 μL LGSCM.
    6. Byt kulturmediet i varje brunn en gång varannan dag. Efter 7 dagars kultur, leta efter LGSC-sfärer som har en diameter på 100-300 μm under det inverterade mikroskopet (okular: 10x, mål: 4x).
      LGSC kan odlas i mer än 14 dagar totalt.
  4. Isolera och odla primära LGSC för ROSA26mT / mG-möss och DED-möss (NOD / ShiLtJ) enligt stegen som beskrivs ovan.

2. LGSC underhåll och passage

  1. Ta bort kulturmediet från sfärkulturen väl.
  2. Dela upp LGSC-sfärerna som odlats i 7 dagar genom inkubation i 20 μl 10 U/ml dispas och 100 μl 10 mM PBS i 30 minuter vid 37 °C.
  3. Överför suspensionen till ett 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 150 × g i 4 minuter. Ta bort supernatanten.
  4. Behandla sfärerna med 1 ml 0,05% trypsin-EDTA i 5 minuter vid 37 °C. Tillsätt 1 ml 0,05% trypsinhämmare (TI) och pipettera upprepade gånger för att neutralisera trypsinet och dissociera sfärerna i enstaka celler.
  5. Centrifugera vid 150 × g i 5 min och ta bort supernatanten för att erhålla LGSC i pelleten. Tillsätt 1 ml LGSCM för att återsuspendera LGSC-pelleten.
  6. Platta de enskilda cellerna enligt beskrivningen i steg 1.3.1 till 1.3.6.

3. LGSC-differentiering

  1. Förfarande 1: Förläng odlingstiden för LGSC från 7 till 14 dagar med LGSC-kultursystemet för slumpmässig differentiering.
  2. Förfarande 2: Ändra förhållandet mellan matrisgel-LGSCM-blandningen från 1: 1 till 1: 2 i början av LGSC-kulturen för differentiering av duktala celler. Seeda LGSC i matrisen för induktion i 14 dagar (se steg 1.3).
  3. Förfarande 3: Efter passage, ersätt LGSCM med LGSCM-10% fetal bovin serum (FBS) blandning för differentiering av acinarceller. Inducera differentiering i 14 dagar.

4. LG vävnad uttorkning

  1. Skaffa LG-vävnader (steg 1.1.1) och skölj LG: erna med 4 ml steril 10 mM PBS-lösning i en 6 cm skål i 2 minuter. Flytta vävnaderna till 10% formalinlösning för fixering i 24 timmar.
  2. Skölj de fasta vävnaderna med 10 mM PBS i 2 minuter för att ta bort formalinet och överför vävnaden till en vävnadsinbäddningslåda. Sätt inbäddningslådan i den automatiska dehydratorn.
  3. Använd den automatiska dehydratorn för att dehydrera vävnaderna enligt följande: 70% etanol, 2 h; 80% etanol, 2 h; 90% etanol, 30 min; 95% etanol, 30 min; absolut etanol, 30min; absolut etanol, 2 h; absolut etanol: 100% xylen (1: 1) blandning, 30 min; 100% xylen, 30 min; 100% xylen, 2 timmar; 100% xylen: paraffin (1: 1) blandning, 30 min; paraffin, 2 timmar; paraffin,3 timmar.

5. LG organoid / sfär uttorkning

  1. Skaffa LG-organoider / sfärer (steg 2.1-2.3) i ett 1.5 ml mikrocentrifugrör och skölj LG-organoiderna / sfärerna med 1 ml steril 10 mM PBS-lösning i 2 minuter.
  2. Centrifugera vid 100 × g i 1 min och ta bort supernatanten.
  3. Bered 4% paraformaldehydlösning (PFA) enligt följande: tillsätt 20 g PFA till en blandning av 400 ml 10 mM PBS och 40 μL 1 M NaOH, skaka lösningen väl och värm den i ett 65 °C vattenbad i 2 timmar tills PFA är helt upplöst. Efter kylning till rumstemperatur, använd 10 mM PBS för att fylla på volymen till 500 ml och förvara den vid 4 °C.
  4. Tillsätt 1 ml 4 % PFA i mikrocentrifugröret med organoid-/sfärpelleten och sätt röret i ett kylskåp på 4 °C i minst 24 timmar för fixering.
  5. Efter fixering, centrifugera vid 100 × g i 1 min och ta bort supernatanten. Tillsätt 1 ml 10 mM PBS i mikrocentrifugröret med organoid/sfärpelleten och blanda försiktigt genom att pipettera i 2 minuter för att skölja bort PFA. Upprepa detta steg två gånger.
  6. Centrifugera vid 100 × g i 1 min och ta bort supernatanten.
  7. Värm inbäddningshydrogel för att lösa upp och tillsätt 50-60 μL inbäddningshydrogel till organoid / sfärpelleten och blanda. Pipettera blandningen på parafilmen i form av en droppe och vänta i 5 minuter tills den stelnar vid rumstemperatur.
  8. Dehydrera gelén med organoiderna/sfärerna i ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör enligt följande.
    1. Tillsätt 1 ml 50% etanol till röret, vänta i 30 minuter vid rumstemperatur och ta bort vätskan från röret genom pipettering. Upprepa detta steg genom att ändra etanolkoncentrationen till 70%, 80%, 90%, 95% successivt.
    2. Tillsätt 1 ml absolut etanol i röret, vänta i 30 minuter vid rumstemperatur och ta bort vätskan från röret genom pipettering. Upprepa detta steg.
    3. Tillsätt 1 ml av en blandning av 0,5 ml absolut etanol och 0,5 ml 100% xylen till röret, vänta i 30 minuter vid rumstemperatur och ta bort vätskan från röret genom pipettering.
    4. Tillsätt 1 ml 100% xylen till röret, vänta i 30 minuter vid rumstemperatur och ta bort vätskan från röret genom pipettering. Upprepa detta steg.
      OBS: Steg 5.8.5-5.8.6 måste utföras i ett metallbad vid 65 °C.
    5. Tillsätt 1 ml av en blandning av 0,5 ml paraffin och 0,5 ml 100% xylen till röret, vänta i 30 minuter vid 65 °C och avlägsna vätskan från röret genom pipettering.
    6. Tillsätt 1 ml paraffin i röret, vänta i 30 minuter vid 65 °C och ta bort vätskan från röret genom pipettering. Upprepa detta steg och förläng bearbetningstiden till 1 h.

6. Paraffininbäddning och sektionering

  1. Inbäddning av paraffin
    1. Innan du bäddar in, slå på inbäddningsmaskinen och förvärm den för att smälta paraffinvaxet i paraffintanken.
    2. Placera den uttorkade vävnaden eller organoiden/sfärgelen i spåret på den inbäddande järnlådan och sätt järnlådan i inbäddningsmaskinens paraffin.
    3. Ta bort plastlocket och placera plastinbäddningslådan på järnlådan för att täcka den. Flytta den inbäddade järnlådan till ett kylskåp.
    4. När paraffinet har kondenserats till block i inbäddningslådan, ta bort det från järnlådan och skiva det direkt eller förvara det tillfälligt i ett kylskåp på 4 °C.
  2. Paraffin sektionering
    1. Innan paraffinskivan skivas, förmontera paraffinskivan och tillsätt destillerat vatten i skivarens diskbänk för förvärmning. Börja skiva när vattentemperaturen stiger till 42 °C.
    2. Fäst provet på paraffinskivans provspår. Justera sektionstjockleken till 5 μm under skivning.
    3. Avsnitt provet kontinuerligt. Fäst den helkaklade sektionen på halkbekämpningen i skivbehållaren.
    4. Efter sektionering, placera de objektsglas som är fästa med provvävnad i en biokemisk inkubator vid 37 °C för torkning i 24 timmar. Förvara diabilderna tillfälligt i kylskåp vid 4 °C.

7. Hematoxylin och eosinfärgning

  1. Smält paraffinsektionerna vid 60 °C i 30 min, blötlägg sektionerna i 100% xylen i 15 minuter och upprepa.
  2. Behandla sektionerna med absolut etanol på en shaker i 5 min.
  3. Behandla sektionerna med 90% etanol, 80% etanol och 70% etanol på en shaker, vardera i 3 minuter.
  4. Behandla sektionerna med avjoniserat vatten på en shaker i 5 min och 2 min successivt.
  5. Färga sektionerna på en våt låda i 5 min med 4 mg / ml hematoxylinlösning. Skölj sektionerna i rinnande vatten i 10 min.
  6. Agitera sektionerna på en shaker först med avjoniserat vatten i 2 min och sedan med 0,5% -1% eosin i 1 min.
  7. Agitera sektionerna med 70% etanol, 80% etanol och 90% etanol på en shaker i 3 min (vardera) successivt. Agitera sektionerna med absolut etanol på en shaker i 5 min.
  8. Blötlägg sektionerna i 100% xylen i 15 minuter och upprepa blötläggningen.
  9. Använd en pipett eller droppare för att lägga till 3-4 droppar neutral balsam i bilden och täck den långsamt med en täckglas. Lufttorka diabilderna vid rumstemperatur.

8. Immunohistokemisk (IHC) färgning

  1. Smält paraffinsektionerna vid 60 °C i 30 min, blötlägg sektionerna i 100% xylen i 10 minuter och upprepa detta steg två gånger.
  2. Agitera sektionerna på en shaker först med absolut etanol, 90% etanol och 80% etanol i 2 min (vardera), successivt och sedan med avjoniserat vatten i 3 min. Upprepa omrörningen med avjoniserat vatten två gånger.
  3. Agitera sektionerna på en shaker först med en blandning av 20 ml 30%H2O2och 180 ml metanol i 10 min och sedan avjoniserat vatten i 5 min. Upprepa detta steg tre gånger.
  4. Överför sektionerna till förkokt citronsyrabuffert (1 liter avjoniserat vatten med 3 g Na3C6H5O7,2H 2Ooch 0,4 gC6H8O7, pH 6,0), mikrovågsugn i 10 minför att hålla dem vid subkritisk kokpunkt och svalna vid rumstemperatur i 30 min. Agitera sektionerna med avjoniserat vatten på en shaker i 5 min. Upprepa detta steg tre gånger.
  5. Agitera sektionerna med 10 mM PBS på en shaker i 5 minuter och upprepa detta steg tre gånger. Omslut vävnadsområdet på den våta lådan med en vattenavvisande markör, tillsätt en droppe färdigt icke-immunt getserum för att täcka proverna och placera dem vid rumstemperatur i 1 timme.
  6. Avlägsna serumet, tillsätt primära antikroppar till proverna (se materialförteckningen) och inkubera dem över natten vid 4 °C. Ta bort den primära antikroppen, agitera sektionerna med 10 mM PBS på en skakapparat i 5 minuter och upprepa detta omrörningssteg med 10 mM PBS tre gånger.
  7. Tillsätt sekundär antikropp (se materialtabellen) för att täcka proverna och inkubera dem på en våt låda i 30 minuter vid rumstemperatur. Agitera sektionerna med 10 mM PBS på en shaker i 5 minuter och upprepa omrörningssteget tre gånger.
  8. Tillsätt nyberedd 0,03-0,05% 3,3'-diaminobenzidinlösning (DAB) för att täcka proverna på våtlådan och fläcka i 30-90 s. Skölj sektionerna med rinnande vatten i 10 min.
    OBS: Kontrollera färgningstiden genom att observera under ett ljusmikroskop tills gul färg visas.
  9. Tillsätt 4 mg/ml hematoxylinlösning för att täcka proverna, färga i 5 min på en våt låda och skölj sektionerna med rinnande vatten i 10 min.
  10. Agitera sektionerna på en shaker med 80% etanol, 90% etanol och absolut etanol i 2 min vardera, successivt, och blötlägg sektionerna i 100% xylen i 30 min.
  11. Använd en pipett eller droppare för att lägga till 3-4 droppar neutral balsam i bilden och täck den långsamt med en täckglas. Lufttorka diabilderna vid rumstemperatur.

9. Global immunofluorescensfärgning av organoider / sfärer

OBS: Samla upp organoiderna/sfärerna fixerade med 4% PFA-lösning i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör (se steg 5.1 till 5.4). Utför fluorescensmärkningen enligt följande.

  1. Dehydrera organoiderna/sfärerna genom att tillsätta 1 ml 30 % sackaroslösning till röret och inkubera den över natten i kylskåp vid 4 °C.
  2. Tillsätt 100 μL PBST-lösning (10 mM PBS-lösning med 0,1% Triton X-100) till röret för att skölja organoiderna /sfärerna i 5 minuter, centrifugera röret vid 100 × g i 1 min och samla pelleten. Upprepa detta steg tre gånger.
  3. Tillsätt 0,5-1 ml färdigt icke-immunt getserum till röret och försegla det vid rumstemperatur i 1 timme. Centrifugera röret vid 100 × g i 1 min och samla upp pelleten.
  4. Tillsätt flera droppar utspädd primär antikropp för att bara täcka pelleten och inkubera i kylskåp vid 4 °C i 48 timmar. Centrifugera röret vid 100 × g i 1 min och samla upp pelleten.
  5. Upprepa steg 9.2.
  6. Tillsätt flera droppar av en fluorescerande sekundär antikropp och 4',6-diamidino-2-fenylindollösning (DAPI) till röret för att bara täcka pelleten och inkubera i kylskåp vid 4 °C i 24 timmar, för att undvika ljus.
  7. Upprepa steg 9.2 och undvik ljus.
  8. Tillsätt 100 μL PBST-lösning till röret och förvara det tillfälligt i ett 4 °C kylskåp, borta från ljus. Observera och fotografera organoiderna/sfärerna med hjälp av ljusplåtsskanningsmikroskopet.

10. LGSC pLX-mCherry-transfektion

OBS: Produktion av lentivirala partiklar måste utföras i ett biosäkerhetsskåp och en ren bänk på BSL2 biosäkerhetsnivå.

  1. Odla lentivirusförpackningscellen 293T i en 6-brunnsplatta med DMEM + 10% FBS vid 37 ° C, 5% CO2 i 3-5 dagar för att nå 80% cellsammanflöde.
  2. Transfektera lentivirusvektorn pLX-mCherry till LGSC.
    OBS: Reagensberedning är indicerat för en brunn på en 6-brunnsplatta.
    1. Förbered två sterila 1,5 ml centrifugrör och tillsätt 250 μl DMEM/F12 till varje rör.
    2. Tillsätt 7,5 μl transfektionsreagens till ett rör och blanda reagenset noggrant genom pipettering.
    3. Tillsätt 2 μg pLX-mCherry-plasmid utan endotoxin och matchande lentivirusförpackningsplasmid i ett annat rör och tillsätt transfektionsreagenset (2 μL/μg plasmid).
    4. Blanda vätskan i båda centrifugrören och låt blandningarna stå i 5 min vid rumstemperatur.
    5. Avlägsna odlingsmediet för 293T-cellerna och tillsätt blandningen från steg 10.2.4 till 293T-cellerna. Byt odlingsmediet till färskt DMEM + 10% FBS efter 8 timmar.
    6. Efter 48 timmar, samla virussupernatanten för första gången och filtrera den genom ett 0,45 μm filter. Efter 72 h, samla virussupernatanten för andra gången och filtrera den genom ett 0,45 μm filter igen.
      OBS: Förvara båda filtrerade supernatanterna på is tills lentivirustransduktion.
  3. Hämta LGSC från DED-möss (NOD/ShiLtJ) (se steg 1).
  4. Tillsätt 1 ml av den församlade pLX-mCherry lentivirus supernatanten för att återsuspendera cellerna.
  5. Ställ centrifugröret på en skakapparat iCO2-inkubatorn vid 37 °C. Skaka den vid 100 rpm för att maximera kontakten mellan lentiviruset och cellerna. Efter 8 timmar centrifugerar du blandningen vid 250 × g i 4 minuter och avlägsnar supernatanten.
  6. Tillsätt 1 ml DMEM/F12 för att återsuspendera cellpelleten. Använd en cellräknare för att bestämma cellantalet och frö totalt 1 × 104 celler till 100 μL matrisgel-LGSCM-matris (matrisgel: LGSCM = 1:1) i varje brunn av en 24-brunnsplatta förbelagd med 20 μL matrisgel-LGSCM-matris (se steg 1.3.2).
  7. Efter 7 dagars kultur (se steg 1), välj sfärer som uppvisar röd fluorescens under ett fluorescensmikroskop för att expandera kulturen.

11. LGSC ortotopisk transplantation

OBS: Alla kirurgiska operationer utförs i en SPF-operationssal och alla kirurgiska instrument steriliseras.

  1. Hämta LGSC-sfärerna från ROSA26mT / mG-möss med röd fluorescens (td-Tomat) eller mCherry-transfektion odlad i 7 dagar (se steg 1).
  2. Kyl ett 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller en 1:1-blandning av matrisgel och DMEM/F12 på is före användning. Smält LGSC-sfärerna i enstaka celler och återsuspendera cellerna med en densitet av 2 × 106 celler / ml i röret.
  3. Bedöva NOD/ShiLtJ-mössen genom intraperitoneal injektion av pentobarbitalnatrium (50 mg/kg).
    OBS: NOD / ShiLtJ-mus är en idealisk modell med idiopatiska ADD-symtom, inklusive minskad tårsekretion, inflammatorisk infiltration och orbitalsår.
  4. Efter anestesi, använd saltlösning eller veterinärsalva på ögonen för att förhindra torrhet och använd sedan oftalmiska saxar för att göra ett 5-8 mm snitt i huden bakom örat (nära ögat) hos bedövningsmössen för att exponera LGs.
    OBS: Jodofor bör användas strikt för desinfektion runt snittet.
  5. Injicera 2 × 104 celler i LG på vänster sida och injicera blandningen utan celler (se steg 11.2) i LG på höger sida som kontroll.
  6. Efter injektion, återställ LGs till sina ursprungliga positioner med oftalmiska pincett och suturera såret. Foder mössen i 2 månader och observera effekten av behandlingen.
    OBS: Burkuddematerialet måste också steriliseras strikt efter operationen, och kuddmaterialet ska bytas ut en gång om dagen. Efter suturering av såret kan tramadol selektivt injiceras i svansvenen hos möss med standarddosen 2,5 mg/kg för att uppnå analgesi.
  7. Bedöva dessa möss 2 månader efter experimentet (se steg 11.3). Filma symtomen på ögonområdet.
    1. Under anestesi, leta efter följande symtom: nacke och lem muskelavslappning; djup, långsam och stadig andning; elevförminskning; hornhinnereflex försvinnande.
    2. Under anestesi och operation, håll kroppstemperaturen hos möss vid 37 °C. Efter operationen, tillsätt lämpliga antibiotika till dricksvattnet för möss för att minska risken för sårinfektion. Lämna inte mössen obevakade förrän de har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternal recumbency. Returnera inte mössen som har genomgått operation till andra möss till andra möss förrän de är helt återställda.
    3. Efter att ha filmat symtomen i ögonområdet öppnar du ImageJ-programvaran, klickar på File | Öppna | Frihandsval, håll ned vänster musknapp och välj området för orbitalsår i bilden. Klicka på Analysera | Mät för att få det relativa området av sårbildning.
  8. Sätt den fenolröda bomullstråden på lateral canthus av anestesimöss i 10 s; mäta och registrera längden på den missfärgade delen av bomullstråden. Avliva mössen genom cervikal ryggradsförskjutning efter tårmätning.
  9. Dissekera mössen och få LGs för IHC-analys.

12. RNA-isolering

OBS: Före experimentet, förkyl centrifugen till 4 °C och garantera att alla reagenser och förbrukningsvaror är fria från RNAse-kontaminering.

  1. Samla LGSC eller LG-fragment i ett mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 ml celllysbuffert och lysera cellerna eller vävnaderna helt genom virveloscillation.
  2. Tillsätt 0,2 ml kloroform och låt den stå vid rumstemperatur i 10 min efter virveloscillation i 1 min. Centrifugera i 15 min vid 4 °C, 12 000 × g.
    OBS: Efter centrifugering är vätskan uppdelad i tre lager och RNA är i den översta transparenta vattenfasen.
  3. Pipettera försiktigt den översta transparenta vattenfasen och överför den till ett nytt 1,5 ml RNAse-fritt centrifugrör.
  4. Tillsätt en lika stor volym isopropylalkohol och blanda försiktigt. Låt blandningen stå i rumstemperatur i 10 min och centrifugera sedan i 15 min vid 4 °C, 12 000 × g.
  5. Ta bort supernatanten och tillsätt 1 ml 75% etanol. Vänd upp röret för att tvätta pelleten och centrifugera i 5 min vid 4 °C, 7 500 × g. Upprepa detta steg.
  6. Ta bort supernatanten försiktigt och sätt centrifugröret i den ultrarena arbetsbänken för att torka den i cirka 20 minuter.
    OBS: Fortsätt till nästa steg när den vita pelleten blir genomskinlig. Utför alla operationer på is.
  7. Tillsätt 20 μL RNAse-fritt vatten för att lösa upp pelleten helt. Mät RNA-koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer (se materialförteckningen) och förvara RNA-lösningen vid -80 °C.

13. PCR

  1. Omvänd transkriptionsreaktion
    1. Tillsätt 1 μg totalt RNA (beräkna volymen tillsatt RNA-lösning enligt koncentrationen av RNA-lösningen) i PCR-reaktionsröret och inkubera vid 65 °C i 5 min för denaturering.
    2. Lägg den på is i 1 min och tillsätt sedan enzymfritt vatten tills den totala volymen når 12 μL. Tillsätt 4 μL 4x DNA Master Mix och inkubera det vid 37 °C i 5 min.
    3. Lägg röret på is, tillsätt 4 μL 5x RT Master Mix och blanda det försiktigt. Ställ in följande PCR-inställningar: 37 °C i 15 min, 50 °C i 5 min, 98 °C i 5 min, 4 °C i 1 min.
    4. Förvara den vid -20 °C eller fortsätt till nästa steg efter att den omvända transkriptionsreaktionen är klar.
  2. PCR-reaktion
    1. Förbered PCR-reaktionen i PCR-röret enligt följande: 14,1 μL enzymfritt vatten, 2 μL dNTP, 2 μL 10x buffert, 0,8 μl primer (10 μM, 0,4 μl framåtprimer och 0,4 μl omvänd primer, se materialtabellen), 1 μl omvänd transkription cDNA (se steg 13.1) och 0,1 μl Taq-enzym.
    2. Placera den beredda PCR-reaktionen i PCR-apparaten för PCR. Se instruktionerna i Taq-enzymsatsen för PCR-proceduren (se materialtabellen).
  3. Agarosgelelektrofores
    1. Använd en analysvåg för att väga 242 g Tris och 37,2 g Na2EDTA·2H2O och tillsätt dem till en 1 L-bägare. Tillsätt ~ 800 ml avjoniserat vatten och 57,1 ml isättika till bägaren, blanda väl, tillsätt avjoniserat vatten till 1 L för att få 50x TAE-buffert och förvara det vid rumstemperatur.
      OBS: Späd 50x TAE-buffert med avjoniserat vatten före användning.
    2. Använd en analysvåg för att väga 1,2 g agaros och tillsätt den till en E-kolv som innehåller 80 ml 1x TAE-buffert. Värm den upprepade gånger i mikrovågsugnen tills den är helt upplöst.
    3. Kyl kolven under rinnande kranvatten tills lösningstemperaturen sjunker till 60 °C. Tillsätt 8 μL nukleinsyrafläck, häll lösningen i gelatiniseringstanken efter blandning väl, placera kammen och låt den stå vid rumstemperatur i 30 minuter.
    4. Dra ut kammen och ladda PCR-produkterna i den beredda agarosgelen. Utför elektrofores vid 120 V i 30 min.
    5. Placera gelén i ECL Gel-bildsystemet och fotografera.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etablera 3D, serumfritt odlingssystem
I denna studie utvecklades LGSCM innehållande EGF, Wnt3A, FGF10 och Y-27632 för MUS LGSC, och LGSC isolerades framgångsrikt och odlades framgångsrikt med en 3D-odlingsmetod (figur 1A). Ett framgångsrikt 3D, serumfritt odlingssystem av LGSC från C57BL/6-möss, NOD/ShiLtJ-möss, BALB/c-möss och ROSA26mT/mG-möss har etablerats med hjälp av denna metod16. För en manlig mus erhölls 1,5-2 × 106 celler från två LGs genom dissociation. Efter en veckas kultur bildades 30-60 sfärer vid sådd av 1 × 104 LG-celler i början av kulturen. Dessutom uttryckte cellerna som odlades med denna metod Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestin och andra stamcellsmarkörer16, vilket indikerar att de erhållna cellerna hade egenskaperna hos LGSC: er. Krt14 och Ki67 uttrycktes i alla sfärer bildade av LGSC odlade i 7 dagar (figur 1B), vilket indikerar att LGSC: erna hade självförnyelsekapacitet.

Under en 7-dagars kultur nådde LGSC-sfärerna en diameter på 100 μm. Färgning av hematoxylin och eosin (H&E) visade cellularitet vid dag 7 (figur 1C och figur 1F). Anrikningsfaktorerna för LGSC som erhölls efter 7 dagars primärkultur och subkultur indikerade att LGSC: erna berikade med denna metod hade stark proliferativ förmåga (Figur 1D). I detta system kunde LGSC passeras över 40 gånger, och de behöll fortfarande stamcellsegenskaper (figur 1E och figur 1G). Sammanfattningsvis beskriver detta dokument ett protokoll för att upprätta ett 3D, serumfritt odlingssystem för LGSC in vitro. Cellerna som odlas av detta protokoll har kontinuerlig och stabil proliferativ förmåga.

Inducera differentiering in vitro
Differentieringskapaciteten hos LGSC in vitro analyserades. När de odlades i mer än 7 dagar förlorade LGSC gradvis tillväxtförmågan och uttrycket av AQP5, Ltf, Krt19 och andra markörer associerade med differentiering ökade, medan uttrycket av Krt14 gradvis minskade16. LGSC inducerades att bilda fler knoppar av FBS och en låg andel matrisgel (figur 2A,B). Dessutom indikerade H&E-färgning att FBS kunde få sfärerna att producera fler kavitationsstrukturer (figur 2C).

Det tidigare arbetet föreslog att minskande matrishårdhet främjade differentieringen av LGSC till duktalt liknande organoider. Basalskiktscellerna bibehöll egenskaperna hos stamceller som uttrycker Krt14, medan de basala övre skiktcellerna differentierades till kanalliknande strukturer med håligheter och uttryckte Krt19. Dessutom kan tillsatsen av FBS inducera differentiering av LGSC till acinarliknande organoider, vilket upprätthöll egenskaperna hos stamceller med högt kärn- / cytoplasmatiskt förhållande. Vissa differentierade acinarliknande celler uttryckte höga nivåer av AQP5 med lågt kärn-/cytoplasmatiskt förhållande16.

 Reparera LGSC  in vivo
Baserat på ovanstående experiment undersöktes LGSC: s förmåga att reparera skadade LGs genom ortotopisk injektion. Efter ortotopisk injektion av ROSA-LGSC i NOD/ ShiLtJ-möss bildades nya lacrimal lobules intill LGs (Figur 3A-C). De flesta lobulerna bestod av mogna acinarceller med högt uttryck av AQP5, och det fanns intralobulär kanalbildning med lågt AQP5-uttryck (figur 3D-F). Efter injektion av ROSA-LGSC i 8 veckor mättes sönderfallet runt mottagarnas bana. Mätningarna indikerade att injektionen av LGSC minskade sönderfallsområdet med ~ 60% (figur 3G, H). Dissektionen visade att LG-volymen ökade efter injektion i 10 veckor (figur 3I). Mängden tårsekretion på ROSA-LGSC-injektionssidan var högre än på kontrollsidan men lägre än hos vildtypsmöss (figur 3J). Dessa resultat indikerar att cellerna som skördas av detta odlingssystem har egenskaperna hos LGSC och kan användas för stamcellsterapi hos möss med ADDED och xerophthalmia.

Figure 1
Figur 1: Isolering och karakterisering av LGSC: er. (B) Immunofluorescensfärgning av LGSC vid dag 7. LGSC uttrycker epitelcellsmarkör E-kadherin (röd), stamcellsmarkör Krt14 (röd), proliferativ cellmarkör Ki67 (röd). Motfärg, DAPI (blå). (C) Morfologin hos LGSC i kultur i 1, 3, 5 och 7 dagar. (D) Relativ anrikningsfaktor för LGSC-kultur i primärkultur och subkultur. Relativ anrikningsfaktor är förhållandet mellan det totala antalet celler erhållna efter 7 dagars odling och antalet celler som fröas i odling. P < 0,01. (E) Transkription av vuxna stam- / stamcellsmarkörer för musen LG och olika passage LGSC (P1, P10, P20 och P40). (F) Morfologin (vänster) och H&E-färgningen (höger) av LGSC i primärkulturen vid dag 7. (G) LGSC odlade i olika passager (P1, P10, P20 och P40). Skalstänger = 50 μm (B, F, G), 100 μm (C). Förkortningar: LG = lacrimal körtel; LGSC = LG-stamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol;; NC = negativ kontroll; TE = trypsin-EDTA; H&E = hematoxylin och eosin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Differentiering av LGSC in vitro. (A) LGSC odlade i 10 dagar i P10 (vänster: normalt medium, höger: FBS-innehållande medium). (B) LGSC odlade i 14 dagar i P31 (vänster: normalt medium, höger: medium med 1/3rd matrisgel). (C) H&E-färgning av LGSC:er som odlats i 14 dagar (överst: normalt medium, botten: FBS-innehållande medium). Skalstänger = 100 μm (A), 200 μm (B), 50 μm (C). Förkortningar: LG = lacrimal körtel; LGSC = LG-stamceller; H&E = hematoxylin och eosin; FBS = fetalt bovint serum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Engraftment av LGSC allotransplantation och lindring av ADDERADE symtom. Använd vänster och höger sida av samma mus som experimentgruppen och kontrollgruppen. (A-C) IHC-färgning med anti-td-tomatantikropp; (D-F) IHC-färgning med anti-AQP5-antikropp; (A, D) LG injicerad med vehikel (1:1 blandning av matrisgel och DMEM/F12), (B, E) LG injicerad med ROSA-LGSC, (C, F) de förstorade bilderna av de svarta rutorna i B, E (röd pil, intralobulär kanal). (G, H) Tillståndet för NOD / ShiLtJ musögonbana efter injektion av ROSA-LGSC vid 8 veckor. Injektionen av LGSC lindrar signifikant förfallet runt ögonbanan. (I) LGs för NOD / ShiLtJ-musen vid 10 veckor (vänster: LG från den cellinsprutade sidan, höger: LG från kontrollsidan). (J) Rivvolym av vildtyps- och NOD / ShiLtJ-möss transplanterade med 7-dagars kulturer av ROSA-LGSC efter 8 veckor. Tårvolymen för ROSA-LGSC-injicerade LGs är högre än för kontroll-LGs men signifikant lägre än för WT LGs. n = 3; NOD/ShiLtJ-möss, n = 4; P < 0,01; *P < 0,05. Skalstänger = 50 μm (A-F). Förkortningar: LG = lacrimal körtel; LGSC = LG-stamceller; IHC = immunohistokemisk; WT = vild typ; TILLAGT = vattenbrist i torra ögon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns väletablerade metoder för isolering och in vitro-odling av lacrimala stamceller för lacrimal stamcellsodling och LG-skadereparation. Shatos et al.17 och Ackermannet al. 6 framgångsrikt odlade och subkulturerade lacrimalstamceller från råttor respektive möss med 2D-odlingsmetoder, vilket gör det möjligt att transplantera lacrimalstamceller för behandling av ADDED. Studier på stamceller18 och mesenkymala stamceller19,20 av LGs odlade i 2D visade att transplantationen av dessa celler kunde lindra symtomen på ADD till viss del. Genom fluorescensaktiverad cellsortering, Gromovaet al. 2 utvalda stamceller som uttrycker LG-stamceller från mus-LG och differentierade dem till kanaler och acini in vitro, vilket framgångsrikt realiserade differentieringen av vuxna stamceller till funktionella celler av LGs. Det visades också att transplantation av ett tillräckligt antal stamceller kunde lindra ADD-symtom hos möss.

För att möta behoven av stamcellsanrikning och eliminera serumberoende i befintliga lacrimala stamcellsodlingsmetoder etablerades det serumfria odlingssystemet för lacrimala stamceller i detta protokoll baserat på tidigare publicerad forskning och organoid 3D-odlingsteknik21. Således förväntas detta system främja klinisk forskning på lacrimala stamceller. I detta protokoll inkluderar de kritiska stegen primärkultur, subkultur och expansion av LGSC och in situ-transplantation av LGSC till skadade LGs hos möss.

Primärkulturen är grunden för att erhålla LGSC. Det är nödvändigt att upprätthålla sterila förhållanden under primärkulturen. Brunnen är förbelagd med matrisgel för att undvika vidhäftande tillväxt av celler i botten av cellodlingsbrunnen. Vid användning av matrisgel är det nödvändigt att följa tillverkarens instruktioner och alltid hålla den i flytande tillstånd före tillsats till brunnen för att undvika matris-gelförlust under experimentet och den ojämna matrisgelen i kulturen.

Antalet seedade celler i primärkulturen är 10 000 celler/brunnar. I praktiken kan antalet sådda celler ökas om lämpligt tillväxtutrymme och näringstillförsel av celler säkerställs. Subkultur är ett viktigt steg för att rena och berika stamceller. Efter passage bildade LGSC i P1-generationen fler sfärer, och det fanns fler P1-generationsceller än P0-generationen. Detta indikerar att LGSC med proliferativ förmåga har berikats i detta system.

När LGSC odlades i detta 3D-system under 10 dagar var 0,05% trypsin-EDTA ibland inte tillräckligt för att fullständigt smälta organoiderna i enstaka celler under passagen. Detta problem löstes genom att förlänga matsmältningstiden på lämpligt sätt. In situ injektionsbehandling är ett nödvändigt förfarande för att verifiera det kliniska värdet av LGSC: er. På grund av den lilla storleken och de tunna och lösa vävnaderna hos LGs hos möss förloras celler alltid från injektionsstället om cellsuspensionen bereds i normal saltlösning eller 10 mM PBS för injektion. Därför rekommenderas att blanda cellsuspensionen med matrisgel för injektion. Eftersom matrisgelen som används i detta system stelnar vid temperaturer över 10 °C kan celler lätt kolonisera när de injiceras i LG. Blandningen av celler och matrisgel måste alltid förvaras på is före injektion och injektionen utföras snabbt.

Förutom att isolera LGSC från normala möss isolerades och odlades vuxna LGSC från ADDED-möss framgångsrikt för första gången med detta protokoll16. Detta system har dock fortfarande brister och olösta problem. För det första härrör den använda matrisgelen från möss 22,23, vilket kan orsaka avstötningsreaktioner i människokroppen och därför har begränsad klinisk tillämplighet. Det är nödvändigt att förbättra odlingssystemet genom att hitta lämpliga syntetiska geler för att ersätta matrisgelén.

För det andra måste differentieringsstrategin i detta protokoll förbättras. Istället för att förlänga odlingstiden för differentiering21 eller tillsätta serum i odlingsmediet förväntas tillägg av specifika tillväxtfaktorer och förändrade specifika miljöförhållanden för riktad induktion ge önskat resultat. Det är nödvändigt att ytterligare utforska mekanismen för underhåll och differentiering av LGSC genom att belysa de signalvägar som orsakar differentiering. Dessutom har tidigare studier visat att myoepitelceller odlade in vitro också uttrycker stamcellsgener, såsom Nestin, Musashi och Pax6, vilket indikerar att myoepitelceller också har stamcellsegenskaper17.

Denna studie ägnade ingen uppmärksamhet åt myoepitelceller och verifierade därför inte om myoepitelceller finns i LG-organoiderna genom att identifiera specifika uttrycksmarkörer för myoepitelceller. På grund av begränsningen av odlingsförhållandena kunde myoepitelceller inte induceras eller att deras antal var för litet för att kunna observeras. Odlingstiden kan förlängas för att observera om organoiderna ytterligare differentieras till myoepitelceller, eller fokusera på myoepitelceller i framtida studier av induktionsdifferentiering och systemförbättring.

Sammanfattningsvis tillhandahåller detta protokoll en metod för att studera LGSC för utveckling, reparation och regenerering av LGs. Differentieringen av LGSC in vitro skulle kunna ligga till grund för framtida in vitro-regenerering av LGs, medan isolering och odling av LGSC kan lösa problemet med avstötning vid stamcellsaltotransplantation. Denna metod ger en viktig grund för klinisk individualiserad behandling av xeroftalmi med LGSC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (nr 31871413) och två program för Guangdong Science and Technology (2017B020230002 och 2016B030231001). Vi är verkligen tacksamma för de forskare som har hjälpt oss under studien och för personalen som arbetar på djurcentret för deras stöd i djurvården.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO -
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID -
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID -
Yeast Extract OXID -
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC		 Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT		 Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG		 Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC		 Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC		 Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT		 Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA		 Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT		 Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC		 Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Tags

Biologi utgåva 184
Tredimensionellt, serumfritt odlingssystem för lacrimalkörtelstamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Huang, P., Zhang, Y.… More

Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter