Summary
يصف هذا البروتوكول بناء صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المصممة خصيصا لتسجيل إمكانات المجال المحلي في الجسم الحي من هياكل دماغية متعددة في وقت واحد.
Abstract
غالبا ما يحتاج الباحثون إلى تسجيل إمكانات المجال المحلي (LFPs) في وقت واحد من العديد من هياكل الدماغ. يتطلب التسجيل من مناطق الدماغ المرغوبة المتعددة تصميمات مختلفة للأقطاب الكهربائية الدقيقة ، ولكن صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المتاحة تجاريا غالبا ما لا توفر مثل هذه المرونة. هنا ، يحدد البروتوكول الحالي التصميم المباشر لمصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة المصممة خصيصا لتسجيل LFPs من هياكل دماغية متعددة في وقت واحد على أعماق مختلفة. يصف هذا العمل بناء الأقطاب الكهربائية الثنائية القشرية والمخططة والبطنية الجانبية والكهربائية الدقيقة كمثال. يوفر مبدأ التصميم المحدد المرونة ، ويمكن تعديل الأقطاب الكهربائية الدقيقة وتخصيصها لتسجيل LFPs من أي هيكل عن طريق حساب الإحداثيات المجسمة وتغيير البناء بسرعة وفقا لذلك لاستهداف مناطق الدماغ المختلفة في الفئران التي تتحرك بحرية أو تخديرها. يتطلب تجميع microelectrode أدوات ولوازم قياسية. تسمح صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المخصصة للمحققين بتصميم صفائف microelectrode بسهولة في أي تكوين لتتبع النشاط العصبي ، مما يوفر تسجيلات LFP بدقة مللي ثانية.
Introduction
إمكانات المجال المحلي (LFPs) هي الإمكانات الكهربائية المسجلة من الفضاء خارج الخلية في الدماغ. يتم إنشاؤها بواسطة اختلالات تركيز الأيونات خارج الخلايا العصبية وتمثل نشاط مجموعة صغيرة وموضعية من الخلايا العصبية ، مما يسمح بمراقبة نشاط منطقة معينة من الدماغ بدقة مقارنة بتسجيلات EEG على نطاق واسع1. كتقدير ، تتوافق الأقطاب الكهربائية الدقيقة LFP المفصولة ب 1 مم مع مجموعتين مختلفتين تماما من الخلايا العصبية. في حين يتم ترشيح إشارة EEG بواسطة أنسجة المخ والسائل الدماغي الشوكي والجمجمة والعضلات والجلد ، فإن إشارة LFP هي علامة موثوقة للنشاط العصبي المحلي1.
غالبا ما يحتاج الباحثون إلى تسجيل LFPs في وقت واحد من العديد من هياكل الدماغ ، ولكن صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المتاحة تجاريا غالبا ما لا توفر مثل هذه المرونة. هنا ، يصف البروتوكول الحالي الأقطاب الكهربائية الدقيقة القابلة للتخصيص بالكامل وسهلة البناء لتسجيل LFPs في وقت واحد من أي منطقة دماغية مرغوبة على أعماق مختلفة. على الرغم من أن LFPs قد استخدمت على نطاق واسع لتسجيل النشاط العصبي لمنطقة معينة في الدماغ2،3،4،5،6،7،8،9 ، فإن التصميم الحالي السهل القابل للتخصيص يسمح بتسجيل LFPs من أي مناطق دماغية سطحية أو عميقة متعددة11,12 . يمكن أيضا تعديل البروتوكول لبناء أي مصفوفة ميكروكترود مرغوبة من خلال تحديد الإحداثيات المجسمة لمناطق الدماغ وتجميع المصفوفة وفقا لذلك. تسمح لنا هذه الأقطاب الكهربائية الدقيقة ذات معدل أخذ العينات 10 كيلو هرتز ومقاومة 60-70 kΩ (طول 2 سم) بتسجيل LFPs بدقة مللي ثانية. يمكن بعد ذلك تضخيم البيانات بواسطة مضخم صوت مكون من 16 قناة ، وتصفيته (تمرير منخفض 1 هرتز ، وتمرير مرتفع 5 كيلو هرتز) ، ورقمنت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذا العمل من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة فرجينيا. تم استخدام C57Bl / 6 فئران من كلا الجنسين (7-12 أسبوعا) للتجارب. تم الحفاظ على الحيوانات في دورة مظلمة مدتها 12 ساعة / 12 ساعة من الضوء وكان لديها إمكانية الوصول إلى الطعام والماء.
1. بناء القطب الدقيق
- لبناء الأقطاب الكهربائية الدقيقة ، استخدم سلك النيكل والكروم المطلي بالديميل 50 ميكرومتر (انظر جدول المواد). قم بشريط أحد طرفي السلك في الجزء الخلفي من المنصة ولف السلك ثلاث مرات حول أقرب مقبض على المنصة (الشكل 1A ، C).
ملاحظة: تم استخدام منصة أكريليك مع مقبضين (2 × 5 بوصات) هنا ، ولكن يمكن استخدام أي منصة.- قم بتمديد السلك حول أبعد مقبض ثان لإنشاء حلقتين بين المقابض. لف السلك ثلاث مرات أخرى حول المقبض الأول لإصلاح السلك في مكانه وربط النهاية مرة أخرى في الجزء الخلفي من المنصة.
ملاحظة: بعد فصل الأسلاك (الخطوات 1.2-1.3.1)، يجب أن يكون هناك سلكان على كل جانب (أربعة أسلاك في المجموع، الشكل 1B).
- قم بتمديد السلك حول أبعد مقبض ثان لإنشاء حلقتين بين المقابض. لف السلك ثلاث مرات أخرى حول المقبض الأول لإصلاح السلك في مكانه وربط النهاية مرة أخرى في الجزء الخلفي من المنصة.
- ضع قضبان التوتر تحت الأسلاك مع الشريط ملفوف حولها (الجانب اللزج لأعلى) (الشكل 1C).
ملاحظة: تم استخدام قطع الأكريليك المثلثة لقضبان التوتر ، مع شريط ملفوف حولها (جانب لزج في الخارج لتوصيل الأسلاك). الجانب اللزج من الشريط خارج قضبان التوتر سيبقي الأسلاك في مكانها لضبط المسافة بينهما. يجب أن تكون قضبان التوتر على بعد ~ 2.5 سم من المقابض ، ويجب ألا تكون الأسلاك فضفاضة. - باستخدام المجهر والملقط الناعم ، قم بعمل فجوة 3 مم أو 4.5 مم بين الأسلاك (فجوة 3 مم بين الأسلاك لصنع أقطاب دقيقة قشرية (Ctx) - نواة المهاد البطني الجانبي (VL) ؛ فجوة 4.5 مم لصنع أقطاب دقيقة مخططة (Str) - nigral (SNR) ) (الشكل 1B).
- إذا تم استخدام التكبير على المجهر ، فتأكد من حساب وضبط الفرق في التكبير والمسافة الفعلية بين الأسلاك.
ملاحظة: إذا تم بناء أقطاب كهربائية دقيقة لهياكل أخرى غير تلك المستخدمة هنا ، فيجب ضبط المسافة بين الأسلاك على المسافة المجسمة بين الهياكل. ويقدم الشكل 2 باء مثالا على كيفية تنظيم الأسلاك؛ وفقا لذلك ، يجب تعديل الإحداثيات المجسمة للهياكل الأخرى.
- إذا تم استخدام التكبير على المجهر ، فتأكد من حساب وضبط الفرق في التكبير والمسافة الفعلية بين الأسلاك.
- قطع أربع قطع صغيرة من البلاستيك (بسماكة 0.5 مم) ~ 6 مم (عرض) × 3 مم (ارتفاع) (الشكل 1C).
ملاحظة: يمكن استخدام أي قطع بلاستيكية طالما أن سمكها 0.5 مم ؛ هنا ، تم استخدام الأنابيب المربعة التي تم فيها بيع المسامير (دبابيس ، انظر جدول المواد). إذا تم استخدام سمك مختلف ، فيرجى إضافة المزيد أو أقل من قطع البلاستيك لتناسب الإحداثيات المجسمة المطلوبة. - ضع الغراء (انظر جدول المواد) على البلاستيك وضعه على الأسلاك (الشكل 1C). ضع القطع البلاستيكية على بعد 1.0 سم تقريبا من منتصف السلك ، وهو على بعد 1.0 سم من شريط التوتر. إزالة الفائض من الغراء الفائق مع قطعة قطن.
- بعد أن يجف الغراء الفائق ، اقطع الأسلاك باستخدام مقص دقيق ، بالترتيب الموضح في الشكل 1C.
- قم بقطع أربعة أنابيب زجاجية مقاس 7 مم باستخدام مجموعة متاحة تجاريا (انظر جدول المواد) وأدخل أسلاك القطب الكهربائي في الأنابيب الزجاجية كما هو موضح في الشكل 2A.
- أدخل أزواج أقطاب VL و SNR في الأنابيب الزجاجية.
ملاحظة: يجب إدخال أسلاك الهياكل العميقة فقط في الأنابيب الزجاجية لدعم الزرع الجراحي. تأكد من عدم إدخال أقطاب كهربائية قشرية في الأنبوب الزجاجي.
- أدخل أزواج أقطاب VL و SNR في الأنابيب الزجاجية.
- ضع الغراء في قاعدة الأنابيب الزجاجية لتوصيلها بالبلاستيك. انتظر بعض الوقت حتى يجف الغراء.
- قطع الأنابيب والأسلاك الزجاجية باستخدام مشرط كما هو موضح في الجدول 1 ؛ تأكد من أن أطوال الأقطاب الكهربائية الدقيقة صحيحة. إذا كانت الأقطاب الكهربائية الدقيقة تستهدف هياكل مختلفة ، فاضبط مسافة القطع وفقا للإحداثيات المجسمة المطلوبة.
الشكل 1: مخطط بناء القطب الدقيق . (أ) إعداد الأسلاك على المنصة مع قضبان التوتر أسفل الأسلاك. (ب) الفجوة بين الأسلاك. (ج) يتم لصق أربع قطع من البلاستيك على الأسلاك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| سي تي إكس | شارع | في إل | SNR | |
| AP (الأمامي / الخلفي) | 2.2 | 1.2 | -1.3 | -3.3 |
| ML (الإنسي / الجانبي) | 1.8 | 1.5 | 1 | 1.5 |
| DV (الظهرية / البطنية) | 0.5 | 3.5 | 4 | 4.75 |
| طول القطب الكهربائي | 4 | 4.75 | 5.25 | 6 |
الجدول 1: إحداثيات وأبعاد الزرع المجسمة للأقطاب الكهربائية الدقيقة.
2. تجميع صفيف القطب الصغير
- استخدم الغراء لإرفاق البلاستيك بالترتيب المطلوب للمناطق المستهدفة. ويظهر مثال على الأقطاب الكهربائية القشرية والثالاميك والمخططة والنيجيرية في الشكل 2B,C.
- ضع زوج القطب الكهربائي Ctx-VL وجها لأسفل (الجانب مع أسلاك القطب الكهربائي يجب أن يكون متجها لأسفل) وقم بتوصيل قطعتين فارغتين من البلاستيك مقاس 6 مم × 3 مم في الأعلى بالغراء.
- فوق القطع الثلاث من البلاستيك ، ضع زوج القطب الكهربائي Ctx-VL الثاني مع الأقطاب الكهربائية المتجهة لأعلى (استخدم المجهر وتأكد من محاذاة أقطاب VL).
ملاحظة: تعد محاذاة الأقطاب الكهربائية الثنائية (هنا ، محاذاة أقطاب VL اليسرى واليمنى) ضرورية لاستهداف الهياكل الثنائية المطلوبة بشكل مناسب. - استخدم الغراء لتوصيل أقطاب SNR في الأعلى مع أقطاب SNR الكهربائية على بعد 2.0 مم من أقطاب VL و ~ 5.0 مم بعيدا عن الأقطاب الكهربائية القشرية (يجب أن تواجه أسلاك قطب SNR لأعلى).
- كرر الخطوة 2.1.3. للجانب الآخر (يجب أن تواجه أسلاك القطب SNR خارج صفيف القطب الدقيق).
- ضع راتنجات الايبوكسي حول البلاستيك لربط الأقطاب الكهربائية معا. تجنب وضع راتنجات الايبوكسي على الأقطاب الكهربائية.
- خذ سلك سميك واصنع حلقة على طرف واحد. اغمس الحلقة في محلول الإيبوكسي وضعها على البلاستيك ، مما يضمن أن السلك السميك مستلقيا بشكل مسطح (الشكل 2D) بحيث يمكن استخدام هذا السلك كمقبض للخطوات التالية. انتظر حتى تجف الأقطاب الكهربائية تماما.
- قطع الأسلاك إلى 2 سم ، كما هو موضح في الشكل 2E.
الشكل 2: بناء القطب الدقيق وأبعاده. (أ) أربعة أزواج من الأقطاب الكهربائية التي تشكلت بعد قطع الأسلاك بالمقص ، كما هو موضح في الشكل 1C (زوجان من أقطاب Ctx-VL وزوجان من أقطاب Str-SNR). أدخل أقطاب كهربائية عميقة البنية (VL و SNR) في الأنابيب الزجاجية وقم بلصق قواعدها بالبلاستيك (النقاط الحمراء). (B) المنظر العلوي: يتم لصق أزواج القطب الكهربائي من (A) في كومة لإنشاء قلب القطب الدقيق. تشير الخطوط الحمراء إلى خطوط الغراء. (ج) منظر جانبي أمامي للرقم (ب). (د) تم توصيل السلك السميك بالأقطاب الكهربائية الدقيقة. (ه) يتم تجميع الأسلاك كما هو موضح ، ويتم كشط الأطراف المعزولة وتقطيعها إلى 2 سم.
3. اتصال Microelectrode بسماعة الرأس
- قم بتجميع الأسلاك كما هو موضح في الشكل 2E وكشط 1 مم من الأطراف المعزولة بمشرط.
- ثني الأقطاب الكهربائية القشرية كما هو موضح في الشكل 3A. افصل الأسلاك كما هو موضح في الشكل 3B. باستخدام ملقط ناعم ، قم بعمل حلقة في نهاية كل سلك (الشكل 3B).
- أمسك سماعة رأس ذات 10 سنون مع مرقئ (انظر جدول المواد) واستخدم الطرف الخشبي لقطعة قطن لتطبيق الحد الأدنى من التدفق على المسامير (الشكل 3C). تأكد من عدم وضع التدفق خارج المسامير لمنع ماس كهربائى بين الدبابيس.
- باستخدام النهاية الخشبية لقطعة قطن ، ضع التدفق على حلقات الأسلاك.
- قم بلحام حلقات السلك بسماعة الرأس ذات 10 سنون كما هو موضح في الشكل 3C. بعد اللحام ، جفف سماعة الرأس لمنع حدوث ماس كهربائى بين المسامير.
- خذ سلكا رفيعا (0.005-0.008 بوصة) للإشارة والأسلاك الأرضية وقم بتجريد البلاستيك من طرف واحد. قم بعمل حلقة على الطرف الآخر من السلك.
- لحام الجانب المجرد من المرجع والأسلاك الأرضية إلى دبابيس كل منها (الشكل 3A ، C).
- عند الإمساك بالسلك السميك (الشكل 2D) ، ضع أسمنت رأب القحف حول الأقطاب الكهربائية الدقيقة ، خاصة عندما تتصل الأسلاك بالمسامير. تجنب لمس القطب الكهربائي الفعلي مع الأسمنت.
- بعد أن يجف الأسمنت ، ضع راتنجات الإيبوكسي في قاعدة الأنابيب الزجاجية ، وأسلاك القطب الدقيق المخططة ، والقطب بأكمله. تجنب لمس القطب الكهربائي الفعلي مع راتنجات الايبوكسي. انتظر حتى تجف الأقطاب الكهربائية تماما.
- الأقطاب الكهربائية جاهزة. حفر ثقوب في جمجمة الماوس (وفقا للإحداثيات المجسمة المطلوبة) باستخدام مثقاب الأسنان وزرع سماعة الرأس كما هو موضح في الشكل 3D عن طريق خفض سماعة الرأس مع الأقطاب الكهربائية الدقيقة التي تواجه الجمجمة والثقوب المناسبة. يمكن توصيل سماعة الرأس بالذراع المجسمة للحصول على الدعم أثناء الزرع.
الشكل 3: زرع القطب الدقيق . (أ) يتم ثني الأقطاب الكهربائية القشرية كما هو موضح. (ب) يتم فصل الأسلاك لإنشاء حلقات في النهايات. (ج) يتم لحام التدفق (عند النقاط الحمراء) والأسلاك الحلقية بسماعة الرأس ذات ال 10 سنون، مما يضمن انتقال كل سلك إلى الدبوس المناسب له. (د) يتم زرع سماعة الرأس لتسجيل LFPs. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. وضع علامة على موقع القطب الكهربائي بعد التسجيلات
- في نهاية تسجيلات LFP ، تأكد من الموضع الصحيح للأقطاب الكهربائية في المنطقة المستهدفة عن طريق تطبيق تيار على أطراف القطب الكهربائي لعمل آفة والانتظار لمدة 30 دقيقة قبل اختراق الماوس.
ملاحظة: إعدادات الآفة لتأكيد موقع أطراف القطب الكهربائي: انفجار واحد، 40 ميكروأمبير، 0.75 مللي ثانية نبضة موجة مربعة أحادية الطور، 50 هرتز، 30 ثانية. - تخدير الفئران مع الايزوفلوران (حتى نام الفأر) و perfuse10 عبر القلب مع 4 ٪ paraformaldehyde (PFA) في 0.1 M فوسفات الصوديوم العازلة. قسم الأدمغة (بسماكة 40 ميكرومتر) على كريوستات (انظر جدول المواد) ووصمة عار مع DAPI (0.02٪ في PBS). تأكد من الموقع الصحيح للأقطاب الكهربائية من خلال وجود آفات طرف القطب الكهربائي كما هو موضح في الشكل 4B ، C.
ملاحظة: يجب تطبيق النسبة المئوية للإيسوفلوران باتباع المبادئ التوجيهية لكل مؤسسة على حدة.
5. قياس مقاومة القطب الكهربائي
- قم بقياس مقاومة الأقطاب الكهربائية وتحقق من الدائرة القصيرة بين الأقطاب الكهربائية باستخدام مقياس متعدد النطاقات (انظر جدول المواد). اضبط مقياس المقاومة على R × 10000 ، مما يشير إلى أن انحراف الوحدة في المؤشر يتوافق مع مقاومة 1 kΩ. تحتاج الأقطاب الكهربائية التي يبلغ طولها 2 سم إلى مقاومة 60-70 kΩ.
- قم بتخصيص سماعة الرأس عن طريق أخذ عشرة دبابيس فردية (انظر جدول المواد). لحام كل دبوس بسلك نحاسي رفيع متعدد الخيوط في كابل.
- اضغط على الدبابيس الملحومة مع ذيول الكابلات المقابلة لها في مقبس التزاوج ذي الصف المزدوج المكون من 10 سنون (المقابس المطابقة). اضغط على المسامير المفتوحة لمقبس التزاوج في سماعة الرأس LFP. وبهذه الطريقة ، يحتوي كل قطب LFP على سلك كابل معين في التجميع.
- اغمس طرف كل قطب LFP (الذي يجب قياس مقاومته) في محلول ملحي كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ (تركيز كلوريد الصوديوم في الدم). قم بتوصيل طرف سلك الكابل الذي يتوافق مع قطب LFP بالطرف الموجب للأومتر.
- استخدم سلك منخفض المقاومة (̴100 Ω) مع جانب واحد في المياه المالحة والجانب الآخر كنهاية مفتوحة. قم بتوصيل الطرف المفتوح للسلك منخفض المقاومة بأرض مؤشر الأومتر.
ملاحظة: يكمل هذا الترتيب الدائرة ويدفع إلى انحراف مؤشر الأومتر.
- استخدم سلك منخفض المقاومة (̴100 Ω) مع جانب واحد في المياه المالحة والجانب الآخر كنهاية مفتوحة. قم بتوصيل الطرف المفتوح للسلك منخفض المقاومة بأرض مؤشر الأومتر.
- تأكد من عدم وجود اتصال كهربائي بين أي قطبين كهربائيين على سماعة الرأس. تحقق من العزل الكهربائي لأقطاب LFP الزوجية (الأرض: كابل واحد يتوافق مع قطب كهربائي واحد ؛ موجب: كابل آخر يتوافق مع قطب آخر). تخلص من الأقطاب الكهربائية إذا لوحظ أي انحراف في هذه الحالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا العمل ، تم استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة LFP لرسم خريطة للنوبة المنتشرة عبر العقد القاعدية11. تم إجراء تسجيلات LFP المتزامنة من القشرة المخية اليمنى قبل الحركية (حيث كان تركيز النوبة) و VL الأيسر والمخطط و SNR (الشكل 4). تم تحديد بداية النوبة على أنها انحراف في أثر الجهد على الأقل ضعف خط الأساس (الشكل 4A ، السهم الأحمر). ويبين مخطط طيف القدرة11 التوزيعات الترددية لل LFPs المسجلة (الشكل 4A). ويمكن مقارنة زمن انتقال بداية النوبات (الأشرطة الحمراء) بين كل هيكل بدقة ميلي ثانية (الشكل 4 ألف). تم تطبيق نبضة حالية في نهاية التسجيلات لتحديد وتأكيد موقع أطراف القطب الكهربائي ، مما يشكل آفة (الشكل 4B ، C).
الشكل 4: تسجيلات LFP التمثيلية . (أ) تم تسجيل نوبة من القشرة المخية اليمنى قبل الحركية واليسرى VL و striatum و SNR باستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة LFP مع أطياف الطاقة المقابلة. يشير السهم الأحمر إلى بداية النوبة. تشير الأشرطة الأفقية الحمراء إلى تأخير بداية النوبة في كل هيكل. يوضح مخطط الدماغ موضع الأقطاب الكهربائية الدقيقة (النقاط الحمراء). (ب، ج) تم آفة الهياكل بعد التسجيلات لتحديد موقع أطراف القطب الدقيق في VL و SNR. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تاريخيا ، تم استخدام صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة على نطاق واسع لتسجيل النشاط العصبي من منطقة معينة في الدماغ ذات أهمية2،3،4،5،6،7،8،9،13. ومع ذلك ، فإن تصميم microelectrode السهل لدينا يسمح بالتسجيل من هياكل متعددة في وقت واحد11,12. هنا ، يتم وصف بناء الأقطاب الكهربائية الدقيقة القشرية والمهادية والمخططة والنيجيرية كمثال. يمكن للمحققين تعديل تصميم القطب الدقيق ليناسب أي هيكل مرغوب فيه عن طريق حساب المسافات المجسمة اللازمة وضبط البناء وفقا لذلك.
على سبيل المثال ، قمنا سابقا بتعديل تصميم صفائف الأقطاب الدقيقة هذه لتسجيل LFPs في الاتجاه الرقائقي والسبعيني الزماني في الحصين12. فصل سلك تباعد 50 ميكرومتر بين الأقطاب الكهربائية المجاورة كأربعة أقطاب كهربائية دقيقة مسجلة على طول الصفيحة الحصينية لمنع التلوث المتبادل للإشارة. على الرغم من أن هذه لم تكن تسجيلات أحادية الوحدة ، إلا أن كل قطب كهربائي يمثل مجموعة صغيرة من الخلايا العصبية كما هو موضح في تباين الشكل الموجي السنبلة كدالة للمسافة من جسم الخلية.
أثناء البناء ، كان من الضروري إدخال أسلاك المهاد والقطب الصغير في أنابيب زجاجية لتوفير الاستقرار أثناء جراحة الزرع لاستهداف تلك الهياكل العميقة. كان هناك ثمانية أقطاب كهربائية دقيقة ثنائية ، أربعة منها تحتوي على أنابيب زجاجية (2 VL و 2 SNR) ، والتي كانت حدا قبل رفع الضغط داخل الجمجمة وزيادة معدل الوفيات. بشكل عام ، هناك حاجة إلى أنابيب زجاجية عندما يكون عمق الإدخال المطلوب 2 مم على الأقل.
أيضا ، كانت هناك حاجة إلى بلاستيك بسماكة 0.5 مم ، مما يحد من الحد الأدنى لمسافة الفصل بين الأقطاب الكهربائية إلى 0.5 مم ، ولكن يمكن استخدام مواد بلاستيكية أخرى. في الحالة الحالية ، تم وضع البلاستيك على طول المحور الرئيسي لسماعة الرأس. يمكن أيضا وضع البلاستيك عبر محور سماعة الرأس حيث تحتوي العديد من الأقطاب الكهربائية على إحداثيات أمامية وخلفية متطابقة (AP) ولكن إحداثيات إنسية جانبية مختلفة (ML). تقدم هذه الطريقة مجموعة واسعة من التكوينات الممكنة لمناطق معينة من الدماغ.
يحد عدد المسامير الموجودة على سماعة الرأس من عدد الأقطاب الكهربائية الدقيقة. تغطي سماعة الرأس التي تحتوي على 12 دبوسا المدى الأمامي والخلفي لرأس فأر بالغ بالكامل. يجب عزل كل دبوس عن الدبابيس الأخرى أثناء اللحام. كانت هناك حاجة إلى أومتر و 0.9٪ من المياه المالحة لاختبار العزل الكهربائي لكل زوج من محطات القطب الكهربائي. تحد سماعة الرأس المكونة من 12 سنا من التسجيل إلى 10 مناطق (2 محجوزة للأرض والمرجع).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة (RO1 NS120945 ، R37NS119012 إلى JK) ومعهد UVA للدماغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier 16-Channel | A-M Systems | Model 3600 | Amplifier |
| Cranioplasty cement | Coltene | Perm Reeline/Repair Resin Type II Class I Shade - Clear | Cement to hold microelectrodes |
| Cryostat Microtome | Precisionary | CF-6100 | To slice brain |
| Diamel-coatednickel-chromium wire | Johnson Matthey Inc. | 50 µm | Microelectrode wire |
| Dremel | Dremel | 300 Series | To drill holes in mouse skull |
| Epoxy | CEC Corp | C-POXY 5 | Fast setting adhesive |
| Hemostat | Any | To hold the headset | |
| Forceps | Any | To hold microelectrodes | |
| Light microscope | Nikon | SMZ-10 | To see alignment |
| Ohmmeter | Any | To measurre resistance | |
| Pins (Headers and matching Sockets) | Mill-Max | Interconnects, 833 series, 2 mm grid gull wing surface mount headers and sockets | To attach microelectrodes to |
| Polymicro Tubing Kit | Neuralynx | ID 100 ± 04 µm, OD 164 ± 06 µm, coating thickness 12 µm | Glass tubes |
| Pulse Stimulator | A-M Systems | Model 2100 | To mark the microelectrode location at the end of the recordings |
| Scissors | Any | To cut microelectrodes | |
| Superglue | Gorilla | Adhesive | |
| Thick wire 0.008 in. – 0.011 in. | A-M Systems | 791900 | Tick wire to hold the microelectrode array |
| Thin wire 0.005 in. - 0.008 in. | A-M Systems | 791400 | Thin wire for reference and ground |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Receptive fields of single neurones in the cat's striate cortex. The Journal of Physiology. 148 (3), 574-591 (1959).
- O'Keefe, J. Place units in the hippocampus of the freely moving rat. Experimental Neurology. 51 (1), 78-109 (1976).
- Fyhn, M., Molden, S., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B. Spatial representation in the entorhinal cortex. Science. 305 (5688), 1258-1264 (2004).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7, 446-451 (2004).
- Buckmaster, P. S., Edward Dudek, F. In vivo intracellular analysis of granule cell axon reorganization in epileptic rats. Journal of Neurophysiology. 81 (2), 712-721 (1999).
- Driscoll, N., et al. Multimodal in vivo recording using transparent graphene microelectrodes illuminates spatiotemporal seizure dynamics at the microscale. Communications Biology. 4, 1-14 (2021).
- Roy, D. S., et al. Memory retrieval by activating engram cells in mouse models of early Alzheimer's disease. Nature. 531, 508-512 (2016).
- Igarashi, K. M., Lu, L., Colgin, L. L., Moser, M. B., Moser, E. I. Coordination of entorhinal-hippocampal ensemble activity during associative learning. Nature. 510, 143-147 (2014).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Brodovskaya, A., Shiono, S., Kapur, J. Activation of the basal ganglia and indirect pathway neurons during frontal lobe seizures. Brain. 144 (7), 2074-2091 (2021).
- Ren, X., Brodovskaya, A., Hudson, J. L., Kapur, J. Connectivity and neuronal synchrony during seizures. The Journal of Neuroscience. 41 (36), 7623-7635 (2021).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
