Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את בנייתם של מערכי מיקרו-אלקטרוניקה מותאמים אישית לתיעוד פוטנציאל שדה מקומי in vivo ממבנים מוחיים מרובים בו-זמנית.
Abstract
חוקרים צריכים לעתים קרובות לתעד פוטנציאל שדה מקומי (LFPs) בו-זמנית מכמה מבני מוח. הקלטה מאזורי מוח רצויים מרובים דורשת עיצובים שונים של מיקרו-אלקטרוניקה, אך מערכי מיקרו-אלקטרוניקה הזמינים מסחרית לעתים קרובות אינם מציעים גמישות כזו. כאן, הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התכנון הפשוט של מערכי מיקרו-אלקטרוניקה מותאמים אישית כדי לתעד LFPs ממבנים מוחיים מרובים בו-זמנית בעומקים שונים. עבודה זו מתארת את הבנייה של המיקרו-אלקטרוניקה הדו-צדדית בקליפת המוח, הסטריאטלית, הגחונית והמיקרו-אלקטרוניקה הניגרלית כדוגמה. עקרון התכנון המתואר מציע גמישות, וניתן לשנות ולהתאים אישית את המיקרו-אלקטרוניקה כדי להקליט LFPs מכל מבנה על ידי חישוב קואורדינטות סטריאוטקסיות ושינוי מהיר של הבנייה בהתאם כדי להתמקד באזורי מוח שונים בעכברים הנעים בחופשיות או מרדימים. מכלול המיקרו-אלקטרוניקה דורש כלים ואספקה סטנדרטיים. מערכי מיקרו-אלקטרוניקה מותאמים אישית אלה מאפשרים לחוקרים לתכנן בקלות מערכי מיקרו-אלקטרודה בכל תצורה כדי לעקוב אחר הפעילות העצבית, ולספק הקלטות LFP ברזולוציה של אלפית השנייה.
Introduction
פוטנציאל שדה מקומי (LFPs) הוא הפוטנציאלים החשמליים שנרשמו מהחלל החוץ-תאי במוח. הם נוצרים על ידי חוסר איזון בריכוזי יונים מחוץ לנוירונים ומייצגים את הפעילות של אוכלוסייה קטנה ומקומית של נוירונים, מה שמאפשר לנטר במדויק את הפעילות של אזור מוח מסוים בהשוואה לרישומי EEG בקנה מידה מאקרו1. כאומדן, המיקרו-אלקטרוניקה של LFP המופרדים על ידי 1 מ"מ תואמים לשתי אוכלוסיות שונות לחלוטין של נוירונים. בעוד שאות EEG מסונן על ידי רקמת מוח, נוזל מוחי, גולגולת, שריר ועור, אות LFP הוא סמן אמין לפעילות עצבית מקומית1.
לעתים קרובות חוקרים צריכים להקליט בו-זמנית LFPs מכמה מבנים מוחיים, אך מערכי מיקרו-אלקטרוניקה הזמינים באופן מסחרי לעתים קרובות אינם מציעים גמישות כזו. כאן, הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרו-אלקטרוניקה הניתנת להתאמה אישית מלאה, הניתנת להתאמה אישית בקלות, כדי להקליט בו-זמנית LFPs מכל אזור מוח רצוי בעומקים שונים. למרות שנעשה שימוש נרחב ב-LFPs כדי לתעד את הפעילות העצבית של אזור מוח מסוים 2,3,4,5,5,6,7,8,9, העיצוב הנוכחי הניתן להתאמה אישית מאפשר הקלטת LFPs מכל אזורי מוח שטחיים או עמוקים מרובים 11,12 . ניתן גם לשנות את הפרוטוקול כדי לבנות כל מערך מיקרו-אלקטרוד רצוי על ידי קביעת קואורדינטות סטריאוטקסיות של אזורי המוח והרכבת המערך בהתאם. מיקרו-אלקטרוניקה אלה עם קצב דגימה של 10 קילוהרץ ועמידות של 60-70 kΩ (אורך 2 ס"מ) מאפשרים לנו להקליט LFPs בדיוק של אלפית השנייה. לאחר מכן ניתן להגביר את הנתונים על ידי מגבר בן 16 ערוצים, מסוננים (מעבר נמוך 1 הרץ, מעבר גבוה 5 קילוהרץ) ודיגיטציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
העבודה הנוכחית מאושרת על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת וירג'יניה. עכברי C57Bl/6 משני המינים (7-12 שבועות) שימשו לניסויים. בעלי החיים נשמרו על מחזור חשוך של 12 שעות/12 שעות והייתה להם גישה אד-ליביטום למזון ולמים.
1. בניית מיקרואלקטרודה
- כדי לבנות את המיקרו-אלקטרוניקה, השתמש בחוט ניקל-כרום מצופה דיאמל באורך 50 מיקרומטר (קוטר) המצופה בדיאמל (ראו טבלת חומרים). הדביקו קצה אחד של החוט בחלק האחורי של הרציף ועטפו את החוט שלוש פעמים סביב הידית הקרובה ביותר על הרציף (איור 1A,C).
הערה: פלטפורמה אקרילית עם שתי ידיות (2 x 5 אינץ ') שימשה כאן, אך ניתן להשתמש בכל פלטפורמה.- מתחו את החוט סביב הידית השנייה הרחוקה ביותר כדי ליצור שתי לולאות בין הידיות. עטוף את החוט שלוש פעמים נוספות סביב הידית הראשונה כדי לתקן את החוט במקומו ולהדביק את הקצה שוב בחלק האחורי של הפלטפורמה.
הערה: לאחר הפרדת החוטים (שלבים 1.2-1.3.1), חייבים להיות שני חוטים בכל צד (ארבעה חוטים בסך הכל, איור 1B).
- מתחו את החוט סביב הידית השנייה הרחוקה ביותר כדי ליצור שתי לולאות בין הידיות. עטוף את החוט שלוש פעמים נוספות סביב הידית הראשונה כדי לתקן את החוט במקומו ולהדביק את הקצה שוב בחלק האחורי של הפלטפורמה.
- הניחו את פסי המתח מתחת לחוטים כשהסרט עטוף סביבם (צד דביק כלפי מעלה) (איור 1C).
הערה: חתיכות אקריליות משולשות שימשו למוטות המתח, עם סרט עטוף סביבם (צד דביק בחוץ כדי לחבר את החוטים). הצד הדביק של הקלטת מחוץ למוטות המתח ישמור על החוטים במקומם כדי להתאים את המרחק ביניהם. מוטות המתח חייבים להיות במרחק של כ-2.5 ס"מ מהידיות, ואסור שהחוטים יהיו רופפים. - באמצעות מיקרוסקופ ומלקחיים עדינים, יוצרים מרווח של 3 מ"מ או 4.5 מ"מ בין החוטים (מרווח של 3 מ"מ בין החוטים כדי ליצור מיקרו-אלקטרוניקה של גרעין תלמי גחוני (Ctx) - גרעין תלמי גחוני (VL); מרווח של 4.5 מ"מ כדי ליצור מיקרו-אלקטרוניקה סטריאלית (Str) - nigral (SNR) (איור 1B).
- אם נעשה שימוש בהגדלה במיקרוסקופ, הקפד לחשב ולהתאים את ההבדל בהגדלה ואת המרחק בפועל בין החוטים.
הערה: אם מיקרו-אלקטרוניקה בנויה עבור מבנים אחרים מאלה המשמשים כאן, יש להתאים את המרחק בין החוטים למרחק הסטריאוטקסי בין המבנים. איור 2B מספק דוגמה לאופן שבו החוטים יתארגנו; לפיכך, הקואורדינטות הסטריאוטקסיות עבור מבנים אחרים חייבות להיות מותאמות.
- אם נעשה שימוש בהגדלה במיקרוסקופ, הקפד לחשב ולהתאים את ההבדל בהגדלה ואת המרחק בפועל בין החוטים.
- חותכים ארבע חתיכות פלסטיק קטנות (בעובי 0.5 מ"מ) כ-6 מ"מ (רוחב) x 3 מ"מ (גובה) (איור 1C).
הערה: ניתן להשתמש בכל חתיכות הפלסטיק כל עוד הן בעובי של 0.5 מ"מ; כאן נעשה שימוש בצינורות מרובעים שבהם נמכרו הפינים (סיכות, ראו טבלת חומרים). אם נעשה שימוש בעובי שונה, אנא הוסף יותר או פחות חתיכות פלסטיק שיתאימו לקואורדינטות הסטריאוטקסיות הנדרשות. - מרחו דבק (ראו טבלת חומרים) על הפלסטיק והניחו אותם על החוטים (איור 1C). מניחים חתיכות פלסטיק במרחק של כ-1.0 ס"מ מאמצע החוט, המרוחק 1.0 ס"מ ממוט המתח. הסר את עודף הסופרגלו עם צמר גפן.
- לאחר שהסופרגלו מתייבש, חותכים את החוטים באמצעות מספריים עדינים, לפי הסדר המצוין באיור 1C.
- חותכים ארבעה צינורות זכוכית בקוטר 7 מ"מ באמצעות ערכה זמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים) ומחדירים את חוטי האלקטרודה לצינורות הזכוכית כפי שמצוין באיור 2A.
- הכנס זוגות אלקטרודות VL ו- SNR לצינורות הזכוכית.
הערה: יש להחדיר רק את החוטים למבנים עמוקים לצינורות הזכוכית כדי לתמוך בהשתלה כירורגית. הקפידו לא להחדיר אלקטרודות קליפת המוח לצינור הזכוכית.
- הכנס זוגות אלקטרודות VL ו- SNR לצינורות הזכוכית.
- שים את הדבק בבסיס צינורות הזכוכית כדי לחבר אותם לפלסטיק. יש להמתין זמן מה עד שהדבק יתייבש.
- חותכים את צינורות הזכוכית והחוטים באמצעות אזמל כפי שמצוין בטבלה 1; ודא שאורכי המיקרו-אלקטרוניקה נכונים. אם המיקרו-אלקטרוניקה מכוונת למבנים שונים, התאם את מרחק החיתוך בהתאם לקואורדינטות הסטריאוטקסיות הנדרשות.
איור 1: סכמטית של מבנה המיקרו-אלקטרוניקה. (ב) הפער בין החוטים. (C) ארבע חתיכות פלסטיק מודבקות לחוטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| Ctx | סטר | VL | SNR | |
| AP (קדמי/אחורי) | 2.2 | 1.2 | -1.3 | -3.3 |
| ML (מדיאלי/לרוחב) | 1.8 | 1.5 | 1 | 1.5 |
| DV (גב/גחון) | 0.5 | 3.5 | 4 | 4.75 |
| אורך אלקטרודה | 4 | 4.75 | 5.25 | 6 |
טבלה 1: קואורדינטות וממדים של השתלה סטריאוטקסית של המיקרו-אלקטרוניקה.
2. הרכבה של מערך מיקרואלקטרודה
- השתמשו בדבק כדי לחבר פלסטיק בסדר הרצוי של אזורי המטרה. דוגמה לאלקטרודות קליפת המוח, התלמיות, הסטריטאליות והניגרליות מוצגת באיור 2B,C.
- מניחים את זוג האלקטרודות Ctx-VL עם הפנים כלפי מטה (בצד עם חוטי האלקטרודה צריכים לפנות כלפי מטה) ומחברים שתי חתיכות פלסטיק ריקות בגודל 6 מ"מ על 3 מ"מ מלמעלה עם דבק.
- על גבי שלוש פיסות הפלסטיק, הניחו את זוג האלקטרודות השני Ctx-VL כאשר האלקטרודות פונות כלפי מעלה (השתמשו במיקרוסקופ וודאו שאלקטרודות ה-VL מיושרות).
הערה: יישור של אלקטרודות דו-צדדיות (כאן, יישור אלקטרודות VL שמאל וימין) חיוני כדי להתמקד במבנים דו-צדדיים רצויים כראוי. - השתמשו בדבק כדי לחבר את אלקטרודות ה-SNR למעלה עם אלקטרודות ה-SNR במרחק של 2.0 מ"מ מאלקטרודות ה-VL ובמרחק של כ-5.0 מ"מ מהאלקטרודות בקליפת המוח (חוטי האלקטרודה של SNR צריכים לפנות כלפי מעלה).
- חזור על שלב 2.1.3. עבור הצד השני (חוטי האלקטרודה SNR צריכים להתמודד מחוץ למערך המיקרו-אלקטרוניקה).
- מרחו שרף אפוקסי סביב הפלסטיק כדי לקשור את האלקטרודות זו לזו. הימנעו מהנחת שרף אפוקסי על האלקטרודות.
- קח חוט עבה ועשה לולאה בקצה אחד. טבלו את הלולאה בתמיסת האפוקסי והניחו אותה על הפלסטיק, כדי לוודא שהחוט העבה שוכב שטוח (איור 2D) כך שבשלבים הבאים, חוט זה יוכל לשמש כידית. המתן עד שהאלקטרודות יתייבשו במלואן.
- חתכו את החוטים ל-2 ס"מ, כפי שמוצג באיור 2E.
איור 2: בנייה וממדים של מיקרואלקטרודות. (A) ארבעה זוגות של אלקטרודות שנוצרו לאחר שהחוטים נחתכו במספריים, כפי שמצוין באיור 1C (2 זוגות של אלקטרודות Ctx-VL ו-2 זוגות של אלקטרודות Str-SNR). החדירו אלקטרודות מבנה עמוק (VL ו-SNR) לתוך צינורות הזכוכית והדביקו את בסיסיהם לפלסטיק (נקודות אדומות). (B) מבט עליון: זוגות האלקטרודות מ-(A) מודבקים בערימה כדי ליצור את ליבת המיקרו-אלקטרוניקה. קווים אדומים מציינים קווי דבק. (C) מבט מהצד הקדמי של (B). (ד) החוט העבה היה מחובר למיקרו-אלקטרוניקה. (E) החוטים מקובצים כמפורט, והקצוות המבודדים נשרטים וחותכים ל-2 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
3. חיבור מיקרואלקטרודה לאוזניות
- קבץ את החוטים כפי שמצוין באיור 2E וגרד 1 מ"מ של הקצוות המבודדים עם אזמל.
- כופפו את האלקטרודות בקליפת המוח כפי שמוצג באיור 3A. הפרד את החוטים כפי שמוצג באיור 3B. באמצעות מלקחיים עדינים, צור לולאה בקצה של כל חוט (איור 3B).
- החזיקו אוזניות עם 10 פינים עם המוסטאט (ראו טבלת חומרים) והשתמשו בקצה העץ של צמר גפן כדי למרוח כמויות מינימליות של שטף על הפינים (איור 3C). הקפידו לא לשים שטף מחוץ לפינים כדי למנוע קצר חשמלי בין הפינים.
- באמצעות קצה העץ של ספוגית כותנה, להחיל שטף על לולאות החוט.
- הלחימו את לולאות החוטים לאוזניות בנות 10 הפינים, כפי שמוצג באיור 3C. לאחר ההלחמה, ייבשו את האוזניות כדי למנוע קצר חשמלי בין הפינים.
- קח חוט דק (0.005-0.008 אינץ ') עבור חוטי הייחוס וההארקה ופשט את הפלסטיק מקצה אחד. צור לולאה בקצה השני של החוט.
- הלחימו את הצד המופשט של חוטי הייחוס וההארקה לפינים המתאימים להם (איור 3A,C).
- כשהם אוחזים בחוט העבה (איור 2D), מורחים מלט קרניופלסטי סביב המיקרו-אלקטרוניקה, במיוחד במקום שבו החוטים מתחברים לפינים. הימנעו מלגעת בקצוות האלקטרודה הממשיים עם המלט.
- לאחר שהמלט מתייבש, שים שרף אפוקסי בבסיס צינורות הזכוכית, חוטי מיקרו-אלקטרוניקה סטריאליים וכל האלקטרודה. הימנעו מלגעת באלקטרודה הממשית המסתיימת בשרף אפוקסי. המתן עד שהאלקטרודות יתייבשו במלואן.
- האלקטרודות מוכנות. קודחים חורים בגולגולתו של העכבר (בהתאם לקואורדינטות הסטריאוטקסיות הנדרשות) באמצעות מקדחה דנטלית ומשתילים את האוזניות כפי שמוצג באיור 3D על ידי הורדת האוזניות עם מיקרו-אלקטרוניקה עם מיקרו-אלקטרוניקה הפונה אל הגולגולת והחורים המתאימים. ניתן לחבר את האוזנייה לזרוע הסטריאוטקסית לתמיכה במהלך ההשתלה.
איור 3: השתלת מיקרואלקטרודה. (A) האלקטרודות בקליפת המוח כפופות כפי שצוין. (B) החוטים מופרדים כדי ליצור לולאות בקצוות. (C) השטף (בנקודות האדומות) והחוטים הלולאתיים מולחמים לאוזניות של 10 פינים, ומבטיחים שכל חוט יעבור לפין המתאים לו. (D) האוזניות מושתלות להקלטת LFPs. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
4. סימון מיקום האלקטרודה לאחר הקלטות
- בסוף הקלטות ה- LFP, אשר את המיקום הנכון של האלקטרודות באזור המטרה על ידי הפעלת זרם בקצות האלקטרודה כדי ליצור נגע והמתנה של 30 דקות לפני ההדבקה של העכבר.
הערה: הגדרות נגעים כדי לאשר את המיקום של קצות האלקטרודה: פרץ יחיד, 40 μA, 0.75 ms פולס גל מרובע מונופסי, 50 הרץ, 30 שניות. - מרדימים את העכברים עם איזופלורן (עד שהעכבר נרדם) ומכניסים10 באופן טרנסקרדיאלי עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-0.1 M חיץ נתרן פוספט. חתכו את המוחות (בעובי של 40 מיקרומטר) על קריוסטאט (ראו טבלת חומרים) והכתימו ב-DAPI (0.02% ב-PBS). אשר את המיקום הנכון של האלקטרודות על ידי נוכחותם של נגעי קצה האלקטרודה כפי שמוצג באיור 4B,C.
הערה: יש ליישם את אחוז האיזופלורן בהתאם להנחיות המוסד הבודד.
5. מדידת התנגדות האלקטרודה
- מדוד את ההתנגדות של האלקטרודות ובדוק את המעגל הקצר בין האלקטרודות באמצעות אומטר רב טווח (ראה טבלת חומרים). הגדר את סולם ההתנגדות ב- R x 10,000, וציין כי סטיית יחידה במצביע מתאימה להתנגדות של 1 kΩ. אלקטרודות באורך 2 ס"מ צריכות להיות בעלות התנגדות של 60-70 kΩ.
- התאם אישית את האוזניות על-ידי לקיחת עשרה סיכות בודדות (ראה טבלת חומרים). הלחמה כל סיכה עם חוט נחושת דק ורב גדילי בכבל.
- לחץ על פינים המולחמים עם זנבות הכבל המתאימים להם לתוך שקע הזיווג הכפול בעל 10 פינים (שקעים תואמים). לחץ על התאם את הפינים הפתוחים של שקע ההזדווגות לאוזניות LFP. בדרך זו, לכל אלקטרודה LFP יש חוט כבל ייעודי בהרכבה.
- טבלו את הקצה של כל אלקטרודה LFP (שאת עמידותה יש למדוד) בתמיסת מלח NaCl של 0.9% (ריכוז NaCl בדם). חבר את קצה חוט הכבל המתאים לאלקטרודת LFP למסוף החיובי של האומטר.
- השתמש בחוט התנגדות נמוכה (̴100 Ω) עם צד אחד במים המלוחים ובצד השני כקצה הפתוח. חבר את הקצה הפתוח של החוט בעל ההתנגדות הנמוכה לקרקע של מצביע האומטר.
הערה: סידור זה משלים את המעגל ומבקש סטייה של מצביע ה-ohmmeter.
- השתמש בחוט התנגדות נמוכה (̴100 Ω) עם צד אחד במים המלוחים ובצד השני כקצה הפתוח. חבר את הקצה הפתוח של החוט בעל ההתנגדות הנמוכה לקרקע של מצביע האומטר.
- ודא שאין חיבור חשמלי בין שתי אלקטרודות כלשהן באוזניות. בדוק את הבידוד החשמלי של אלקטרודות LFP זוגיות (הארקה: כבל אחד מתאים לאלקטרודה אחת; חיובי: כבל אחר מתאים לאלקטרודה אחרת). השליכו את האלקטרודות אם נצפתה סטייה כלשהי במקרה זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעבודה זו, המיקרו-אלקטרוניקה של LFP שימשו למיפוי התפיסה שהתפשטה דרך הגרעינים הבסיסיים11. הקלטות LFP סימולטניות בוצעו מקליפת המוח הקדם-מוטורית הימנית (שם היה מוקד ההתקף) ומה-VL, הסטריאטום וה-SNR השמאליים (איור 4). תחילת ההתקף זוהתה כסטייה של עקבות המתח לפחות פי שניים מקו הבסיס (איור 4A, חץ אדום). תרשים ספקטרום ההספק11 מציג התפלגויות תדרים עבור ה-LFPs שנרשמו (איור 4A). ניתן להשוות בין חריגות של התחלת פרכוסים (פסים אדומים) בין כל מבנה בדיוק של אלפית השנייה (איור 4A). דופק זרם הופעל בסוף ההקלטות כדי לסמן ולאשר את המיקום של קצות האלקטרודה, ויצר נגע (איור 4B,C).
איור 4: הקלטות LFP מייצגות. (A) התקף נרשם מקליפת המוח הקדם-מוטורית הימנית ומ-VL, סטריאטום ו-SNR שמאליים באמצעות מיקרו-אלקטרוניקה של LFP עם ספקטרום ההספק המתאים. החץ האדום מציין את תחילת ההתקף. הפסים האופקיים האדומים מציינים עיכוב בהתפרצות ההתקף בכל מבנה. סכמת המוח מראה את מיקומם של המיקרו-אלקטרוניקה (נקודות אדומות). (ב,ג) המבנים נגעו לאחר ההקלטות כדי לסמן את מיקומם של קצות המיקרו-אלקטרוניקה ב-VL וב-SNR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מבחינה היסטורית, מערכי מיקרו-אלקטרוניקה שימשו באופן נרחב לתיעוד פעילות עצבית מאזור מסוים במוח שמעניין 2,3,4,5,6,6,7,8,9,13. עם זאת, עיצוב המיקרו-אלקטרוניקה הקל שלנו מאפשר הקלטה ממספר מבנים בו זמנית11,12. כאן, הבנייה של מיקרואלקטרודות קליפת המוח, תלמיות, סטריאליות וניגרליות מתוארות כדוגמה. חוקרים יכולים לשנות את תכנון המיקרואלקטרודה כך שיתאים לכל מבנה רצוי על ידי חישוב המרחקים הסטריאוטקסיים הדרושים והתאמת הבנייה בהתאם.
לדוגמה, שינינו בעבר את העיצוב של מערכי מיקרו-אלקטרודות אלה כדי לרשום LFPs בכיוון הלאמלרי והספטו-טמפוראלי בהיפוקמפוס12. חוט ריווח של 50 מיקרומטר הפריד בין אלקטרודות סמוכות כאשר ארבעה מיקרו-אלקטרוניקה נרשמו לאורך הלמינה ההיפוקמפוסית כדי למנוע זיהום צולב של האות. אף על פי שאלו לא היו הקלטות של יחידה אחת, כל אלקטרודה ייצגה קבוצה קטנה של נוירונים כפי שמעידה השונות של צורת גל ספייק כפונקציה של מרחק מגוף התא.
במהלך הבנייה, החדרת חוטי המיקרו-אלקטרוניקה התלמיים והניגריים לצינורות הזכוכית הייתה נחוצה כדי לספק יציבות במהלך ניתוח ההשתלה כדי להתמקד באותם מבנים עמוקים. היו שמונה מיקרואלקטרודות דו-צדדיות, שארבע מהן היו בעלות צינורות זכוכית (2 VL ו-2 SNR), שהיו גבול לפני שהגבירו את הלחץ התוך-גולגולתי והגבירו את התמותה. בדרך כלל, צינורות זכוכית נדרשים כאשר עומק ההחדרה הרצוי הוא לפחות 2 מ"מ.
כמו כן, היה צורך בפלסטיק בעובי 0.5 מ"מ, שהגביל את הפרדת המרחק המינימלית בין האלקטרודות ל-0.5 מ"מ, אך ניתן היה להשתמש בפלסטיק אחר. במקרה הנוכחי, פלסטיק הונח לאורך הציר הראשי של האוזניות. ניתן גם למקם פלסטיק על פני ציר האוזניות, כאשר למספר אלקטרודות יש קואורדינטות קדמיות-אחוריות זהות (AP) אך קואורדינטות מדיאליות-רוחביות (ML) שונות. שיטה זו מציעה מגוון רחב של תצורות אפשריות עבור אזורים ספציפיים במוח.
מספר הפינים באוזניות מגביל את מספר המיקרו-אלקטרוניקה. אוזניות המכילות 12 פינים מכסות את ההיקף הקדמי-אחורי של ראש עכבר בוגר לחלוטין. יש לבודד כל סיכה מהסיכות האחרות במהלך ההלחמה. היה צורך באומטר וב-0.9% מים מלוחים כדי לבדוק את הבידוד החשמלי עבור כל זוג של מסופי אלקטרודות. האוזניות בעלות 12 הפינים מגבילות את ההקלטה ל-10 אזורים (2 שמורות לקרקע ולהפניה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (RO1 NS120945, R37NS119012 עד JK) ומכון המוח UVA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier 16-Channel | A-M Systems | Model 3600 | Amplifier |
| Cranioplasty cement | Coltene | Perm Reeline/Repair Resin Type II Class I Shade - Clear | Cement to hold microelectrodes |
| Cryostat Microtome | Precisionary | CF-6100 | To slice brain |
| Diamel-coatednickel-chromium wire | Johnson Matthey Inc. | 50 µm | Microelectrode wire |
| Dremel | Dremel | 300 Series | To drill holes in mouse skull |
| Epoxy | CEC Corp | C-POXY 5 | Fast setting adhesive |
| Hemostat | Any | To hold the headset | |
| Forceps | Any | To hold microelectrodes | |
| Light microscope | Nikon | SMZ-10 | To see alignment |
| Ohmmeter | Any | To measurre resistance | |
| Pins (Headers and matching Sockets) | Mill-Max | Interconnects, 833 series, 2 mm grid gull wing surface mount headers and sockets | To attach microelectrodes to |
| Polymicro Tubing Kit | Neuralynx | ID 100 ± 04 µm, OD 164 ± 06 µm, coating thickness 12 µm | Glass tubes |
| Pulse Stimulator | A-M Systems | Model 2100 | To mark the microelectrode location at the end of the recordings |
| Scissors | Any | To cut microelectrodes | |
| Superglue | Gorilla | Adhesive | |
| Thick wire 0.008 in. – 0.011 in. | A-M Systems | 791900 | Tick wire to hold the microelectrode array |
| Thin wire 0.005 in. - 0.008 in. | A-M Systems | 791400 | Thin wire for reference and ground |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Receptive fields of single neurones in the cat's striate cortex. The Journal of Physiology. 148 (3), 574-591 (1959).
- O'Keefe, J. Place units in the hippocampus of the freely moving rat. Experimental Neurology. 51 (1), 78-109 (1976).
- Fyhn, M., Molden, S., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B. Spatial representation in the entorhinal cortex. Science. 305 (5688), 1258-1264 (2004).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7, 446-451 (2004).
- Buckmaster, P. S., Edward Dudek, F. In vivo intracellular analysis of granule cell axon reorganization in epileptic rats. Journal of Neurophysiology. 81 (2), 712-721 (1999).
- Driscoll, N., et al. Multimodal in vivo recording using transparent graphene microelectrodes illuminates spatiotemporal seizure dynamics at the microscale. Communications Biology. 4, 1-14 (2021).
- Roy, D. S., et al. Memory retrieval by activating engram cells in mouse models of early Alzheimer's disease. Nature. 531, 508-512 (2016).
- Igarashi, K. M., Lu, L., Colgin, L. L., Moser, M. B., Moser, E. I. Coordination of entorhinal-hippocampal ensemble activity during associative learning. Nature. 510, 143-147 (2014).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Brodovskaya, A., Shiono, S., Kapur, J. Activation of the basal ganglia and indirect pathway neurons during frontal lobe seizures. Brain. 144 (7), 2074-2091 (2021).
- Ren, X., Brodovskaya, A., Hudson, J. L., Kapur, J. Connectivity and neuronal synchrony during seizures. The Journal of Neuroscience. 41 (36), 7623-7635 (2021).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
