A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Den nuværende protokol beskriver konstruktionen af specialfremstillede mikroelektrodearrays til registrering af lokale feltpotentialer in vivo fra flere hjernestrukturer samtidigt.

Abstract

Forskere har ofte brug for at registrere lokale feltpotentialer (LMP’er) samtidigt fra flere hjernestrukturer. Optagelse fra flere ønskede hjerneområder kræver forskellige mikroelektrodedesign, men kommercielt tilgængelige mikroelektrodearrays tilbyder ofte ikke en sådan fleksibilitet. Her skitserer den nuværende protokol det enkle design af specialfremstillede mikroelektrodearrays til at optage LMP’er fra flere hjernestrukturer samtidigt på forskellige dybder. Dette arbejde beskriver konstruktionen af de bilaterale kortikale, striatale, ventrolaterale thalamiske og nigrale mikroelektroder som et eksempel. Det skitserede designprincip giver fleksibilitet, og mikroelektroderne kan modificeres og tilpasses til at optage LMP’er fra enhver struktur ved at beregne stereotaxiske koordinater og hurtigt ændre konstruktionen i overensstemmelse hermed for at målrette mod forskellige hjerneområder i enten frit bevægelige eller anæstetiserede mus. Mikroelektrodeenheden kræver standardværktøj og forsyninger. Disse brugerdefinerede mikroelektrodearrays giver efterforskere mulighed for nemt at designe mikroelektrodearrays i enhver konfiguration for at spore neuronal aktivitet, hvilket giver LFP-optagelser med millisekundopløsning.

Introduction

Lokale feltpotentialer (LMP’er) er de elektriske potentialer, der registreres fra det ekstracellulære rum i hjernen. De genereres af ionkoncentrationsubalancer uden for neuroner og repræsenterer aktiviteten af en lille, lokaliseret population af neuroner, hvilket gør det muligt præcist at overvåge aktiviteten af en bestemt hjerneregion sammenlignet med makroskala EEG-optagelserne¹. Som et skøn svarer LFP-mikroelektroderne adskilt af 1 mm til to helt forskellige populationer af neuroner. Mens EEG-signal filtreres af hjernevæv, cerebrospinalvæske, kranium, muskel og hud, er LFP-signal en pålidelig markør for lokal neuronal aktivitet¹.

Forskere har ofte brug for samtidig at registrere LMP’er fra flere hjernestrukturer, men kommercielt tilgængelige mikroelektrodearrays tilbyder ofte ikke en sådan fleksibilitet. Her beskriver den nuværende protokol fuldt tilpasselige, let konstruerede mikroelektroder til samtidig at optage LMP’er fra enhver ønsket hjerneregion på forskellige dybder. Selvom LMP’er i vid udstrækning er blevet brugt til at registrere neuronal aktivitet i en bestemt hjerneregion ^{2,3,4,5,6,7,8,9}, tillader det nuværende let tilpasselige design optagelse af LMP’er fra flere overfladiske eller dybe hjerneområder^11,12 . Protokollen kan også ændres til at konstruere ethvert ønsket mikroelektrodearray ved at bestemme stereotaxiske koordinater for hjerneområderne og samle arrayet i overensstemmelse hermed. Disse mikroelektroder med en samplingshastighed på 10 kHz og en modstand på 60-70 kΩ (2 cm længde) giver os mulighed for at optage LMP’er med millisekundpræcision. Dataene kan derefter forstærkes af en 16-kanals forstærker, filtreres (lavt pas 1 Hz, højt pass 5 kHz) og digitaliseres.

Protocol

Det nuværende arbejde er godkendt af University of Virginia Animal Care and Use Committee. C57Bl/6 mus af begge køn (7-12 uger) blev brugt til forsøgene. Dyrene blev opretholdt på en 12 timers lys/12 timers mørk cyklus og havde ad libitum adgang til mad og vand. 1. Mikroelektrode konstruktion For at konstruere mikroelektroderne skal du bruge 50 μm (diameter) diamelbelagt nikkel-kromtråd (se materialetabel). Tape den ene ende af ledningen på bagsiden af platformen, og vikl ledningen tre gange rundt om den nærmeste knap på platformen (figur 1A,C).BEMÆRK: En akrylplatform med to knapper (2 x 5 tommer) blev brugt her, men enhver platform kan bruges. Stræk ledningen rundt om den fjerneste anden knap for at lave to løkker mellem knapperne. Pak ledningen tre gange mere rundt om den første knap for at fastgøre ledningen på plads, og tape enden igen på bagsiden af platformen.BEMÆRK: Når ledningerne er adskilt (trin 1.2-1.3.1), skal der være to ledninger på hver side (fire ledninger i alt, figur 1B). Placer spændingsstængerne under ledningerne med båndet viklet rundt om dem (klæbrig side op) (figur 1C).BEMÆRK: Trekantede akrylstykker blev brugt til spændingsstængerne med tape viklet rundt om dem (klæbrig side udenfor for at fastgøre ledningerne). Den klæbrige side af båndet uden for spændingsstængerne holder ledningerne på plads for at justere afstanden mellem dem. Spændestængerne skal være ~2,5 cm væk fra knopperne, og ledningerne må ikke være løse. Brug et mikroskop og fine tang til at lave enten et mellemrum på 3 mm eller 4,5 mm mellem ledningerne (3 mm mellemrum mellem ledningerne for at fremstille kortikale (Ctx) – ventrolaterale thalaminkerne (VL) mikroelektroder; 4,5 mm mellemrum for at fremstille striatale (Str) – nigrale (SNR) mikroelektroder) (figur 1B). Hvis der anvendes forstørrelse på mikroskopet, skal du sørge for at beregne og justere for forskellen i forstørrelse og den faktiske afstand mellem ledningerne.BEMÆRK: Hvis mikroelektroder er konstrueret til andre strukturer end dem, der anvendes her, skal afstanden mellem ledningerne justeres til den stereotaxiske afstand mellem strukturerne. Figur 2B giver et eksempel på, hvordan ledningerne vil blive organiseret; Derfor skal de stereotaksiske koordinater for andre strukturer justeres. Skær fire små stykker plast (0,5 mm tykt) ~ 6 mm (bredde) x 3 mm (højde) (figur 1C).BEMÆRK: Eventuelle plaststykker kan bruges, så længe de er 0,5 mm tykke; her blev der brugt firkantede slanger, hvor stifterne blev solgt (Pins, se Tabel over materialer). Hvis der anvendes en anden tykkelse, skal du tilføje flere eller færre stykker plast, så de passer til de krævede stereotaxiske koordinater. Påfør lim (se Materialetabel) på plasten og læg dem på ledningerne (figur 1C). Placer plaststykker ~ 1,0 cm væk fra midten af ledningen, som er 1,0 cm væk fra spændingsstangen. Fjern overskuddet af superlim med en vatpind. Når superlimet tørrer, skal du klippe ledningerne ved hjælp af en fin saks i den rækkefølge, der er angivet i figur 1C. Skær fire 7 mm glasrør ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt (se materialetabellen), og indsæt elektrodetrådene i glasrørene som angivet i figur 2A. Indsæt VL- og SNR-elektrodepar i glasrørene.BEMÆRK: Kun ledningerne til dybe strukturer skal indsættes i glasrørene for at understøtte kirurgisk implantation. Sørg for ikke at indsætte kortikale elektroder i glasrøret. Sæt limen i bunden af glasrørene for at forbinde dem med plasten. Vent lidt tid, indtil limen tørrer. Skær glasrørene og ledningerne ved hjælp af en skalpel som angivet i tabel 1; Sørg for, at mikroelektrodernes længder er korrekte. Hvis mikroelektroderne er rettet mod forskellige strukturer, skal du justere skæreafstanden i henhold til de krævede stereotaxiske koordinater. Figur 1: Skematisk oversigt over mikroelektrodekonstruktionen. (A) Opsætning af ledninger på platformen med spændingsstænger under ledningerne. (B) Afstanden mellem ledningerne. (C) Fire stykker plast limes på ledningerne. Klik her for at se en større version af denne figur. Ctx Str VL SNR AP (Forreste/Bageste) 2.2 1.2 -1.3 -3.3 ML (medial/lateral) 1.8 1.5 1 1.5 DV (Dorsal/Ventral) 0.5 3.5 4 4.75 Elektrode længde 4 4.75 5.25 6 Tabel 1: Stereotaksiske implantationskoordinater og dimensioner af mikroelektroderne. 2. Samling af mikroelektrodearray Brug limen til at fastgøre plast i den ønskede rækkefølge af målregioner. Et eksempel på kortikale, thalamiske, striatale og nigrale elektroder er vist i figur 2B,C. Placer Ctx-VL elektrodepar med forsiden nedad (siden med elektrodeledninger skal vende nedad) og tilslut to 6 mm x 3 mm tomme stykker plast ovenpå med lim. Oven på de tre stykker plast skal du placere det andet Ctx-VL-elektrodepar med elektroderne vendt opad (brug et mikroskop og sørg for, at VL-elektroderne er justeret).BEMÆRK: Justering af bilaterale elektroder (her justering af venstre og højre VL-elektroder) er afgørende for at målrette de ønskede bilaterale strukturer korrekt. Brug limen til at fastgøre SNR-elektroderne ovenpå med SNR-elektroderne 2,0 mm væk fra VL-elektroderne og ~ 5,0 mm væk fra de kortikale elektroder (SNR-elektrodetrådene skal vende opad). Gentag trin 2.1.3. til den anden side (SNR-elektrodeledningerne skal vende uden for mikroelektrodearrayet). Påfør epoxyharpiks omkring plasten for at binde elektroderne sammen. Undgå at lægge epoxyharpiks på elektroderne. Tag en tyk ledning og lav en løkke i den ene ende. Dyp løkken i epoxyopløsningen, og læg den på plasten, og sørg for, at den tykke ledning ligger fladt (figur 2D), så denne ledning i de næste trin kan bruges som håndtag. Vent, indtil elektroderne er helt tørre. Skær ledningerne til 2 cm, som vist i figur 2E. Figur 2: Mikroelektrodekonstruktion og dimensioner. (A) Fire par elektroder dannet efter at ledningerne blev skåret med en saks, som angivet i figur 1C (2 par Ctx-VL-elektroder og 2 par Str-SNR-elektroder). Indsæt dybe strukturelektroder (VL og SNR) i glasrørene og lim deres baser på plast (røde prikker). (B) Topvisning: Elektrodeparrene fra (A) limes i en stak for at skabe mikroelektrodekernen. Røde linjer angiver limlinjer. (C) Set forfra af (B). (D) Den tykke ledning blev fastgjort til mikroelektroderne. (E) Ledningerne er grupperet som angivet, og de isolerede ender skrabes af og skæres i 2 cm. Klik her for at se en større version af denne figur. 3. Mikroelektrodeforbindelse til headsettet Ledningerne grupperes som angivet i figur 2E , og 1 mm af de isolerede ender skrabes væk med en skalpel. Bøj de kortikale elektroder som vist i figur 3A. Adskil ledningerne som vist i figur 3B. Brug fine tang til at lave en løkke i enden af hver ledning (figur 3B). Hold et 10-polet headset med hæmostat (se Materialetabel), og brug trædenden af en vatpind til at påføre minimale mængder flux på stifterne (figur 3C). Sørg for ikke at lægge flux uden for stifterne for at forhindre kortslutning mellem stifterne. Brug trædenden af en vatpind til at påføre flux på trådsløjferne. Lodde trådsløjferne til det 10-benede headset som vist i figur 3C. Efter lodning tørres headsettet for at forhindre kortslutning mellem stifterne. Tag en tynd ledning (0,005-0,008 tommer) til referencen og jordledningerne og fjern plasten fra den ene ende. Lav en løkke i den anden ende af ledningen. Lodde den strippede side af referencen og jordledningerne til deres respektive stifter (figur 3A,C). Hold på den tykke ledning (figur 2D), påfør kranioplastikcement omkring mikroelektroderne, især hvor ledningerne forbinder til stifterne. Undgå at røre ved de faktiske elektrodeender med cementen. Når cementen tørrer, sættes epoxyharpiks i bunden af glasrørene, striatale mikroelektrodetråde og hele elektroden. Undgå at røre ved de faktiske elektrodeender med epoxyharpiks. Vent, indtil elektroderne er helt tørre. Elektroderne er klar. Bor huller i musens kranium (i henhold til de krævede stereotaksiske koordinater) ved hjælp af en tandboremaskine og implanter headsettet som vist i figur 3D ved at sænke headsettet med mikroelektroder mod kraniet og de relevante huller. Headsettet kan fastgøres til den stereotaxiske arm for støtte under implantationen. Figur 3: Mikroelektrodeimplantation. (A) De kortikale elektroder bøjes som angivet. (B) Ledningerne adskilles for at lave sløjfer i enderne. (C) Fluxen (ved de røde prikker) og sløjfede ledninger loddes til det 10-benede headset, hvilket sikrer, at hver ledning går til sin passende stift. (D) Headsettet er implanteret til at optage LMP’er. Klik her for at se en større version af denne figur. 4. Markering af elektrodeplacering efter optagelser I slutningen af LFP-optagelserne skal du bekræfte elektrodernes korrekte position i målområdet ved at anvende en strøm ved elektrodespidserne for at lave en læsion og vente i 30 minutter, før musen perfuseres.BEMÆRK: Læsionsindstillinger for at bekræfte placeringen af elektrodespidserne: Enkelt burst, 40 μA, 0,75 ms monofasisk firkantet bølgepuls, 50 Hz, 30 s. Anæstesi musene med isofluran (indtil musen faldt i søvn) og perfus10 transkardialt med 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M natriumphosphatbuffer. Sektion hjernen (40 μm tyk) på en kryostat (se Tabel over materialer) og plet med DAPI (0,02% i PBS). Elektrodernes korrekte placering ved tilstedeværelsen af elektrodespidslæsionerne som vist i figur 4B,C.BEMÆRK: Procentdelen af isofluran skal anvendes efter det enkelte instituts retningslinjer. 5. Måling af elektrodemodstanden Mål elektrodernes modstand, og kontroller kortslutningen mellem elektroderne ved hjælp af et ohmmeter med flere områder (se Materialetabel). Indstil modstandsskalaen til R x 10.000, hvilket indikerer, at en enhedsafbøjning i markøren svarer til 1 kΩ modstand. 2 cm lange elektroder skal have 60-70 kΩ modstand. Tilpas headsettet ved at tage ti individuelle stifter (se Tabel over materialer). Lodde hver stift med en tynd, flerstrenget kobbertråd i et kabel. Tryk og monter loddestifterne med deres tilsvarende kabelhaler i den 10-benede dobbeltrækkede parringsstik (matchende stikkontakter). Tryk og monter de åbne stifter på parringsstikket i LFP-headsettet. På denne måde har hver LFP-elektrode en udpeget kabelledning i samlingen. Dyp spidsen af hver LFP-elektrode (hvis modstand skal måles) i 0,9% NaCl saltopløsning (NaCl-koncentration i blodet). Tilslut kabeltrådenden, der svarer til LFP-elektroden, til ohmmeterets positive terminal. Brug en ledning med lav modstand ( ̴100 Ω) med den ene side i saltvandet og den anden side som den åbne ende. Tilslut den åbne ende af ledningen med lav modstand til jorden på ohmmetermarkøren.BEMÆRK: Dette arrangement fuldender kredsløbet og beder om en afbøjning af ohmmetermarkøren. Sørg for, at der ikke er nogen elektrisk forbindelse mellem to elektroder på headsettet. Kontroller den elektriske isolering af parvise LFP-elektroder (jord: et kabel svarer til en elektrode; positivt: et andet kabel svarer til en anden elektrode). Kassér elektroderne, hvis der observeres afbøjning i dette tilfælde.

Representative Results

I dette arbejde blev LFP-mikroelektroderne brugt til at kortlægge anfaldet spredt gennem de basale ganglier11. Samtidige LFP-optagelser blev udført fra højre præmotoriske cortex (hvor anfaldsfokus var) og venstre VL, striatum og SNR (figur 4). Anfaldsstart blev identificeret som afbøjning af spændingssporet mindst to gange basislinjen (figur 4A, rød pil). Effektspektrumplottet11 viser frekvensfordelinger for…

Discussion

Historisk set er mikroelektrodearrays blevet brugt i vid udstrækning til at registrere neuronal aktivitet fra en bestemt hjerneregion af interesse 2,3,4,5,6,7,8,9,13. Vores nemme mikroelektrodedesign tillader dog optagels…

Materials

Amplifier 16-Channel	A-M Systems	Model 3600	Amplifier
Cranioplasty cement	Coltene	Perm Reeline/Repair Resin Type II Class I Shade – Clear	Cement to hold microelectrodes
Cryostat Microtome	Precisionary	CF-6100	To slice brain
Diamel-coatednickel-chromium wire	Johnson Matthey Inc.	50 µm	Microelectrode wire
Dremel	Dremel	300 Series	To drill holes in mouse skull
Epoxy	CEC Corp	C-POXY 5	Fast setting adhesive
Hemostat	Any		To hold the headset
Forceps	Any		To hold microelectrodes
Light microscope	Nikon	SMZ-10	To see alignment
Ohmmeter	Any		To measurre resistance
Pins (Headers and matching Sockets)	Mill-Max	Interconnects, 833 series, 2 mm grid gull wing surface mount headers and sockets	To attach microelectrodes to
Polymicro Tubing Kit	Neuralynx	ID 100 ± 04 µm, OD 164 ± 06 µm, coating thickness 12 µm	Glass tubes
Pulse Stimulator	A-M Systems	Model 2100	To mark the microelectrode location at the end of the recordings
Scissors	Any		To cut microelectrodes
Superglue	Gorilla		Adhesive
Thick wire 0.008 in. – 0.011 in.	A-M Systems	791900	Tick wire to hold the microelectrode array
Thin wire 0.005 in. – 0.008 in.	A-M Systems	791400	Thin wire for reference and ground