Summary
Den nåværende protokollen beskriver byggingen av skreddersydde mikroelektrode arrays for å registrere lokale feltpotensialer in vivo fra flere hjernestrukturer samtidig.
Abstract
Forskere må ofte registrere lokale feltpotensialer (ALFPer) samtidig fra flere hjernestrukturer. Opptak fra flere ønskede hjerneregioner krever forskjellige mikroelektrode design, men kommersielt tilgjengelige mikroelektrode arrays tilbyr ofte ikke slik fleksibilitet. Her skisserer den nåværende protokollen den enkle utformingen av skreddersydde mikroelektrode arrays for å registrere AKU-er fra flere hjernestrukturer samtidig på forskjellige dybder. Dette arbeidet beskriver byggingen av de bilaterale kortikale, striatale, ventrolaterale thalamic og nigrale mikroelektroder som et eksempel. Det skisserte designprinsippet gir fleksibilitet, og mikroelektrodene kan modifiseres og tilpasses for å registrere AKU-er fra hvilken som helst struktur ved å beregne stereotaksiske koordinater og raskt endre konstruksjonen tilsvarende for å målrette forskjellige hjerneregioner i enten fritt bevegelige eller bedøvede mus. Mikroelektrodeenheten krever standardverktøy og -forsyninger. Disse tilpassede mikroelektrode-arrayene gjør det enkelt for undersøkere å designe mikroelektrode-arrayer i enhver konfigurasjon for å spore nevronaktivitet, og gir LFP-opptak med millisekunders oppløsning.
Introduction
Lokale feltpotensialer (AKU-er) er de elektriske potensialene som registreres fra det ekstracellulære rommet i hjernen. De genereres av ionkonsentrasjonsubalanser utenfor nevroner og representerer aktiviteten til en liten, lokalisert befolkning av nevroner, slik at de nøyaktig kan overvåke aktiviteten til en bestemt hjerneregion sammenlignet med makroskala EEG-registreringene1. Som et estimat tilsvarer LFP-mikroelektrodene atskilt med 1 mm to helt forskjellige populasjoner av nevroner. Mens EEG-signal filtreres etter hjernevev, cerebrospinalvæske, hodeskalle, muskel og hud, er LFP-signal en pålitelig markør for lokal nevronaktivitet1.
Forskere må ofte samtidig registrere AKU-er fra flere hjernestrukturer, men kommersielt tilgjengelige mikroelektrode arrayer tilbyr ofte ikke slik fleksibilitet. Her beskriver den nåværende protokollen fullt tilpassbare, lett konstruerte mikroelektroder for samtidig å registrere AKU-er fra ønsket hjerneregion på forskjellige dybder. Selv om AKU-er i stor grad har blitt brukt til å registrere nevronaktiviteten til en bestemt hjerneregion 2,3,4,5,6,7,8,9, tillater den nåværende enkle tilpassbare designen opptak av AKU-er fra flere overfladiske eller dype hjerneregioner 11,12 . Protokollen kan også modifiseres for å konstruere ønsket mikroelektroderingsmatrise ved å bestemme stereotaksiske koordinater i hjerneregionene og montere matrisen tilsvarende. Disse mikroelektrodene med en samplingsfrekvens på 10 kHz og 60-70 kΩ motstand (2 cm lengde) lar oss registrere AKU-er med millisekundpresisjon. Dataene kan deretter forsterkes av en 16-kanals forsterker, filtreres (lavpass 1 Hz, høy pass 5 kHz) og digitaliseres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det nåværende arbeidet er godkjent av University of Virginia Animal Care and Use Committee. C57Bl/6 mus av begge kjønn (7-12 uker) ble brukt til forsøkene. Dyrene ble opprettholdt på en 12 timers lys/12 timers mørk syklus og hadde ad libitum tilgang til mat og vann.
1. Microelectrode konstruksjon
- For å konstruere mikroelektrodene, bruk 50 μm (diameter) diamelbelagt nikkel-kromtråd (se Materialtabell). Tape den ene enden av ledningen på baksiden av plattformen og vikle ledningen tre ganger rundt nærmeste knott på plattformen (figur 1A,C).
MERK: En akrylplattform med to knotter (2 x 5 tommer) ble brukt her, men enhver plattform kan brukes.- Strekk ledningen rundt den lengste andre knotten for å lage to løkker mellom knottene. Vikle ledningen tre ganger til rundt den første knotten for å feste ledningen på plass og tape enden igjen på baksiden av plattformen.
MERK: Etter at ledningene er separert (trinn 1.2-1.3.1), må det være to ledninger på hver side (totalt fire ledninger, figur 1B).
- Strekk ledningen rundt den lengste andre knotten for å lage to løkker mellom knottene. Vikle ledningen tre ganger til rundt den første knotten for å feste ledningen på plass og tape enden igjen på baksiden av plattformen.
- Plasser strekkstengene under ledningene med båndet viklet rundt dem (klebrig side opp) (figur 1C).
MERK: Trekantede akrylstykker ble brukt til spenningsstengene, med tape viklet rundt dem (klebrig side utenfor for å feste ledningene). Den klissete siden av båndet utenfor strekkstengene vil holde ledningene på plass for å justere avstanden mellom dem. Strekkstengene må være ~2,5 cm fra knottene, og ledningene må ikke være løse. - Bruk et mikroskop og fine tanger, lag enten et 3 mm eller 4,5 mm mellomrom mellom ledningene (3 mm mellomrom mellom ledningene for å lage kortikale (Ctx) - ventrolaterale thalamic nucleus (VL) mikroelektroder; 4,5 mm mellomrom for å lage striatal (Str) - nigral (SNR) mikroelektroder) (Figur 1B).
- Hvis forstørrelse brukes på mikroskopet, må du sørge for å beregne og justere for forskjellen i forstørrelse og den faktiske avstanden mellom ledningene.
MERK: Hvis mikroelektroder er konstruert for andre strukturer enn de som brukes her, må avstanden mellom ledningene justeres til stereotaksisk avstand mellom strukturene. Figur 2B gir et eksempel på hvordan ledningene vil bli organisert; Derfor må de stereotaksiske koordinatene for andre strukturer justeres.
- Hvis forstørrelse brukes på mikroskopet, må du sørge for å beregne og justere for forskjellen i forstørrelse og den faktiske avstanden mellom ledningene.
- Klipp fire små plastbiter (0,5 mm tykke) ~6 mm (bredde) x 3 mm (høyde) (figur 1C).
MERK: Alle plastbiter kan brukes så lenge de er 0,5 mm tykke; her ble det brukt firkantede rør der pinnene ble solgt (Pins, se Tabell over materialer). Hvis en annen tykkelse brukes, vennligst tilsett flere eller færre plastbiter for å passe til de nødvendige stereotakaxiske koordinatene. - Påfør lim (se Materialbord) på plasten og legg dem på ledningene (figur 1C). Plasser plastbiter ~1,0 cm fra midten av ledningen, som er 1,0 cm fra strammestangen. Fjern overskuddet av superlim med en bomullspinne.
- Etter at superlimet tørker, kutt ledningene med fin saks, i den rekkefølgen som er angitt i figur 1C.
- Klipp fire glassrør på 7 mm med et kommersielt tilgjengelig sett (se Materialtabell) og sett elektrodeledningene inn i glassrørene som angitt i figur 2A.
- Sett inn VL- og SNR-elektrodepar i glassrørene.
MERK: Bare ledningene for dype strukturer må settes inn i glassrørene for å støtte kirurgisk implantasjon. Pass på at du ikke setter kortikale elektroder inn i glassrøret.
- Sett inn VL- og SNR-elektrodepar i glassrørene.
- Sett limet på bunnen av glassrørene for å koble dem til plasten. Vent litt til limet tørker.
- Klipp glassrørene og ledningene med en skalpell som angitt i tabell 1; påse at lengdene på mikroelektrodene er riktige. Hvis mikroelektrodene er rettet mot forskjellige strukturer, juster skjæreavstanden i henhold til de nødvendige stereotakaxiske koordinatene.
Figur 1: Skjematisk for mikroelektrodkonstruksjonen. (A) Oppsett av ledninger på plattformen med strammestenger under ledningene. (B) Avstanden mellom ledningene. (C) Fire plastbiter limes til ledningene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Ctx | Str | VL | SNR | |
| AP (fremre/bakre) | 2.2 | 1.2 | -1.3 | -3.3 |
| ML (medial/lateral) | 1.8 | 1.5 | 1 | 1.5 |
| DV (Dorsal/Ventral) | 0.5 | 3.5 | 4 | 4.75 |
| Elektrode lengde | 4 | 4.75 | 5.25 | 6 |
Tabell 1: Stereotoksiske implantasjonskoordinater og dimensjoner på mikroelektrodene.
2. Mikroelektrode array-montering
- Bruk limet til å feste plast i ønsket rekkefølge av målområder. Et eksempel for kortikale, thalamic, striatal og nigrale elektroder er vist i figur 2B,C.
- Plasser Ctx-VL elektrodeparet med forsiden ned (side med elektrodeledninger må vende ned) og koble to 6 mm x 3 mm tomme plastbiter på toppen med lim.
- På toppen av de tre plastbitene plasserer du det andre Ctx-VL-elektrodeparet med elektrodene vendt oppover (bruk et mikroskop og sørg for at VL-elektrodene er justert).
MERK: Justering av bilaterale elektroder (her justering av venstre og høyre VL-elektroder) er avgjørende for å målrette ønsket bilaterale strukturer på riktig måte. - Bruk limet til å feste SNR-elektrodene på toppen med SNR-elektrodene 2,0 mm fra VL-elektrodene og ~5,0 mm fra kortikale elektroder (SNR-elektrodeledningene må vende oppover).
- Gjenta trinn 2.1.3. for den andre siden (SNR-elektrodeledningene må vende ut av mikroelektrode arrayet).
- Påfør epoksyharpiks rundt plasten for å binde elektrodene sammen. Unngå å sette epoksyharpiks på elektrodene.
- Ta en tykk ledning og lag en løkke i den ene enden. Dypp løkken i epoksyløsningen og legg den på plasten, og sørg for at den tykke ledningen ligger flatt (figur 2D) slik at denne ledningen for de neste trinnene kan brukes som et håndtak. Vent til elektrodene er helt tørre.
- Kapp ledningene til 2 cm, som vist i figur 2E.
Figur 2: Mikroelektrodkonstruksjon og dimensjoner. (A) Fire par elektroder dannet etter at ledningene ble kuttet med saks, som angitt i figur 1C (2 par Ctx-VL elektroder og 2 par Str-SNR-elektroder). Sett inn dype strukturelektroder (VL og SNR) i glassrørene og lim basene til plast (røde prikker). (B) Toppvisning: Elektrodeparene fra (A) limes i en stabel for å skape mikroelektrodkjernen. Røde linjer angir limlinjer. (C) Sett forfra på (B). (D) Den tykke ledningen ble festet til mikroelektrodene. (E) Ledningene er gruppert som angitt, og de isolerte endene skrapes av og kuttes i 2 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Mikroelektrode tilkobling til headsettet
- Grupper ledningene som angitt i figur 2E , og skrap bort 1 mm av de isolerte endene med en skalpell.
- Bøy de kortikale elektrodene som vist i figur 3A. Skill ledningene som vist i figur 3B. Bruk fine tang, lag en løkke på enden av hver ledning (figur 3B).
- Hold et 10-pinners hodesett med hemostat (se Materialbord) og bruk treenden av en bomullspinne til å påføre minimale mengder fluss på pinnene (figur 3C). Pass på at du ikke setter fluss utenfor pinnene for å forhindre kortslutning mellom pinnene.
- Bruk treenden av en bomullspinne, bruk flux på trådløkkene.
- Lodd trådløkkene til det 10-pinners hodesettet som vist i figur 3C. Etter lodding, tørk headsettet for å forhindre kortslutning mellom pinnene.
- Ta en tynn ledning (0,005-0,008 tommer) for referanse- og jordledninger og strip av plasten fra den ene enden. Lag en løkke i den andre enden av ledningen.
- Lodd den stripete siden av referansen og jordledningene til de respektive pinnene (figur 3A,C).
- Hold på den tykke ledningen (figur 2D), påfør kranioplastisk sement rundt mikroelektrodene, spesielt der ledningene kobles til pinnene. Unngå å berøre de faktiske elektrodeendene med sementen.
- Etter at sementen tørker, legg epoksyharpiks ved foten av glassrørene, striatal mikroelektrode ledninger og hele elektroden. Unngå å berøre de faktiske elektrodeendene med epoksyharpiks. Vent til elektrodene er helt tørre.
- Elektrodene er klare. Bor hull i musens hodeskalle (i henhold til de nødvendige stereotaksiske koordinatene) ved hjelp av en tannbor og implanter headsettet som vist i figur 3D ved å senke headsettet med mikroelektroder vendt mot skallen og de riktige hullene. Headsettet kan festes til den stereotaktiske armen for støtte under implantasjonen.
Figur 3: Mikroelektrodimplantasjon. (A) De kortikale elektrodene bøyes som indikert. (B) Ledningene er separert for å lage løkker i endene. (C) Fluxen (ved de røde prikkene) og sløyfetrådene loddes til det 10-pinners hodesettet, noe som sikrer at hver ledning går til riktig pinne. (D) Headsettet er implantert for å ta opp AKU-er . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Merking av elektrodeplassering etter opptak
- På slutten av LFP-opptakene bekrefter du riktig posisjon av elektrodene i målområdet ved å bruke en strøm på elektrodespissene for å lage en lesjon og vente i 30 minutter før du parfymerer musen.
MERK: Lesjonsinnstillinger for å bekrefte plasseringen av elektrodespissene: Enkelt utbrudd, 40 μA, 0,75 ms monofasisk kvadratisk bølgepuls, 50 Hz, 30 s. - Bedøv musene med isofluran (til musen sovner) og perfuse10 transkardialt med 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M natriumfosfatbuffer. Seksjon hjernene (40 μm tykke) på en kryostat (se Materialtabell) og flekk med DAPI (0,02% i PBS). Bekreft riktig plassering av elektrodene ved tilstedeværelse av elektrodespisslesjonene som vist i figur 4B,C.
MERK: Prosentandelen av isofluranen må brukes i henhold til den enkelte institusjons retningslinjer.
5. Måling av elektrodemotstanden
- Mål elektrodens motstand og kontroller kortslutningen mellom elektrodene ved hjelp av et multi-range ohmmeter (se Materialtabell). Still inn motstandsskalaen på R x 10 000, noe som indikerer at en enhetsavbøyning i pekeren tilsvarer 1 kΩ motstand. 2 cm lange elektroder må ha 60-70 kΩ motstand.
- Tilpass headsettet ved å ta ti individuelle pinner (se Materialtabell). Lodde hver pinne med en tynn, multistrenget kobbertråd i en kabel.
- Trykk på loddepinnene med de tilsvarende kabelhalene i den 10-pinners torads parringskontakten (matchende stikkontakter). Trykk på de åpne pinnene på paringskontakten i LFP-hodesettet. På denne måten har hver LFP-elektrode en utpekt kabelledning i enheten.
- Dypp spissen av hver LFP-elektrode (hvis motstand skal måles) i 0,9% NaCl saltoppløsning (NaCl konsentrasjon i blodet). Koble kabeltrådenden som tilsvarer LFP-elektroden, til plusspolen på ohmmeteret.
- Bruk en lav motstandsledning (̴ 100 Ω) med den ene siden i saltvann og den andre siden som den åpne enden. Koble den åpne enden av ledningen med lav motstand til bakken på ohmmeterpekeren.
MERK: Dette arrangementet fullfører kretsen og ber om en avbøyning av ohmmeterpekeren.
- Bruk en lav motstandsledning (̴ 100 Ω) med den ene siden i saltvann og den andre siden som den åpne enden. Koble den åpne enden av ledningen med lav motstand til bakken på ohmmeterpekeren.
- Kontroller at det ikke er noen elektrisk forbindelse mellom to elektroder på headsettet. Kontroller den elektriske isolasjonen av parvise LFP-elektroder (jording: en kabel tilsvarer en elektrode; positiv: en annen kabel tilsvarer en annen elektrode). Kast elektrodene hvis det i dette tilfellet observeres avbøyning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette arbeidet ble LFP-mikroelektrodene brukt til å kartlegge anfallet spredt gjennom basal ganglia11. Samtidige LFP-opptak ble utført fra høyre premotorisk cortex (hvor anfallsfokuset var) og venstre VL, striatum og SNR (figur 4). Anfallsstart ble identifisert som avbøyning av spenningssporet minst dobbelt så stor grunnlinje (figur 4A, rød pil). Kraftspektrumplottet11 viser frekvensfordelinger for de registrerte AKU-ene (figur 4A). Anfallsforsinkelser (røde stolper) kan sammenlignes mellom hver struktur med millisekundpresisjon (figur 4A). En strømpuls ble påført på slutten av opptakene for å markere og bekrefte plasseringen av elektrodespissene, og dannet en lesjon (figur 4B,C).
Figur 4: Representative LFP-opptak. (A) Et anfall ble registrert fra høyre premotorisk cortex og venstre VL, striatum og SNR ved hjelp av LFP mikroelektroder med tilsvarende kraftspekter. Den røde pilen indikerer anfallsde begynnelse. De røde horisontale stolpene indikerer anfallsforsinkelse i hver struktur. Hjerneskjemaet viser posisjonen til mikroelektrodene (røde prikker). (B,C) Strukturene ble lesjonert etter opptakene for å markere plasseringen av mikroelektrodespissene i VL og SNR. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historisk har mikroelektrode arrayer blitt mye brukt til å registrere nevronaktivitet fra en bestemt hjerneregion av interesse 2,3,4,5,6,7,8,9,13. Imidlertid tillater vår enkle mikroelektrode design opptak fra flere strukturer samtidig11,12. Her beskrives byggingen av kortikale, thalamic, striatal og nigral mikroelektroder som et eksempel. Etterforskere kan modifisere mikroelektrodedesignen slik at den passer til ønsket struktur ved å beregne de nødvendige stereotaksiske avstandene og justere konstruksjonen deretter.
For eksempel har vi tidligere endret utformingen av disse mikroelektrode matrisene for å registrere ALFPer i lamellar og septotemporal retning i hippocampus12. En 50 μm avstandstråd separerte tilstøtende elektroder som fire mikroelektroder registrert langs hippocampal lamina for å forhindre krysskontaminering av signalet. Selv om det ikke var enkeltenhetsopptak, representerte hver elektrode en liten gruppe nevroner som indikert av variasjonen av en spike waveform som en funksjon av avstand fra cellekroppen.
Under konstruksjonen var innsetting av thalamic og nigral mikroelekrode ledninger i glassrør nødvendig for å gi stabilitet under implantasjonskirurgi for å målrette de dype strukturene. Det var åtte bilaterale mikroelektroder, hvorav fire hadde glassrør (2 VL og 2 SNR), som var en grense før de økte intrakranielt trykk og økende dødelighet. Generelt er glassrør nødvendig når ønsket innsettingsdybde er minst 2 mm.
Det var også behov for 0,5 mm tykk plast, noe som begrenset minimumsavstandsseparasjonen mellom elektrodene til 0,5 mm, men annen plast kunne brukes. I dette tilfellet ble plast plassert langs hovedaksen på headsettet. Plast kan også plasseres over hodesettaksen der flere elektroder har identiske fremre bakre (AP), men forskjellige medial-laterale (ML) koordinater. Denne metoden tilbyr et bredt spekter av mulige konfigurasjoner for spesifikke hjerneregioner.
Antall pinner på et hodesett begrenser antall mikroelektroder. Et hodesett som inneholder 12 pinner dekker den fremre bakre omfanget av et voksent musehode helt. Hver pinne skal isoleres fra de andre pinnene under lodding. Et ohmmeter og 0,9% saltvann var nødvendig for å teste den elektriske isolasjonen for hvert par elektrodeterminaler. Det 12-pinners hodesettet begrenser opptaket til 10 regioner (2 er reservert for bakken og referansen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health (RO1 NS120945, R37NS119012 til JK) og UVA Brain Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier 16-Channel | A-M Systems | Model 3600 | Amplifier |
| Cranioplasty cement | Coltene | Perm Reeline/Repair Resin Type II Class I Shade - Clear | Cement to hold microelectrodes |
| Cryostat Microtome | Precisionary | CF-6100 | To slice brain |
| Diamel-coatednickel-chromium wire | Johnson Matthey Inc. | 50 µm | Microelectrode wire |
| Dremel | Dremel | 300 Series | To drill holes in mouse skull |
| Epoxy | CEC Corp | C-POXY 5 | Fast setting adhesive |
| Hemostat | Any | To hold the headset | |
| Forceps | Any | To hold microelectrodes | |
| Light microscope | Nikon | SMZ-10 | To see alignment |
| Ohmmeter | Any | To measurre resistance | |
| Pins (Headers and matching Sockets) | Mill-Max | Interconnects, 833 series, 2 mm grid gull wing surface mount headers and sockets | To attach microelectrodes to |
| Polymicro Tubing Kit | Neuralynx | ID 100 ± 04 µm, OD 164 ± 06 µm, coating thickness 12 µm | Glass tubes |
| Pulse Stimulator | A-M Systems | Model 2100 | To mark the microelectrode location at the end of the recordings |
| Scissors | Any | To cut microelectrodes | |
| Superglue | Gorilla | Adhesive | |
| Thick wire 0.008 in. – 0.011 in. | A-M Systems | 791900 | Tick wire to hold the microelectrode array |
| Thin wire 0.005 in. - 0.008 in. | A-M Systems | 791400 | Thin wire for reference and ground |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Receptive fields of single neurones in the cat's striate cortex. The Journal of Physiology. 148 (3), 574-591 (1959).
- O'Keefe, J. Place units in the hippocampus of the freely moving rat. Experimental Neurology. 51 (1), 78-109 (1976).
- Fyhn, M., Molden, S., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B. Spatial representation in the entorhinal cortex. Science. 305 (5688), 1258-1264 (2004).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7, 446-451 (2004).
- Buckmaster, P. S., Edward Dudek, F. In vivo intracellular analysis of granule cell axon reorganization in epileptic rats. Journal of Neurophysiology. 81 (2), 712-721 (1999).
- Driscoll, N., et al. Multimodal in vivo recording using transparent graphene microelectrodes illuminates spatiotemporal seizure dynamics at the microscale. Communications Biology. 4, 1-14 (2021).
- Roy, D. S., et al. Memory retrieval by activating engram cells in mouse models of early Alzheimer's disease. Nature. 531, 508-512 (2016).
- Igarashi, K. M., Lu, L., Colgin, L. L., Moser, M. B., Moser, E. I. Coordination of entorhinal-hippocampal ensemble activity during associative learning. Nature. 510, 143-147 (2014).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Brodovskaya, A., Shiono, S., Kapur, J. Activation of the basal ganglia and indirect pathway neurons during frontal lobe seizures. Brain. 144 (7), 2074-2091 (2021).
- Ren, X., Brodovskaya, A., Hudson, J. L., Kapur, J. Connectivity and neuronal synchrony during seizures. The Journal of Neuroscience. 41 (36), 7623-7635 (2021).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
