Summary
Det nuvarande protokollet beskriver konstruktionen av skräddarsydda mikroelektrodmatriser för att registrera lokala fältpotentialer in vivo från flera hjärnstrukturer samtidigt.
Abstract
Forskare behöver ofta registrera lokala fältpotentialer (LFP) samtidigt från flera hjärnstrukturer. Inspelning från flera önskade hjärnregioner kräver olika mikroelektrodkonstruktioner, men kommersiellt tillgängliga mikroelektrodmatriser erbjuder ofta inte sådan flexibilitet. Här beskriver det nuvarande protokollet den enkla utformningen av skräddarsydda mikroelektrodmatriser för att spela in LFP från flera hjärnstrukturer samtidigt på olika djup. Detta arbete beskriver konstruktionen av de bilaterala kortikala, striatala, ventrolaterala talamiska och nitrala mikroelektroderna som ett exempel. Den skisserade designprincipen erbjuder flexibilitet, och mikroelektroderna kan modifieras och anpassas för att spela in LFP från vilken struktur som helst genom att beräkna stereotaxiska koordinater och snabbt ändra konstruktionen i enlighet därefter för att rikta in sig på olika hjärnregioner i antingen fritt rörliga eller bedövade möss. Mikroelektrodaggregatet kräver standardverktyg och tillbehör. Dessa anpassade mikroelektrodmatriser gör det möjligt för utredare att enkelt designa mikroelektrodmatriser i vilken konfiguration som helst för att spåra neuronal aktivitet, vilket ger LFP-inspelningar millisekunders upplösning.
Introduction
Lokala fältpotentialer (LFP) är de elektriska potentialer som registreras från det extracellulära utrymmet i hjärnan. De genereras av jonkoncentrationsobalanser utanför neuroner och representerar aktiviteten hos en liten, lokaliserad population av neuroner, vilket gör det möjligt att exakt övervaka aktiviteten i en specifik hjärnregion jämfört med makroskala EEG-inspelningarna1. Som en uppskattning motsvarar LFP-mikroelektroderna separerade med 1 mm två helt olika populationer av neuroner. Medan EEG-signalen filtreras av hjärnvävnad, cerebrospinalvätska, skalle, muskler och hud, är LFP-signalen en pålitlig markör för lokal neuronal aktivitet1.
Forskare behöver ofta samtidigt registrera LFP från flera hjärnstrukturer, men kommersiellt tillgängliga mikroelektrodmatriser erbjuder ofta inte sådan flexibilitet. Här beskriver det nuvarande protokollet helt anpassningsbara, lätt konstruerade mikroelektroder för att samtidigt spela in LFP från önskad hjärnregion på olika djup. Även om LFP i stor utsträckning har använts för att registrera den neuronala aktiviteten i en specifik hjärnregion 2,3,4,5,6,7,8,9, tillåter den nuvarande enkla anpassningsbara designen inspelning av LFP från alla flera ytliga eller djupa hjärnregioner 11,12 . Protokollet kan också modifieras för att konstruera vilken önskad mikroelektrodmatris som helst genom att bestämma stereotaxiska koordinater för hjärnregionerna och montera matrisen i enlighet därav. Dessa mikroelektroder med en samplingsfrekvens på 10 kHz och 60-70 kΩ motstånd (2 cm längd) gör att vi kan spela in LFP med millisekundprecision. Data kan sedan förstärkas av en 16-kanals förstärkare, filtreras (lågt pass 1 Hz, högpass 5 kHz) och digitaliseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det nuvarande arbetet är godkänt av University of Virginia Animal Care and Use Committee. C57Bl/6 möss av båda könen (7-12 veckor) användes för experimenten. Djuren hölls på en 12 h ljus / 12 h mörk cykel och hade ad libitum tillgång till mat och vatten.
1. Mikroelektrodkonstruktion
- För att konstruera mikroelektroderna, använd 50 μm (diameter) diamelbelagd nickelkromtråd (se Materialtabell). Tejpa ena änden av tråden på baksidan av plattformen och linda tråden tre gånger runt närmaste ratt på plattformen (figur 1A,C).
OBS: En akrylplattform med två vred (2 x 5 tum) användes här, men vilken plattform som helst kan användas.- Sträck tråden runt den längsta andra ratten för att göra två öglor mellan rattarna. Vik tråden ytterligare tre gånger runt den första ratten för att fixera tråden på plats och tejpa änden igen på baksidan av plattformen.
OBS: Efter att ledningarna har separerats (steg 1.2-1.3.1) måste det finnas två ledningar på varje sida (totalt fyra ledningar, figur 1B).
- Sträck tråden runt den längsta andra ratten för att göra två öglor mellan rattarna. Vik tråden ytterligare tre gånger runt den första ratten för att fixera tråden på plats och tejpa änden igen på baksidan av plattformen.
- Placera spännstängerna under ledningarna med tejpen lindad runt dem (klibbig sida uppåt) (Figur 1C).
OBS: Triangulära akrylbitar användes för spänningsstängerna, med tejp lindad runt dem (klibbig sida utanför för att fästa ledningarna). Den klibbiga sidan av tejpen utanför spännstängerna håller ledningarna på plats för att justera avståndet mellan dem. Spännstängerna måste vara ~ 2,5 cm från rattarna och ledningarna får inte vara lösa. - Använd ett mikroskop och fina pincett, gör antingen ett mellanrum på 3 mm eller 4,5 mm mellan ledningarna (3 mm mellanrum mellan ledningarna för att göra kortikala (Ctx) - ventrolaterala talamiska kärnor (VL) mikroelektroder; 4,5 mm mellanrum för att göra striatala (Str) - nigral (SNR) mikroelektroder) (Figur 1B).
- Om förstoring används på mikroskopet, se till att beräkna och justera för skillnaden i förstoring och det faktiska avståndet mellan ledningarna.
OBS: Om mikroelektroder är konstruerade för andra strukturer än de som används här, måste avståndet mellan ledningarna justeras till det stereotaxiska avståndet mellan strukturerna. Figur 2B ger ett exempel på hur ledningarna kommer att organiseras; Följaktligen måste de stereotaxiska koordinaterna för andra strukturer justeras.
- Om förstoring används på mikroskopet, se till att beräkna och justera för skillnaden i förstoring och det faktiska avståndet mellan ledningarna.
- Skär fyra små plastbitar (0,5 mm tjocka) ~ 6 mm (bredd) x 3 mm (höjd) (figur 1C).
OBS: Alla plastbitar kan användas så länge de är 0,5 mm tjocka; här användes fyrkantiga slangar där stiften såldes (Pins, se Materialtabell). Om en annan tjocklek används, lägg till fler eller färre plastbitar för att passa de stereotaxiska koordinaterna som krävs. - Applicera lim (se Materialtabell) på plasten och placera dem på ledningarna (Figur 1C). Placera plastbitar ~ 1,0 cm från mitten av tråden, som är 1,0 cm från spännstången. Ta bort överskottet av superlim med en bomullspinne.
- När superlimet torkar, klipp av ledningarna med en fin sax, i den ordning som anges i figur 1C.
- Skär fyra 7 mm glasrör med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit (se materialtabell) och sätt in elektrodtrådarna i glasrören enligt figur 2A.
- Sätt i VL- och SNR-elektrodpar i glasrören.
OBS: Endast ledningarna för djupa strukturer behöver sättas in i glasrören för att stödja kirurgisk implantation. Se till att inte sätta in kortikala elektroder i glasröret.
- Sätt i VL- och SNR-elektrodpar i glasrören.
- Sätt limet vid basen av glasrören för att ansluta dem till plasten. Vänta lite tid tills limet torkar.
- Skär glasrören och ledningarna med en skalpell enligt tabell 1. se till att mikroelektrodernas längder är korrekta. Om mikroelektroderna riktar sig mot olika strukturer, justera skäravståndet enligt de stereotaxiska koordinaterna som krävs.
Figur 1: Schematisk över mikroelektrodkonstruktionen. (A) Uppsättning av ledningar på plattformen med spännstänger under ledningarna. (B) Klyftan mellan ledningarna. (C) Fyra plastbitar limmas på ledningarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Ctx | Str | VL | SNR | |
| AP (främre/bakre) | 2.2 | 1.2 | -1.3 | -3.3 |
| ML (medial/lateral) | 1.8 | 1.5 | 1 | 1.5 |
| DV (dorsal/ventral) | 0.5 | 3.5 | 4 | 4.75 |
| Elektrodens längd | 4 | 4.75 | 5.25 | 6 |
Tabell 1: Stereotaxiska implantationskoordinater och dimensioner för mikroelektroderna.
2. Montering av mikroelektrodmatriser
- Använd limet för att fästa plast i önskad ordning av målregioner. Ett exempel på kortikala, talamiska, striatala och nigrala elektroder visas i figur 2B,C.
- Placera Ctx-VL-elektrodparet med framsidan nedåt (sidan med elektrodtrådar måste vända nedåt) och anslut två 6 mm x 3 mm tomma plastbitar ovanpå med lim.
- Ovanpå de tre plastbitarna placerar du det andra Ctx-VL-elektrodparet med elektroderna vända uppåt (använd ett mikroskop och se till att VL-elektroderna är inriktade).
OBS: Justering av bilaterala elektroder (här inriktningen av vänster och höger VL-elektroder) är avgörande för att rikta önskade bilaterala strukturer på lämpligt sätt. - Använd limet för att fästa SNR-elektroderna ovanpå med SNR-elektroderna 2,0 mm från VL-elektroderna och ~ 5,0 mm från kortikala elektroder (SNR-elektrodtrådarna måste vända uppåt).
- Upprepa steg 2.1.3. för den andra sidan (SNR-elektrodtrådarna måste vända utanför mikroelektrodmatrisen).
- Applicera epoxiharts runt plasten för att binda elektroderna ihop. Undvik att sätta epoxiharts på elektroderna.
- Ta en tjock tråd och gör en slinga i ena änden. Doppa slingan i epoxilösningen och placera den på plasten, så att den tjocka tråden ligger platt (figur 2D) så att denna tråd för nästa steg kan användas som handtag. Vänta tills elektroderna är helt torra.
- Klipp av ledningarna till 2 cm, som visas i figur 2E.
Figur 2: Mikroelektrodkonstruktion och dimensioner. (A) Fyra par elektroder bildade efter att trådarna klipptes med sax, vilket anges i figur 1C (2 par Ctx-VL-elektroder och 2 par Str-SNR-elektroder). Sätt in djupa strukturelektroder (VL och SNR) i glasrören och lim deras baser på plast (röda prickar). (B) Toppvy: Elektrodparen från (A) limmas i en stapel för att skapa mikroelektrodkärnan. Röda linjer indikerar limlinjer. (C) Främre sidovy av (B). (D) Den tjocka tråden fästes på mikroelektroderna. (E) Trådarna grupperas enligt anvisningarna och de isolerade ändarna skrapas av och skärs i 2 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Mikroelektrodanslutning till headsetet
- Gruppera ledningarna enligt figur 2E och skrapa bort 1 mm av de isolerade ändarna med en skalpell.
- Böj de kortikala elektroderna enligt figur 3A. Separera ledningarna enligt figur 3B. Använd fina pincett och gör en slinga i slutet av varje tråd (figur 3B).
- Håll i ett 10-polig headset med en hemostat (se Materialtabell) och använd träänden på en bomullspinne för att applicera minimala mängder flöde på stiften (Figur 3C). Se till att inte sätta flöde utanför stiften för att förhindra kortslutning bland stiften.
- Använd träänden på en bomullspinne och applicera flöde på trådslingorna.
- Löd trådslingorna till det 10-poliga headsetet som visas i figur 3C. Torka headsetet efter lödning för att förhindra kortslutning bland stiften.
- Ta en tunn tråd (0,005-0,008 tum) för referens- och jordledningarna och ta bort plasten från ena änden. Gör en slinga i andra änden av tråden.
- Löd den avskalade sidan av referens- och jordledningarna till deras respektive stift (figur 3A,C).
- Håll på den tjocka tråden (figur 2D), applicera kranioplastisk cement runt mikroelektroderna, särskilt där ledningarna ansluter till stiften. Undvik att röra vid de faktiska elektrodändarna med cementet.
- När cementet torkar, sätt epoxiharts vid basen av glasrören, striatala mikroelektrodtrådar och hela elektroden. Undvik att vidröra de faktiska elektrodändarna med epoxiharts. Vänta tills elektroderna är helt torra.
- Elektroderna är klara. Borra hål i musens skalle (enligt de stereotaxiska koordinaterna) med hjälp av en tandborr och implantera headsetet som visas i figur 3D genom att sänka headsetet med mikroelektroder vända mot skallen och lämpliga hål. Headsetet kan fästas på stereotaxiska armen för stöd under implantationen.
Figur 3: Mikroelektrodimplantation. (A) De kortikala elektroderna är böjda enligt anvisningarna. (B) Ledningarna är separerade för att göra slingor i ändarna. (C) Flödet (vid de röda prickarna) och slingade ledningarna löds till det 10-poliga headsetet, vilket säkerställer att varje tråd går till sin lämpliga stift. (D) Headsetet implanteras för att spela in LFP. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Märkning av elektrodens plats efter inspelningar
- I slutet av LFP-inspelningarna, bekräfta elektrodernas korrekta position i målområdet genom att applicera en ström vid elektrodspetsarna för att göra en lesion och vänta i 30 minuter innan du perfuserar musen.
OBS: Lesionsinställningar för att bekräfta placeringen av elektrodspetsarna: Enkel burst, 40 μA, 0,75 ms monofasisk kvadratisk vågpuls, 50 Hz, 30 s. - Bedöva mössen med isofluran (tills musen somnade) och perfusera10 transkardiellt med 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M natriumfosfatbuffert. Sektionera hjärnorna (40 μm tjocka) på en kryostat (se materialtabell) och fläcka med DAPI (0,02% i PBS). Bekräfta den korrekta placeringen av elektroderna genom närvaron av elektrodspetsskadorna som visas i figur 4B,C.
OBS: Procentandelen isofluran måste tillämpas enligt det enskilda institutets riktlinjer.
5. Mätning av elektrodmotståndet
- Mät elektrodernas motstånd och kontrollera kortslutningen bland elektroderna med hjälp av en ohmmeter med flera intervall (se Materialtabell). Ställ in motståndsskalan på R x 10 000, vilket indikerar att en enhetsavböjning i pekaren motsvarar 1 kΩ motstånd. 2 cm långa elektroder måste ha 60-70 kΩ motstånd.
- Anpassa headsetet genom att ta tio enskilda stift (se Materialtabell). Löd varje stift med en tunn, flersträngad koppartråd i en kabel.
- Tryck in de lödda stiften med motsvarande kabelsvansar i det 10-poliga dubbelradiga parningsuttaget (matchande uttag). Tryck in de öppna stiften på parningsuttaget i LFP-headsetet. På detta sätt har varje LFP-elektrod en utsedd kabeltråd i enheten.
- Doppa spetsen på varje LFP-elektrod (vars resistans ska mätas) i 0,9% NaCl-saltlösning (NaCl-koncentration i blodet). Anslut kabeltrådänden som motsvarar LFP-elektroden till ohmmeterns positiva terminal.
- Använd en tråd med lågt motstånd (̴100 Ω) med ena sidan i saltvattnet och den andra sidan som öppen ände. Anslut den öppna änden av lågmotståndstråden till ohmmeterpekarens jord.
OBS: Detta arrangemang slutför kretsen och uppmanar till en avböjning av ohmmeterpekaren.
- Använd en tråd med lågt motstånd (̴100 Ω) med ena sidan i saltvattnet och den andra sidan som öppen ände. Anslut den öppna änden av lågmotståndstråden till ohmmeterpekarens jord.
- Se till att det inte finns någon elektrisk anslutning mellan två elektroder på headsetet. Kontrollera den elektriska isoleringen av parvisa LFP-elektroder (jord: en kabel motsvarar en elektrod; positiv: en annan kabel motsvarar en annan elektrod). Kassera elektroderna om någon avböjning observeras i detta fall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta arbete användes LFP-mikroelektroderna för att kartlägga anfallsspridningen genom de basala ganglierna11. Samtidiga LFP-inspelningar utfördes från höger premotorisk cortex (där anfallsfokus var) och vänster VL, striatum och SNR (figur 4). Anfallsstart identifierades som avböjning av spänningsspåret minst två gånger baslinjen (figur 4A, röd pil). Effektspektrumdiagrammet11 visar frekvensfördelningar för de inspelade LFP:erna (figur 4A). Svarsfrekvenser för anfallsstart (röda staplar) kan jämföras mellan varje struktur med millisekundprecision (figur 4A). En strömpuls applicerades i slutet av inspelningarna för att markera och bekräfta placeringen av elektrodspetsarna och bilda en lesion (figur 4B,C).
Figur 4: Representativa LFP-inspelningar. (A) Ett anfall registrerades från höger premotorisk cortex och vänster VL, striatum och SNR med användning av LFP-mikroelektroder med motsvarande effektspektrum. Den röda pilen indikerar anfallsdebut. De röda horisontella staplarna indikerar anfallsfördröjning i varje struktur. Hjärnschemat visar mikroelektrodernas position (röda prickar). (B,C) Strukturerna skadades efter inspelningarna för att markera placeringen av mikroelektrodspetsarna i VL och SNR. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historiskt sett har mikroelektrodmatriser använts i stor utsträckning för att registrera neuronal aktivitet från en specifik hjärnregion av intresse 2,3,4,5,6,7,8,9,13. Vår enkla mikroelektroddesign möjliggör dock inspelning från flera strukturer samtidigt11,12. Här beskrivs konstruktionen av kortikala, talamiska, striatala och nitrala mikroelektroder som ett exempel. Utredare kan modifiera mikroelektroddesignen för att passa önskad struktur genom att beräkna de nödvändiga stereotaxiska avstånden och justera konstruktionen i enlighet därefter.
Till exempel har vi tidigare modifierat utformningen av dessa mikroelektrodmatriser för att spela in LFP i lamellär och septotemporal riktning i hippocampus12. En 50 μm avståndstråd separerade intilliggande elektroder som fyra mikroelektroder registrerade längs hippocampal lamina för att förhindra korskontaminering av signalen. Även om dessa inte var inspelningar med en enhet, representerade varje elektrod en liten grupp neuroner som indikeras av variationen hos en spikvågform som en funktion av avståndet från cellkroppen.
Under konstruktionen var det nödvändigt att sätta in de talamiska och nigrala mikroelektrodtrådarna i glasrör för att ge stabilitet under implantationskirurgi för att rikta in sig på de djupa strukturerna. Det fanns åtta bilaterala mikroelektroder, varav fyra hade glasrör (2 VL och 2 SNR), som var en gräns innan det intrakraniella trycket höjdes och dödligheten ökade. I allmänhet behövs glasrör när det önskade införingsdjupet är minst 2 mm.
Dessutom behövdes 0,5 mm tjock plast, vilket begränsade minsta avståndsseparationen mellan elektroderna till 0,5 mm, men annan plast kunde användas. I det aktuella fallet placerades plast längs headsetets huvudaxel. Plast kan också placeras över headsetaxeln där flera elektroder har identiska främre-bakre (AP) men olika mediala-laterala (ML) koordinater. Denna metod erbjuder ett brett utbud av möjliga konfigurationer för specifika hjärnregioner.
Antalet stift på ett headset begränsar antalet mikroelektroder. Ett headset som innehåller 12 stift täcker den främre-bakre omfattningen av ett vuxet mushuvud helt. Varje stift ska isoleras från de andra stiften under lödning. En ohmmeter och 0,9% saltvatten behövdes för att testa den elektriska isoleringen för varje par elektrodterminaler. Det 12-stifts headsetet begränsar inspelningen till 10 regioner (2 är reserverade för marken och referensen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of Health (RO1 NS120945, R37NS119012 till JK) och UVA Brain Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier 16-Channel | A-M Systems | Model 3600 | Amplifier |
| Cranioplasty cement | Coltene | Perm Reeline/Repair Resin Type II Class I Shade - Clear | Cement to hold microelectrodes |
| Cryostat Microtome | Precisionary | CF-6100 | To slice brain |
| Diamel-coatednickel-chromium wire | Johnson Matthey Inc. | 50 µm | Microelectrode wire |
| Dremel | Dremel | 300 Series | To drill holes in mouse skull |
| Epoxy | CEC Corp | C-POXY 5 | Fast setting adhesive |
| Hemostat | Any | To hold the headset | |
| Forceps | Any | To hold microelectrodes | |
| Light microscope | Nikon | SMZ-10 | To see alignment |
| Ohmmeter | Any | To measurre resistance | |
| Pins (Headers and matching Sockets) | Mill-Max | Interconnects, 833 series, 2 mm grid gull wing surface mount headers and sockets | To attach microelectrodes to |
| Polymicro Tubing Kit | Neuralynx | ID 100 ± 04 µm, OD 164 ± 06 µm, coating thickness 12 µm | Glass tubes |
| Pulse Stimulator | A-M Systems | Model 2100 | To mark the microelectrode location at the end of the recordings |
| Scissors | Any | To cut microelectrodes | |
| Superglue | Gorilla | Adhesive | |
| Thick wire 0.008 in. – 0.011 in. | A-M Systems | 791900 | Tick wire to hold the microelectrode array |
| Thin wire 0.005 in. - 0.008 in. | A-M Systems | 791400 | Thin wire for reference and ground |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Receptive fields of single neurones in the cat's striate cortex. The Journal of Physiology. 148 (3), 574-591 (1959).
- O'Keefe, J. Place units in the hippocampus of the freely moving rat. Experimental Neurology. 51 (1), 78-109 (1976).
- Fyhn, M., Molden, S., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B. Spatial representation in the entorhinal cortex. Science. 305 (5688), 1258-1264 (2004).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7, 446-451 (2004).
- Buckmaster, P. S., Edward Dudek, F. In vivo intracellular analysis of granule cell axon reorganization in epileptic rats. Journal of Neurophysiology. 81 (2), 712-721 (1999).
- Driscoll, N., et al. Multimodal in vivo recording using transparent graphene microelectrodes illuminates spatiotemporal seizure dynamics at the microscale. Communications Biology. 4, 1-14 (2021).
- Roy, D. S., et al. Memory retrieval by activating engram cells in mouse models of early Alzheimer's disease. Nature. 531, 508-512 (2016).
- Igarashi, K. M., Lu, L., Colgin, L. L., Moser, M. B., Moser, E. I. Coordination of entorhinal-hippocampal ensemble activity during associative learning. Nature. 510, 143-147 (2014).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Brodovskaya, A., Shiono, S., Kapur, J. Activation of the basal ganglia and indirect pathway neurons during frontal lobe seizures. Brain. 144 (7), 2074-2091 (2021).
- Ren, X., Brodovskaya, A., Hudson, J. L., Kapur, J. Connectivity and neuronal synchrony during seizures. The Journal of Neuroscience. 41 (36), 7623-7635 (2021).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
