Summary
为了开发预防和管理背痛的新型治疗干预措施，需要动物模型从转化角度检查这些疗法的机制和有效性。本协议描述了BMS测试，这是一种评估大鼠背部机械敏感性的标准化方法。
Abstract
腰痛是全世界残疾的主要原因，具有严重的个人、经济和社会后果。为了开发新的治疗方法，需要动物模型从转化角度检查新疗法的机制和有效性。在当前的研究中使用了几种啮齿动物的背痛模型。然而，令人惊讶的是，没有标准化的行为测试被验证来评估背痛模型中的机械敏感性。这对于确认推定背痛的动物对伤害性刺激存在局部超敏反应以及在旨在缓解背痛的干预措施期间监测敏感性至关重要。这项研究的目的是制定一个简单易用的测试来评估大鼠背部的机械敏感性。专门为这种方法制造了一个测试笼;长 x 宽 x 高：50 x 20 x 7 厘米，顶部有不锈钢网。该测试笼允许在背部施加机械刺激。为了进行测试，在感兴趣的区域剃掉动物的背部，并根据需要标记测试区域以在不同日期重复测试。机械阈值是通过将冯弗雷细丝应用于椎旁肌肉来确定的，使用前面描述的上下方法。积极的反应包括（1）肌肉抽搐，（2）拱起（背部伸展），（3）颈部旋转（4）抓挠或舔背部，以及（5）逃跑。该行为测试（背部机械敏感性（BMS）测试）可用于啮齿动物背痛模型的机制研究，以开发预防和管理背痛的治疗干预措施。
Introduction
腰痛（LBP）是全球残疾的主要原因，具有严重的个人，经济和社会后果1，2，3，4。每年，约有37%的人口受到LBP5的影响。腰痛通常在几周内消退，但在 24%-33% 的个体中复发，在 5%-10% 的病例中变为慢性2.为了了解LBP的机制和影响以及不同治疗干预的效果，已经使用了几种LBP动物模型，模拟临床条件或LBP6的某些成分。这些小鼠和大鼠模型可分为以下一个或多个类别：（1）椎间盘性LBP7，8，，（2）根性LBP 8，9，10，11，（3）小关节骨关节炎12和（4）肌肉诱导的LBP13，14.由于疼痛不能直接在非人类物种中测量，因此已经开发了许多测试来量化这些模型中的类似疼痛的行为8。这些测试评估由有害刺激（机械力15，16，17，热刺激18，19，20，21，22，23，24，25）或自发产生的行为26，27，28，29。
使用机械刺激的方法包括冯弗雷检验15，16和兰德尔-塞利托检验17。使用热刺激的方法包括尾部轻弹测试18、热板测试19、哈格里夫斯测试20和热探针测试21。使用冷刺激的方法包括冷板试验22、丙酮蒸发试验23和冷足底试验24。自发行为的方法包括鬼脸秤26，挖洞27，负重和步态分析28，以及自动行为分析29。尽管有这么多可用的测试，但没有一个是专门为背痛模型设计的。
这项研究的目的是制定一个简单易用的测试来评估大鼠背部的机械敏感性。该技术主要基于应用于后爪足底表面的冯弗雷测试15，16。冯弗雷测试的基本原理是使用一系列单丝到感兴趣的区域，提供恒定的预定力。如果大鼠表现出伤害性行为，则反应被认为是积极的。然后可以根据引起响应的细丝计算机械阈值。在本研究中，提供了一种基于冯弗雷测试的简单易行的方法来确定大鼠背部的机械敏感性。
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Protocol
该实验方案得到了魁北克三河大学动物护理委员会的批准，并符合加拿大动物护理理事会的指导方针和国际疼痛研究协会（IASP）的研究和伦理问题委员会的指导方针。本研究使用了六只雄性Wistar大鼠（体重：320-450克;年龄：18-22周）。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。这些大鼠的数据来自先前研究30的较大样本。
1. 实验准备
- 将动物安置在标准动物设施的温度控制室中，可以 随意 获得食物和水，并具有14小时-10小时的明暗循环。确保所有动物在实验当天身体健康。
- 按照以下步骤生成慢性背痛动物模型。
- 为了诱发慢性背痛，请按照先前的报告14，30，31向背部肌肉肌内注射完全弗氏佐剂（CFA）。
- 使用异氟醚麻醉动物（4%用于诱导，2%-2.5%用于维持）。
- 根据方案需要，使用 27 G 针头将 150 μL 即用型 CFA 油包水乳液（参见 材料表）单侧或双侧注入椎旁肌肉。
- 完成注射后，将注射针保持在适当的位置至少3分钟。对于对照组中的动物，使用相同的程序30，但注射无菌生理盐溶液（150μL，0.9%）而不是CFA溶液。
- 制造测试笼。
- 为两只动物制作一个测试笼，每只动物包含一个腔室。
注意：对于本研究，每个腔室具有以下尺寸：长x宽x高：50 x 20 x 7厘米（见 材料表）。 - 将两个连续的腔室安装在四个 33 厘米长的有机玻璃腿上。使用透明有机玻璃作为房间的墙壁，但使用黑色有机玻璃分隔房间以防止动物看到彼此。
- 使用由 1 mm 金属丝制成的不锈钢网，线间距离为 8 mm 来制作测试笼的地板和天花板（图 1）。
- 为两只动物制作一个测试笼，每只动物包含一个腔室。
2. 背部机械灵敏度（BMS）测试
- 在第一次测试之前，连续5-7天，每天30分钟使动物熟悉测试笼。根据需要重复测试。
- 使用2%异氟醚31 麻醉动物（见 材料表）。
- 在异氟醚麻醉下的俯卧位，使用动物毛发修剪器剃除感兴趣区域（从T6到L6椎体水平）的后毛（见 材料表）。对于重复措施，每天每3天剃一次背毛，无需行为评估，以确保刺激始终直接施加在皮肤上。用永久性记号笔在皮肤上画一个黑色标记，以确保在不同日期重复测试时始终将细丝应用于同一区域。
- 在测试当天，在测试前将动物放入测试笼中15-30分钟，直到动物平静。
- 在测试过程中，垂直于背面施用冯弗雷细丝（0.07、0.16、0.4、0.6、1、2、4、6、10、15 和 26 g），始终从 2 g 长丝开始并使用上下方法15 （参见 材料表）。用动物后面的细丝慢慢接近动物的背部。
- 仅当动物醒着，用四只爪子站立并且不动时才使用细丝。将细丝双向施加到感兴趣的区域2秒，距离棘突10毫米（图2），每15-30秒一次。
注意：如果动物在施加细丝期间或之后立即表现出以下一种或多种行为，则认为反应是积极的：（1）肌肉抽搐，（2）拱起（背部伸展），（3）旋转颈部看背部，（4）抓挠或舔背部，以及（5）逃跑。
- 仅当动物醒着，用四只爪子站立并且不动时才使用细丝。将细丝双向施加到感兴趣的区域2秒，距离棘突10毫米（图2），每15-30秒一次。
- 如前所述，15，如果在施加细丝时没有观察到响应，则在串联中以更高的力施加下一根细丝。如果观察到响应，请使用串联中力较小的下一根灯丝。继续此过程，直到在第一次行为改变后获得四个读数（一系列“无反应”后的响应或一系列“响应”后无响应）。
- 数据收集完成后，使用以下公式计算代表机械阈值 50% 的值，如 Chaplan 等人 15 所述：
50% 阈值 （g） = 10（Xf+kδ）/10 000
注意：在此公式中，“Xf”是最后一个使用的冯弗雷灯丝的手柄标记。“k”是基于动物反应模式15的表格值，“δ”是冯弗雷细丝之间手柄标记增量的平均值。根据实验设计和实验需求，可以仅评估脊柱的一侧以报告一个阈值，或者可以评估两侧，并且阈值单独报告或作为平均值报告。有关计算模板32，请参阅补充表1。
3. 动物恢复
- 肌内注射完成后，停止麻醉并将动物单独放入标准外壳笼中以进行恢复。
- 在恢复期间，检查动物的行为，不要让它无人看管。
- 确认动物从麻醉中恢复并在 5 分钟内正常移动。然后，将动物与其他动物一起放回通常的笼子里。
注意：在实验结束时，在深度异氟醚麻醉（5%）下，用10%福尔马林溶液将动物灌注到心脏中。然后提取注射区域的背部肌肉进行组织学检查并确认炎症变化。
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Representative Results
该方法用于先前的研究，其中提供了完整的数据和统计数据，以比较CFA和对照大鼠之间的机械敏感性30。来自先前研究中包含的六只大鼠的代表性个体数据（左右阈值的平均值）如图 3 和 表1所示。在基线时，两组之间的机械敏感性相似。在腰肌肌内注射CFA导致CFA注射后机械敏感性从7天显着增加到28天。相比之下，对照（CTL）大鼠没有表现出这种变化。如图 3所示，正如这种类型的行为评估所预期的那样，在动物内部和动物之间观察到了变异性。然而，过敏的CFA大鼠表现出降低的变异性。基于先前的研究30，16只动物（8只CFA和8只CTL）足以检测组间随时间推移（η2p = 0.38）5个时间点的显着影响。
在这项研究中，通过组织学检查证实了注射CFA的肌肉中存在慢性炎症变化（图4）30。此外，除了背部外，还通过标准冯弗雷测试在后爪观察到机械超敏反应（图5）30。在先前使用相同背痛模型的研究中，我们显示出自发性疼痛行为以及神经炎症和神经生理变化的增加14，31。事实上，在福尔马林试验期间，与对照组大鼠相比，CFA的舔行为增加，并且在右杏仁核中对坐骨神经有害刺激的单单位反应发生了改变31。此外，与对照组14相比，CFA脊髓中的NF-kB蛋白表达增加。总之，这些研究的结果验证了这种慢性背痛模型，并且本研究直观地展示了如何确认该大鼠模型背部存在机械超敏反应。
图 1：背部机械灵敏度 （BMS ） 测试笼。 （A） 测试笼示意图。（B）定制的测试笼，包括两个腔室，每只动物一个。（C）测试笼的侧视图，其中一个腔室中有一只大鼠。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：背面机械灵敏度评估。 实验者从后面接近动物，并将冯弗雷细丝施加到感兴趣的区域，距离棘突横向10毫米。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：背面机械灵敏度的个别示例。 CFA和对照（CTL）大鼠的背部机械敏感性，分别在基线和肌内注射CFA或盐水后7，14，21和28天。个人数据由灰色 （CTL） 和黑色 （CFA） 填充圆圈显示。水平条指示均值。误差线表示平均值的标准误差。 请点击此处查看此图的大图。
图4：慢性肌肉炎症的组织学确认。来自CFA大鼠和对照组的背部肌肉的个体例子30。 （A）肌肉注射生理盐水14天后对照大鼠的健康背部肌肉。（乙-丙）来自两只CFA治疗的大鼠的背部肌肉在肌内注射CFA后14天显示出慢性炎症，白细胞浸润明显。苏木精-伊红着色用于对肌肉切片进行染色。比例尺 = 250 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图5：CFA大鼠的机械超敏反应30。在背部肌肉注射CFA（n = 8）或生理盐水（n = 8）后（L5-L6水平）后，机械敏感性超过4周的时间过程。（A-B）左右后爪下的机械敏感性。与对照大鼠相比，CFA的机械阈值随着时间的推移显着降低（P < 0.01）。这种效应在左右后爪之间没有显着差异（P = 0.7）。对于两个后爪的组合，Tukey HSD测试显示，与对照大鼠相比，CFA的机械阈值较低，从注射后1周到4周（所有P<0.03）。单独后爪的时间过程仅供说明之用（相互作用不显著，详见结果）。（中四）背部的机械灵敏度。随着时间的推移，与对照大鼠相比，CFA的机械阈值显着降低（P < 0.001）。这种效应在左右评估点之间没有显著差异（P=0.3）。对于左右评估部位的组合，Tukey HSD测试显示，与对照大鼠相比，CFA的机械阈值较低，从注射后1周到4周（所有P<0.05）。单独后爪的时间过程仅供说明之用（相互作用不显著，详见结果）。在图（D）中，为了说明目的，一只CFA大鼠的个体数据未显示在基线（9.6g）上。阴影区域表示基线评估。请点击此处查看此图的大图。
| 鼠 | 群 | 基线 | 第七天 | 第14天 | 第21天 | 第28天 |
| 1 | 2.34 | 0.29 | 0.12 | 0.29 | 0.29 | |
| 2 | 终审 法院 | 1 | 0.48 | 0.05 | 0.48 | 0.08 |
| 3 | 1.26 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.19 | |
| 平均±标清 | 1.53 ± 0.58 | 0.27 ± 0.18 | 0.07 ± 0.03 | 0.27 ± 0.18 | 0.19 ± 0.09 | |
| 4 | 1.59 | 2.61 | 0.64 | 3.26 | 2.45 | |
| 5 | 中联 | 1.15 | 0.63 | 3.41 | 2.3 | 1.29 |
| 6 | 0.43 | 1.26 | 0.77 | 0.32 | 2.09 | |
| 平均±标清 | 1.06 ± 0.48 | 1.50 ± 0.83 | 1.61 ± 1.28 | 1.96 ± 1.22 | 1.94 ± 0.48 |
表1：CFA和对照大鼠背部机械敏感性的个体示例。
补充表1：机械阈值的测定。 此模板表用于计算机械阈值。记录响应模式 （X/O），并且仅为 Xf 和 k 输入计算所需的值，对应于用于测试的最后一根细丝的手柄标记以及与响应模式关联的 k 值，在本例中为 XX 后跟 OOXXO。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
关键步骤
BMS测试是一种评估大鼠背部机械敏感性的简单方法，无论是在一个时间点还是在几天或几周内重复，当预期会发生变化（疼痛模型）或在药物或非药物干预后。该方法的关键问题包括测试笼，其尺寸必须确保大鼠舒适但不会移动太多。动物的背部必须通过网状天花板保持可接近，以实现可重复的机械刺激。为了限制阈值评估的变异性，必须剃掉被研究的背部区域，以便将机械刺激直接施加到皮肤上。此外，需要标记皮肤，以便将机械刺激施加到同一区域。最后，实验者必须从动物后面将细丝靠近皮肤，以避免被动物看到。
与用于评估后爪15，16 机械灵敏度的冯弗雷测试相比，在 BMS 测试中产生阳性响应所需的机械力较低。应仔细选择用于测试的细丝。使用以下细丝应满足大多数实验需求（0.07、0.16、0.4、0.6、1、2、4、6、10、15 和 26 g），并防止面对天花板或地板效应。在这种情况下，2 g灯丝用于第一次应用。只要相应地调整计算，就可以适应实验需求。
修改和故障排除
在试点实验期间，确定了测试的理想区域。由于大鼠身体的形状，胸腰椎区域是测试笼中最容易进入的区域。如果没有理由在脊柱的其他区域进行测试，这是应用机械刺激的首选区域。腰部区域也很容易到达。在决定测试哪个区域时，必须记住，灯丝必须垂直于表面并正确弯曲以提供预定的校准力。
局限性
实验者必须接受培训，以观察与测试相关的行为。五种积极反应包括肌肉抽搐、拱形、颈部旋转看背部、舔或抓挠背部以及逃脱30。虽然这些反应中的大多数都很容易观察到，但肌肉抽搐有时对于较低力量的刺激是微妙的。此外，大鼠可能会在笼子中自发移动，因此这不能与逃逸混淆，逃逸是在施加细丝时发生的。为了避免混淆这两种行为，实验者必须等待动物平静至少几秒钟。
意义和潜在应用
在当前的研究中使用了几种啮齿动物的背痛模型8。然而，令人惊讶的是，没有标准化的行为测试被验证来评估背痛模型中的机械敏感性。这对于确认推定背痛的动物对伤害性刺激存在局部超敏反应以及在旨在缓解背痛的干预措施期间监测敏感性至关重要。此处介绍的BMS测试为这些目的提供了一种简单易用的解决方案。虽然它是为大鼠30开发的，但它将来可能会适应其他实验动物。
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Disclosures
作者声明没有可能导致任何利益冲突的竞争利益或关系。
Acknowledgments
这项工作得到了魁北克脊椎基金会和加拿大自然科学与工程研究理事会（MP：grant #06659）的资助。香港的贡献得到了魁北克三河大学（PAIR计划）的支持。BP的贡献得到了魁北克健康研究基金会（FRQS）和魁北克脊椎基金会的支持。TP的贡献得到了加拿大自然科学和工程研究理事会的支持。NE和EK的贡献得到了魁北克脊椎基金会的支持。MP 的贡献得到了 FRQS 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerrane (isoflurane, USP) - Veterinary Use Only | Baxter | NDC 10019-773-60 | Inhalation Anaesthetic ; DIN 02225875, for inducing anasthesia |
| Complete Freund Adjuvant (CFA) | Fisher Scientific | #77140 | Water-in-oil emulsion of Complete Freund Adjuvant (CFA) with killed cells of Mycobacterium butyricum. |
| Male Wistar Rats | Charles River Laboratories | body weight: 320–450 g; age: 18-22 weeks. | |
| Penlon Sigma Delta Vaporizer | Penlon | 990-VI5K-SVEEK | Penlon Sigma Delta Vaporizer used for anasthesia |
| Sharpie Permanent Marker | Sharpie | BC23636 | Permanent Marker, Fine Point, Black |
| Test cage | Custom-made | Width: 20 cm; Length: 50 cm; Height from the bottom to the top: 40 cm; Height from the bottom mesh to the top of the cage: 7 cm; Wall thickness: 5 mm; Mesh: 1 mm wire with an 8 mm inter-wire distance | |
| Von Frey Filaments | Aesthesio, Precise Tactile Sensory Evaluator | 514000-20C | Filaments from 0.07 g to 26 g |
| Wahl Professional Animal, ARCO Cordless Pet Clipper, Trimmer Grooming | Wahl | Kit #8786-1201 | Animal hair trimmer, for shaving purposes, zero blade |
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