Summary
Para desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas para la prevención y el tratamiento del dolor de espalda, se requieren modelos animales para examinar los mecanismos y la efectividad de estas terapias desde una perspectiva traslacional. El presente protocolo describe la prueba BMS, un método estandarizado para evaluar la sensibilidad mecánica de la espalda en la rata.
Abstract
El dolor lumbar es la principal causa de discapacidad en todo el mundo, con consecuencias personales, económicas y sociales dramáticas. Para desarrollar nuevas terapias, se necesitan modelos animales para examinar los mecanismos y la efectividad de las nuevas terapias desde una perspectiva traslacional. Varios modelos de roedores de dolor de espalda se utilizan en las investigaciones actuales. Sorprendentemente, sin embargo, no se validó ninguna prueba de comportamiento estandarizada para evaluar la sensibilidad mecánica en modelos de dolor de espalda. Esto es crítico para confirmar que los animales con presunto dolor de espalda presentan hipersensibilidad local a los estímulos nociceptivos, y para monitorear la sensibilidad durante las intervenciones diseñadas para aliviar el dolor de espalda. El objetivo de este estudio es establecer una prueba simple y accesible para evaluar la sensibilidad mecánica en la espalda de ratas. Se fabricó una jaula de prueba específicamente para este método; largo x ancho x alto: 50 x 20 x 7 cm, con una malla de acero inoxidable en la parte superior. Esta jaula de prueba permite la aplicación de estímulos mecánicos a la espalda. Para realizar la prueba, se afeita la espalda del animal en la región de interés, y se marca el área de prueba para repetir la prueba en diferentes días, según sea necesario. El umbral mecánico se determina con filamentos de Von Frey aplicados a los músculos paraespinales, utilizando el método arriba-abajo descrito anteriormente. Las respuestas positivas incluyen (1) espasmos musculares, (2) arqueamiento (extensión de la espalda), (3) rotación del cuello (4) rascarse o lamer la espalda, y (5) escapar. Esta prueba conductual (Back Mechanical Sensitivity (BMS)) es útil para la investigación mecanicista con modelos roedores de dolor de espalda para el desarrollo de intervenciones terapéuticas para la prevención y el manejo del dolor de espalda.
Introduction
El dolor lumbar (DL) es la principal causa de discapacidad en todo el mundo, lo que tiene consecuencias personales, económicas y sociales dramáticas 1,2,3,4. Cada año, aproximadamente el 37% de la población se ve afectada por LBP5. El dolor lumbar generalmente se resuelve en unas pocas semanas, pero recurre en el 24% -33% de los individuos, volviéndose crónico en el 5% -10% de los casos2. Para comprender los mecanismos e impactos del dolor lumbar, así como los efectos de diferentes intervenciones terapéuticas, se han utilizado varios modelos animales de dolor lumbar, imitando condiciones clínicas o algunos componentes del dolor lumbar6. Estos modelos de ratón y rata se pueden clasificar en una o más de las siguientes categorías: (1) dolor lumbar discogénico7,8,, (2) dolor lumbar radicular8,9,10,11, (3) osteoartritis de la articulación facetaria 12 y (4) dolor lumbar inducido por músculo 13,14 . Dado que el dolor no puede ser medido directamente en especies no humanas, se han desarrollado numerosas pruebas para cuantificar comportamientos similares al dolor en estos modelos8. Estas pruebas evalúan comportamientos evocados por un estímulo nocivo (fuerza mecánica 15,16,17, estimulación térmica 18,19,20,21,22,23,24,25) o producidos espontáneamente26,27,28,29.
Los métodos que utilizan estímulos mecánicos incluyen la prueba de Von Frey 15,16 y la prueba de Randall-Selitto17. Los métodos que utilizan estímulos de calor incluyen la prueba de movimiento de cola18, la prueba de placa caliente19, la prueba de Hargreaves20 y la prueba de sonda térmica21. Los métodos que utilizan estímulos fríos incluyen la prueba de placa fría22, la prueba de evaporación de acetona 23 y el ensayo plantar frío24. Los métodos para los comportamientos espontáneos incluyen las escalas de muecas 26, madriguera 27, análisis de soporte de peso y marcha28, así como un análisis de comportamiento automatizado29. A pesar de estas numerosas pruebas disponibles, ninguna de ellas está diseñada específicamente para modelos de dolor de espalda.
El objetivo de este estudio es establecer una prueba simple y accesible para evaluar la sensibilidad mecánica en la espalda de ratas. La técnica se basa en gran medida en la prueba de Von Frey aplicada a la superficie plantar de la pata trasera15,16. El principio básico de la prueba de Von Frey es utilizar una serie de monofilamentos para la región de interés, entregando fuerzas constantes predeterminadas. Una respuesta se considera positiva si la rata muestra un comportamiento nocifensivo. El umbral mecánico se puede calcular en función de los filamentos que evocaron respuestas. En el presente estudio, se proporciona un método simple y accesible adaptado de la prueba de Von Frey para determinar la sensibilidad mecánica en la espalda de ratas.
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Protocol
El protocolo experimental fue aprobado por el comité de cuidado animal de la Université du Québec à Trois-Rivières y se ajustó a las Directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de los Animales y las Directrices del Comité de Investigación y Cuestiones Éticas de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (IASP). El presente estudio utilizó seis ratas Wistar macho (peso corporal: 320-450 g; edad: 18-22 semanas). Los animales fueron obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Los datos de estas ratas provienen de la muestra más grande de un estudio previo30.
1. Preparación experimental
- Aloje a los animales en una habitación con temperatura controlada en instalaciones estándar para animales con acceso a alimentos y agua ad libitum y un ciclo de luz-oscuridad de 14 h-10 h. Asegúrese de que todos los animales estén en buen estado de salud el día de los experimentos.
- Genere el modelo animal de dolor de espalda crónico siguiendo los pasos a continuación.
- Para inducir dolor de espalda crónico, realizar una inyección intramuscular de Adyuvante Freund Completo (CFA) en los músculos de la espalda siguiendo los informes anteriores 14,30,31.
- Anestesiar al animal con isoflurano (4% para inducción y 2%-2,5% para mantenimiento).
- Usando una aguja de 27 G, inyecte 150 μL de una emulsión de agua en aceite lista para usar de CFA (consulte la Tabla de materiales) en los músculos paraespinales de forma unilateral o bilateral, según las necesidades del protocolo.
- Mantenga la aguja de inyección en su lugar durante al menos 3 minutos después de completar la inyección. Para los animales en el grupo de control, use los mismos procedimientos30, pero inyecte una solución de solución salina fisiológica estéril (150 μL, 0.9%) en lugar de CFA.
- Fabrica la jaula de prueba.
- Haga una jaula de prueba para dos animales que comprenda una cámara para cada animal.
NOTA: Para el presente estudio, cada cámara tiene las siguientes dimensiones: largo x ancho x alto: 50 x 20 x 7 cm (ver Tabla de Materiales). - Monte las dos cámaras contiguas en cuatro patas de plexiglás de 33 cm de largo. Use plexiglás transparente para las paredes de las cámaras, pero use plexiglás negro para separar las cámaras para evitar que los animales se vean entre sí.
- Utilice una malla de acero inoxidable hecha de alambre de 1 mm con una distancia entre hilos de 8 mm para hacer el piso y el techo de la jaula de prueba (Figura 1).
- Haga una jaula de prueba para dos animales que comprenda una cámara para cada animal.
2. Prueba de sensibilidad mecánica trasera (BMS)
- Familiarice al animal con la jaula de prueba 30 min/día durante 5-7 días consecutivos antes de la primera prueba. Repita la prueba según sea necesario.
- Anestesiar a los animales usando isoflurano al 2%31 (ver Tabla de Materiales).
- En posición prona bajo anestesia con isoflurano, afeite el pelo posterior del área de interés (de los niveles vertebrales T6 a L6) con un recortador de pelo de animal (ver Tabla de materiales). Para medidas repetidas, afeite el vello de la espalda cada 3 días en un día sin evaluación del comportamiento para garantizar que los estímulos siempre se apliquen directamente sobre la piel. Dibuje una marca negra en la piel con un marcador permanente para asegurarse de que los filamentos siempre se apliquen en la misma área cuando se repita la prueba en días diferentes.
- El día de la prueba, coloque a los animales en la jaula de prueba durante 15-30 minutos antes de la prueba hasta que el animal esté tranquilo.
- Durante la prueba, aplicar filamentos de Von Frey (0.07, 0.16, 0.4, 0.6, 1, 2, 4, 6, 10, 15 y 26 g) perpendicularmente a la espalda, siempre comenzando con el filamento de 2 g y utilizando el método arriba-abajo15 (ver Tabla de materiales). Acércate lentamente a la espalda del animal con el filamento por detrás del animal.
- Aplique el filamento solo cuando el animal esté despierto, parado sobre sus cuatro patas y sin moverse. Aplicar el filamento durante 2 s bilateralmente a la zona de interés, a 10 mm de la apófisis espinosa (Figura 2), cada 15-30 s.
NOTA: Una respuesta se considera positiva si el animal exhibe uno o más de los siguientes comportamientos durante o inmediatamente después de aplicar el filamento: (1) espasmos musculares, (2) arqueamiento (extensión de la espalda), (3) rotación del cuello para mirar la espalda, (4) rascarse o lamer la espalda, y (5) escapar.
- Aplique el filamento solo cuando el animal esté despierto, parado sobre sus cuatro patas y sin moverse. Aplicar el filamento durante 2 s bilateralmente a la zona de interés, a 10 mm de la apófisis espinosa (Figura 2), cada 15-30 s.
- Como se describió anteriormente15, si no se observa respuesta con la aplicación de un filamento, aplique el siguiente filamento con una fuerza mayor en la serie. Si se observa una respuesta, use el siguiente filamento con una fuerza menor en la serie. Continúe este procedimiento hasta que se obtengan cuatro lecturas después del primer cambio de comportamiento (respuesta después de una serie de "sin respuesta" o sin respuesta después de una serie de "respuesta").
- Una vez completada la recolección de datos, calcular el valor que representa el 50% del umbral mecánico, como lo describen Chaplan et al.15, utilizando esta fórmula:
Umbral del 50% (g) = 10(Xf+kδ)/10 000
NOTA: En esta fórmula, "Xf" es la marca de mango del último filamento von Frey que se utilizó. "k" es el valor tabular basado en el patrón de respuesta del animal15, y "δ" es la media de los incrementos de Handle Mark entre los filamentos de Von Frey. Dependiendo del diseño experimental y las necesidades experimentales, solo se puede evaluar un lado de la columna vertebral para informar un umbral, o se pueden evaluar dos lados, y los umbrales se informan por separado o como una media. Consulte el cuadro complementario 1 para la plantilla de cálculo32.
3. Recuperación animal
- Después de completar la inyección intramuscular, suspenda la anestesia y coloque al animal solo en una jaula de alojamiento estándar para su recuperación.
- Durante el período de recuperación, examine el comportamiento del animal y no lo deje desatendido.
- Confirme que el animal se recupera de la anestesia y se mueve normalmente dentro de los 5 minutos. Luego, devuelva al animal a su jaula de alojamiento habitual con los otros animales.
NOTA: Al final del experimento, el animal se perfunde a través del corazón con una solución de formalina al 10%, bajo anestesia profunda con isoflurano (5%). Los músculos de la espalda en el área inyectada se extraen para la histología y la confirmación de los cambios inflamatorios.
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Representative Results
El método fue utilizado en un estudio previo, en el que se presentaron datos completos y estadísticas para comparar la sensibilidad mecánica de la espalda entre CFA y ratas control30. Los datos individuales representativos (media de los umbrales izquierdo y derecho) de seis ratas incluidas en el estudio anterior se presentan en la Figura 3 y la Tabla 1. Al inicio del estudio, la sensibilidad mecánica fue similar entre los grupos. La inyección intramuscular de CFA en los músculos lumbares causó un marcado aumento de la sensibilidad mecánica (umbral disminuido) de 7 días a 28 días después de la inyección de CFA. En contraste, las ratas de control (CTL) no mostraron este cambio. Como se muestra en la Figura 3, se observó variabilidad dentro y entre los animales, como se esperaba con este tipo de evaluación del comportamiento. Sin embargo, las ratas CFA hipersensibles mostraron una disminución de la variabilidad. Según el estudio anterior, 30, 16 animales (8 CFA y 8 CTL) son suficientes para detectar un efecto significativo entre los grupos a lo largo del tiempo (η2p =0,38) durante 5 puntos temporales.
En este estudio, la presencia de cambios inflamatorios crónicos en los músculos inyectados con CFA fue confirmada por el examen histológico (Figura 4)30. Además, se observó hipersensibilidad mecánica en la pata trasera con una prueba estándar de Von Frey, además de la espalda (Figura 5)30. En estudios previos con el mismo modelo de dolor de espalda, mostramos aumento del comportamiento del dolor espontáneo y cambios neuroinflamatorios y neurofisiológicos14,31. De hecho, los comportamientos de lamido aumentaron en CFA en comparación con las ratas control durante la prueba de formalina, y las respuestas de una sola unidad a la estimulación nociva del nervio ciático se alteraron en la amígdala derecha31. Además, la expresión de la proteína NF-kB fue aumentada en la médula espinal de CFA en comparación con ratas control14. Juntos, los resultados de estos estudios validan este modelo de dolor de espalda crónico, y el presente estudio demuestra visualmente cómo confirmar la presencia de hipersensibilidad mecánica en la parte posterior de este modelo de rata.
Figura 1: Jaula de prueba de sensibilidad mecánica trasera (BMS). (A) Dibujo esquemático de la jaula de prueba. B) Jaula de ensayo hecha a medida compuesta por dos cámaras, una para cada animal. (C) Vista lateral de la jaula de prueba con una rata en una de las cámaras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de la sensibilidad mecánica de la espalda. El experimentador se acerca al animal por detrás y aplica el filamento de Von Frey al área de interés, a 10 mm lateralmente de la apófisis espinosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos individuales de sensibilidad mecánica de la espalda. Sensibilidad mecánica de la espalda en ratas CFA y control (CTL), al inicio y 7, 14, 21 y 28 días después de la inyección intramuscular de CFA o solución salina, respectivamente. Los datos individuales se muestran mediante círculos llenos de gris (CTL) y negro (CFA). Las barras horizontales indican las medias. Las barras de error indican el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Confirmación histológica de inflamación muscular crónica. Ejemplos individuales de músculos de la espalda de ratas CFA y controles30. (A) Músculo sano de la espalda de una rata control 14 días después de la inyección intramuscular de solución salina. (B-C) Los músculos de la espalda de dos ratas tratadas con CFA mostraron inflamación crónica 14 días después de la inyección intramuscular de CFA, con una clara infiltración de leucocitos. La coloración hematoxilina-eosina se utilizó para teñir las rodajas musculares. Barra de escala = 250 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Hipersensibilidad mecánica en ratas CFA30. Curso de tiempo de sensibilidad mecánica durante 4 semanas, después de la inyección de CFA (n = 8) o solución salina (n = 8) en los músculos de la espalda (nivel L5-L6). (A-B) Sensibilidad mecánica debajo de las patas traseras izquierda y derecha. Los umbrales mecánicos se redujeron significativamente en CFA en comparación con las ratas control (P < 0.01) a lo largo del tiempo. Este efecto no fue significativamente diferente entre las patas traseras izquierda y derecha (P = 0,7). Para ambas patas traseras combinadas, la prueba Tukey HSD reveló umbrales mecánicos más bajos en CFA en comparación con las ratas control, de 1 semana a 4 semanas después de la inyección (todas las P < 0.03). Los cursos de tiempo para patas traseras separadas se muestran solo con fines ilustrativos (la interacción no es significativa, consulte los resultados para obtener más detalles). (C-D) Sensibilidad mecánica en la espalda. Los umbrales mecánicos se redujeron significativamente en CFA en comparación con las ratas control (P < 0.001) a lo largo del tiempo. Este efecto no fue significativamente diferente entre los sitios de evaluación izquierdo y derecho (P = 0,3). Para los sitios de evaluación izquierda y derecha combinados, la prueba Tukey HSD reveló un umbral mecánico más bajo en CFA en comparación con las ratas control, de 1 semana a 4 semanas después de la inyección (todas las P < 0.05). Los cursos de tiempo para patas traseras separadas se muestran solo con fines ilustrativos (la interacción no es significativa, consulte los resultados para obtener más detalles). En el panel (D), los datos individuales de una rata CFA no se muestran en la línea de base (9,6 g) con fines ilustrativos. Las áreas sombreadas representan la evaluación de referencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Rata | Grupo | Referencia | Día 7 | Día 14 | Día 21 | Día 28 |
| 1 | 2.34 | 0.29 | 0.12 | 0.29 | 0.29 | |
| 2 | CFA | 1 | 0.48 | 0.05 | 0.48 | 0.08 |
| 3 | 1.26 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.19 | |
| Media ± SD | 1,53 ± 0,58 | 0,27 ± 0,18 | 0,07 ± 0,03 | 0,27 ± 0,18 | 0,19 ± 0,09 | |
| 4 | 1.59 | 2.61 | 0.64 | 3.26 | 2.45 | |
| 5 | CTL | 1.15 | 0.63 | 3.41 | 2.3 | 1.29 |
| 6 | 0.43 | 1.26 | 0.77 | 0.32 | 2.09 | |
| Media ± SD | 1,06 ± 0,48 | 1,50 ± 0,83 | 1,61 ± 1,28 | 1,96 ± 1,22 | 1,94 ± 0,48 |
Tabla 1: Ejemplos individuales de sensibilidad mecánica de la espalda en ratas CFA y control.
Cuadro complementario 1: Determinación del umbral mecánico. Esta tabla de plantilla se utiliza para calcular el umbral mecánico. Se anota el patrón de respuestas (X/O) y se introducen los valores necesarios para el cálculo solo para Xf y k, correspondientes al Handle Marking del último filamento que se utilizó para la prueba y al valor k asociado al patrón de respuesta, en este caso, XX seguido de OOXXO. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Pasos críticos
La prueba BMS es un método simple para evaluar la sensibilidad mecánica en la espalda de ratas, ya sea en un momento dado o repetidamente durante días o semanas, cuando se espera que ocurran cambios (modelos de dolor) o después de una intervención farmacológica o no farmacológica. Los problemas críticos del método incluyen la jaula de prueba, cuyas dimensiones deben garantizar que la rata esté cómoda pero no se mueva demasiado. La espalda del animal debe permanecer accesible a través del techo de malla para una estimulación mecánica reproducible. Para limitar la variabilidad en la evaluación del umbral, el área posterior bajo investigación debe afeitarse para que los estímulos mecánicos se apliquen directamente a la piel. Además, la piel necesita ser marcada para que los estímulos mecánicos se apliquen a la misma área. Por último, el experimentador debe acercar el filamento a la piel desde detrás del animal para evitar ser visto por el animal.
En comparación con la prueba de Von Frey utilizada para evaluar la sensibilidad mecánica en la pata trasera15,16, la fuerza mecánica necesaria para producir una respuesta positiva en la prueba BMS es menor. Los filamentos utilizados para la prueba deben seleccionarse cuidadosamente. El uso de los siguientes filamentos debe cubrir la mayoría de las necesidades experimentales (0,07, 0,16, 0,4, 0,6, 1, 2, 4, 6, 10, 15 y 26 g) y evitar que se enfrente a un techo o un efecto suelo. En este caso, el filamento de 2 g se utiliza para la primera aplicación. Esto se puede adaptar a las necesidades experimentales siempre que el cálculo se ajuste en consecuencia.
Modificaciones y solución de problemas
Durante un experimento piloto, se determinó el área ideal para la prueba. Debido a la forma del cuerpo de la rata, la región toracolumbar es el área más accesible en la jaula de prueba. Si no hay razón para que la prueba se realice en otras regiones de la columna vertebral, esta es el área de elección para aplicar estímulos mecánicos. La zona lumbar también es de fácil acceso. Al decidir qué área probar, debe tenerse en cuenta que el filamento debe aplicarse perpendicularmente a la superficie y doblarse correctamente para entregar la fuerza calibrada predeterminada.
Limitaciones
El experimentador debe estar entrenado para observar los comportamientos asociados con la prueba. Las cinco respuestas positivas incluyen espasmos musculares, arqueamiento, rotación del cuello para mirar la espalda, lamer o rascarse la espalda y escapar de30. Si bien la mayoría de estas respuestas son fácilmente observables, las contracciones musculares a veces son sutiles para estímulos de menor fuerza. Además, la rata puede moverse espontáneamente en la jaula, por lo que esto no debe confundirse con el escape, que ocurre específicamente cuando se aplica el filamento. Para evitar confundir ambos comportamientos, el experimentador debe esperar a que el animal esté tranquilo durante al menos unos segundos.
Importancia y aplicaciones potenciales
Varios modelos de roedores de dolor de espalda se utilizan en las investigaciones actuales8. Sorprendentemente, sin embargo, no se validó ninguna prueba de comportamiento estandarizada para evaluar la sensibilidad mecánica en modelos de dolor de espalda. Esto es crítico para confirmar que los animales con presunto dolor de espalda presentan hipersensibilidad local a los estímulos nociceptivos, y para monitorear la sensibilidad durante las intervenciones diseñadas para aliviar el dolor de espalda. La prueba BMS presentada aquí proporciona una solución simple y accesible para estos fines. Aunque fue desarrollado para ratas30, puede adaptarse a otros animales de laboratorio en el futuro.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses o relaciones en conflicto que puedan conducir a conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fondation Chiropratique du Québec y el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (MP: subvención #06659). La contribución de HK fue apoyada por la Université du Québec à Trois-Rivières (programa PAIR). La contribución de BP fue apoyada por el Fonds de recherche du Québec en Santé (FRQS) y la Fondation Chiropratique du Québec. La contribución de TP fue apoyada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá. La contribución de NE y EK fue apoyada por la Fondation Chiropratique du Québec. La contribución de MP fue apoyada por el FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerrane (isoflurane, USP) - Veterinary Use Only | Baxter | NDC 10019-773-60 | Inhalation Anaesthetic ; DIN 02225875, for inducing anasthesia |
| Complete Freund Adjuvant (CFA) | Fisher Scientific | #77140 | Water-in-oil emulsion of Complete Freund Adjuvant (CFA) with killed cells of Mycobacterium butyricum. |
| Male Wistar Rats | Charles River Laboratories | body weight: 320–450 g; age: 18-22 weeks. | |
| Penlon Sigma Delta Vaporizer | Penlon | 990-VI5K-SVEEK | Penlon Sigma Delta Vaporizer used for anasthesia |
| Sharpie Permanent Marker | Sharpie | BC23636 | Permanent Marker, Fine Point, Black |
| Test cage | Custom-made | Width: 20 cm; Length: 50 cm; Height from the bottom to the top: 40 cm; Height from the bottom mesh to the top of the cage: 7 cm; Wall thickness: 5 mm; Mesh: 1 mm wire with an 8 mm inter-wire distance | |
| Von Frey Filaments | Aesthesio, Precise Tactile Sensory Evaluator | 514000-20C | Filaments from 0.07 g to 26 g |
| Wahl Professional Animal, ARCO Cordless Pet Clipper, Trimmer Grooming | Wahl | Kit #8786-1201 | Animal hair trimmer, for shaving purposes, zero blade |
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