Summary
腰痛の予防と管理のための新しい治療的介入を開発するためには、動物モデルがトランスレーショナルの観点からこれらの治療法のメカニズムと有効性を調べる必要があります。本プロトコールは、ラットにおける背部機械的感受性を評価するための標準化された方法であるBMS試験を記載する。
Abstract
腰痛は世界中の障害の主な原因であり、個人的、経済的、社会的に劇的な結果をもたらします。新規治療法の開発には、トランスレーショナルな観点から新規治療法のメカニズムと有効性を調べるための動物モデルが必要です。現在の調査では、腰痛のいくつかのげっ歯類モデルが使用されています。しかし、驚くべきことに、腰痛モデルの機械的感度を評価するための標準化された行動テストは検証されていませんでした。これは、腰痛と推定される動物が侵害受容刺激に対して局所的な過敏症を示すことを確認し、腰痛を和らげるように設計された介入中の感度を監視するために重要です。この研究の目的は、ラットの背中の機械的感受性を評価するための簡単でアクセス可能なテストを設定することです。この方法のために特別にテストケージが製造されました。長さx幅x高さ:50 x 20 x 7 cm、上部にステンレス鋼メッシュがあります。このテストケージは、背中に機械的刺激を加えることを可能にします。試験を実施するには、動物の背中を関心領域で剃り、必要に応じて異なる日に試験を繰り返すように試験領域にマークを付ける。機械的閾値は、前述のアップダウン法を利用して、傍脊髄筋に適用されるフォンフレイフィラメントによって決定されます。肯定的な反応には、(1)筋肉のけいれん、(2)アーチ(背中の伸展)、(3)首の回転、(4)背中を引っ掻く、または舐める、(5)逃げるなどがあります。この行動テスト(背部機械的感受性(BMS)テスト)は、腰痛の予防と管理のための治療的介入の開発のための腰痛のげっ歯類モデルを用いた機構研究に役立ちます。
Introduction
腰痛(LBP)は、世界中の障害の主な原因であり、個人的、経済的、社会的に劇的な影響を及ぼします1,2,3,4。毎年、人口の約37%がLBP5の影響を受けています。LBPは通常数週間以内に解消しますが、個人の24%〜33%で再発し、症例の5%〜10%で慢性化します2。LBPのメカニズムと影響、およびさまざまな治療介入の効果を理解するために、臨床状態またはLBP6のいくつかの成分を模倣したLBPのいくつかの動物モデルが使用されてきました。これらのマウスおよびラットモデルは、以下のカテゴリーの1つ以上に分類することができる:(1)椎間板形成性LBP7,8、(2)神経根性LBP 8,9,10,11、(3)椎間関節変形性関節症12、および(4)筋肉誘発性LBP 13,14.痛みはヒト以外の種では直接測定できないため、これらのモデルで痛みのような行動を定量化するために多数のテストが開発されています8。これらのテストは、有害な刺激(機械的力15,16,17、熱刺激18,19,20,21,22,23,24,25)によって引き起こされる、または自発的に生成された行動を評価します26,27,28,29。
機械的刺激を使用する方法には、フォンフレイテスト15,16およびランドールセリットテスト17が含まれます。熱刺激を使用する方法には、テールフリックテスト18、ホットプレートテスト19、ハーグリーブステスト20、およびサーマルプローブテスト21が含まれます。低温刺激を使用する方法には、コールドプレート試験22、アセトン蒸発試験23、および冷足底アッセイ24が含まれる。自発的行動のための方法には、しかめっ面スケール26、穴掘り27、体重負荷および歩行分析28、ならびに自動行動分析29が含まれる。これらの多数の利用可能なテストにもかかわらず、それらのどれも腰痛モデルのために特別に設計されていません。
この研究の目的は、ラットの背中の機械的感受性を評価するための簡単でアクセス可能なテストを設定することです。この技術は、主に後足15,16の足底表面に適用されるフォンフライテストに基づいています。フォンフライテストの基本原理は、一連のモノフィラメントを関心領域に使用し、一定の事前に決定された力を提供することです。ラットが侵害行動を示した場合、応答は陽性と見なされます。次に、機械的閾値は、応答を誘発したフィラメントに基づいて計算することができる。本研究では、ラットの背中の機械的感受性を決定するために、フォンフライテストから適応された簡単でアクセス可能な方法が提供されます。
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Protocol
実験プロトコルは、ケベック大学トロワリビエール大学の動物飼育委員会によって承認され、カナダ動物飼育評議会のガイドラインおよび国際疼痛学会(IASP)の研究および倫理問題委員会のガイドラインに準拠しました。本研究では、6匹の雄のWistarラット(体重:320〜450 g、年齢:18〜22週)を使用しました。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。これらのラットからのデータは、以前の研究30のより大きなサンプルからのものである。
1. 実験準備
- 動物を標準的な動物施設の温度管理された部屋に収容し、食物と水を 自由に 利用でき、14時間から10時間の明暗サイクルで飼育します。実験当日、すべての動物が健康であることを確認してください。
- 以下の手順に従って慢性腰痛動物モデルを生成します。
- 慢性腰痛を誘発するには、以前の報告14,30,31に続いて、背中の筋肉に完全フロイントアジュバント(CFA)の筋肉内注射を行います。
- イソフルラン(誘導のために4%および維持のために2%〜2.5%)を使用して動物を麻酔する。
- 27 Gの針を使用して、プロトコルのニーズに応じて、すぐに使用できるCFAの油中水型エマルジョン( 材料の表を参照)150 μLを片側または両側の傍脊髄筋に注入します。
- 注射が完了した後、少なくとも3分間注射針を所定の位置に保ちます。対照群の動物については、同様の手順30を使用するが、CFAの代わりに滅菌生理食塩水(150μL、0.9%)の溶液を注入する。
- テストケージを製作します。
- 動物ごとに1つのチャンバーで構成される2匹の動物用のテストケージを作成します。
注:本研究では、各チャンバーの寸法は、長さx幅x高さ:50 x 20 x 7 cmです( 材料の表を参照)。 - 2つの隣接するチャンバーを長さ33cmのプレキシガラスの4本の脚に取り付けます。チャンバーの壁には透明なプレキシガラスを使用しますが、動物がお互いを見るのを防ぐために、チャンバーを分離するには黒いプレキシガラスを使用します。
- テストケージの床と天井を作るために、1mmのワイヤーで8mmのワイヤーで作られたステンレス鋼メッシュを使用します(図1)。
- 動物ごとに1つのチャンバーで構成される2匹の動物用のテストケージを作成します。
2.バックメカニカル感度(BMS)テスト
- 最初の試験の前に、動物を30分/日、5〜7日間連続して試験ケージに慣れさせます。必要に応じてテストを繰り返します。
- 2%イソフルラン31 を使用して動物を麻酔します( 材料の表を参照)。
- イソフルラン麻酔下で腹臥位で、動物の毛髪トリマーを使用して、関心のある領域の後ろ毛(T6からL6の椎骨レベル)を剃ります( 材料の表を参照)。繰り返し測定する場合は、行動評価なしで1日3日ごとに後ろ髪を剃り、常に肌に直接刺激が与えられるようにします。異なる日にテストを繰り返すときにフィラメントが常に同じ領域に適用されるように、永久マーカーで皮膚に黒いマークを描きます。
- 試験当日、動物が落ち着くまで、試験前に動物を試験ケージに15〜30分間入れます。
- テスト中、フォンフレイフィラメント(0.07、0.16、0.4、0.6、1、2、4、6、10、15、および26 g)を背面に垂直に適用し、常に2 gフィラメントから始めて、アップダウン法15 を使用します( 材料の表を参照)。動物の後ろからフィラメントでゆっくりと動物の背中に近づきます。
- 動物が目を覚ましていて、4本の足で立っていて、動いていないときにのみフィラメントを塗ります。フィラメントを、棘突起から10 mmの関心のある領域に2秒間、15〜30秒ごとに30秒間適用します。
注:動物がフィラメントの適用中または適用直後に次の1つ以上の行動を示す場合、反応は陽性と見なされます:(1)筋肉のけいれん、(2)アーチ(背中の伸展)、(3)背中を見るための首の回転、(4)背中を引っ掻くまたはなめる、および(5)逃げる。
- 動物が目を覚ましていて、4本の足で立っていて、動いていないときにのみフィラメントを塗ります。フィラメントを、棘突起から10 mmの関心のある領域に2秒間、15〜30秒ごとに30秒間適用します。
- 前述の15のように、フィラメントの適用で応答が観察されない場合は、直列でより高い力で次のフィラメントを適用します。応答が観察された場合は、直列の力が低い次のフィラメントを使用します。最初の行動変化の後に4つの読み取り値が得られるまでこの手順を続けます(一連の「応答なし」の後の応答または一連の「応答」の後に応答なし)。
- データ収集が完了したら、次の式を使用して、Chaplanら15で説明されているように、機械的しきい値の50%を表す値を計算します。
50% 閾値 (g) = 10(Xf+kδ)/10 000
注:この式では、「Xf」は最後に使用されたフォンフレイフィラメントのハンドルマークです。「k」は動物の応答パターン15に基づく表の値であり、「δ」はフォンフレイフィラメント間のハンドルマークの増分の平均です。実験デザインと実験のニーズに応じて、脊椎の片側のみを評価して1つの閾値を報告することも、両側を評価して閾値を別々に、または平均として報告することもできます。計算テンプレート32については別表1を参照されたい。
3.動物の回復
- 筋肉内注射が完了したら、麻酔を中止し、回復のために動物を標準のハウジングケージに単独で入れます。
- 回復期間中は、動物の行動を調べ、放置しないでください。
- 動物が麻酔から回復し、5分以内に正常に動くことを確認します。次に、動物を他の動物と一緒に通常の飼育ケージに戻します。
注:実験の終わりに、動物は深いイソフルラン麻酔(5%)下で10%ホルマリン溶液で心臓を通して灌流されます。次に、注射部位の背筋を抽出して、組織学と炎症性変化を確認します。
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Representative Results
この方法は以前の研究で使用され、CFAと対照ラット30の間の機械的感受性を比較するために完全なデータと統計が提示されました。前の研究に含まれる6匹のラットからの代表的な個体データ(左右の閾値の平均)を 図3 および 表1に示す。ベースラインでは、機械的感受性は群間で類似していた。腰部筋肉へのCFAの筋肉内注射は、CFA注射後7日から28日にかけて機械的感受性の著しい増加(閾値の低下)を引き起こした。対照的に、対照(CTL)ラットはこの変化を示さなかった。 図3に示すように、この種の行動評価で予想されるように、動物内および動物間で変動が観察されました。しかし、過敏性CFAラットは変動性の減少を示した。以前の研究30に基づいて、16匹の動物(8 CFAおよび8 CTL)は、5つの時点(η2p = 0.38)にわたってグループ間の有意な効果を検出するのに十分です。
この研究では、CFAを注射した筋肉の慢性炎症性変化の存在が組織学的検査によって確認されました(図4)30。また、背中に加えて、標準的なフォンフライテストで後足に機械的過敏症が観察されました(図5)30。同じ腰痛モデルを用いた以前の研究では、自発的な疼痛行動の増加と神経炎症性および神経生理学的変化が示されました14,31。実際、ホルマリン試験中の対照ラットと比較してCFAで舐め行動が増加し、坐骨神経の有害な刺激に対する単一ユニットの反応が右扁桃体で変化しました31。さらに、NF-kBタンパク質発現は、対照ラット14と比較してCFAの脊髄において増加した。まとめると、これらの研究の結果はこの慢性腰痛モデルを検証し、本研究は、このラットモデルの後ろに機械的過敏症の存在を確認する方法を視覚的に示しています。
図1:背面機械的感度(BMS)テストケージ 。 (A)テストケージの概略図。(B)動物ごとに1つずつ、2つのチャンバーで構成されるカスタムメイドのテストケージ。(C)チャンバーの1つにラットがいるテストケージの側面図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:バックメカニカル感度評価。 実験者は後ろから動物に近づき、フォンフレイフィラメントを棘突起から横方向に10 mmの関心領域に適用します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:背面の機械的感度の個々の例。 CFAおよび対照(CTL)ラットにおける背中の機械的感受性、ベースライン時およびCFAまたは生理食塩水の筋肉内注射後7、14、21、および28日でそれぞれ。個々のデータは、灰色 (CTL) と黒 (CFA) で塗りつぶされた円で示されます。水平バーは平均を示します。エラーバーは平均の標準誤差を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:慢性筋肉炎症の組織学的確認。CFAラットおよび対照30由来の背筋の個々の例。 (a)生理食塩水の筋肉内注射の14日後に対照ラットからの健康な背筋。(B-C)CFA処理ラット2匹の背筋は、CFA注射の14日後に慢性炎症を示し、白血球浸潤が明らかでした。ヘマトキシリン-エオジンの着色は、筋肉スライスの染色に使用されました。スケールバー = 250 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:CFAラット30における機械的過敏症。背筋へのCFA(n=8)または生理食塩水(n=8)のいずれかの注射(L5-L6レベル)に続く、4週間にわたる機械的感受性の経時変化。(A-B)左右の後足の下の機械的感度。機械的閾値は、対照ラットと比較してCFAで有意に減少した(P < 0.01)。この効果は左右の後足で有意差はなかった(P = 0.7)。両方の後足を合わせたTukey HSD試験では、対照ラットと比較して、注射後1週間から4週間まで、CFAの機械的閾値が低いことが明らかになりました(すべてのP<0.03)。別々の後足の時間経過は、説明のみを目的として示されています(相互作用は有意ではありません、詳細については結果を参照してください)。(C-D)背中の機械的感度。機械的閾値は、対照ラットと比較してCFAで有意に減少した(P < 0.001)。この効果は、左右の評価部位間で有意差はなかった(P = 0.3)。左右の評価部位を合わせたTukey HSD試験では、対照ラットと比較して、注射後1週間から4週間まで、CFAの機械的閾値が低いことが明らかになりました(すべてのP<0.05)。別々の後足の時間経過は、説明のみを目的として示されています(相互作用は有意ではありません、詳細については結果を参照してください)。パネル(D)では、1匹のCFAラットの個々のデータは、説明のためにベースライン(9.6 g)に示されていません。.影付きの領域は、ベースライン評価を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 鼠 | 群 | ベースライン | 7日目 | 14日目 | 21日目 | 28日目 |
| 1 | 2.34 | 0.29 | 0.12 | 0.29 | 0.29 | |
| 2 | ティッカー | 1 | 0.48 | 0.05 | 0.48 | 0.08 |
| 3 | 1.26 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.19 | |
| 平均±SDの | 1.53 ± 0.58 | ±0.27±±0.18 | ±0.07± ±0.03 | ±0.27±±0.18 | ±0.19±±0.09 | |
| 4 | 1.59 | 2.61 | 0.64 | 3.26 | 2.45 | |
| 5 | ティッカー | 1.15 | 0.63 | 3.41 | 2.3 | 1.29 |
| 6 | 0.43 | 1.26 | 0.77 | 0.32 | 2.09 | |
| 平均±SDの | 1.06 ± 0.48 | 1.50 ± 0.83 | 1.61 ± 1.28 | 1.96 ± 1.22 | 1.94± 0.48 |
表1:CFAおよび対照ラットにおける背部機械的感受性の個々の例。
補足表1:機械的閾値の決定。 このテンプレートテーブルは、機械的なしきい値を計算するために使用されます。応答のパターン(X/O)が記録され、計算に必要な値は、テストに使用された最後のフィラメントのハンドルマーキングと応答パターンに関連付けられたk値(この場合はXXの後にOOXXO)に対応するXfとkに対してのみ入力されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
重要な手順
BMSテストは、変化が起こると予想されるとき(疼痛モデル)、または薬理学的または非薬理学的介入後に、ある時点で、または数日または数週間にわたって繰り返し、ラットの背中の機械的感受性を評価する簡単な方法です。この方法の重要な問題には、ラットが快適であるがあまり動かないことを保証しなければならない試験ケージが含まれる。動物の背中は、再現可能な機械的刺激のためにメッシュ天井からアクセス可能なままでなければなりません。閾値評価のばらつきを制限するには、機械的刺激が皮膚に直接適用されるように、調査中の背部を剃る必要があります。さらに、機械的刺激が同じ領域に適用されるように皮膚にマークを付ける必要があります。最後に、実験者は、動物に見られないように、動物の後ろからフィラメントを皮膚に近づける必要があります。
後足15,16での機械的感度を評価するために使用されるフォンフライテストと比較して、BMSテストで陽性応答を生成するために必要な機械的力は低くなります。テストに使用するフィラメントは慎重に選択する必要があります。次のフィラメントを使用すると、ほとんどの実験ニーズ(0.07、0.16、0.4、0.6、1、2、4、6、10、15、および26 g)をカバーし、天井や床効果に直面するのを防ぐことができます。この場合、2gフィラメントが最初の用途に使用される。これは、計算がそれに応じて調整されている限り、実験のニーズに適合させることができます。
変更とトラブルシューティング
パイロット実験中に、テストの理想的な領域が決定されました。ラットの体の形のために、胸腰部はテストケージの中で最もアクセスしやすい領域です。脊椎の他の領域でテストを実行する理由がない場合、これは機械的刺激を適用するための選択領域です。腰部にも簡単にアクセスできます。テストする領域を決定するときは、フィラメントを表面に垂直に適用し、適切に曲げて、事前に決定された校正された力を提供する必要があることに注意する必要があります。
制限
実験者は、テストに関連する動作を観察するようにトレーニングされている必要があります。5つの肯定的な反応には、筋肉のけいれん、アーチ、背中を見るための首の回転、背中をなめるか引っ掻く、30を逃れるなどがあります。これらの反応のほとんどは簡単に観察できますが、筋肉のけいれんは、より低い力の刺激に対して微妙な場合があります。また、ラットはケージ内で自発的に動くかもしれないので、これは特にフィラメントが適用されたときに起こる逃げることと混同されてはならない。両方の行動を混乱させないために、実験者は動物が少なくとも数秒間落ち着くのを待たなければなりません。
意義と潜在的なアプリケーション
腰痛のいくつかのげっ歯類モデルが現在の調査で使用されています8。しかし、驚くべきことに、腰痛モデルの機械的感度を評価するための標準化された行動テストは検証されていませんでした。これは、腰痛と推定される動物が侵害受容刺激に対して局所的な過敏症を示すことを確認し、腰痛を和らげるように設計された介入中の感度を監視するために重要です。ここで紹介するBMSテストは、これらの目的のためのシンプルでアクセス可能なソリューションを提供します。ラット30用に開発されたが、将来的には他の実験動物に適応する可能性がある。
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Disclosures
著者は、利益相反につながる可能性のある競合する利益または関係を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、ケベック州カイロプラティック財団とカナダ自然科学工学研究評議会からの助成金(MP:助成金#06659)によってサポートされました。香港の貢献は、ケベック大学トロワリビエール大学(PAIRプログラム)によってサポートされました。BPの貢献は、ケベックアンサンテ財団(FRQS)とケベックカイロプラティック財団によってサポートされました。TPの貢献は、カナダ自然科学工学研究評議会によってサポートされました。NEとEKの貢献は、ケベックカイロプラティック財団によってサポートされました。MPの貢献はFRQSによってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerrane (isoflurane, USP) - Veterinary Use Only | Baxter | NDC 10019-773-60 | Inhalation Anaesthetic ; DIN 02225875, for inducing anasthesia |
| Complete Freund Adjuvant (CFA) | Fisher Scientific | #77140 | Water-in-oil emulsion of Complete Freund Adjuvant (CFA) with killed cells of Mycobacterium butyricum. |
| Male Wistar Rats | Charles River Laboratories | body weight: 320–450 g; age: 18-22 weeks. | |
| Penlon Sigma Delta Vaporizer | Penlon | 990-VI5K-SVEEK | Penlon Sigma Delta Vaporizer used for anasthesia |
| Sharpie Permanent Marker | Sharpie | BC23636 | Permanent Marker, Fine Point, Black |
| Test cage | Custom-made | Width: 20 cm; Length: 50 cm; Height from the bottom to the top: 40 cm; Height from the bottom mesh to the top of the cage: 7 cm; Wall thickness: 5 mm; Mesh: 1 mm wire with an 8 mm inter-wire distance | |
| Von Frey Filaments | Aesthesio, Precise Tactile Sensory Evaluator | 514000-20C | Filaments from 0.07 g to 26 g |
| Wahl Professional Animal, ARCO Cordless Pet Clipper, Trimmer Grooming | Wahl | Kit #8786-1201 | Animal hair trimmer, for shaving purposes, zero blade |
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