一种小鼠腹膜透析导管放置的逆行植入方法

Summary

本文描述了在小鼠模型中植入腹膜透析导管的程序的修改，以避免使用传统技术观察到的主要技术问题。

Abstract

小鼠模型用于探测腹膜透析（PD）的各个方面，例如腹膜炎症和纤维化。这些事件导致人类腹膜衰竭，由于其在管理终末期肾病（ESKD）患者方面具有深远的临床意义，因此仍然是一个紧张的研究领域。尽管PD及其相关并发症具有临床重要性，但目前的实验小鼠模型面临着影响模型性能的关键技术挑战。这些包括PD导管移位和扭结，通常需要更早移除导管。这些限制也推动了对更多动物完成研究的需求。针对这些缺点，本研究引入了技术改进和手术细微差别，以防止小鼠模型中常见的PD导管并发症。此外，这种改进的模型通过使用脂多糖注射诱导腹膜炎症和纤维化来验证。从本质上讲，本文描述了一种创建PD实验模型的改进方法。

Introduction

终末期肾病负担
慢性肾脏病（CKD）是一个全球性的健康问题¹。目前的估计表明，全世界有超过8.5亿人患有肾脏疾病。肾脏病的患病率几乎是糖尿病患者人数（4.22亿）的两倍，^{是全世界癌症}（4200万）或艾滋病毒/艾滋病患者（3670万）患病率的20倍以上2。大约七分之一的美国人患有CKD，每1，000名美国人中就有2名患有ESKD，需要肾移植或透析支持³。考虑到全球ESKD负担不断加重，优化透析技术至关重要³.

腹膜透析
在美国，PD 是一种治疗 ESKD 的未充分利用的方式。根据美国肾脏数据系统（USRDS）的数据，2020年PD患者患病率仅为11%4^，5。与中心血液透析（HD）相比，PD具有几个优势，包括更好的生活质量，更少的诊所就诊次数以及减少^{医疗保险支出6，7}。此外，PD是一种基于家庭的疗法，与严重感染（如菌血症和心内膜炎）的风险要低得多，这些感染通常与血液透析导管有关。此外，PD可以通过紧急启动方案快速启动，从而减少了使用留置血管导管开始透析^{的需求8。}PD被认为是儿科ESKD人群的首选透析方法⁹。

腹膜透析引起的腹膜损伤
PD需要将PD液（透析液）引入腹膜，随着时间的推移导致腹膜发炎和重塑。腹膜炎症会引发纤维化，最终导致膜超滤能力随着时间的推移而丧失。腹膜的保存是PD的一项重大挑战，进一步的研究对于确保从业者获得最佳临床实践至关重要。有完善的小鼠模型有助于进一步了解腹膜感染和炎症、溶质、水运输动力学和膜衰竭的病理生理机制;尽管如此，导管的技术问题通常会限制这些型号¹⁰。

分析腹膜变化
在ESKD患者中，透析液传统上通过具有深而浅表袖带的Tenkhoff导管引入腹膜腔。患者可能会出现导管相关并发症，包括导管迁移、输液疼痛和透析液引流不良¹¹，^12，13。已经为人类引入了两种主要类型的腹膜导管，盘绕或直管，以尽量减少这些并发症¹²。在原始导管上增加了一些修改，包括对传统双袖带导管的额外袖带，以延长PD导管的存活期¹¹。插入技术根据几个因素而有所不同，通过防止在生存后添加导管迁移，包括资源的可用性和专业知识水平¹⁴。

相比之下，与人腹膜导管相比，腹膜透析的小鼠模型在技术和目的上具有根本差异。例如，小鼠模型中的腹膜导管主要用于研究膜改变，较少用于双向引流功能。由于动物的处理，目前的技术存在潜在的端口移位和导管迁移。在传统的小鼠模型中，接入端口不固定在皮肤上。这一方面造成了一个不稳定的通道，在清醒的动物中可能会被移位，导致导管迁移。鉴于小鼠模型在腹膜研究中的重要性，必须创建有效的手术技术以生成可靠的模型。因此，我们着手优化PD导管放置的传统模型。重要的是要注意，导管本身会导致腹膜的组织病理学改变，因此，关于PD溶液在动物研究中的影响的任何结论都必须在PD导管作为异物的背景下解释¹⁵，^16，17。

腹膜组织病理学
PD失败主要与纤维化和血管生成过多有关，导致渗透压浓度梯度丧失。此外，腹膜过滤能力可能受到腹膜炎的影响。此外，感染性腹膜炎是透析方式从腹膜透析转变为血液透析的明确原因。¹⁸.

Protocol

在这项研究中，使用了八只雌性C57BL / 6J小鼠，年龄为8-12周，平均体重为20g。将小鼠饲养在标准条件下，并 随意喂食食物和水。这项研究是在波士顿大学医学中心（AN-1549）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准下进行的。此处描述的程序是在无菌条件下进行的。

1.在异氟醚室中麻醉小鼠，并皮下注射镇痛药

1. 从尾巴根部握住动物。将动物保持在非惯用手的背侧。
2. 将动物转移到充满3%-4%异氟醚的连续麻醉诱导室中。通过左右后肢无趾夹反射来确认全身麻醉是否充分。用异氟醚维持全身麻醉1%-3%。
3. 在双眼上涂抹眼药膏。
4. 皮下注射丁丙诺啡。
   1. 将丁丙诺啡原液以0.3mg / mL的浓度溶解在氯化钠（NaCl）0.9%中，以达到0.03mg / mL的最终浓度。
   2. 在20g小鼠（每只小鼠2μg或66μL0.03mg / mL丁丙诺啡）手术前20分钟注射0.03mg / mL丁丙诺啡和500μL无菌NaCl 0.9%的剂量。

2. 皮肤准备

1. 将完全麻醉的小鼠置于左侧位置，将其右翼暴露在加热毯上。剃掉腹部的右侧，刚好靠近脊柱旁区域的中线，并向下到动物的尾巴。
2. 使用棉签对剃须区域进行三次消毒，交替使用消毒液或磨砂膏以及 70% 酒精或无菌盐水以圆周运动，从手术切口部位开始并向外移动。每次使用后丢弃棉签。注意不要用酒精或防腐剂过度弄湿动物的非手术区域，因为这会加重体温过低。
   注意：重要的是适当稀释消毒液，不要在手术过程中将手术磨砂膏留在皮肤上，因为它们可能会有刺激性并且需要冲洗掉。在手术过程中经常检查加热毯的温度，以确保温度不会下降。

3.测量导管长度，并在准备好的皮肤上标记腹部和管道内的插入点

1. 将检修口口袋指定在动物尾巴上方 1 厘米处。用非惯用食指和拇指握住安装段，放在靠近尾巴的指定区域。
2. 将导管放在皮肤上方，并估计导管插入腹腔内的位置。标记管插入的指定位置，尊重管子在前中线附近的最小弯曲。
   注意：所有程序必须戴无菌手套进行，并且在测量过程中导管应保持无菌。手术工具在使用前必须在121°C高压灭菌。有关该程序所需的仪器，请参阅 补充图S1 。

4.定制腹膜导管储液器部分

1. 用鼠标耳标记器在储液罐部分的框架上打一个侧孔（图1 和 图2）。需要注意的是，耳孔是一种手术工具，需要无菌。

5.放置滴注口

1. 在尾巴上方1厘米处做一个1厘米宽的水平皮肤切口。将皮下平面与下面的肌肉层进行钝性解剖，以制作用于放置导管的袋子，以确保滴注口自由地位于理想的口袋中。
2. 保持虹膜剪刀的尖端朝中线，为管子放置形成一个倾斜的隧道（图3A）。
3. 从定制的侧孔通过3.0缝合线。通过收紧通过的缝合线将通道固定在肌肉床上，保持头管路线。

6.使导管尖端插入部位切口

1. 在中线附近先前标记的区域上做一个 1 厘米的切口。通过将剪刀穿过该道来确认发育良好的道。
2. 用镊子轻轻挑动导管尖端，将导管逆行放置。
   注意：避免夹住管子的侧孔。
3. 将导管穿过准备好的通道（图3B）。在靠近右中线的肌肉层上做一个 1 厘米的切口。

7. 确认导管的功能

1. 在关闭所有切口之前，请确保放置的导管正常工作。使用连接到端口的特定Huber针头上的1 mL注射器检查功能。
2. 将200μL生理盐水注入滴注口。寻找对阻力零容忍的平稳流动。
3. 用 10% 肝素冲洗端口和导管以保持通畅。

8. 闭合皮肤切口

1. 用3-0条可吸收缝合线关闭端口储液器周围的皮肤切口（图3C）。

9.将导管尖端固定在腹腔内

1. 在切开的腹壁肌肉周围放置一条松散的钱包绳缝合线，并用 4-0 圆形可吸收缝合线。将导管的近端感觉传递到切口内。
2. 在管子周围收紧准备好的钱包绳缝合线，同时将第二根毛毡保持在钱包绳外，在肌肉层上（图3D），并用3-0条可吸收缝合线关闭皮肤（图2）。

10.术后和每天监测动物，给予术后镇痛和液体，并保持每日术后记录至少7天，直到完全恢复

1. 每天通过导管注射 200 μL 生理盐水，保持导管功能。

11. 液体注射

1. 通过仔细检查皮肤切口来确认平静的术后过程。
2. 通过将40μgLPS与无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释至0.2μg/ μL的工作浓度来制备LPS 2mg / kg体重用于腹膜内注射（ip）。
3. 在导管植入后的第二周开始注射。
   1. 用非惯用手轻轻握住动物，并限制滴注口，同时将食指和拇指向头颅方向移动。
   2. 用70%异丙醇对覆盖在储液罐上的皮肤进行消毒。使用连接到Huber针头的注射器注射LPS。
      1. 用Huber针头进入端口后，向端口中注入100μL生理盐水以确认专利过程。
      2. 注入准备好的 200 μL LPS，然后注入 100 μL 生理盐水进行管灌，并确保没有阻力。

12.在收获腹膜之前麻醉小鼠并收集腹膜液

1. 在 LPS 注射 7 天和导管植入 2 周后，计划腹膜活检。
2. 计划全身麻醉。
   1. 在异氟醚室中麻醉小鼠并皮下注射镇痛药。
   2. 从尾巴根部握住动物，并将动物保持在手的背侧。
   3. 将动物转移到充满3%-4%异氟醚的连续麻醉诱导室中。通过左右后肢无趾夹反射来确认全身麻醉是否充分。用异氟醚维持全身麻醉1%-3%。

13.腹膜活检

1. 将动物仰卧放在加热的毯子上。从剑突下到膀胱做一个中线皮肤切口。
2. 用冷PBS灌注筋膜下平面（图3E）。
3. 确保在不干扰腹膜完整性的情况下完全解剖平面。从左下腹的侧腹膜反射开始解剖腹膜，从肺门到左胁，从下腹解剖膀胱，以保持动物之间的样品一致（图3F）。
4. 腹膜收获后，通过颈椎脱位对动物实施安乐死。

Representative Results

直到研究结束，所有植入的导管都有效，导管移位或扭结不会使任何植入的导管复杂化。使用LPS的腹膜炎诱导模型进一步验证了当前改进的技术。对照小鼠接受200μL每日生理盐水注射，而实验小鼠在导管植入后总共7天注射200μLLPS，如方案步骤11中所述。

通过苏木精和伊红（H&E）以及Masson Trichrome染色评估腹膜的组织病理学特征。对H&E染色切片的分析显示腹膜下间隙中的细胞外基质（ECM）显着增加（图4A，用星号标记），这是使用ImageJ测量的。对照小鼠腹膜下间隙ECM的平均+ SD为87.10 + 24.66μm，LPS暴露小鼠（148.9 + 60.85μm，P = 0.008）翻倍（图4B）。

三色染色检测纤维化（图5和图6中的蓝色染色），估计为强度密度归一化为表面积（μm）。强度密度积分了感兴趣区域中像素的数量及其强度，是用于定量感兴趣组织学特征的经过验证的方法^19，20。

接下来，我们假设LPS诱导的炎症可能导致血管改变和腹膜下空间扩大。CD31用作内皮细胞的标记物（图7），并在两组小鼠中随机选择的高倍场（HPF）图像中定量为积分密度（图8B，C）。LPS诱导的小鼠腹膜下纤维化增加了三倍（图8A，P = 0.015）。腹膜中的所有这些改变与暴露于长期透析液的患者观察到的改变一致²¹。结果显示血管性增加~8-9倍（P = 0.0168）（图7和图8B），标记为SP的腹膜下间隙增加~2倍（P = 0.008）（图7和图8C）。这些结果与PD患者长期暴露于透析液腹膜后观察到的新生血管形成一致¹⁸，^22，23。

图 1：PD 导管和定制的侧孔。 缩写：PD = 腹膜透析。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：常规方法与改良方法。 PD导管放置的传统顺行方法（右）从固定壁腹膜中的内环开始，而在这种改良的逆行方法（左）中，该过程首先在小鼠背部的肌肉床上缝合定制的通路端口。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：插入腹膜导管。 （A）从定制的侧孔通过3.0缝合线，并将肌肉床缝合到侧孔，保持头颅管路线。（B）使PD管的隧道与覆盖的皮肤一起细致地解剖肌肉层，并以逆行方式通过管。（C）关闭端口储液器周围的皮肤切口。（D）在管子周围收紧准备好的钱包绳缝合线，同时将第二根毡子放在钱包绳外，在肌肉层上。（E）用2毫升冷PBS冲洗腹膜腔，同时保持针头斜面向上。（F）开始从左下腹的外侧腹膜反射中解剖腹膜（蓝色箭头）。缩写：PD =腹膜透析;PBS = 磷酸盐缓冲盐水。请点击此处查看此图的大图。

图4：H&E染色。 实验组中暴露于LPS的两只C57BL6小鼠腹膜的代表性图像（100x），如图所示（N = 4 /组）。黑色箭头指向腹膜，星号表示腹膜下间隙。比例尺 = 100 μm。 缩写：H&E = 苏木精和伊红;M = 肌肉;LPS = 脂多糖。 请点击此处查看此图的大图。

图5：H&E和Masson Trichrome染色。 两只C57BL6小鼠腹膜的代表性图像（100x），一只在对照组（A），另一只在实验组（B）暴露于LPS。比例尺 = 100 μm。缩写：SP = 腹膜下间隙;P = 腹膜间隙;M = 肌肉;H&E = 苏木精和伊红;LPS = 脂多糖。 请点击此处查看此图的大图。

图 6：马森三色染色。 两只C57BL6小鼠腹膜的代表性图像（100x），一只暴露于LPS，另一只暴露于盐水注射对照。黑色箭头指向腹膜，橙色星号表示腹膜下间隙，N = 4/组。比例尺 = 100 μm。 缩写：M = 肌肉;LPS = 脂多糖。 请点击此处查看此图的大图。

图7：炎症背景下腹膜下间隙血管的改变。 石蜡包埋切片用CD31和DAPI染色。显示了在400倍放大镜下获得的随机图像。比例尺 = 100 μm。缩写：SP=腹膜下间隙;P = 腹膜间隙;白色星号 = 腹膜下血管;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的大图。

图8：LPS暴露增强了新生血管，腹膜纤维化和腹膜下间隙的扩张 。 （A）纤维化的综合密度。（B）CD31的积分密度。（C）测量腹膜下间隙。对所有测量值进行学生 t检验。黑色星号表示重要性级别。误差线 = SEM。 缩写：LPS = 脂多糖。 请点击此处查看此图的大图。

补充图S1：执行手术所需的手术器械。 1. 耳标器， 2.分钟鼠标端口，3。胡伯点针，4.延迟吸收缝合线，5。直角夹具，6.直尖镊子，7.弯曲尖端镊子，8。虹膜剪刀。 请点击此处下载此文件。

Discussion

描述了PD的三种小鼠模型。这包括腹膜表面的盲穿刺，开放永久性系统和封闭系统¹⁰。腹膜表面盲穿涉及类似于腹膜内注射的直接腹膜通路，但不允许透析液引流。作为一种盲法手术，这种方法会伤害腹部内脏器官。开放式永久性系统模型将透析导管和滴注口保持在体外。然而，这种技术在小鼠中与并发症有关，例如由于动物的运动，感染和无法进行长期实验而导致的袋子断开。封闭式腹膜导管于2009年推出。在这个系统中，接入口和管子都被植入动物的体内。直接经皮滴注液体变得可行。在人类中，腹膜透析液袋放置在身体外部，但由于它们的移动性，这在小鼠中是不可能的。此外，导管的机械阻塞往往与侧孔堵塞和管子^{弯曲有关20}。封闭系统中的储层是可移动的，可以翻转，此事件可以扭结储液罐-管连接处。

已经应用了几种方法来克服封闭PD系统的上述局限性，包括网膜切除术和肝素输注以防止PD导管堵塞。尽管这些解决方案在短期研究中可能有用，但在小鼠模型中挽救导管以进行更长时间实验的挑战仍然存在。此外，与人类不同，小鼠的网膜很小，这解释了网膜切除术在挽救小鼠腹膜导管性能方面缺乏成功的原因^24，25。

在这项研究中，对封闭的PD导管系统应用了两个关键步骤，以改善当前技术的局限性。这些措施包括（a）在导管上打一个侧孔和（b）通过预制隧道的逆行管。（图3B）在滴注口打一个侧孔有助于将导管牢固地固定在肌肉床上，并在注射过程中提供活动性。在解决上述限制的同时，这种修改减少了管子的拉力和小鼠皮肤的拉伤。

传统上，PD导管尖端在植入（顺行植入）时首先进入腹膜腔。我们引入了逆行植入方法，首先将滴注口固定在皮肤上，然后将导管放置在腹膜腔中。由于导管植入是在储液器放置之后进行的，因此被认为是逆行导管植入。这种植入方法导致管子的直线过程和废弃的管线圈。

该技术的潜在局限性可能是从缝合线拉伤小鼠皮肤。这些提议的修改防止导管迁移和拉动管子这一事实强调了改进技术的重要性。它允许在鼠标清醒时精确滴注PD液。上述问题的减少允许长期实验并避免失败，从而排除了大量小鼠的使用。除了在PD研究中的应用外，这些修饰还可以在其他环境中利用，例如卵巢癌模型，腹膜癌或慢性腹膜炎，以精确地递送实验药物。

选择LPS注射来验证这种改良的植入方法。研究结果与对艾考糊精和葡萄糖基腹膜透析液的反应一致²⁶。此外，LPS 的使用具有临床相关性，因为人类的 PD 腹膜炎可能来自革兰氏阴性菌，并且在憩室炎或内脏穿孔的情况下经常观察到。革兰氏阴性菌分泌导致腹膜炎的LPS，是腹膜炎^26，27的公认实验模型。人类PD衰竭的病理特征包括腹膜纤维化和腹膜下微血管系统增加，导致PD患者腹膜溶质梯度丧失²⁷，^28，29。这些特征在LPS诱导的腹膜炎模型中得到了概括。未来的研究将在模型中进一步检查该技术，其中腹膜透析液将在小鼠中应用至少1个月以诱导腹膜纤维化。这项长期研究还将能够随访并发症，包括PD导管的盘绕。

综上所述，传统的封闭系统腹膜导管植入小鼠模型在当前研究中得到了修改。目前的修改可能为生成稳健可靠的小鼠模型铺平道路，以研究人类ESKD患者腹膜衰竭的长期后果。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% heparin	Canada Inc., Boucherville, QC, Canada)	Pharmaceutical product
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
CD31	Abcam	Ab9498
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools	11282-11
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Fisherbrand Animal Ear-Punch	Fisher Scientific	13-812-201
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Huber point needle	Access  technologies	PG25-500	Needle for injections
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Lipopolysaccharide from E.coli	SIGMA	L4391
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes	Access  technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´	Access  technologies	PG25-500
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Vicryl Suture	AD-Surgical	#L-G330R24