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Medicine

Ein retrograder Implantationsansatz für die Peritonealdialysekatheter-Platzierung bei Mäusen

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63689
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1,3,4
1Renal Section, Department of Medicine, Boston University Aram V. Chobanian & Edward Avedisian School of Medicine, 2Department of Biomedical Science, Kaiser Permanente Bernard J. Tyson School of Medicine, 3Veterans Affairs Boston Healthcare System, 4Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology

ERRATUM NOTICE

Summary

Dieser Artikel beschreibt Modifikationen eines Verfahrens zur Implantation eines Peritonealdialysekatheters in ein Mausmodell, um größere technische Probleme zu vermeiden, die bei den herkömmlichen Techniken beobachtet werden.

Abstract

Mausmodelle werden verwendet, um verschiedene Aspekte der Peritonealdialyse (PD) zu untersuchen, wie z. B. Peritonealentzündung und Fibrose. Diese Ereignisse führen zum Versagen der Peritonealmembran beim Menschen, das aufgrund seiner tiefgreifenden klinischen Auswirkungen auf die Behandlung von Patienten mit Niereninsuffizienz im Endstadium (ESKD) nach wie vor intensiv untersucht wird. Trotz der klinischen Bedeutung der Parkinson-Krankheit und der damit verbundenen Komplikationen leiden aktuelle experimentelle Mausmodelle unter wichtigen technischen Herausforderungen, die die Leistung der Modelle beeinträchtigen. Dazu gehören die Migration und das Knicken von PD-Kathetern und erfordern in der Regel eine frühere Katheterentfernung. Diese Einschränkungen führen auch dazu, dass eine größere Anzahl von Tieren eine Studie abschließen muss. Um diese Nachteile zu beheben, führt diese Studie technische Verbesserungen und chirurgische Nuancen ein, um häufig beobachtete PD-Katheterkomplikationen in einem Mausmodell zu verhindern. Darüber hinaus wird dieses modifizierte Modell durch die Induktion von Peritonealentzündung und Fibrose unter Verwendung von Lipopolysaccharid-Injektionen validiert. Im Wesentlichen beschreibt dieser Artikel eine verbesserte Methode, um ein experimentelles Modell der Parkinson-Krankheit zu erstellen.

Introduction

Belastung durch Niereninsuffizienz im Endstadium
Die chronische Nierenerkrankung (CKD) ist ein weltweites Gesundheitsproblem1. Aktuelle Schätzungen gehen davon aus, dass weltweit mehr als 850 Millionen Menschen an einer Nierenerkrankung leiden. Die Prävalenz von Nierenerkrankungen verdoppelt fast die Zahl der Menschen mit Diabetes (422 Millionen) und ist mehr als 20 Mal so hoch wie die Prävalenz von Krebspatienten (42 Millionen) oder HIV/AIDS (36,7 Millionen) weltweit2. Etwa jeder siebte Amerikaner hat CKD, und zwei von 1.000 Amerikanern haben ESKD, die eine Nierentransplantation oder Dialyseunterstützung benötigen3. Angesichts der weltweit zunehmenden Belastung durch ESKD ist die Optimierung der Dialysetechnologie von entscheidender Bedeutung3.

Peritonealdialyse
PD ist eine deutlich zu wenig genutzte Modalität für die Behandlung von ESKD in den Vereinigten Staaten. Nach Angaben des United States Renal Data System (USRDS) betrug der Anteil der prävalenten Parkinson-Patienten im Jahr 2020 nur 11% 4,5. Parkinson bietet mehrere Vorteile gegenüber der In-Center-Hämodialyse (HD), darunter eine bessere Lebensqualität, weniger Klinikbesuche und eine Verringerung der Medicare-Ausgaben 6,7. Darüber hinaus ist Parkinson eine häusliche Therapie und ist mit einem viel geringeren Risiko für schwere Infektionen wie Bakteriämie und Endokarditis verbunden, die häufig mit Hämodialysekathetern in Verbindung stehen. Darüber hinaus kann die Parkinson-Krankheit mit einem Notfallstartprotokoll schnell eingeleitet werden, wodurch die Notwendigkeit einer Dialyseeinleitung mit verweilten Gefäßkathetern verringertwird 8. PD gilt als die bevorzugte Dialysemethode in der pädiatrischen ESKD-Population9.

Peritoneale Beeinträchtigung durch Peritonealdialyse
Parkinson beinhaltet die Einführung von PD-Flüssigkeit (Dialysat) in das Peritoneum, was im Laufe der Zeit zu einer Entzündung und einem Umbau der Peritonealmembran führt. Eine peritoneale Entzündung löst eine Fibrose aus, die im Laufe der Zeit zu einem möglichen Verlust der Ultrafiltrationsfähigkeiten der Membran führt. Die Erhaltung der Peritonealmembran ist eine große Herausforderung bei Parkinson, und weitere Forschung ist von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass den Ärzten die besten klinischen Praktiken zur Verfügung stehen. Es gibt gut etablierte Mausmodelle, die das Verständnis der pathophysiologischen Mechanismen von peritonealen Infektionen und Entzündungen, gelösten Stoffen, Wassertransportkinetik und Membranversagen fördern. Dennoch schränken technische Probleme mit dem Katheter diese Modelle oftein 10.

Analyse der Veränderungen der Peritonealmembran
Bei ESKD-Patienten wird Dialysat traditionell durch einen Tenkhoff-Katheter mit einer tiefen und oberflächlichen Manschette in die Bauchhöhle eingeführt. Bei den Patienten können möglicherweise katheterbedingte Komplikationen auftreten, einschließlich Kathetermigration, Infusionsschmerzen und schlechter Drainage des Dialysats11,12,13. Zwei Haupttypen von Peritonealkathetern wurden für den Menschen eingeführt, gewickelt oder gerade, um diese Komplikationen zu minimieren12. Mehrere Modifikationen, einschließlich einer zusätzlichen Manschette zu den herkömmlichen Kathetern mit zwei Manschetten, wurden zu den ursprünglichen Kathetern hinzugefügt, um das Überleben des PD-Katheters zu verlängern11. Die Insertionstechnik hängt von mehreren Faktoren ab, indem sie verhindert, dass nach dem Überleben eine Kathetermigration hinzugefügt wird, einschließlich der Verfügbarkeit der Ressourcen und des Fachwissens14.

Im Gegensatz dazu unterscheiden sich die murinen Modelle der Peritonealdialyse grundlegend in Technik und Zweck im Vergleich zu menschlichen Peritonealkathetern. Zum Beispiel werden Peritonealkatheter in murinen Modellen in erster Linie zur Untersuchung von Membranveränderungen verwendet und sind weniger für bidirektionale Drainagefunktionen gedacht. Die derzeitige Technik leidet unter einer möglichen Verschiebung des Hafens und einer Kathetermigration aufgrund der Handhabung der Tiere. Bei den herkömmlichen Mausmodellen waren die Zugangsöffnungen nicht an der Haut befestigt. Dieser Aspekt führte zu einem instabilen Zugangsport, der sich bei wachen Tieren lösen konnte, was zu einer Kathetermigration führte. Angesichts der Bedeutung von Mausmodellen in der Peritonealmembranforschung ist es unerlässlich, effektive Operationstechniken zu entwickeln, um zuverlässige Modelle zu generieren. Daher haben wir uns vorgenommen, das konventionelle Modell der PD-Katheterplatzierung zu optimieren. Es ist wichtig zu beachten, dass der Katheter selbst histopathologische Veränderungen in der Peritonealmembran verursacht, so dass alle Schlussfolgerungen über die Wirkung von PD-Lösungen in Tierversuchen im Zusammenhang mit dem PD-Katheter als Fremdkörper interpretiert werden müssen15,16,17.

Histopathologie der Peritonealmembran
Das PD-Versagen steht hauptsächlich im Zusammenhang mit Fibrose und übermäßiger Angiogenese, die zum Verlust eines osmolaren Konzentrationsgradienten führt. Darüber hinaus kann die Filtrationskapazität der Peritonealmembran durch eine Peritonitis beeinträchtigt werden. Darüber hinaus ist die infektiöse Peritonitis eine gut etablierte Ursache für den Wechsel der Dialysemodalität von der Peritonealdialyse zur Hämodialyse. 18. Auflage.

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Protocol

Für diese Studie wurden acht weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und einem Durchschnittsgewicht von 20 g verwendet. Die Mäuse wurden unter Standardbedingungen untergebracht und ad libitum mit Futter und Wasser gefüttert. Diese Studie wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Boston University Medical Center (AN-1549) durchgeführt. Die hier beschriebenen Verfahren wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

1. Betäuben Sie die Maus in einer Isofluran-Kammer und injizieren Sie das Analgetikum subkutan

  1. Halten Sie das Tier von der Schwanzbasis aus. Halten Sie das Tier auf der Rückenoberfläche der nicht dominanten Hand.
  2. Überführen Sie das Tier in die kontinuierliche Anästhesie-Inästhesie-Kammer, die mit 3%-4% Isofluran gefüllt ist. Bestätigen Sie eine ausreichende Vollnarkose durch das Fehlen eines Zehenklemmreflexes in den rechten und linken Hinterbeinmaßen. Halten Sie die Aufrechterhaltung der Vollnarkose mit Isofluran 1% -3%.
  3. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf.
  4. Verabreichen Sie eine subkutane Injektion von Buprenorphin.
    1. Lösen Sie den Vorrat an Buprenorphin in einer Konzentration von 0,3 mg/ml in Natriumchlorid (NaCl) 0,9% auf, um die Endkonzentration von 0,03 mg/ml zu erreichen.
    2. Injizieren Sie eine Dosis von 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml Buprenorphin zusammen mit 500 μl sterilem NaCl 0,9%, 20 min vor der Operation in eine 20 g schwere Maus (2 μg oder 66 μl 0,03 mg/ml Buprenorphin pro Maus).

2. Hautvorbereitung

  1. Legen Sie die vollständig betäubte Maus in eine linke Seitenposition und legen Sie ihre rechte Flanke der Heizdecke frei. Rasieren Sie die rechte Seite des Bauches, genau in der Nähe der Mittellinie zum paraspinalen Bereich und bis zum Schwanz des Tieres.
  2. Desinfizieren Sie den rasierten Bereich dreimal mit einem Wattestäbchen mit der abwechselnden Anwendung der antiseptischen Lösung oder des Peelings und entweder 70% Alkohol oder steriler Kochsalzlösung in kreisförmigen Bewegungen, beginnend an der chirurgischen Inzisionsstelle und nach außen. Entsorgen Sie das Wattestäbchen nach jedem Gebrauch. Achten Sie darauf, nicht-chirurgische Bereiche des Tieres nicht übermäßig mit Alkohol oder Antiseptikum zu benetzen, da dies die Unterkühlung verschlimmern kann.
    HINWEIS: Es ist wichtig, antiseptische Lösungen richtig zu verdünnen und während der Operation keine chirurgischen Peelings auf der Haut zu hinterlassen, da sie irritierend sein können und abgespült werden müssen. Überprüfen Sie während des Eingriffs häufig die Temperatur der Heizdecke, um sicherzustellen, dass die Temperatur nicht abfällt.

3. Messen Sie die Katheterlänge und markieren Sie die Einstichstelle im Bauchraum und den Schlauchtrakt über der vorbereiteten Haut

  1. Weisen Sie die Zugangstasche 1 cm über dem Schwanz des Tieres zu. Halten Sie das Installationssegment mit dem nicht dominanten Zeige- und Daumenfinger über den zugewiesenen Bereich in der Nähe des Endes.
  2. Platzieren Sie den Katheter über der Haut und schätzen Sie den Ort für das Einführen des Katheters in die Bauchhöhle. Markieren Sie die zugewiesene Stelle für das Einführen des Tubus unter Berücksichtigung der minimalen Biegung des Tubus in der Nähe der vorderen Mittellinie.
    HINWEIS: Alle Eingriffe müssen mit sterilen Handschuhen durchgeführt werden und der Katheter sollte während der Messung steril gehalten werden. Chirurgische Instrumente müssen vor Gebrauch bei 121 °C autoklaviert werden. Die für das Verfahren erforderlichen Instrumente sind der ergänzenden Abbildung S1 zu entnehmen.

4. Passen Sie den Peritonealkatheterbehälter an

  1. Stanzen Sie mit der Maus-Ohrmarke ein seitliches Loch über den Rahmen des Behälterabschnitts (Abbildung 1 und Abbildung 2). Es sollte beachtet werden, dass der Ohrschlag ein chirurgisches Instrument ist und steril sein muss.

5. Platzieren Sie den Instillationsanschluss

  1. Machen Sie einen horizontalen 1 cm breiten Hautschnitt 1 cm über dem Schwanz. Trennen Sie die subkutane Ebene stumpf von der darunter liegenden Muskelschicht, um einen Beutel für die Katheterplatzierung herzustellen, um sicherzustellen, dass sich der Instillationsport frei in der idealen Porttasche befindet.
  2. Halten Sie die Spitze der Irisschere in Richtung der Mittellinie, um einen schrägen Tunnel für die Platzierung der Röhre zu erstellen (Abbildung 3A).
  3. Führen Sie die 3.0-Naht aus dem angepassten Seitenloch aus. Befestigen Sie den Zugangsanschluss zum Muskelbett, indem Sie die durchgelassene Naht festziehen und den Schlauchverlauf Kopfschmerz halten.

6. Machen Sie den Einschnitt an der Katheterspitze an der Einführungsstelle

  1. Machen Sie einen 1 cm langen Schnitt über den zuvor markierten Bereich in der Nähe der Mittellinie. Bestätigen Sie den gut entwickelten Trakt, indem Sie eine Schere durch den Trakt führen.
  2. Picken Sie die Katheterspitze vorsichtig mit einer Pinzette auf, um den Katheter in einen retrograden Verlauf zu bringen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die seitlichen Löcher des Rohrs einzuklemmen.
  3. Führen Sie den Katheterschlauch durch den vorbereiteten Trakt (Abbildung 3B). Machen Sie einen 1 cm langen Schnitt über die Muskelschicht in der Nähe der rechten Mittellinie.

7. Bestätigen Sie die Funktion des Katheters

  1. Bevor Sie alle Einschnitte schließen, stellen Sie sicher, dass der platzierte Katheter funktionsfähig ist. Überprüfen Sie die Funktion mit einer 1-ml-Spritze, die an der spezifischen Huber-Nadel für den Port befestigt ist.
  2. Injizieren Sie 200 μL normale Kochsalzlösung in die Instillationsöffnung. Achten Sie auf einen reibungslosen Fluss mit einer Null-Toleranz für Widerstand.
  3. Spülen Sie den Port und den Katheter mit 10% Heparin, um die Durchgängigkeit zu erhalten.

8. Schließen Sie die Hautschnitte

  1. Schließen Sie die Hautschnitte um das Portreservoir (Abbildung 3C) mit 3-0 resorbierbaren Nähten.

9. Fixieren Sie die Katheterspitze in der Bauchhöhle

  1. Legen Sie eine lockere Portemonnaie-Naht mit 4-0 runder, resorbierbarer Naht um den eingeschnittenen Bauchwandmuskel. Führen Sie den proximalen Filz des Katheters in den Schnitt ein.
  2. Ziehen Sie die vorbereitete Naht um die Röhre an, während Sie den zweiten Filz außerhalb der Handtaschenschnur über der Muskelschicht halten (Abbildung 3D), und schließen Sie die Haut mit 3-0 resorbierbaren Nähten (Abbildung 2).

10. Überwachen Sie die Tiere postoperativ und täglich, verabreichen Sie postoperative Analgesie und Flüssigkeiten und führen Sie tägliche postoperative Aufzeichnungen für mindestens 7 Tage und bis zur vollständigen Genesung

  1. Halten Sie den Katheter funktionstüchtig mit einer täglichen Injektion von 200 μL normaler Kochsalzlösung durch den Katheter.

11. Flüssigkeitsinjektionen

  1. Bestätigen Sie den ereignislosen postoperativen Prozess, indem Sie den Hautschnitt sorgfältig inspizieren.
  2. Bereiten Sie LPS 2 mg/kg Körpergewicht für intraperitoneale Injektionen (IP) vor, indem Sie 40 μg des LPS mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf die Arbeitskonzentration von 0,2 μg/μl (im Wesentlichen 10 μl für 2 μg/g Körpergewicht und 200 μl LPS für 20 g Mäuse) verdünnen.
  3. Beginnen Sie mit den Injektionen in der zweiten Woche nach der Katheterimplantation.
    1. Halten Sie das Tier vorsichtig mit der nicht dominanten Hand und halten Sie die Instillationsöffnung zurück, während Sie den Zeige- und Daumenfinger in Richtung Kopfhaut bewegen.
    2. Desinfizieren Sie die Haut über dem Reservoir mit 70% Isopropylalkohol. Verwenden Sie die Spritze, die an der Huber-Nadel befestigt ist, um das LPS zu injizieren.
      1. Nachdem Sie mit der Huber-Nadel in den Port eingedrungen sind, injizieren Sie 100 μL normale Kochsalzlösung in den Port, um den Patentverlauf zu bestätigen.
      2. Injizieren Sie die vorbereiteten 200 μL LPS, gefolgt von den 100 μL normaler Kochsalzlösung für die Spülung von Röhrchen, und stellen Sie sicher, dass kein Widerstand besteht.

12. Betäuben Sie die Mäuse vor der Ernte des Peritoneums und sammeln Sie die Peritonealflüssigkeit

  1. Nach 7 Tagen LPS-Injektionen und 2 Wochen Katheterimplantation planen Sie die Peritonealbiopsie.
  2. Planen Sie eine Vollnarkose.
    1. Betäuben Sie die Maus in einer Isoflurankammer und injizieren Sie das Analgetikum subkutan.
    2. Halten Sie das Tier von der Basis des Schwanzes und halten Sie das Tier auf der Rückenoberfläche der Hand.
    3. Überführen Sie das Tier in die kontinuierliche Anästhesie-Inästhesie-Kammer, die mit 3%-4% Isofluran gefüllt ist. Bestätigen Sie eine ausreichende Vollnarkose durch das Fehlen eines Zehenklemmreflexes in den rechten und linken Hinterbeinmaßen. Halten Sie die Aufrechterhaltung der Vollnarkose mit Isofluran 1% -3%.

13. Peritonealbiopsie

  1. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf die beheizte Decke. Machen Sie einen Hautschnitt in der Mittellinie vom Subxiphoid zur Blase.
  2. Perfundiert Sie die subfasziale Ebene mit kaltem PBS (Abbildung 3E).
  3. Stellen Sie sicher, dass das Flugzeug vollständig präpariert ist, ohne die Integrität des Peritoneums zu stören. Beginnen Sie mit der Sezierung des Peritoneums von der lateralen peritonealen Reflexion im linken unteren Quadranten, beginnend mit dem Hilum bis zur linken Flanke, und der Blase im unteren Aspekt, um die Proben zwischen den Tieren konsistent zu halten (Abbildung 3F).
  4. Nach der Peritonealernte wird das Tier durch Gebärmutterhalsluxation eingeschläfert.

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Representative Results

Alle implantierten Katheter waren bis zum Ende der Studie funktionsfähig, und das Lösen oder Knicken des Katheters erschwerte keinen der implantierten Katheter. Die aktuelle, modifizierte Technik wurde mit einem Peritonitis-induzierten Modell unter Verwendung von LPS weiter validiert. Die Kontrollmäuse erhielten täglich 200 μl normale Kochsalzlösungsinjektionen, während den Versuchsmäusen insgesamt 7 Tage nach der Katheterimplantation 200 μl LPS injiziert wurden, wie im Protokollschritt 11 beschrieben.

Die Peritonealmembran wurde auf histopathologische Eigenschaften durch Hämatoxylin- und Eosin- (H&E) und Masson-Trichrom-Färbung untersucht. Die Analyse der H&E-gefärbten Schnitte zeigte einen erheblichen Anstieg der extrazellulären Matrix (EZM) im subperitonealen Raum (Abbildung 4A, mit einem Sternchen markiert), der mit ImageJ gemessen wurde. Der Mittelwert + SD der ECM im subperitonealen Raum der Kontrollmäuse betrug 87,10 + 24,66 μm und verdoppelte sich bei LPS-exponierten Mäusen (148,9 + 60,85 μm, P = 0,008) (Abbildung 4B).

Die Trichrom-Färbung erkennt Fibrose (blaue Färbung in Abbildung 5 und Abbildung 6), die als auf die Oberfläche normierte Intensitätsdichte (μm) geschätzt wurde. Die Intensitätsdichte integriert die Anzahl der Pixel und deren Intensität in einer interessierenden Region und ist eine validierte Methode für quantitative histologische Merkmale von Interesse19,20.

Als nächstes postulierten wir, dass LPS-induzierte Entzündungen zu einer veränderten Vaskularität und Erweiterung des subperitonealen Raums führen können. CD31 wurde als Marker für Endothelzellen verwendet (Abbildung 7) und als integrierte Dichte in zufällig ausgewählten HPF-Bildern (High Power Field) in jeder Maus in beiden Gruppen quantifiziert (Abbildung 8B, C). LPS-induzierte Mäuse zeigten eine dreifache Zunahme der subperitonealen Fibrose (Abbildung 8A, P = 0,015). Alle diese Veränderungen in der Peritonealmembran stimmen mit denen überein, die bei Patienten beobachtet wurden, die Langzeitdialysaten ausgesetzt waren21. Die Ergebnisse zeigten eine ~8-9-fache Zunahme der Vaskularität (P = 0,0168) (Abbildung 7 und Abbildung 8B) und eine ~2-fache Zunahme des als SP markierten subperitonealen Raums (P = 0,008) (Abbildung 7 und Abbildung 8C). Diese Ergebnisse stimmen mit der Neovaskularisation überein, die bei Patienten mit Parkinson nach längerer Exposition der Peritonealmembran mit dem Dialysatbeobachtet wurde 18,22,23.

Figure 1
Abbildung 1: PD-Katheter und das kundenspezifische Seitenloch. Abkürzung: PD = Peritonealdialyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Konventionelle versus modifizierte Methoden. Die konventionelle antegrade Methode der PD-Katheterplatzierung (rechts) beginnt mit der Sicherung des inneren Rings im parietalen Peritoneum, während bei dieser modifizierten retrograden Methode (links) das Verfahren mit dem Nähen der maßgeschneiderten Zugangsöffnung über dem Muskelbett auf dem Rücken der Mäuse beginnt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Einführen des Peritonealkatheters. (A) Führen Sie die 3.0-Naht aus dem kundenspezifischen Seitenloch und nähen Sie das Muskelbett an das Seitenloch, wobei der Schlauchverlauf Cephalad erhalten bleibt. (B) Machen Sie den Tunnel der PD-Röhre mit sorgfältiger Dissektion der Muskelschicht von der darüber liegenden Haut und führen Sie die Röhre in retrograder Weise durch. (C) Schließen Sie die Hautschnitte um das Hafenreservoir. (D) Ziehen Sie die vorbereitete Naht der Geldbeutelschnur um die Röhre an, während Sie den zweiten Filz außerhalb der Handtaschenschnur über der Muskelschicht halten. (E) Die Peritonealhöhle wird mit 2 ml kaltem PBS gespült, während die Nadel abgeschrägt bleibt. (F) Beginnen Sie mit der Sezierung des Peritoneums von der lateralen peritonealen Reflexion im linken unteren Quadranten (blauer Pfeil). Abkürzungen: PD = Peritonealdialyse; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: H&E-Färbung. Repräsentative Bilder (100x) von Peritonealmembranen von zwei einzelnen C57BL6-Mäusen, die in der Versuchsgruppe wie angegeben bei LPS exponiert wurden (N = 4/Gruppe). Die schwarze Pfeilspitze zeigt auf das Peritoneum, und ein Sternchen zeigt den subperitonealen Raum. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin und Eosin; M = Muskel; LPS = Lipopolysaccharid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: H&E und Masson Trichrom-Färbung. Repräsentative Bilder (100x) von Peritonealmembranen von zwei C57BL6-Mäusen, eine in der Kontrollgruppe (A) und eine bei LPS exponierte in der Versuchsgruppe (B). Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: SP = subperitonealer Raum; P = Peritonealraum; M = Muskel; H&E = Hämatoxylin und Eosin; LPS = Lipopolysaccharid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Masson-Trichrom-Färbung. Repräsentative Bilder (100x) von Peritonealmembranen von zwei C57BL6-Mäusen, von denen eine LPS-exponiert war und die andere mit Kochsalzlösung injiziert wurde. Die schwarze Pfeilspitze zeigt auf das Peritoneum, und das orangefarbene Sternchen zeigt den subperitonealen Raum, N = 4/Gruppe. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: M = Muskel; LPS = Lipopolysaccharid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Veränderte Vaskularität im subperitonealen Raum im Rahmen einer Entzündung. In Paraffin eingebettete Abschnitte wurden mit CD31 und DAPI gefärbt. Zufällige Bilder, die bei 400-facher Vergrößerung aufgenommen wurden, werden angezeigt. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: SP= subperitonealer Raum; P = Peritonealraum; weißes Sternchen = subperitoneales Gefäß; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Die LPS-Exposition verstärkte die Neovaskularisation, die Fibrose im Peritoneum und die Ausdehnung des subperitonealen Raums . (A) Integrierte Fibrosedichte. (B) Integrierte Dichte von CD31. (C) Der subperitoneale Raum wurde gemessen. Für alle Maßnahmen wurde ein studentischer t-Test durchgeführt. Schwarze Sternchen zeigen den Grad der Signifikanz. Fehlerbalken = REM. Abkürzung: LPS = Lipopolysaccharid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung S1: Chirurgische Instrumente, die für die Durchführung des Eingriffs erforderlich sind. 1. Ohrmarke, 2. Winziger Mausanschluss, 3. Huberspitzennadel, 4. Verzögert-resorbierbare Naht, 5. Rechtwinklige Klemme, 6. Pinzette mit gerader Spitze, 7. Pinzette mit gebogener Spitze, 8. Iris-Schere. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Drei murine Modelle von PD werden beschrieben. Dazu gehören eine blinde Punktion der Peritonealoberfläche, ein offen-permanentes System und ein geschlossenes System10. Die blinde Punktion der Peritonealoberfläche beinhaltet einen direkten peritonealen Zugang ähnlich wie bei intraperitonealen Injektionen, erlaubt jedoch keine Drainage von Dialysat. Da es sich um ein verblindetes Verfahren handelt, kann diese Methode die viszeralen Bauchorgane verletzen. Das Open-Permanent-Systemmodell hält den Dialysekatheter und die Instillationsöffnung außerhalb des Körpers. Diese Technik bei Mäusen ist jedoch mit Komplikationen verbunden, wie z. B. getrennten Taschen aufgrund der Bewegung von Tieren, Infektionen und der Unfähigkeit, Langzeitexperimente durchzuführen. Peritonealkatheter mit geschlossenem System wurden 2009 eingeführt. Bei diesem System werden sowohl die Zugangsöffnung als auch der Schlauch in den Körper der Tiere implantiert. Eine direkte perkutane Flüssigkeitsinstillation wird möglich. Beim Menschen werden die Peritonealdialysatbeutel außerhalb des Körpers platziert, bei Mäusen ist dies aufgrund ihrer Beweglichkeit jedoch nicht möglich. Darüber hinaus kommt es häufig zu einer mechanischen Verstopfung des Katheters im Zusammenhang mit der Verstopfung der Seitenlöcher und der Verbiegung des Schlauches20. Das Reservoir in einem geschlossenen System ist beweglich und kann umkippen, und dieses Ereignis kann die Reservoir-Rohr-Verbindung knicken.

Es wurden mehrere Ansätze angewendet, um die oben genannten Einschränkungen geschlossener Parkinson-Systeme zu überwinden, einschließlich Omentektomie und Heparin-Infusion, um eine Verstopfung des PD-Katheters zu verhindern. Obwohl diese Lösungen in den Kurzzeitstudien nützlich sein könnten, bleiben die Herausforderungen bei der Rettung des Katheters für längere Experimente in Mausmodellen bestehen. Darüber hinaus ist das Omentum bei Mäusen im Gegensatz zum Menschen klein, was den mangelnden Erfolg der Omentektomie zur Rettung der Peritonealkatheterleistung bei Mäusen erklärt24,25.

In dieser Studie wurden zwei kritische Schritte auf das geschlossene PD-Kathetersystem angewendet, um die Einschränkungen der aktuellen Techniken zu verbessern. Dazu gehörten (a) das Stanzen eines seitlichen Lochs in den Katheter und (b) ein retrograder Schlauch, der durch einen vorgefertigten Tunnel führte. (Abbildung 3B) Das Stanzen eines seitlichen Lochs in der Instillationsöffnung half dabei, den Katheter sicher am Muskelbett zu fixieren und sorgte für Beweglichkeit während der Injektionen. Während die oben genannten Einschränkungen behoben wurden, reduzierte diese Modifikation das Ziehen der Röhre und die Belastung der Haut von Mäusen.

Traditionell gelangt die PD-Katheterspitze zum Zeitpunkt der Implantation zuerst in die Bauchhöhle (antegrade Implantation). Wir führten einen retrograden Implantationsansatz ein, bei dem der Instillationsport zuerst auf der Haut fixiert wurde und dann der Katheter in die Peritonealhöhle gelegt wurde. Da die Katheterimplantation auf die Platzierung des Reservoirs folgte, wird sie als retrograde Katheterimplantation bezeichnet. Diese Art der Implantation führte zu einem geraden Verlauf der Röhre und einer abgebrochenen Schlauchwicklung.

Eine mögliche Einschränkung der Technik kann die Abspannung der Mäusehaut von der Naht sein. Die Bedeutung der modifizierten Technik wird durch die Tatsache unterstrichen, dass diese vorgeschlagenen Modifikationen die Kathetermigration und das Ziehen des Schlauchs verhindern. Es ermöglicht ein präzises Einträufeln der PD-Flüssigkeit, während die Maus wach ist. Die Reduzierung der oben genannten Probleme ermöglicht Langzeitexperimente und vermeidet Misserfolge, wodurch die Verwendung einer großen Anzahl von Mäusen ausgeschlossen wird. Neben der Anwendung in der Parkinson-Forschung können diese Modifikationen in anderen Kontexten wie Eierstockkrebsmodellen, Peritonealkarzinomatose oder chronischer Peritonitis genutzt werden, um experimentelle Wirkstoffe präzise zu liefern.

Für die Validierung dieser modifizierten Implantationsmethode wurde die LPS-Injektion ausgewählt. Die Ergebnisse stimmten mit denen überein, die als Reaktion auf Icodextrin und Glukose-basierte Peritonealdialyseflüssigkeitbeobachtet wurden 26. Darüber hinaus ist die Verwendung von LPS klinisch relevant, da die PD-Peritonitis beim Menschen von gramnegativen Bakterien herrühren kann und häufig bei Divertikulitis oder Viskusperforation beobachtet wird. Gramnegative Bakterien sezernieren LPS, die zur Peritonitis beitragen, und sind ein anerkanntes experimentelles Modell der Peritonitis26,27. Zu den pathologischen Merkmalen des Parkinson-Versagens beim Menschen gehören Peritonealfibrose und eine Zunahme der subperitonealen Mikrovaskulatur, die bei Parkinson-Patienten zum Verlust des peritonealen gelösten Gradienten führt27,28,29. Diese Merkmale wurden im LPS-induzierten Peritonitis-Modell rekapituliert. Zukünftige Studien werden diese Technik in Modellen weiter untersuchen, in denen die Peritonealdialyseflüssigkeit mindestens 1 Monat lang bei Mäusen angewendet wird, um eine Peritonealfibrose zu induzieren. Diese Langzeitstudie wird auch die Nachsorge von Komplikationen, einschließlich des Coilings der PD-Katheter, ermöglichen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die konventionelle Peritonealkatheterimplantation im geschlossenen System in einem Mausmodell in der aktuellen Studie modifiziert wurde. Die aktuellen Modifikationen könnten den Weg für die Generierung robuster und zuverlässiger Mausmodelle ebnen, um die Langzeitfolgen eines Peritonealmembranversagens bei menschlichen ESKD-Patienten zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von NIH 1R01HL132325 und R21 DK119740-01 (VCC) und AHA Cardio-Oncology SFRN CAT-HD Center Grant 857078 (VCC und SL) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% heparin  Canada Inc., Boucherville, QC, Canada) Pharmaceutical product
     Buprenorphine 0.3 mg/mL      PAR Pharmaceutical            NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice The Jackson Lab IMSR_JAX:000664
CD31 Abcam Ab9498
            Clamp      Fine Science Tools                13002-10
            Forceps      Fine Science Tools                11002-12
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps Fine Science Tools 11282-11
Fine Scissors - Large Loops Fine Science Tools 14040-10
Fisherbrand Animal Ear-Punch Fisher Scientific 13-812-201
Hill Hemostat Fine Science Tools 13111-12
Huber point needle  Access  technologies  PG25-500 Needle for injections
            Isoflurane, USP             Covetrus             NDC 11695-6777-2
       Lipopolysaccharide from E.coli             SIGMA               L4391
Microscope Nikon Eclipse Inverted Microscope TE2000
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes     Access  technologies         MMP-4S-061108A
 Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´    Access  technologies                PG25-500
            Scissors      Fine Science Tools                14079-10
Vicryl Suture AD-Surgical #L-G330R24

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References

  1. Saran, R., et al. US Renal Data System 2019 Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. American Journal of Kidney Diseases. 75, 1 Suppl 1 6-7 (2020).
  2. ESRD, U.S.R.D.S.M. 2017 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States, Bethesda, MD, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases. USRD. , (2017).
  3. Center of Disease Control, U.S.D.o.H.a.H.S. Chronic Kidney Disease in the United States, 2019. CDC Publications and Resources. , (2019).
  4. Cho, Y., et al. Peritoneal dialysis use and practice patterns: An international survey study. American Journal of Kidney Diseases. 77 (3), 315-325 (2021).
  5. Xieyi, G., Xiaohong, T., Xiaofang, W., Zi, L. Urgent-start peritoneal dialysis in chronic kidney disease patients: A systematic review and meta-analysis compared with planned peritoneal dialysis and with urgent-start hemodialysis. Peritoneal Dialysis International. 41 (2), 179-193 (2021).
  6. Gokal, R., Figueras, M., Olle, A., Rovira, J., Badia, X. Outcomes in peritoneal dialysis and haemodialysis--a comparative assessment of survival and quality of life. Nephrology Dialysis Transplantation. 14, Suppl 6 24-30 (1999).
  7. Gardezi, A. I., Sequeira, A., Narayan, R. Going home: Access for home modalities. Advances in Chronic Kidney Disease. 27 (3), 253-262 (2020).
  8. van de Luijtgaarden, M. W., et al. Trends in dialysis modality choice and related patient survival in the ERA-EDTA Registry over a 20-year period. Nephrology Dialysis Transplantation. 31 (1), 120-128 (2016).
  9. Schaefer, F., Warady, B. A. Peritoneal dialysis in children with end-stage renal disease. Nature Reviews. Nephrology. 7 (11), 659-668 (2011).
  10. Gonzalez-Mateo, G. T., Pascual-Anton, L., Sandoval, P., Aguilera Peralta, A., Lopez-Cabrera, M. Surgical techniques for catheter placement and 5/6 nephrectomy in murine Models of Peritoneal Dialysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e56746 (2018).
  11. Chow, K. M., et al. Straight versus coiled peritoneal dialysis catheters: A randomized controlled trial. American Journal of Kidney Diseases. 75 (1), 39-44 (2020).
  12. LaPlant, M. B., et al. Peritoneal dialysis catheter placement, outcomes and complications. Pediatric Surgery International. 34 (11), 1239-1244 (2018).
  13. Al-Hwiesh, A. K. A modified peritoneal dialysis catheter with a new technique: Farewell to catheter migration. Saudi Journal of Kidney Diseases and Transplantation. 27 (2), 281-289 (2016).
  14. Crabtree, J. H., Chow, K. M. Peritoneal dialysis catheter insertion. Seminars Nephrology. 37 (1), 17-29 (2017).
  15. Flessner, M. F., et al. Peritoneal changes after exposure to sterile solutions by catheter. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (8), 2294-2302 (2007).
  16. Kowalewska, P. M., Margetts, P. J., Fox-Robichaud, A. E. Peritoneal dialysis catheter increases leukocyte recruitment in the mouse parietal peritoneum microcirculation and causes Fibrosis. Peritonial Dialysis International: Journal of the International Society for Peritonial Dialysis. 36 (1), 7-15 (2016).
  17. Kowalewska, P. M., Patrick, A. L., Fox-Robichaud, A. E. Syndecan-1 in the mouse parietal peritoneum microcirculation in inflammation. PLoS One. 9 (9), 104537 (2014).
  18. Yanez-Mo, M., et al. Peritoneal dialysis and epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells. The New England Journal of Medicine. 348 (5), 403-413 (2003).
  19. Arinze, N. V., et al. Tryptophan metabolites suppress Wnt pathway and promote adverse limb events in CKD patients. The Journal of Clinical Investigation. 132 (1), (2021).
  20. Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
  21. Krediet, R. T. The peritoneal membrane in chronic peritoneal dialysis. Kidney International. 55 (1), 341-356 (1999).
  22. Gonzalez-Mateo, G. T., et al. Chronic exposure of mouse peritoneum to peritoneal dialysis fluid: structural and functional alterations of the peritoneal membrane. Peritonial Dialysis International: Journal of the International Society for Peritonial Dialysis. 29 (2), 227-230 (2009).
  23. Sukul, N., et al. Patient-reported advantages and disadvantages of peritoneal dialysis: results from the PDOPPS. BMC Nephrology. 20 (1), 116 (2019).
  24. Lu, Y., et al. A method for islet transplantation to the omentum in mouse. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e57160 (2019).
  25. Gotloib, L., Wajsbrot, V., Shostak, A. A short review of experimental peritoneal sclerosis: from mice to men. The International Journal of Artificial Organs. 28 (2), 97-104 (2005).
  26. Tateda, K., Matsumoto, T., Miyazaki, S., Yamaguchi, K. Lipopolysaccharide-induced lethality and cytokine production in aged mice. Infection and Immunity. 64 (3), 769-774 (1996).
  27. Vila Cuenca, M., et al. Differences in peritoneal response after exposure to low-GDP bicarbonate/lactate-buffered dialysis solution compared to conventional dialysis solution in a uremic mouse model. International Urology and Nephrology. 50 (6), 1151-1161 (2018).
  28. Penar, J., et al. Selected indices of peritoneal fibrosis in patients undergoing peritoneal dialysis. Postepy Higieny Medycyny Doswiadczalnej (Online). 63, 200-204 (2009).
  29. Yung, S., Chan, T. M. Pathophysiological changes to the peritoneal membrane during PD-related peritonitis: the role of mesothelial cells. Mediators of Inflammation. 2012, 484167 (2012).

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Medizin Ausgabe 185 Peritonealkatheter Tasche Maus Peritonealdialyse Lipopolysaccharid Peritoneum

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Retrograde Implantation Approach for Peritoneal Dialysis Catheter Placement in Mice
Posted by JoVE Editors on 03/22/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Retrograde Implantation Approach for Peritoneal Dialysis Catheter Placement in Mice. The Authors section was updated from:

Saran Lotfollahzadeh1
Mengwei Zhang1
Marc Arthur Napoleon1
Wenqing Yin1
Josephine Orrick1
Nagla Elzind1
Austin Morrissey1
Isaac E. Sellinger1
Lauren D. Stern1
Mostafa Belghasem2
Jean M. Francis1
Vipul C. Chitalia1,3,4
1Renal Section, Department of Medicine, Boston University School of Medicine
2Department of Biomedical Science, Kaiser Permanente Bernard J. Tyson School of Medicine
3Veterans Affairs Boston Healthcare System
4Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology

to:

Saran Lotfollahzadeh1
Mengwei Zhang1
Marc Arthur Napoleon1
Wenqing Yin1
Josephine Orrick1
Nagla Elzind1
Austin Morrissey1
Isaac E. Sellinger1
Lauren D. Stern1
Mostafa Belghasem2
Jean M. Francis1
Vipul C. Chitalia1,3,4
1Renal Section, Department of Medicine, Boston University Aram V. Chobanian & Edward Avedisian School of Medicine
2Department of Biomedical Science, Kaiser Permanente Bernard J. Tyson School of Medicine
3Veterans Affairs Boston Healthcare System
4Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology

Ein retrograder Implantationsansatz für die Peritonealdialysekatheter-Platzierung bei Mäusen
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Lotfollahzadeh, S., Zhang, M.,… More

Lotfollahzadeh, S., Zhang, M., Napoleon, M. A., Yin, W., Orrick, J., Elzind, N., Morrissey, A., Sellinger, I. E., Stern, L. D., Belghasem, M., Francis, J. M., Chitalia, V. C. A Retrograde Implantation Approach for Peritoneal Dialysis Catheter Placement in Mice. J. Vis. Exp. (185), e63689, doi:10.3791/63689 (2022).

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