Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kvantifiering av cytoskelettdynamik med hjälp av differentiell dynamisk mikroskopi

Published: June 15, 2022 doi: 10.3791/63931
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 2, 2
1Cell Biology, Neurobiology and Biophysics, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 2Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

Summary

Differentiell dynamisk mikroskopi (DDM) kombinerar funktioner för dynamisk ljusspridning och mikroskopi. Här presenteras processen att använda DDM för att karakterisera rekonstituerade cytoskelettnätverk genom att kvantifiera den subdiffusiva och burade dynamiken hos partiklar i vimentinnätverk och den ballistiska rörelsen hos aktiva myosindrivna aktin-mikrotubulikompositer.

Abstract

Celler kan krypa, självläka och ställa in sin styvhet på grund av deras anmärkningsvärt dynamiska cytoskelett. Som sådan kan rekonstituerande nätverk av cytoskelettala biopolymerer leda till en mängd aktiva och anpassningsbara material. Att konstruera sådana material med exakt avstämda egenskaper kräver emellertid att man mäter hur dynamiken beror på nätverkskompositionen och syntesmetoderna. Kvantifiering av sådan dynamik utmanas av variationer över tid, rum och formuleringsutrymme i sammansatta nätverk. Protokollet beskriver här hur Fourieranalystekniken, differentialdynamisk mikroskopi (DDM), kan kvantifiera dynamiken i biopolymernätverk och är särskilt väl lämpad för studier av cytoskelettnätverk. DDM arbetar med tidssekvenser av bilder som förvärvats med hjälp av en rad mikroskopimetoder, inklusive laserskanningskonfokal, bredfältfluorescens och ljusfältsavbildning. Från sådana bildsekvenser kan man extrahera karakteristiska dekorrelationstider för densitetsfluktuationer över ett spann av vågvektorer. Ett användarvänligt Python-paket med öppen källkod för att utföra DDM-analys utvecklas också. Med detta paket kan man mäta dynamiken hos märkta cytoskelettkomponenter eller inbäddade spårpartiklar, vilket demonstreras här med data från mellanliggande filament (vimentin) nätverk och aktiva aktin-mikrotubulinätverk. Användare utan tidigare programmering eller bildbehandlingserfarenhet kommer att kunna utföra DDM med hjälp av detta programvarupaket och tillhörande dokumentation.

Introduction

Cytoskeletten är ett nätverk av proteinfilament som sträcker sig över cytoplasman hos eukaryota celler och förbinder cellytan med kärnan. Den har unika materialegenskaper, vilket ger mekaniskt skydd mot stora och upprepade mekaniska belastningar, men driver också dynamiska cellformförändringar1. Rekonstituerade cytoskelettnätverk kan ge upphov till en rad intressanta dynamiska beteenden, från placering av inbäddade partiklar till ballistisk rörelse som drivs avmolekylära motorer 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Metoder för att analysera dynamiken i sådana nätverk inkluderar spårning av rörelsen hos inbäddade spårmikrosfärer 6,7,12,13,14, bildanalys för att spåra storleken på proteintäta kluster över tid8, dynamisk ljusspridning15, partikelbildvelocimetri 4,16,17,18,19 , beräkning av bildens effektspektrala densitet över tid19 och kymografanalys20. När fler studier om rekonstituerade cytoskelettnätverk genomförs, oavsett om man ska förstå cellulär mekanik eller aktiv materia, är robusta, opartiska och reproducerbara metoder för att karakterisera dynamiken alltmer nödvändiga. Differentiell dynamisk mikroskopi (DDM)21,22, en relativt ny teknik som har använts för att studera cytoskelettdynamik, är en sådan teknik som effektivt kvantifierar dynamik med få användardefinierade parametrar. Med mjukvarupaketet som beskrivs här kommer forskare med liten erfarenhet av programmering eller bildanalys att kunna utnyttja DDM för sitt eget arbete.

DDM är en bildanalysteknik för att extrahera ett provs dynamik. Liksom partikelspårning eller partikelbildvelocimetri kräver DDM en tidsserie av bilder (ofta tusentals bilder), vanligtvis inspelade med ett mikroskop. Till skillnad från partikelspårning behöver enskilda funktioner eller spårpärlor inte lokaliseras (eller ens vara lokaliserade) i bilden. Till skillnad från både partikelspårning och partikelbildsvelocimetri återvinner man ensembledynamiken med DDM med relativt få användarspecificerade parametrar. Med DDM analyseras bilder i Fourierrummet för att bestämma sönderfallstiden för densitetsfluktuationer över ett antal vågnummer, q, där q = 2πu, och u är storleken på de rumsliga frekvenserna, Equation004. Man får spridningsliknande information men med verkliga rymdbilder som förvärvats på ett mikroskop 21,22,23. Därför kan man dra nytta av de olika kontrastgenererande metoderna för mikroskopi, såsom widefield fluorescens 22,24, konfokal fluorescens25, polariserad26, mörkfält27 eller ljus-ark fluorescens28 mikroskopier. Dessutom kan bilder som används för DDM-analys användas för partikelspårning eller partikelbildvelocimetri för att ge kompletterande information.

Denna kombination av funktioner från dynamisk ljusspridning och optisk mikroskopi gör DDM till en kraftfull och mångsidig teknik. Sedan den första beskrivningen av Cerbino och Trappe 200821, där DDM demonstrerades för att mäta diffusionen av 73 nm kolloidala partiklar, har DDM använts för att mäta flytande kolloider29, kolloidal aggregering30,31, viskoelasticiteten hos nematiska flytande kristaller26, dynamiken hos kolloidala geler32, grovskum33, nanopartiklar i begränsade miljöer34, 35,36,37, bakteriell motilitet 38,39,40,41, diffusion av svagt spridande proteinkluster42, kapillärvågor vid vätskegränssnitt43 och andra system. De som letar efter en mer fullständig lista över publikationer som använder DDM kan hänvisa till grundliga granskningsartiklar om ämnet 22,23,44,45.

DDM har också använts för att undersöka dynamiken i biologiska nätverk. använde DDM för att mäta dynamiken hos aktin i levande Drosophila-oocyter 46. kvantifierade dynamiken hos spårpartiklar i nätverk av hyaluronan och hyaluronan-kollagenkompositer47. Flera användningar av DDM för att studera dynamiken hos spårpartiklar i rekonstituerade cytoskelettnätverk 9,10, transport av DNA-molekyler i sådana nätverk 48,49 och dynamiken i aktiva rekonstituerade nätverk har också dokumenterats 11,50,51. En fördel med DDM vid mätning av dynamiken i sådana system är att enskilda partiklar eller molekyler inte behöver lokaliseras och spåras. Så till exempel kan dynamiken hos DNA-molekyler i trånga miljöer mätas med DDM trots svårigheten att spåra sådana små och icke-sfäriska molekyler. Vidare kan man med fluorescensmikroskopi använda flerfärgsmärkning för att selektivt mäta dynamiken hos enskilda beståndsdelar i en komplex komposit.

För att utföra DDM tas en sekvens av bilder över tiden, I(x,y,t). För en given fördröjningstid, Δt, hittas alla (eller en delmängd av) bildpar separerade av den fördröjningstiden. Den kvadratiska Fouriertransformen av skillnaden mellan varje par,

Equation007

beräknas och beräknas i genomsnitt tillsammans. Denna kvantitet, Equation008, är radiellt medelvärde, förutsatt att dynamiken är isotrop. Detta ger DDM-matrisen (även kallad bildstrukturfunktionen), Equation009. Denna process visas grafiskt i figur 1. För att bestämma provets dynamik från denna DDM-matris antas DDM-matrisen ha formen

Equation010

där A är amplituden, som beror på mikroskopets detaljer och provets struktur, B är bakgrunden, som beror på bruset i bilderna, och f (q, Δt) är den mellanliggande spridningsfunktionen (ISF), som innehåller information om dynamiken21,22. I enkla fall,

Equation014

där τ är en karakteristisk sönderfalls- eller dekorrelationstid. En sådan ISF har använts i flera studier som använder DDM på ergodiska system som utspädda kolloidala suspensioner 21,24,27,37,40,52. Andra former av ISF kan dock användas för att modellera olika typer av dynamik. Till exempel kan man använda en kumulantexpansion för att modellera ISF för polydispersprover som

Equation016

där μ är ett mått på polydispersiteten42,53; om densitetsfluktuationer förfaller med två separata lägen kan man använda en ISF som

Equation01826, 54, 55, 56, 57;

andra isf-plattformar kan användas för att simma mikroorganismer eller andra aktiva partiklar 38,39,40,41,58,59.

Figure 1
Figur 1: Översikt över DDM-analys. Från tidsserien av bilder beräknas Fourier-transformen av bildskillnader för att beräkna DDM-matrisen. DDM-matrisen kan anpassas till en modell för att bestämma tidsskalan för densitetsfluktuationer över ett intervall av q-värden . Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Här beskrivs användningen av ett DDM-analysprogramvarupaket utvecklat i Python, PyDDM. Detta programvarupaket bygger på det arbete som utförts av våra forskningslaboratorier och andra publicerade studier under de senaste åren. Primära motivatorer för att skapa detta programvarupaket inkluderar behovet av (1) att hålla reda på och lagra metadata och parametrar som används i analysen; (2) grundlig dokumentation med detaljerade exempel på analys från början till slut; och (3) ett enkelt sätt att använda olika (eller skapa nya) matematiska modeller för att passa data (t.ex. att lägga till ISF-modeller, som de som nyligen utvecklats för aktiva filament60, skulle vara enkelt). Andra programvarupaket för DDM-analys finns också, men inte alla är väl dokumenterade och skrivna i ett programmeringsspråk med öppen källkod. Det finns till exempel C ++ -kod med databehandling på GPU: er (https://github.com/peterlu/ConDDM) 25, C ++ -kod som använder Fourier-transformeringar i tid för att påskynda beräkningar (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro) 61, MATLAB- och Python-versioner (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM) 40, MATLAB-kod (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html) 27 och MATLAB-kod med osäkerhetskvantifiering ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Eftersom detta PyDDM-paket är väldokumenterat och ger mycket flexibilitet i hur DDM-matrisen beräknas och analyseras, kan det förhoppningsvis vara användbart för forskare som vill implementera DDM oavsett bakgrund i programmering eller bildanalys.

Protokollet visar hur detta mjukvarupaket kan användas för att kvantifiera dynamiken i in vitro-rekonstituerade cytoskelettnätverk. Detta görs genom att använda två distinkta uppsättningar bilddata: (1) bilder av submikronspårämnespartiklar inbäddade i ett vimentinnätverk tagna med brightfield-mikroskopi och (2) bilder av fluorescerande märkta aktin- och mikrotubulifilament i ett intrasslat kompositnätverk med myosindriven aktivitet tagen med laserscannande konfokalmikroskopi. Analyserna av dessa två dataset belyser anmärkningsvärda styrkor hos DDM, inklusive dess förmåga att analysera bilder tagna med en mängd olika bildmetoder (t.ex. ljusfält eller konfokal fluorescens), att extrahera dynamik från antingen inbäddade spårämnen eller från märkta filament och att kvantifiera en mängd olika dynamiker (t.ex. subdiffusiv och begränsad eller ballistisk).

Protocol

En Jupyter Notebook-fil som innehåller koden som ska följa med varje steg i följande protokoll finns på följande GitHub-lagringsplats, https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. En PDF av den filen ingår i tilläggsfil 1. Dessutom finns en genomgång av koden och dokumentationen för varje funktion och klass på webbplatsen, https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.

1. Installation av programvara

  1. Om du vill följa med DDM-exempelanalysfilerna installerar du Jupyter Notebook för att köra koden. Installera andra vanliga Python-paket som krävs, inklusive NumPy och Matplotlib också. Dessa paket levereras alla med Anaconda-distributionen (se https://www.anaconda.com/products/individual).
  2. Installera Python-paketet xarray63. Detta paket är nödvändigt för att organisera och lagra metadata och analysparametrar. Om du använder Anaconda-distributionen installerar du xarray (tillsammans med dess rekommenderade beroenden) med kommandot:
    conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 flaskhals
  3. Installera PyYAML-paketet med kommandot:
    conda installera -c anaconda yaml
    Detta paket är nödvändigt för att läsa metadata om bilderna som ska analyseras och de parametrar som användaren ställer in för analys och anpassning.
  4. Installera PyDDM-paketet genom att ladda ned från GitHub-lagringsplatsen eller använda git-kommandot:
    git klona https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git

2. Planera bildsessionerna

  1. Välj den optimala tillgängliga bildmodaliteten och optiska inställningar. Som nämnts kan DDM användas med ett antal mikroskopimetoder.
  2. För att hjälpa till att planera lämplig objektivlins och bildstorlek som ska användas, bestäm intervallet för vågnummer, q, som ska undersökas baserat på pixelstorlek och total bildstorlek. Bekräfta att valet av förstoring och synfält är optimalt för experimentet, baserat på dessa beräkningar. För bilderna som analyseras här användes ett 60x 1,4 NA-mål och en bildstorlek på 256 x 256 pixlar med en pixelstorlek på 0,83 μm för det aktiva kompositnätverket actin-microtubule. För bilder av pärlor inbäddade i ett vimentinnätverk användes ett 100x 1,4 NA-mål och en bildstorlek på 512 x 512 pixlar med en pixelstorlek på 0,13 μm.
    OBS: Minsta q ställs in med 2π / NΔx, där bildstorleken (antas vara kvadratisk) är N × N pixlar med en pixelstorlek på Δx. Det maximala q är det lägsta av π /Δx och 2π NA / λ, där NA är bildmålets numeriska bländare, och λ är ljusets våglängd (för ljusfältsavbildning kan man ersätta NA med (NA-mål +NA-kondensor)/2).
  3. Tänk sedan på tidsintervallet som ska undersökas. Vanligtvis görs DDM-analys på sekvenser med minst 1000 bilder.
    1. För att bestämma lämplig bildhastighet, överväga den förväntade tiden det tar för funktioner i provet att flytta ett avstånd i storleksordningen för den minsta upplösningsbara längdskalan (motsvarande den maximala q).
    2. När du överväger den övre gränsen för det undersökta tidsintervallet, inse att effektspektrumet för hundratals bildskillnader för en given fördröjningstid Δt vanligtvis är i genomsnitt tillsammans för att ge tillräcklig statistik för att minska bruset. Skaffa därför bildsekvenser som är längre än den maximala tidsskalan som avsöks.
      OBS: Om en förväntad diffusionskoefficient, D, eller hastighet, v, är känd, kan man uppskatta förväntade karakteristiska sönderfallstider med τ = 1 / Dq2 eller τ = 1 / vq tillsammans med intervallet q, som bestämdes baserat på synfältet och pixelstorleken. Intervallet med förväntade τ-värden över det tillgängliga q-intervallet kan hjälpa till att styra valet av bildhastighet och antalet bildrutor som ska hämtas.

3. Provberedning och bildförvärv

OBS: För detaljer om provberednings- och bildinställningarna som används för de data som presenteras i avsnittet om representativa resultat, se tidigare publikationer från författarna 11,51,64 och kompletterande fil 2.

  1. Baserat på övervägandet av tids- och längdskalorna för att sondera, skaffa bildsekvenser av, helst, över 1000 bilder.
    OBS: Koden analyserar fyrkantiga bilder eller fyrkantiga områden av intresse i bilden, så justera ramstorleken därefter.
  2. Spara bildsekvenser som en tredimensionell TIFF-stapel i gråskala. Alternativt kan formatet som används av Nikon Instruments-system, ND2-format, läsas av det installerade paketet. Om bilderna sparas i något annat format använder du ImageJ eller ett annat bildbehandlingsprogram för att konvertera bilderna till en TIFF-stapel.
    Om du använder ND2-filer måste paketet nd2reader från https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader installeras.

4. Inställning av parametrar

  1. Gör en kopia av parameterfilen example_parameter_file.yml som finns i PyDDM-koddatabasen under exempelmappen. Öppna den här YAML-filen med en textredigerare som NotePad ++ eller textredigeraren i JupyterLab. Se Tilläggsfil 2 för ett exempel på en YAML-parameterfil som används vid analys av data som presenteras i avsnittet om representativa resultat.
  2. I den kopierade YAML-filen anger du datakatalogen och filnamnet som motsvarar bildsekvensen som ska analyseras. Under metadataavsnittet anger du pixelstorlek och bildhastighet.
  3. Under avsnittet Analysis_parameters anger du information om hur DDM-matrisen ska beräknas. Vissa parametrar här är valfria.
    1. Ange åtminstone värden för parametrarna number_lag_times och last_lag_time. Dessa motsvarar antalet olika fördröjningstider för vilka DDM-matrisen ska beräknas respektive den längsta fördröjningstiden (i ramar) som ska användas. För data från spårpärlor i vimentinnätverk som används här var parametrarna number_lag_times och last_lag_time 60 respektive 1000. Koden beräknar DDM-matrisen för fördröjningstider från 1 bildruta (eller någon annan minsta fördröjningstid om den valfria parametern first_lag_time anges) till last_lag_time med logaritmiskt avstånd.
      OBS: Om M-ramar förvärvades kunde man beräkna DDM-matrisen för en fördröjningstid så stor som M-1. Men med dålig statistik vid en så stor fördröjningstid kommer uppgifterna sannolikt att vara bullriga. Den längsta fördröjningstiden för att beräkna DDM-matrisen beror på detaljerna i data, men vi föreslår att du försöker cirka en tredjedel av den totala bildseriens varaktighet.
  4. Ange information om hur DDM-matrisen eller den mellanliggande spridningsfunktionen (ISF) ska passa in i avsnittet Fitting_parameters. Ange namnet på modellen under modellparametern. Ange den första gissningen, den nedre gränsen och den övre gränsen för var och en av anpassningsparametrarna i den valda modellen.
    OBS: För att visa en lista över möjliga anpassningsmodeller, kör funktionen print_fitting_models. Modellerna finns också i onlinedokumentationen på PyDDM:s webbplats.

5. Beräkning av DDM-matrisen

  1. Initiera en instans av klassen DDM_Analysis. Det gör du genom att ange metadata- och analysparametrarna som beskrivs ovan genom att skicka filnamnet, med den fullständiga filsökvägen inkluderad, för YAML-filen till DDM_Analysis. Du kan också skicka metadata och parametrar som en Python-ordlista datastruktur.
  2. Kör funktionen calculate_DDM_matrix för att beräkna DDM-matrisen. Denna beräkning kan ta flera minuter eller längre beroende på bildstorleken och antalet fördröjningstider. Se bild 2 för typiska körtider.
  3. Kontrollera returnerade data, som kommer att finnas i en datastruktur från xarray-paketet som kallas en datauppsättning. Denna datastruktur lagras under attributet ddm_dataset.
    OBS: Inte bara DDM-matrisen utan även tillhörande variabler och metadata kommer att lagras i denna datastruktur. Det kommer också att sparas på disken i ett NetCDF-format (Network Common Data Form).
  4. Inspektera tomterna och figurerna, som kommer att genereras och visas. Dessa siffror sparas också som en PDF-fil i datakatalogen.
    1. Se att en av de genererade tomterna visar den ensemble-genomsnittliga kvadratmodulen för de Fourier-transformerade bilderna, Equation031 som en funktion av q. Som standard använder koden detta för att uppskatta bakgrundsparametern B. Uppskatta bakgrunden från Equation031 genom att anta att den i gränsen för stort q kommer att närma sig B/2, där B är bakgrunden.
    2. Om Equation031 inte når en platå i stort q, använd sedan en annan metod för att uppskatta B. För att uppnå detta anger du parametern background_method i antingen YAML-filen eller som ett valfritt nyckelordsargument till funktionen calculate_DDM_matrix. Mer information om metoderna för att uppskatta B presenteras i avsnittet om representativa resultat.

Figure 2
Figur 2: Beräkningstid för beräkning av DDM-matrisen. I (A) och (B) visas tiden för beräkning av DDM-matrisen, Equation009, . Data som används i alla fall är en film med 5000 bilder med en bildstorlek på 512 x 512 pixlar. DDM-matrisen beräknades för 30 fördröjningstider, logaritmiskt fördelade mellan 1 ram (0,01 s) och 1000 ramar (10 s). Koden kördes på en Intel i7-10700 2,90 GHz stationär dator med 32 GB RAM. I (A) visas effekten av att variera hur många bildskillnader som används vid beräkning av DDM-matrisen för varje fördröjningstid. För detta är bilderna binned för att resultera i en bildstorlek på 256 x 256. För varje fördröjningstid Δt subtraheras bilder separerade med det Δt och den resulterande matrisen transformeras Fourier. För en given Δt kan alla bildpar separerade med det Δt användas (visas i blått), endast icke-överlappande bildpar kan användas (t.ex. bildrutorna 1 och 10, 10 och 19, etc.; visas i brunt), eller 300 bildpar eller färre kan användas för varje Δt. I (B) visas effekten av att ändra bildstorleken på beräkningstiden. Bilderna binned antingen genom att gruppera 2 x 2, 4 x 4 eller 8 x 8 pixlar, vilket resulterade i bildstorlekar på 256 x 256, 128 x 128 respektive 64 x 64. För varje används cirka 300 bildpar vid beräkning av DDM-matrisen för varje Δt. (C) Från DDM-matrisen kan den mellanliggande spridningsfunktionen (ISF) extraheras. Detta visas för de tre fallen i (A). De blå datapunkterna (utan förskjutning) motsvarar ISF när det maximala antalet bildpar används för varje Δt; de bruna datapunkterna (med en förskjutning på 0,1) motsvarar ISF när icke-överlappande bildpar används för varje Δt; och de rosa datapunkterna (med en förskjutning på 0,2) motsvarar ISF när högst 300 bildpar används för varje Δt. ISF som hittades med hjälp av icke-överlappande bildpar visar bullrighet vid lång Δt. I så fall används få bildpar vid långa Δt (t.ex. för Δt på 1000 bildrutor används endast 4 bildpar). (D) Genom att anpassa ISF till en exponentiell funktion bestäms den karakteristiska sönderfallstiden, τ, för varje vågnummer, q. I rosa visas resultaten efter att originalbilderna har buntats med 2 x 2, vilket resulterar i en bildstorlek på 256 x 256. I grått visas resultaten efter binning med 8 x 8, vilket resulterar i en bildstorlek på 64 x 64. Genom att lagra data går information om dynamiken vid högre vågnummer förlorad, men beräkningen av DDM-matrisen för 64 x 64-bilderna är cirka 16 gånger snabbare än för 256 x 256-bilderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. Montering av DDM-matrisen eller ISF

  1. Initiera en instans av klassen DDM_Fit. Det gör du genom att skicka till DDM_Fit filnamnet på YAML-filen som innehåller bildmetadata och parametrar för anpassning.
  2. Bestäm vilken modell för DDM-matrisen eller ISF som ska användas för att anpassa data. Lista tillgängliga modeller genom att köra funktionen print_fitting_models. Ange den modell som ska användas i YAML-parameterfilen eller med hjälp av funktionen reload_fit_model_by_name.
  3. Ange de första gissningarna och gränserna för varje parameter i den valda modellen i den angivna YAML-parameterfilen. För att ändra den ursprungliga gissningen för någon parameter, använd funktionen set_parameter_initial_guess. Ange gränser för parametrarna med funktionen set_parameter_bounds. Till exempel, som ses i kompletterande fil 2, för data från spårpärlor i vimentinnätverket, var den ursprungliga gissningen för sönderfallstiden 1 s och gränserna för den parametern var 0,01 s och 2000 s.
  4. Utför passformen med funktionspassningen. Tilldela en variabel till utdata från den här funktionen för att enkelt komma åt resultaten.
    OBS: Den här funktionen kan ta många valfria argument. Se koddokumentationen och de angivna exemplen för en lista över sådana argument och när du ska överväga att ange dem till icke-standardvärden.

7. Tolkning av passformsresultaten

  1. Generera diagram för att inspektera passningarna och q-beroendet av passningsparametrarna med funktionen fit_report.
    OBS: Denna funktion kommer att generera en serie tomter, som också sparas som en PDF. Valfria argument till den här funktionen kan användas för att ändra de områden som produceras.
  2. Bland de genererade diagrammen kommer att finnas en figur med 2 x 2 delplots som visar DDM-matrisen eller ISF (beroende på den valda anpassningsmodellen) vid fyra q-värden (anges som ett valfritt argument för att fit_report), tillsammans med den beräknade DDM-matrisen eller ISF med hjälp av modellen och bästa passformsparametrar. Om du vill rita DDM-matrisen eller ISF tillsammans med den bästa passformen på ett interaktivt sätt använder du klassen Browse_DDM_Fits som visas i de angivna exemplen när Jupyter Notebook-miljön används.
  3. Från diagrammet för den karakteristiska sönderfallstiden τ kontra vågnumret q, bestäm om dynamiken följer diffusiv, subdiffusiv, ballistisk eller någon annan typ av rörelse. Detta kan göras genom att leta efter maktlagsförhållandet mellan τ och q.
    OBS: På loggloggdiagrammet för τ vs. q som genereras av funktionen fit_report visas tre rader som motsvarar effektlagen passar över ett angivet intervall av q-värden . Den heldragna svarta linjen motsvarar montering τ vs. q till en effektlag, τ = 1 / Kqβ, där K och β är fria parametrar. Den streckade linjen i orange motsvarar anpassning till enkel diffusion, τ = 1 / Dq2, där D är en diffusionskoefficient. Den punktstreckade linjen i blått motsvarar anpassning till τ = 1 / vq, där v är en hastighet.

8. Spara resultaten

  1. Resultatet av anpassningen sparas i en xarray-datauppsättning. Använd xarray-funktionen to_netcdf eller Pythons inbyggda pickle-modul för att spara den här datastrukturen på disken. Använd xarray-funktionen open_dataset för att ladda dessa netCDF-filer.
  2. Använd funktionen save_fit_results_to_excel för att spara passningsresultaten, tillsammans med data, i en kalkylbladsfil.

Representative Results

Här visar vi exempel på analysen som gjorts med PyDDM från två olika uppsättningar experiment. I en uppsättning experiment inbäddades spårpärlor med submikron i nätverk bestående av det mellanliggande filamentproteinet vimentin och avbildades med en 100x objektivlins i ljusfältsläge vid 100 bilder / s (Figur 3A). Vimentin uttrycks i mesenkymala celler och är en viktig determinant för de mekaniska egenskaperna hos cytoplasman65 och den mekaniska stabiliteten hos kärnan i celler som utför begränsad migration66,67. Hittills har rekonstituerade vimentinnätverk studerats främst genom makroskopisk reologi 64,68,69, medan dynamiken har fått jämförelsevis lite uppmärksamhet 13,70,71. Ytterligare information om dessa experiment finns i tilläggsfil 2. I den andra uppsättningen experiment framställdes aktiva cytoskelettnätverk med aktin, mikrotubuli och myosin. Spektralt distinkta fluorescerande etiketter gjorde det möjligt att avbilda aktin- och mikrotubulifilamenten med ett tvåfärgs laserscannande konfokalmikroskop med en 60x objektivlins vid 2,78 bilder / s (figur 3B, C). Aktin- och mikrotubulifilament är båda viktiga drivkrafter för dynamiska cellformsförändringar, med deras åtgärder samordnade av mekaniska och biokemiska interaktioner72. Ytterligare detaljer om dessa experiment finns i11. Enskilda bildrutor från bildsekvenser tagna i dessa experiment visas i figur 3.

Figure 3
Figur 3: Bilder från tidsserien analyserade. (B,C) Bild av (B) mikrotubuli och (C) aktin i en aktiv aktin-mikrotubulikomposit tagen med ett 60x mål på ett laserscannande konfokalmikroskop, med användning av 561 nm excitationsljus för mikrotubuliavbildning och 488 nm excitationsljus för aktinavbildningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För bilder av tracerpärlor i vimentinnätverk spelades filmer med 5000 bilder med en storlek på 512 x 512 pixlar vid 100 bilder/s in. Från dessa beräknades DDM-matrisen vid 60 logaritmiskt fördelade fördröjningstider mellan 1 och 1000 bilder, eller 0,01 s och 10 s. För att uppskatta bakgrunden beräknades och sattes B, medelvärdet av de kvadratiska Fouriertransformerade bilderna, Equation031och sattes lika med Equation03755,73. Ett antagande gjordes att över de största 10% av q-värdena är denna kvantitet lika med B/2 och att B är oberoende av q. Detta är paketets standardmetod för att uppskatta B, men andra metoder är möjliga genom att ställa in parametern background_method till ett annat värde.

Med parametrarna A(q) och B bestämda från Equation031kan man extrahera den mellanliggande spridningsfunktionen (ISF) från DDM-matrisen. Exempel på ISF visas i figur 4. I figur 4A visas ISF från bilder av pärlor med en diameter på 0,6 μm inbäddade i ett nätverk med en vimentinkoncentration på 19 μM. I figur 4B visas ISF för samma typ av pärlor i ett nätverk med en vimentinkoncentration på 34 μM. Intressant nog förföll ISF i inget av fallen till noll. Vid stora fördröjningstider bör ISF närma sig noll för ergodiska system. Det vill säga i sådana system bör densitetsfluktuationer helt dekorrelera över stora fördröjningstider. Det faktum att ISF här inte förföll till noll kan ha orsakats av felaktiga uppskattningar av A (q) och B, som användes för att hitta ISF från den beräknade DDM-matrisen. Noterbart är att den metod som används här kan överskatta B i vissa scenarier62. Det är dock mer troligt att dynamiken hos spårpärlorna verkligen är ickeergodisk eftersom pärlorna har en jämförbar storlek med nätverkets maskstorlek och därför kan bli burade. Andra data bekräftade upptäckten av icke-gudicitet. Pärlstorleken, 0,6 μm, var nämligen större än det beräknade medelvärdet för maskstorlekarna på 0,4 μm för koncentrationen 19 μM och 0,3 μm för koncentrationen på 34 μM. Dessutom visade resultaten från enstaka partikelspårning av dessa spårpärlor, som visas senare, också begränsad rörelse.

Figure 4
Figur 4: Mellanliggande spridningsfunktioner vid flera vågnummer för vimentinnätverk. ISF plottas som en funktion av fördröjningstiden för q-värden från cirka 1 till 9 μm-1. (A) ISF från bilder av 0,6 μm pärlor i ett vimentinnätverk med vimentinkoncentration på 19 μM. (B) ISF från bilder av 0,6 μm pärlor i ett vimentinnätverk med vimentinkoncentration på 34 μM. ISF: s långa fördröjningstidsplatå vid ett värde långt över noll indikerar icke-gudicitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Med tanke på att dynamiken sannolikt är ickeergodisk är ISF: erna lämpliga till formen Equation039, där C är nonergodicitetsfaktorn 32. Denna form av ISF har använts i tidigare studier av icke-ergodisk dynamik, såsom den hos kolloidala geler32,74 eller spårpartiklar i aktin-mikrotubulinätverk 10. De prickade svarta linjerna i figur 4 visar passningarna tillsammans med data. Utifrån dessa passningar kan man nu titta på q-beroendet av sönderfallstiden, τ, och av nonergodicitetsparametern, C.

Figure 5
Figur 5: Sönderfallstid kontra vågnummer för vimentinnätverk. Från passar till ISF bestäms sönderfallstiden τ för ett intervall av q-värden . För tydlighetens skull visar vi inte värdet på τ för varje q, utan bara en logaritmiskt åtskild uppsättning. I blått (tan) är data från bilder av 0,6 μm pärlor inom vimentinnätverk med en vimentinkoncentration på 19 μM (34 μM). Felstaplarna representerar standardavvikelserna i τ över flera filmer (fyra filmer för data med 19 μM-nätverket [blå] och fem filmer för data med 34 μM-nätverket [tan]). Röda streckprickade linjer markerar uppskattade gränser för vår tidsmässiga och rumsliga upplösning, som beskrivs i resultaten. Den heldragna svarta linjen visar Equation044 skalning, vilket skulle indikera diffusiv rörelse. Ingen av datauppsättningarna följer den här skalningen. Snarare visar pärlor i 19 μM-nätverket subdiffusiv rörelse (Equation010med β > 2), och pärlor i 34 μM-nätverket visar begränsad eller burad rörelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Sönderfallstiderna visade en stor osäkerhet, både vid låga q- och höga q-ytterligheter, vilket ses i figur 5. Felfälten i det här diagrammet visar standardavvikelsen mellan fyra videor som analyserats för fallet med lägre vimentinkoncentration eller fem videor som analyserats för den högre koncentrationen. För att förstå källan till den stora osäkerheten vid dessa ytterligheter, överväga både den tidsmässiga och rumsliga upplösningen. Ungefärliga gränser för upplösningen visas med tre röda streckprickade linjer. De två horisontella linjerna motsvarar de minsta och maximala fördröjningstiderna som undersökts. Med tanke på bildhastigheten på 100 bilder/s och den maximala fördröjningstiden motsvarande 1000 bildrutor (20 % av den totala videovaraktigheten) gick noggrannheten förlorad när man mätte dynamiken snabbare än 0,01 s eller långsammare än 10 s. Vid de lägre q-värdena var de anpassade värdena för τ större än 10 s. Därför bör stora osäkerheter förväntas i sönderfallstider som är större än den maximala fördröjningstiden. I den högre änden av q-intervallet närmade sig sönderfallstiden den minsta fördröjningstiden på 0,01 s men förblev över den. I stället för att begränsas av den tidsmässiga upplösningen, vid dessa högre q-värden, kan den rumsliga upplösningen vara den begränsande faktorn. Med tanke på pixelstorleken på 0,13 μm var det största värdet för q cirka 24 μm-1. Den diffraktionsbegränsade upplösningen tillåter emellertid inte nödvändigtvis noggranna mätningar av dynamiken vid dessa höga rumsliga frekvenser. Att approximera den optiska upplösningen som Equation041 leder till en övre vågnummergräns på cirka 16 μm-1, med tanke på objektivlinsens numeriska bländare, NA, på 1,4 och ljusets våglängd, Equation042. Detta markeras av den vertikala röda streckprickade linjen i figur 5. Faktum är att uppgifterna var bullriga vid stora värden på q. Redan innan denna ungefärliga övre gräns för q sågs ökad osäkerhet i τ, och detta kan bero på att man överskattar qmax. Sämre optisk upplösning än förutspått kan bero på att en oljedykningslins användes för att avbilda bortom täckglaset i ett vattenhaltigt prov eller på att kondensatorlinsen var ofullständigt inriktad.

För de 0,6 μm pärlor som är inbäddade i det mindre koncentrerade nätverket (19 μM vimentin) kan det observeras från log-log-diagrammet för sönderfallstiden kontra vågnumret att sönderfallstiden minskade med vågnummer på ett sätt som överensstämmer med en effektlag (figur 5). Det verkar dock inte följa vad som kan förväntas för normal diffusiv rörelse, där Equation044. Snarare minskade τ brantare med ökande q. Detta är ett tecken på subdiffusiv rörelse, som ofta förekommer för pärlor i trånga miljöer som dessa. Anpassning av τ(q) över intervallet 1,4 μm-1 till 12,3 μm-1 till en effektlag av formen τ = 1/Kqβ ger transportparametrarna K = 0,0953 μmβ / s och β = 2,2. För dem som är mer vana vid att tänka på normal diffusion kontra subdiffusion när det gäller den genomsnittliga kvadratförskjutningen (MSD) av spårpartiklar som en funktion av fördröjningstiden (dvs. MSD = K 'Δtα), är det bra att inse att den subdiffusiva skalningsexponenten i MSD-ekvationen, α, motsvarar α = 2 / β. Med andra ord överensstämmer värdet på β = 2,2 med en subdiffusiv skalningsexponent i MSD-ekvationen för α = 0,9. Man skulle ställa in PyDDM så att τ(q) passar över detta intervall av q-värden genom att ange indexen för matrisen q med antingen parametern Good_q_range i YAML-filen eller genom att skicka det valfria argumentet forced_qs till funktionen generate_fit_report. Intervallet q från 1,4 μm-1 till 12,3 μm-1 skulle för data här motsvara index för matrisen q från 15 till 130.

För 0,6 μm pärlor i det mer koncentrerade nätverket (34 μM) visade sönderfallstiden lite beroende av q. Detta beror sannolikt på att pärlor i ett nätverk med mindre maskstorlek inte ärgodicitet. För att undersöka nonergodiciteten i detta system bör nonergodicitetsparametern, C, plottas som en funktion av q, som i figur 6. För 0,6 μm pärlor i 19 μM vimentinnätverket ≈ C 0,2 med lite beroende av q (visas inte). För nätverket med 34 μM vimentin och för ett nätverk med en ännu högre koncentration av 49 μM vimentin var emellertid logen av C proportionell mot q2 som visas i figur 6. Detta förhållande mellan C och q förväntas för begränsad rörelse. För pärlor som fastnat i nätverkets fickor förväntas belastningsbesvären plana ut vid tillräckligt långa fördröjningstider (dvs. Equation055var Equation056 är belastningsbesväret och δ2 är den maximala belastningsbesvären). Eftersom ISF kan uttryckas i termer av MSD som Equation058, och eftersom den icke-erogodiska ISF går till C vid långa fördröjningstider (dvs., Equation059), erhålls förhållandet Equation06032,75. Därför kan man använda C(q) för att hitta δ2, och detta gav δ2 = 0,017 μm2 och 0,0032 μm2 för 34 respektive 49 μM vimentinnätverk (motsvarande δ = 0,13 μm och 0,057 μm).

Figure 6
Figur 6: Nonergodicity parameter jämfört med vågnummer för vimentinnätverk. Från passar till ISF bestäms nonergodicitetsparametern C för ett intervall av q-värden . I tan (röd) är data från bilder av 0,6 μm pärlor inom vimentinnätverk med en vimentinkoncentration på 34 μM (49 μM). Felstaplarna representerar standardavvikelserna i τ över flera filmer (fem filmer för data med 34 μM-nätverket [tan] och fyra filmer för data med 49 μM-nätverket [red]). Y-axeln har logaritmisk skalning. Man observerar ett q-beroende av C som följer Equation060, vilket möjliggör extraktion av den maximala genomsnittliga kvadratförskjutningen, δ2. Passar till Equation060 visas med de heldragna linjerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Man kan använda andra metoder för att extrahera inneslutningsstorleken δ från data såväl som den subdiffusiva exponenten som hittades från att undersöka τ (q) för pärlor inom 19 μM vimentinnätverket. För det första kan man använda den metod som beskrivs av Bayles et al.76 och Edera et al.77 för att extrahera MSD från DDM-matrisen. I synnerhet kräver denna metod ingen anpassning av DDM-matrisen. Man behöver bara beräkna DDM-matrisen, D(q, Δt) och Equation070 (från vilken A(q) och B kan bestämmas). Sedan, för att hitta MSD, använder man förhållandet Equation071. Observera att denna metod för att hitta belastningsbesvär förutsätter att fördelningen av partikelförskjutningar är gaussisk, även om tidigare arbete har visat att belastningsbesvär som härrör från DDM i vissa fall överensstämmer med belastningsbesvär från partikelspårning, även när förskjutningarna är icke-Gaussiska73. För detta system, som förväntat78, finns det icke-Gaussianitet i fördelningen av stora förskjutningar, vilket ses i figur S1. I PyDDM-paketet ska funktionen extract_MSD köras, som returnerar Equation056. För det andra kan man använda spårning av enstaka partiklar för att hitta belastningsbesväret. Även om DDM kan användas för att analysera bilder där antingen partiklarnas höga densitet eller den begränsade optiska upplösningen förbjuder exakt partikellokalisering, för bilderna av 0,6 μm pärlor i vimentinnätverk, kunde vi lokalisera och spåra pärlor med hjälp av trackpy-programvaran (https://github.com/soft-matter/trackpy)79. Detta partikelspårningsprogramvarupaket använder algoritmerna som beskrivs av Crocker och Grier80.

Figure 7
Figur 7: Genomsnittlig förskjutning i kvadrat jämfört med fördröjningstid för vimentinnätverk. Belastningsbesvären bestämdes med hjälp av två metoder. Först beräknades säkerhetsdatabladet från DDM-matrisen (visas med solida symboler). Därefter bestämdes säkerhetsdatabladet med hjälp av enpartikelspårning (SPT) för att hitta partikelbanor (öppna symboler). Felstaplar bestäms på samma sätt som beskrivs i de två föregående figurförklaringarna. (A) Belastningsbesvär för 0,6 μm pärlor i 19 μM vimentinnätverket indikerar subdiffusiv rörelse, med god överensstämmelse mellan de två metoderna för att hitta belastningsbesvär. B) Belastningsbesvär för 0,6 μm pärlor i 49 μM vimentinnätverket indikerar rörelser i bur, i god överensstämmelse mellan de två metoderna för att hitta belastningsbesvär och med den maximala belastningsbesvär som finns från parametern nonergodicity. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Belastningsbesvären kontra fördröjningstiden för 0,6 μm pärlor i 19 μM vimentinnätverket och i 49 μM vimentinnätverket visas i figur 7. I båda fallen överensstämde den belastningsbesvär som fastställts med hjälp av DDM väl med den belastningsbesvär som hittades genom spårning av en partikel (SPT). För det mindre koncentrerade nätverket var dessutom den subdiffusiva skalningsexponenten (α in Equation010) cirka 0,9. Detta överensstämmer med τ(q)-skalningen av Equation010 hittade genom att anpassa ISF för att bestämma τ(q) (det vill säga 2/2,2 = 0,9). För det mer koncentrerade nätverket platåerar belastningsbesvären vid längre fördröjningstider. Den maximala belastningsbesvär som hittades genom att analysera q-beroendet av parametern nonergodicitet (visas i figur 7B med den horisontella linjen vid δ2 = 0,0032 μm2) var ungefär samma värde som belastningsbesvären från både SPT och DDM tycktes plana ut mot. Det finns en skillnad mellan de längsta belastningsbesvären för längre tid som bestäms utifrån DDM och SPT i figur 7A. Även om detta kan bero på ett begränsat antal långa fördröjningsbanor, kan det också vara så att ytterligare optimering av intervallet av q-värden för vilka DDM-matrisen används för att uppskatta Equation056 för varje fördröjningstid (som görs av Bayles et al.76 och Edera et al.77) skulle förbättra våra resultat, och sådan optimering kommer att vara i fokus för framtida arbete.

Dessa experiment där bildsekvenser registrerades av spårpärlor inbäddade i ett nätverk av vimentinintermediära filament möjliggjorde oberoende analyser: DDM (med hjälp av paketet som beskrivs här) och SPT (med trackpy). Båda analyserna kan avslöja graden av subdiffusion och inneslutningslängd, vilket gör att man kan använda två oberoende bildanalystekniker för att tillhandahålla kompletterande mätvärden. Det finns ytterligare kvantiteter man kan jämföra från SPT och DDM. Till exempel kan heterogenitet i provets dynamik avslöja sig som icke-Gaussianitet i fördelningen av partikelförskjutningar (dvs van Hove-fördelningen) bestämd från SPT, liksom i en ISF bestämd från DDM som passar till en sträckt exponentiell34,35. Figur S1 visar van Hove-fördelningen för 0,6 μm-partiklarna i vimentinnätverk och diskuterar sträckningsexponenten som hittades från att passa ISF: erna - mätvärden som använts tillsammans i tidigare studier för att visa den heterogena dynamiken hos partiklar inom biomimetiska system 9,10,47 eller andra trånga miljöer 34 . Som ett annat exempel kan ISF beräknas utifrån partikelbanor uppmätta med SPT och jämföras med de DDM-förvärvade ISF:erna. Medan de genomsnittliga kvadratförskjutningarna och förskjutningsfördelningarna är de mätvärden som oftast hämtas från SPT-analys, kan man också beräkna ISF från partikelbanor, Equation075, med hjälp av Equation076 (se figur S2). Denna ISF kan jämföras med DDM-genererade ISF och användas för att avslöja dynamik som inte framgår av MSD59.

Även om förvärv av bilder av spårpartiklar inom ett nätverk kan göra det möjligt för en att använda de kompletterande analysmetoderna för SPT och DDM, är det viktigt att notera att en fördel med DDM jämfört med SPT är att det inte kräver bilder av pärlor (eller andra funktioner) som enkelt kan lokaliseras och spåras. För att demonstrera denna punkt belyser vi sedan analysen av aktiva nätverk av aktin- och mikrotubulifilament, där fluorescerande märkning av aktin och tubulin möjliggör avbildning av båda filamenttyperna, åtskilda från varandra via olika fluoroforer, med ett flerfärgs laserscannande konfokalmikroskop.

Bilder förvärvades med ett laserscannande konfokalmikroskop av aktin-mikrotubulinätverk med aktivitet som drivs av myosin (kaninskelettmuskelmyosin II; Cytoskelett #MY02). Detaljer om experimenten och resultaten har tidigare beskrivits11, och de representativa resultaten som visas här är från analysen av två filmer som tillhandahålls i tilläggsmaterialet (filmer S1 och S4) för11. Båda bildsekvenserna spelades in med 2,78 bilder/s för 1000 bilder.

För att analysera dessa bilder beräknades DDM-matrisen för 50 fördröjningstider från 0,4 s till 252 s (1 bildruta till 700 bildrutor). DDM-matrisen passades sedan till modellen Equation010, med den mellanliggande spridningsfunktionen som Equation077. Det finns därför fyra passande parametrar: A, τ, s och B. Resultaten av dessa passningar visas i figur 8. Det observerades att DDM-matrisen för ett visst q-värde hade en platå vid låga fördröjningstider, ökade med fördröjningstid och sedan platåerade (eller visade tecken på att börja platå) vid stora fördröjningstider. DDM-matrisen för de lägre värdena på q nådde inte en platå vid långa fördröjningstider. Man bör därför förvänta sig dålig noggrannhet vid mätningen av sönderfallstiden för dessa låga q (stora längdskala) dynamiker.

De karakteristiska sönderfallstiderna, τ, från passningarna till DDM-matrisen visas i figur 9. Resultaten presenteras för ett aktivt aktin-mikrotubulikompositnätverk (liknande film S111) och för ett aktivt aktinnätverk (liknande film S411). Båda nätverken bereddes med samma koncentrationer av aktin och myosin, men det enda aktinnätverket skapades utan tubulin, som beskrivs i11. För dessa två typer av aktiva nätverk var det observerade maktlagsförhållandet Equation010. Denna skalning indikerar ballistisk rörelse och att den myosindrivna sammandragningen och flödet dominerar över filamentens termiska rörelse. Från τ = (vq)-1 kunde en karakteristisk hastighet, v, på cirka 10 nm/s för det aktiva aktin-mikrotubulinätverket och 75 nm/s för det aktiva aktinnätverket hittas. Dessa värden överensstämmer med partikelbildsvelocimetrianalysen av samma videor som visas i11. Skalningen Equation010 höll inte vid de lägre q-värdena för det aktiva kompositnätverket aktin-mikrotubuli. Detta beror sannolikt på att de verkliga sönderfallstiderna för detta aktin-mikrotubulikompositnätverk vid de lägre q-värdena är längre än den maximala fördröjningstiden för den beräknade DDM-matrisen. Den maximala fördröjningstiden anges med den horisontella röda linjen i figur 9, och sönderfallstiderna avvek från den förväntade Equation010 skalningen nära dessa längre tider.

Figure 8
Figur 8: DDM-matris jämfört med fördröjningstid för ett aktivt kompositnätverk med aktin-mikrotubuli. DDM-matrisen för flera värden på q plottas som en funktion av fördröjningstiden från en film i ett sammansatt nätverk bestående av 2,9 μM aktinmonomerer, 2,9 μM tubulindimerer och 0,24 μM myosin. Dessa data visar analysen av bara mikrotubulikanalen i en mångfärgad tidsserie av bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: Sönderfallstid kontra vågnummer för aktiva aktin-mikrotubulinätverk. Från att ha monterat DDM-matrisen finns sönderfallstiden, τ, som en funktion av vågnummer, q. Plottad är τ vs q för bilder av ett aktivt aktin-mikrotubulinätverk (analyserar bara mikrotubulikanalen) i brunt och för bilder av ett aktivt aktinnätverk i grönt. Båda nätverken har samma koncentrationer av aktin och myosin (2,9 μM respektive 0,24 μM); aktin-mikrotubulikompositen har 2,9 μM tubulindimerer. Sönderfallstiderna för det aktiva aktinnätverket är mycket mindre än sönderfallstiderna för det aktiva aktin-mikrotubulinätverket, vilket indikerar snabbare rörelse av det aktiva aktinnätverket. I båda fallen är dynamiken ballistisk eftersom data följer en Equation010 trend. Infällt: ISF:ernas diagram jämfört med fördröjningstiden som skalas av vågnumret (Δt × q) visar en kollaps av ISF:erna över ett intervall av q-värden . Detta indikerar också ballistisk rörelse. De internetleverantör filer som visas i det här indraget kommer från det aktiva aktinnätverket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För dessa data för aktiva nätverk valde vi att passa DDM-matrisen, Equation010. Detta står i kontrast till vad som gjordes för data från pärlor i vimentinnätverket, där A (q) och B uppskattades utan någon anpassning för att isolera ISF, f (q, Δt). I det här fallet, för de aktiva nätverksdata, lämnades A och B som passande parametrar eftersom de metoder som användes för att uppskatta B inte resulterade i bra passformer. Standardmetoden för att uppskatta B är att beräkna Equation031 och anta att detta i stort q går till B/2. Denna metod överskattade emellertid B för dessa data, vilket sågs i det faktum att isf: erna från B uppskattade på detta sätt (visas inte) var större än 1 vid tidiga fördröjningstider (medan de borde gå från högst 1 till antingen noll eller någon icke-gudicitetsparameter med ökande fördröjningstid). Man kan välja andra metoder för att uppskatta B med hjälp av parametern background_method. En av dessa andra metoder är att uppskatta B till att vara minimum av DDM-matrisen vid tidiga fördröjningstider (inställd med background_method = 1). En liknande metod användes av Bayles et al.76, även om de inte antog att B var konstant med q. Ett annat alternativ är att uppskatta B till medelvärdet över alla fördröjningstider för DDM-matrisen vid det maximala q (inställt med background_method = 2). Dessa olika metoder för att uppskatta bakgrunden, liksom resultaten för att låta B vara en fri anpassningsparameter, visas i figur 10. Från dessa diagram kan man se att amplituden, A, inte nådde noll vid de största q-värdena som undersöktes, eftersom Equation031 den inte platåerade i stort q (figur 10B), och eftersom D (qmax, Δt) gick från en lägre fördröjningstidsplatå till någon högre fördröjningstidsplatå (dvs vid qmax fanns det en icke-noll A; Figur 10D). Därför skulle det varken vara lämpligt att uppskatta B som Equation082 eller Equation083 som skulle vara lämpligt. Man bör inspektera Equation031 vs. q och D(qmax, Δt) vs. Δt innan man bestämmer sig för hur (eller om) man ska uppskatta B.

Figure 10
Figur 10: Bakgrund kontra vågnummer för aktiva aktin-mikrotubulinätverk. Genom att montera DDM-matrisen kan man hitta bakgrunden, B, som en funktion av vågnummer, q. Visas är B vs. q för bilder av ett aktivt aktin-mikrotubulinätverk (analyserar bara mikrotubulikanalen) bestämt utifrån dessa passningar med de lila symbolerna. De tre heldragna linjerna i (A) visar uppskattningar av bakgrunden som hittats utan någon passning. Den översta, mörkaste linjen i (A) visar den uppskattade bakgrunden med hjälp av Equation088, vilket kan vara lämpligt om Equation031 platåer till ett konstant värde vid stort q. Från (B), notera att det Equation031 ännu inte har nått ett konstant värde vid den största q-sonderingen. Därför överskattar bakgrunden med hjälp av denna metod. Den nedersta raden i (A) visar den uppskattade bakgrunden med .Equation090 Om DDM-matrisen visar en låg fördröjningstidsplatå som visas i (C) med den röda linjen, kan den här metoden vara lämplig för att uppskatta bakgrunden. Den mellersta, lättaste linjen i (A) visar den uppskattade bakgrunden från Equation083. Denna metod kan vara lämplig om amplituden A vid qmax har nått noll. Från (D) ses att amplituden är icke-noll och därför överskattar denna metod bakgrunden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur S1: Sannolikhetsfördelningar för partikelförskjutningar. Sannolikhetsfördelningar av partikelförskjutningar visar icke-Gaussianitet för vimentinkoncentrationer på 34 μM och 49 μM. Enpartikelspårning av pärlor med en diameter på 0,6 μm utfördes i vimentinnätverk med olika koncentrationer. Olika fördröjningstider visas i förskjutningsfördelningarna för de tre villkoren. (A) Fördelningen av partikelförskjutningar i ett 19 μM vimentinnätverk är lämplig med en Gaussisk funktion. Gaussians bredd ökar med ökande fördröjningstid. (B) Fördelningen av partikelförskjutningar i ett 34 μM vimentinnätverk visar mer icke-Gaussianitet, särskilt vid stora förskjutningar, än för 19 μM-fallet. (C) Fördelningen av partikelförskjutningar i ett 49 μM vimentinnätverk visar också icke-Gaussianitet. Vidare ökar inte fördelningarnas bredder med fördröjningstid lika signifikant som i proverna med lägre vimentinkoncentrationer, vilket indikerar begränsad rörelse. Icke-gaussiska van Hove-fördelningar (sett för alla vimentinprover men mest uppenbara i de högre koncentrationerna) är förknippade med heterogen dynamik som ofta ses vid transport av partiklar i trånga och begränsade miljöer. En annan indikator på heterogen transport som bestäms från DDM-analys är sträckningsexponenten som används för att passa den mellanliggande spridningsfunktionen (parametern s i ekvationen för ISF som används här: Equation077 + Equation061). De genomsnittliga sträckningsexponenterna över q-intervallet 0,4 μm-1 till 9,4 μm-1 är, från högsta vimentinkoncentration till lägsta, 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 och 0,86 ± 0,04 (medelvärde ± standardavvikelse). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S2: De mellanliggande spridningsfunktionerna från DDM och SPT. De mellanliggande spridningsfunktionerna (ISF) för fem olika vågnummer visas. ISF kontra fördröjningstiden som hittas genom DDM plottas med cirkulära markörer, och ISF beräknas från enpartikelbanor med öppna rutor. Prickade svarta linjer visar passningarna till de DDM-förvärvade ISF:erna. ISF beräknas från enpartikelbanor, Equation075, med hjälp av Equation076. I (A) visas ISF för 0,6 μm partiklar i 19 μM vimentinnätverk. I (B) visas ISF för 0,6 μm partiklar i 34 μM vimentinnätverk. Avvikelserna i ISF som hittats från DDM och SPT beror sannolikt på ett begränsat antal långa fördröjningsbanor. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 1: Protokoll för användning av DDM. Inmatningen och utmatningen av stegen som visas i protokollet presenteras. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 2: Detaljer om provberedning och exempelparameterfiler för vimentinnätverk. Detaljerade steg för provberedning och bildförvärv på vimentinnätverk tillhandahålls. Dessutom tillhandahålls en exempelparameterfil för analys av data som presenteras i avsnittet om representativa resultat om vimentinnätverk. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Programvarupaketet som beskrivs här använder DDM för att analysera densitetsfluktuationer som observerats i bilder som förvärvats med hjälp av ett optiskt mikroskop. Representativa resultat från data från spårpartiklar inbäddade i vimentinnätverk visades först. Analysen av sådana data kan användas för att karakterisera nätets maskstorlek och styvhet på samma sätt som enpartikelspårning har använts i många tidigare studier av cytoskelettnätverk 6,12,13. En fördel med att använda DDM jämfört med enpartikelspårning är att DDM inte kräver att partiklarna lokaliseras. Därför, även i bilder där partikeldensiteten är för hög eller partiklarna för små för att lokalisera och spåra, kan DDM fortfarande bestämma dynamiken. Där spårning av en partikel skulle vara fördelaktigt är vid inspektion av partikel-till-partikel-variabilitet. Med DDM finner man ensemblens genomsnittliga dynamik medan man med enpartikelspårning kan beräkna både en enda partikels MSD och ensemble-medelvärdet MSD. DDM kan dock användas för att undersöka heterogen dynamik genom att analysera flera regioner av intresse inom ett stort synfält.

Därefter visades representativa resultat från data av fluorescerande märkta filament i ett aktivt nätverk bestående av två olika märkta cytoskelettfilamenttyper11. Med dessa data karakteriserades den ballistiska rörelsen utan att behöva några lokaliserbara funktioner i bilden. Eftersom DDM extraherar ensemblens genomsnittliga dynamik med få användaringångar, gör det enkelt att jämföra bildserier som förvärvats med olika förhållanden (t.ex. att jämföra prover med olika förhållanden mellan aktin och mikrotubuli eller prover med olika koncentrationer av myosin, som gjorts i50). Med hjälp av fluorescerande avbildning kan vi dessutom undersöka dynamiken hos olika komponenter i ett nätverk med hjälp av flerfärgad märkning. Detta gjordes i11,50, där dynamiken hos aktin och mikrotubuli analyserades separat i ett aktivt aktin-mikrotubulikompositnätverk med hjälp av flerfärgad avbildning. I avsnittet om representativa resultat här visades bara resultaten från mikrotubulikanalen, men i tidigare arbete jämförde vi dynamiken hos mikrotubuli och aktinfilament11.

Vi noterar att dessa representativa resultat visar antingen passiv subdiffusion eller aktiv ballistisk rörelse. Viktigt är att DDM kan användas för att analysera system där det finns en crossover i typen av dynamik vid mellanliggande tids- eller längdskalor. använde DDM med ett system av aktiva Janus-kolloider för att utforska aktiv riktad rörelse vid korta tidsskalor och randomisering av orienteringen vid längre tidsskalor59; använde DDM med ett grovskum och fann en korsning i dynamiken som motsvarar längdskalan för en bubbla33; använde DDM med kolloidala geler och fann tre urskiljbara regimer i olika längdskalor som sträckte sig från fraktalklusterna till hela nätverket32.

De data som ingår i avsnittet om representativa resultat förvärvades med brightfield-mikroskopi och laserscannande konfokalmikroskopi. Men som tidigare nämnts kan DDM användas med många bildmetoder. Med vilken bildmodalitet som helst bör användare överväga optiska inställningar som graden av optisk sektionering eller skärpedjupet. En hög grad av optisk sektionering kan minska signalen från objekt som inte är i fokus, men man kommer inte att kunna mäta dynamiken exakt över tidsskalor som är större än tidsskalan för objekt att röra sig ur skärpedjupet25,28. En mer grundlig diskussion om hur det q-beroende skärpedjupet påverkar DDM-analysen finns i22. För ljusfältsavbildning kan användare också behöva överväga provtjockleken. Medan för svagt spridda prover kan tjockare prover ge mer signal42, kan grumliga prover kräva att analysen modifieras för att ta hänsyn till multipel spridning81. Slutligen, för avbildningsmetoder som inte är linjära rymdinvarianta (det vill säga där intensiteten som registreras av kameran på ett objekt beror på var objektet befinner sig i x-y-provplanet), kan man behöva ta hänsyn till den linjära rymdvariansen, vilket demonstreras med DDM27 med mörkt fält.

För dem som kommer igång med DDM vill vi betona vikten av att överväga den rumsliga och tidsmässiga upplösningen. När man inspekterar de bestämda sönderfallstiderna som en funktion av vågnumret är det viktigt att markera gränserna för sin upplösning (dvs. de maximala och minsta fördröjningstiderna och det maximala vågnumret, som görs i figur 5). Man bör tänka noga över dessa gränser innan man samlar in data så att den optimala objektivlinsen, bildstorleken, bildhastigheten och filmens varaktighet kan väljas. Det andra viktiga övervägandet är hur man uppskattar bakgrundsparametern B. Flera metoder för att skatta bakgrunden har använts i litteraturen, och effekterna av över- eller underskattning av B har beskrivits i tidigare publikationer62,77. Som visas i figur 10 tillåter PyDDM användare att implementera olika metoder för att uppskatta B, och vi föreslår att nya användare provar dessa metoder och utvärderar vilka som är lämpliga att använda.

En styrka med detta paket är dess grundliga dokumentation och genomgångar med exempeldata, lagring och organisering av metadata för att hålla reda på hur analyser utfördes och flexibiliteten i hur man analyserar DDM-matrisen (olika anpassningsmodeller, flera metoder för att uppskatta bakgrundsparametern B, möjligheten att hitta MSD). Det finns dock flera aspekter av den här koden som kan förbättras. För närvarande har koden inte optimerats för snabb beräkningshastighet. Metoder för att snabba upp beräkningen har rapporterats61,62, och dessa kommer att implementeras i framtida utgåvor. Dessutom planerar vi att implementera nyligen rapporterade metoder för att bättre uppskatta osäkerheter och att använda simuleringar för att vägleda användare till lämplig ISF-modell62. För andra förbättringar hoppas vi att användare kommer att kontakta oss med förslag.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Delar av denna forskning finansierades av ett National Institutes of Health R15 Award (National Institute of General Medical Sciences award nr. R15GM123420, tilldelas R.M.R.-A. och R.J.M.), ett Cottrell Scholar Award från Research Corporation for Science Advancement (pris nr 27459, tilldelat R.J.M.) och ett William M. Keck Foundation Research Grant (tilldelat R.M.R-A.). GHK erkänner tacksamt ekonomiskt stöd från det nederländska forskningsrådet (NWO; projektnummer VI.C.182.004 i NWO Talent Programme).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 Hamatsu
F-127 Pluronic Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop Thermo Fisher
Nikon Ti-Eclipse microscope Nikon
PLL-PEG-bio SuSos AG, Dübendorf, Switzerland
Polystyrene beads Sigma Aldrich
Protein dialysis mini-cassette Thermo Fisher
PyDDM University of San Diego N/A Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).
  2. Amblard, F., Maggs, A. C., Yurke, B., Pargellis, A. N., Leibler, S. Subdiffusion and anomalous local viscoelasticity in actin networks. Physical Review Letters. 77 (21), 4470-4473 (1996).
  3. Mizuno, D., Tardin, C., Schmidt, C. F., MacKintosh, F. C. Nonequilibrium mechanics of active cytoskeletal networks. Science. 315 (5810), 370-373 (2007).
  4. Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).
  5. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Physical Review Letters. 102 (18), 188303 (2009).
  6. Stuhrmann, B., Soares e Silva, M., Depken, M., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Nonequilibrium fluctuations of a remodeling in vitro cytoskeleton. Physical Review E. 86 (2), 020901 (2012).
  7. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  8. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  9. Anderson, S. J. et al. Filament rigidity vies with mesh size in determining anomalous diffusion in cytoskeleton. Biomacromolecules. 20 (12),4380-4388 (2019).
  10. Anderson, S. J., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  11. Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).
  12. Wong, I. Y. et al. Anomalous diffusion probes microstructure dynamics of entangled F-actin networks. Physical Review Letters. 92 (17), 178101 (2004).
  13. Köster, S., Lin, Y.-C., Herrmann, H., Weitz, D. A. Nanomechanics of vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 6 (9), 1910-1914 (2010).
  14. Chandrakar, P. et al. Engineering stability, longevity, and miscibility of microtubule-based active fluids. Soft Matter. 18 (9), 1852-1835 (2022).
  15. Alvarado, J., Cipelletti, L., H. Koenderink, G. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).
  16. Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
  17. Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).
  18. Malik-Garbi, M. et al. Scaling behaviour in steady-state contracting actomyosin networks. Nature Physics. 15 (5), 509-516 (2019).
  19. Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (5), e2115895119 (2022).
  20. Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., Nédélec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e714 (2018).
  21. Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).
  22. Giavazzi, F., Brogioli, D., Trappe, V., Bellini, T., Cerbino, R. Scattering information obtained by optical microscopy: differential dynamic microscopy and beyond. Physical Review E. 80 (3), 031403 (2009).
  23. Giavazzi, F., Cerbino, R. Digital Fourier microscopy for soft matter dynamics. Journal of Optics. 16 (8), 083001 (2014).
  24. He, K., Spannuth, M., Conrad, J. C., Krishnamoorti, R. Diffusive dynamics of nanoparticles in aqueous dispersions. Soft Matter. 8 (47), 11933-11938 (2012).
  25. Lu, P. J. et al. Characterizing concentrated, multiply scattering, and actively driven fluorescent systems with confocal differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 108 (21), 218103 (2012).
  26. Giavazzi, F. et al. Viscoelasticity of nematic liquid crystals at a glance. Soft Matter. 10 (22), 3938-3949 (2014).
  27. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Dark-field differential dynamic microscopy. Soft Matter. 12 (8), 2440-2452 (2016).
  28. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. Light-sheet microscopy with digital Fourier analysis measures transport properties over large field-of-view. Optics Express. 24 (18), 20881-20894 (2016).
  29. Richards, J. A., Martinez, V. A., Arlt, J. Particle sizing for flowing colloidal suspensions using flow-differential dynamic microscopy. Soft Matter. 17 (14), 3945-3953 (2021).
  30. Ferri, F. et al. Kinetics of colloidal fractal aggregation by differential dynamic microscopy. The European Physical Journal Special Topics. 199 (1), 139-148 (2011).
  31. Lanfranco, R. et al. Adaptable DNA interactions regulate surface triggered self assembly. Nanoscale. 12 (36), 18616-18620 (2020).
  32. Cho, J. H., Cerbino, R., Bischofberger, I. Emergence of multiscale dynamics in colloidal gels. Physical Review Letters. 124 (8), 088005 (2020).
  33. Giavazzi, F., Trappe, V., Cerbino, R. Multiple dynamic regimes in a coarsening foam. Journal of Physics: Condensed Matter. 33 (2), 024002 (2020).
  34. He, K. et al. Diffusive dynamics of nanoparticles in arrays of nanoposts. ACS Nano. 7 (6), 5122-5130 (2013).
  35. Jacob, J. D. C., He, K., Retterer, S. T., Krishnamoorti, R., Conrad, J. C. Diffusive dynamics of nanoparticles in ultra-confined media. Soft Matter. 11 (38), 7515-7524 (2015).
  36. Sentjabrskaja, T. et al. Anomalous dynamics of intruders in a crowded environment of mobile obstacles. Nature Communications. 7, 11133 (2016).
  37. Hitimana, E., Roopnarine, B. K., Morozova, S. Diffusive dynamics of charged nanoparticles in convex lens-induced confinement. Soft Matter. 18 (4), 832-840 (2022).
  38. Wilson, L. G. et al. Differential dynamic microscopy of bacterial motility. Physical Review Letters. 106 (1), 018101 (2011).
  39. Martinez, V. A. et al. Differential dynamic microscopy: a high-throughput method for characterizing the motility of microorganisms. Biophysical Journal. 103 (8), 1637-1647 (2012).
  40. Germain, D., Leocmach, M., Gibaud, T. Differential dynamic microscopy to characterize Brownian motion and bacteria motility. American Journal of Physics. 84 (3), 202-210 (2016).
  41. Croze, O. A. et al. Helical and oscillatory microswimmer motility statistics from differential dynamic microscopy. New Journal of Physics. 21 (6), 063012 (2019).
  42. Safari, M. S., Vorontsova, M. A., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of weakly scattering and polydisperse protein-rich clusters. Physical Review E. 92 (4), 042712 (2015).
  43. Wang, J., McGorty, R. Measuring capillary wave dynamics using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 15 (37), 7412-7419 (2019).
  44. Cerbino, R., Giavazzi, F., Helgeson, M. E. Differential dynamic microscopy for the characterization of polymer systems. Journal of Polymer Science. 60 (7), 1079-1089 (2021).
  45. Cerbino, R., Cicuta, P. Perspective: differential dynamic microscopy extracts multi-scale activity in complex fluids and biological systems. The Journal of Chemical Physics. 147 (11), 110901 (2017).
  46. Drechsler, M., Giavazzi, F., Cerbino, R., Palacios, I. M. Active diffusion and advection in Drosophila oocytes result from the interplay of actin and microtubules. Nature Communications. 8 (1), 1-11 (2017).
  47. Burla, F., Sentjabrskaja, T., Pletikapic, G., Beugen, J. v., H. Koenderink, G. Particle diffusion in extracellular hydrogels. Soft Matter. 16 (5), 1366-1376 (2020).
  48. Regan, K., Wulstein, D., Rasmussen, H., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. M. Bridging the spatiotemporal scales of macromolecular transport in crowded biomimetic systems. Soft Matter. 15 (6), 1200-1209 (2019).
  49. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).
  50. Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).
  51. Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv:2112.11260 .(2021).
  52. Chen, X. et al. Coaxial differential dynamic microscopy for measurement of Brownian motion in weak optical field. Optics Express. 26 (24), 32083-32090 (2018).
  53. Reufer, M., Martinez, V. A., Schurtenberger, P., Poon, W. C. K. Differential dynamic microscopy for anisotropic colloidal dynamics. Langmuir. 28 (10), 4618-4624 (2012).
  54. Giavazzi, F., Haro-Pérez, C., Cerbino, R. Simultaneous characterization of rotational and translational diffusion of optically anisotropic particles by optical microscopy. Journal of Physics: Condensed Matter. 28 (19), 195201 (2016).
  55. Cerbino, R., Piotti, D., Buscaglia, M., Giavazzi, F. Dark field differential dynamic microscopy enables accurate characterization of the roto-translational dynamics of bacteria and colloidal clusters. Journal of Physics: Condensed Matter. 30 (2), 025901 (2017).
  56. Safari, M. S., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of bidisperse colloidal suspensions. npj Microgravity. 3 (1), 21 (2017).
  57. Giavazzi, F., Pal, A., Cerbino, R. Probing roto-translational diffusion of small anisotropic colloidal particles with a bright-field microscope. The European Physical Journal E. 44 (4), 61 (2021).
  58. Schwarz-Linek, J. et al. Escherichia coli as a model active colloid: a practical introduction. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 137, 2-16 (2016).
  59. Kurzthaler, C. et al. Probing the spatiotemporal dynamics of catalytic Janus particles with single-particle tracking and differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
  60. Mandal, S., Kurzthaler, C., Franosch, T., Löwen, H. Crowding-enhanced diffusion: an exact theory for highly entangled self-propelled stiff filaments. Physical Review Letters. 125 (13), 138002 (2020).
  61. Norouzisadeh, M., Chraga, M., Cerchiari, G., Croccolo, F. The modern structurator: increased performance for calculating the structure function. The European Physical Journal E. 44 (12), 146 (2021).
  62. Gu, M., Luo, Y., He, Y., Helgeson, M. E., Valentine, M. T. Uncertainty quantification and estimation in differential dynamic microscopy. Physical Review E. 104 (3), 034610 (2021).
  63. Hoyer, S., Hamman, J. xarray: N-D labeled arrays and datasets in Python. Journal of Open Research Software. 5 (1), 10 (2017).
  64. Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. Stiffening and inelastic fluidization in vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 15 (36), 7127-7136 (2019).
  65. Guo, M. et al. The role of vimentin intermediate filaments in cortical and cytoplasmic mechanics. Biophysical Journal. 105 (7), 1562-1568 (2013).
  66. Lavenus, S. B., Tudor, S. M., Ullo, M. F., Vosatka, K. W., Logue, J. S. A flexible network of vimentin intermediate filaments promotes migration of amoeboid cancer cells through confined environments. Journal of Biological Chemistry. 295 (19), 6700-6709 (2020).
  67. Patteson, A. E. et al. Loss of vimentin enhances cell motility through small confining spaces. Small. 15 (50), 1903180 (2019).
  68. Lin, Y.-C. et al. Origins of elasticity in intermediate filament networks. Physical Review Letters. 104 (5), 058101 (2010).
  69. Pawelzyk, P., Mücke, N., Herrmann, H., Willenbacher, N. Attractive interactions among intermediate filaments determine network mechanics in vitro. PLOS ONE. 9 (4), e93194 (2014).
  70. Schepers, A. V. et al. Multiscale mechanics and temporal evolution of vimentin intermediate filament networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (27), e2102026118 (2021).
  71. Wu, H. et al. Effect of divalent cations on the structure and mechanics of vimentin intermediate filaments. Biophysical Journal. 119 (1), 55-64 (2020).
  72. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  73. Giavazzi, F., Malinverno, C., Scita, G., Cerbino, R. Tracking-free determination of single-cell displacements and division rates in confluent monolayers. Frontiers in Physics. 6, 120 (2018).
  74. Cho, J. H. Multiscale Probing of Colloidal Gelation Dynamics., Massachusetts Institute of Technology (2018).
  75. Krall, A. H., Weitz, D. A. Internal dynamics and elasticity of fractal colloidal gels. Physical Review Letters. 80 (4), 778-781 (1998).
  76. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Probe microrheology without particle tracking by differential dynamic microscopy. Rheologica Acta. 56 (11), 863-869 (2017).
  77. Edera, P., Bergamini, D., Trappe, V., Giavazzi, F., Cerbino, R. Differential dynamic microscopy microrheology of soft materials: a tracking-free determination of the frequency-dependent loss and storage moduli. Physical Review Materials. 1 (7), 073804 (2017).
  78. Wang, B., Kuo, J., Bae, S. C., Granick, S. When Brownian diffusion is not Gaussian. Nature Materials. 11 (6), 481-485 (2012).
  79. soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0. Zenodo (2021).
  80. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
  81. Nixon-Luke, R., Arlt, J., Poon, W. C. K., Bryant, G., Martinez, V. A. Probing the dynamics of turbid colloidal suspensions using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 18 (9), 1856-1867 (2022).

Tags

Bioteknik utgåva 184
Kvantifiering av cytoskelettdynamik med hjälp av differentiell dynamisk mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G.,… More

Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G., Petitjean, I. I., Koenderink, G. H., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. J. Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63931, doi:10.3791/63931 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter