Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

차등 동적 현미경을 사용하여 세포 골격 역학 정량화

Published: June 15, 2022 doi: 10.3791/63931
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 2, 2
1Cell Biology, Neurobiology and Biophysics, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 2Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

Summary

차동 동적 현미경 (DDM)은 동적 광산란과 현미경의 기능을 결합합니다. 여기서, DDM을 사용하여 비멘틴 네트워크에서 입자의 서브확산 및 케이징된 역학을 정량화함으로써 재구성된 세포골격 네트워크를 특성화하는 과정과 활성 미오신 구동 액틴-미세소관 복합체의 탄도 운동이 제시된다.

Abstract

세포는 크롤링하고, 스스로 치유하고, 현저하게 역동적인 세포 골격으로 인해 강성을 조정할 수 있습니다. 이와 같이, 세포골격 바이오폴리머의 네트워크를 재구성하는 것은 활성이고 적응가능한 물질의 호스트로 이어질 수 있다. 그러나 이러한 재료를 정밀하게 조정 된 특성으로 엔지니어링하려면 역학이 네트워크 구성 및 합성 방법에 어떻게 의존하는지 측정해야합니다. 이러한 역학을 정량화하는 것은 복합 네트워크의 시간, 공간 및 공식화 공간에 걸친 변형에 의해 도전 받고 있습니다. 여기의 프로토콜은 푸리에 분석 기술인 차등 동적 현미경(DDM)이 어떻게 생체 중합체 네트워크의 역학을 정량화할 수 있는지를 설명하며, 특히 세포골격 네트워크 연구에 매우 적합합니다. DDM은 레이저 스캐닝 공초점, 광역 형광 및 브라이트필드 이미징을 포함한 다양한 현미경 양식을 사용하여 획득한 이미지의 시간 시퀀스에서 작동합니다. 이러한 이미지 시퀀스로부터, 파동 벡터의 스팬에 걸친 밀도 변동의 특징적인 역상관 시간을 추출할 수 있다. DDM 분석을 수행하는 사용자 친화적 인 오픈 소스 Python 패키지도 개발되었습니다. 이 패키지를 사용하면 중간 필라멘트 (vimentin) 네트워크 및 활성 액틴 - 미세 소관 네트워크의 데이터로 여기에서 입증 된 바와 같이 표지 된 세포 골격 구성 요소 또는 임베디드 트레이서 입자의 역학을 측정 할 수 있습니다. 사전 프로그래밍 또는 이미지 처리 경험이 없는 사용자는 이 소프트웨어 패키지 및 관련 문서를 사용하여 DDM을 수행할 수 있습니다.

Introduction

세포 골격은 진핵 세포의 세포질을 가로 질러 세포 표면을 핵에 연결하는 단백질 필라멘트의 네트워크입니다. 그것은 크고 반복되는 기계적 부하에 대한 기계적 보호를 제공하는 독특한 재료 특성을 가지고 있지만 동적 셀 모양 변화를 주도합니다1. 재구성 된 세포 골격 네트워크는 임베디드 입자의 케이징에서 분자 모터에 의해 구동되는 탄도 운동에 이르기까지 다양한 흥미로운 동적 행동을 일으킬 수 있습니다 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . 이러한 네트워크의 역학을 분석하는 방법에는 임베디드 트레이서 마이크로스피어(6,7,12,13,14)의 모션을 추적하는 것, 시간에 따른 단백질-밀도 클러스터의 크기를 추적하는 이미지 분석(8), 동적 광 산란 15, 입자 이미지 속도계4,16,17,18,19가 포함된다. , 시간에 따른 이미지의 파워 스펙트럼 밀도를 계산(19), 및 키모그래프 분석(20)을 계산한다. 재구성 된 세포 골격 네트워크에 대한 더 많은 연구가 수행됨에 따라 세포 역학 또는 활성 물질을 이해할지 여부, 역학을 특성화하기위한 견고하고 편견이 없으며 재현 가능한 방법이 점점 더 필요합니다. 세포 골격 역학을 연구하는 데 사용 된 비교적 새로운 기술 인 차동 동적 현미경 (DDM) 21,22은 사용자 정의 매개 변수가 거의없는 역학을 효율적으로 정량화하는 기술 중 하나입니다. 여기에 설명 된 소프트웨어 패키지를 사용하면 프로그래밍 또는 이미지 분석 경험이 거의없는 연구원이 DDM을 자신의 작업에 활용할 수 있습니다.

DDM은 샘플의 역학을 추출하는 이미지 분석 기술입니다. 입자 추적 또는 입자 이미지 속도측정과 마찬가지로 DDM에는 일반적으로 현미경으로 기록되는 시계열 이미지(종종 수천 개의 이미지)가 필요합니다. 파티클 트래킹과 달리, 개별 피쳐 또는 트레이서 비드는 이미지에서 국부화(또는 지역화될 수 있음)될 필요가 없습니다. 입자 추적 및 입자 이미지 속도측정과 달리 상대적으로 적은 사용자 지정 매개 변수로 DDM을 사용하여 앙상블 역학을 복구합니다. DDM을 사용하면 푸리에 공간에서 이미지를 분석하여 파수 범위, q, 여기서 q = 2πu, u는 공간 주파수 Equation004 의 크기, q에 대한 밀도 변동의 감쇠 시간을 결정합니다. 하나는 산란과 같은 정보를 얻지만 현미경21,22,23에서 획득 한 실제 공간 이미지를 얻습니다. 따라서, 광역 형광 22,24, 공초점 형광 25, 편광 26, 암장27, 또는 광장 형광 28 현미경과 같은 현미경 검사의 다양한 콘트라스트 생성 방법을 이용할 수 있다. 또한, DDM 분석에 사용되는 이미지들은 상보적인 정보를 제공하기 위해 입자 추적 또는 입자 이미지 속도측정에 사용될 수 있다.

동적 광산란과 광학 현미경의 이러한 기능의 조합은 DDM을 강력하고 다재다능한 기술로 만듭니다. DDM이 73nm 콜로이드 입자의 확산을 측정하기 위해 입증 된 2008 년 21 년 Cerbino and Trappe에 의해 처음 설명 된 이래로, DDM은 흐르는 콜로이드 29, 콜로이드 응집30,31, 네마틱 액정의 점탄성 26, 콜로이드 젤32의 역학, 조대 폼 33, 제한된 환경에서의 나노 입자 34, 35,36,37, 박테리아 운동성 38,39,40,41, 약하게 산란하는 단백질 클러스터(42), 유체 계면에서의 모세관파(43), 및 다른 시스템의 확산. DDM을 사용하는 출판물의보다 완전한 목록을 찾는 사람들은 주제에 대한 철저한 검토 논문 22,23,44,45를 참조 할 수 있습니다.

DDM은 또한 생물학적 네트워크의 역학을 조사하는 데 사용되었습니다. Drechsler et al.은 DDM을 사용하여 살아있는 초파리 난모세포에서 액틴의 역학을 측정했습니다46. Burla et al. 히알루로난과 히알루로난-콜라겐 복합체47의 네트워크에서 트레이서 입자의 역학을 정량화하였다. 재구성된 세포골격 네트워크(9,10)에서 트레이서 입자의 역학을 연구하기 위한 DDM의 몇몇 용도, 그러한 네트워크에서의 DNA 분자의 수송(48,49), 및 활성 재구성된 네트워크의 역학 또한 11,50,51이 문서화되었다. 이러한 시스템에서 역학을 측정할 때 DDM의 장점은 개별 입자 또는 분자를 국부화하고 추적할 필요가 없다는 것입니다. 예를 들어, 혼잡 한 환경에서 DNA 분자의 역학은 이러한 작고 비 구형 분자를 추적하는 데 어려움이 있음에도 불구하고 DDM으로 측정 할 수 있습니다. 또한, 형광 현미경을 사용하면 다중 색상 라벨링을 사용하여 복합 복합체에서 개별 구성 요소의 역학을 선택적으로 측정 할 수 있습니다.

DDM을 수행하기 위해 시간이 지남에 따라 일련의 이미지 인 I (x, y, t)를 가져옵니다. 주어진 래그 시간에 대해,Δt, 그 지연 시간에 의해 분리된 이미지의 모든 (또는 서브세트의) 쌍이 발견된다. 각 쌍의 차이의 제곱 푸리에 변환,

Equation007

는 함께 계산되고 평균화됩니다. 이 양은, Equation008역학이 등방성인 경우에 한해, 방사상으로 평균화된다. 이렇게 하면 DDM 행렬(이미지 구조 함수라고도 함) Equation009이 생성됩니다. 이 프로세스는 그림 1에 그래픽으로 표시되어 있습니다. 이 DDM 행렬에서 샘플의 역학을 결정하기 위해 DDM 행렬은 형태를 취한다고 가정합니다.

Equation010

여기서 A는 현미경의 세부 사항과 샘플의 구조에 의존하는 진폭이고, B는 이미지의 노이즈에 의존하는 배경이며, f (q,Δt)는 역학21,22에 대한 정보를 포함하는 중간 산란 함수 (ISF)입니다. 간단한 경우에,

Equation014

여기서 τ는 특징적인 감쇠 또는 비상관관계 시간이다. 이러한 ISF는 묽은 콜 로이드 현탁액 21,24,27,37,40,52와 같은 인체 시스템에 DDM을 사용하는 여러 연구에서 사용되어 왔다. 그러나 ISF의 다른 형태를 사용하여 다양한 유형의 역학을 모델링 할 수 있습니다. 예를 들어, 다분산 샘플에 대한 ISF를 모델링하기 위해 누적 확장을 다음과 같이 사용할 수 있다.

Equation016

여기서 μ는 다분산도42,53의 척도이고; 밀도 변동이 두 가지 개별 모드로 감소하면 다음과 같은 ISF를 사용할 수 있습니다

Equation01826, 54, 55, 56 , 57;

다른 ISF는 미생물 또는 다른 활성 입자 38,39,40,41,58,59를 수영하는데 사용될 수 있다.

Figure 1
그림 1: DDM 분석 개요. 이미지의 시계열에서 이미지 차이의 푸리에 변환이 계산되어 DDM 행렬을 계산합니다. DDM 행렬은 q 값 범위에 걸친 밀도 변동의 시간 척도를 결정하기 위해 모델에 적합할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

여기에서는 Python, PyDDM으로 개발된 DDM 분석 소프트웨어 패키지의 사용에 대해 설명합니다. 이 소프트웨어 패키지는 지난 몇 년 동안 연구 실험실 및 기타 출판 된 연구에서 수행 한 작업을 기반으로합니다. 이 소프트웨어 패키지를 만들기 위한 주요 동기는 (1) 분석에 사용된 메타데이터 및 파라미터를 추적하고 저장해야 할 필요성을 포함한다. (2) 처음부터 끝까지 분석의 상세한 예와 함께 철저한 문서화; (3) 데이터를 피팅하기 위해 상이한 수학적 모델을 채용하는(또는 새로운) 수학적 모델을 생성하는 쉬운 방법(예를 들어, 활성 필라멘트(60)을 위해 최근에 개발된 것과 같은 ISF 모델을 추가하는 것은 간단할 것이다). DDM 분석을위한 다른 소프트웨어 패키지도 존재하지만 모든 것이 오픈 소스 프로그래밍 언어로 잘 문서화되고 작성된 것은 아닙니다. 예를 들어, GPU(https://github.com/peterlu/ConDDM)25에서 컴퓨팅을 사용하는 C++ 코드, 푸리에 변환을 사용하여 계산 속도를 높이는 C++ 코드(https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, MATLAB 및 Python 버전(https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, MATLAB 코드(https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27, 불확실성 정량화가 있는 MATLAB 코드( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. 이 PyDDM 패키지는 잘 문서화되어 있으며 DDM 매트릭스를 계산하고 분석하는 방법에 많은 유연성을 제공하므로 프로그래밍 또는 이미지 분석의 배경에 관계없이 DDM을 구현하려는 연구원에게 유용 할 수 있습니다.

이 프로토콜은 이 소프트웨어 패키지를 사용하여 시험관내 재구성된 세포골격 네트워크의 역학을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이것은 두 개의 뚜렷한 이미징 데이터 세트를 사용하여 수행됩니다 : (1) 밝은 필드 현미경으로 찍은 vimentin 네트워크에 내장 된 서브 마이크론 트레이서 입자의 이미지와 (2) 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 찍은 미오신 구동 활동이있는 얽힌 복합 네트워크에서 형광 표지 된 액틴 및 미세 소관 필라멘트의 이미지. 이 두 데이터 세트의 분석은 다양한 이미징 형식 (예 : 밝은 필드 또는 공초점 형광)으로 촬영 한 이미지를 분석하고, 임베디드 트레이서 또는 라벨이 붙은 필라멘트에서 역학을 추출하고, 다양한 역학 (예 : 하위 확산 및 제한 또는 탄도)을 정량화하는 능력을 포함하여 DDM의 주목할만한 강점을 강조합니다.

Protocol

참고: 다음 프로토콜의 각 단계와 함께 사용할 코드가 포함된 Jupyter 노트북 파일은 다음 GitHub 리포지토리 https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples 에서 찾을 수 있습니다. 해당 파일의 PDF는 보충 파일 1에 포함되어 있습니다. 또한 각 함수 및 클래스의 코드 및 설명서에 대한 연습은 웹 사이트 https://rmcgorty.github.io/PyDDM/ 에서 찾을 수 있습니다.

1. 소프트웨어 설치

  1. 예제 DDM 분석 파일을 따라 가려면 코드 실행을 위해 Jupyter Notebook을 설치합니다. NumPy 및 Matplotlib를 포함한 다른 필수 공통 Python 패키지도 설치하십시오. 이 패키지는 모두 Anaconda 배포판과 함께 번들로 제공됩니다 (https://www.anaconda.com/products/individual 참조).
  2. 파이썬 패키지 xarray63을 설치하십시오. 이 패키지는 메타데이터 및 분석 매개 변수를 구성하고 저장하는 데 필요합니다. Anaconda 배포판을 사용하는 경우 다음 명령을 사용하여 xarray (권장 종속성과 함께)를 설치하십시오.
    conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 병목 현상
  3. 다음 명령을 사용하여 PyYAML 패키지를 설치합니다.
    conda install -c anaconda yaml
    이 패키지는 분석할 이미지와 사용자가 분석 및 피팅을 위해 설정한 파라미터에 대한 메타데이터를 읽는 데 필요합니다.
  4. GitHub 리포지토리에서 다운로드하거나 git 명령을 사용하여 PyDDM 패키지를 설치합니다.
    자식 클론 https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git

2. 이미징 세션 계획

  1. 사용 가능한 최적의 이미징 형식 및 광학 설정을 선택합니다. 앞서 언급했듯이 DDM은 여러 가지 현미경 검사 방법과 함께 사용할 수 있습니다.
  2. 사용할 적절한 대물 렌즈와 이미지 크기를 계획하는 데 도움이 되도록 픽셀 크기와 전체 이미지 크기에 따라 프로브될 웨이브 넘버( q)의 범위를 결정합니다. 배율 및 시야각의 선택이 이러한 계산을 기반으로 실험에 최적인지 확인합니다. 여기에서 분석된 이미지의 경우, 60x 1.4 NA 대물 및 0.83 μm의 픽셀 크기를 갖는 256 x 256 픽셀의 이미지 크기를 활성 액틴-미세소관 복합체 네트워크에 사용하였다. 비멘틴 네트워크에 내장된 비드의 이미지의 경우, 100x 1.4 NA 대물렌즈와 0.13μm의 픽셀 크기를 갖는 512 x 512 픽셀의 이미지 크기가 사용되었다.
    참고: 최소 q는 2π/NΔ x로 설정되며, 여기서 이미지 크기(정사각형으로 가정)는 N× N 픽셀이고 픽셀 크기는 Δx입니다. 최대 q는 최소 π/Δx 및 2π NA/λ이며, 여기서 NA는 이미징 대상의 수치 조리개이고 λ는 빛의 파장입니다(브라이트필드 이미징의 경우 NA를 (NA대물 + NA콘덴서)/2로 대체할 수 있음).
  3. 다음으로, 조사할 시간 척도의 범위를 고려합니다. 일반적으로 DDM 분석은 최소 1000 프레임의 시퀀스에서 수행됩니다.
    1. 적절한 프레임 속도를 결정하기 위해, 샘플의 피쳐가 최소 해결 가능한 길이 스케일(최대 q에 해당)의 순서로 거리를 이동하는 데 걸리는 예상 시간을 고려하십시오.
    2. 프로브된 시간 스케일 범위의 상한을 고려할 때, 전형적으로, 주어진 지연 시간Δt 의 수백 개의 이미지 차이들의 전력 스펙트럼이 잡음을 감소시키기에 충분한 통계를 제공하기 위해 함께 평균화된다는 것을 인식한다. 따라서 프로브된 최대 시간 척도보다 긴 이미지 시퀀스를 획득합니다.
      참고: 예상 확산 계수 D 또는 속도 v가 알려진 경우 τ = 1/Dq2 또는 τ = 1/vq를 사용하여 예상 특성 감쇠 시간을 q의 범위와 함께 추정할 수 있으며, 이는 시야각 및 픽셀 크기에 따라 결정됩니다. 액세스 가능한 q-범위에 대한 예상 τ 값의 범위는 프레임 속도의 선택과 획득할 프레임 수를 안내하는 데 도움이 될 수 있습니다.

3. 샘플 준비 및 이미지 수집

참고: 대표 결과 섹션에 제시된 데이터에 사용된 샘플 준비 및 이미징 설정에 대한 자세한 내용은 저자11,51,64 및 보충 파일 2의 이전 간행물을 참조하십시오.

  1. 프로브할 시간 및 길이 스케일의 고려에 기초하여, 이상적으로는, 1000 프레임 이상의 이미지 시퀀스를 획득한다.
    참고: 이 코드는 이미지 내에서 정사각형 이미지 또는 관심 있는 사각형 영역을 분석하므로 그에 따라 프레임 크기를 조정합니다.
  2. 이미지 시퀀스를 입체 그레이스케일 TIFF 스택으로 저장합니다. 또는 Nikon Instruments 시스템에서 사용하는 ND2 형식인 ND2 형식은 설치된 패키지에서 읽을 수 있습니다. 이미지가 다른 형식으로 저장된 경우 ImageJ 또는 다른 이미징 처리 프로그램을 사용하여 이미지를 TIFF 스택으로 변환합니다.
    참고: ND2 파일을 사용하는 경우 https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader 의 패키지 nd2reader를 설치해야 합니다.

4. 매개 변수 설정

  1. PyDDM 코드 리포지토리에 제공된 매개변수 파일 example_parameter_file.yml의 복사본을 예제 폴더 아래에 만듭니다. 이 YAML 파일을 NotePad++와 같은 텍스트 편집기 또는 JupyterLab의 텍스트 편집기로 엽니다. 대표 결과 섹션에 제시된 데이터 분석에 사용되는 예제 YAML 파라미터 파일은 보충 파일 2 를 참조하십시오.
  2. 복사된 YAML 파일에서 분석할 이미지 시퀀스에 해당하는 데이터 디렉터리 및 파일 이름을 제공합니다. 메타데이터 섹션 아래에서 픽셀 크기와 프레임 속도를 제공합니다.
  3. Analysis_parameters 섹션에서 DDM 행렬을 계산하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 여기에 있는 일부 매개 변수는 선택 사항입니다.
    1. 최소한 매개 변수 number_lag_times 및 last_lag_time에 대한 값을 제공합니다. 이들은 DDM 행렬을 계산하는 다른 지연 시간의 수와 사용할 가장 긴 지연 시간 (프레임 내)에 각각 해당합니다. 여기에 사용된 비멘틴 네트워크에서의 트레이서 비드의 데이터에 대해, 파라미터 number_lag_times 및 last_lag_time는 각각 60 및 1000이었다. 이 코드는 1 프레임에서 로그 간격이 있는 first_lag_time까지의 지연 시간(또는 선택적 매개 변수 last_lag_time이 지정된 경우 다른 최소 지연 시간)에 대한 DDM 행렬을 계산합니다.
      참고: M 프레임을 획득한 경우 M-1만큼 큰 지연 시간에 대한 DDM 행렬을 계산할 수 있습니다. 그러나 이러한 큰 지연 시간에 통계가 좋지 않으면 데이터가 시끄러울 수 있습니다. DDM 행렬을 계산하는 데 걸리는 가장 긴 지연 시간은 데이터의 세부 정보에 따라 다르지만 전체 이미지 시리즈 지속 시간의 삼분의 일 정도를 시도하는 것이 좋습니다.
  4. DDM 행렬 또는 ISF(중간 산란 함수)가 Fitting_parameters 섹션에 어떻게 적합해야 하는지에 대한 세부 정보를 제공합니다. model 매개변수 아래에 모델 이름을 지정합니다. 선택한 모델의 각 피팅 매개변수에 대한 초기 추측, 하한 및 상한을 제공합니다.
    참고: 가능한 피팅 모델 목록을 표시하려면 print_fitting_models 기능을 실행하십시오. 이 모델은 PyDDM 웹 사이트의 온라인 설명서에서도 찾을 수 있습니다.

5. DDM 행렬 계산

  1. DDM_Analysis 클래스의 인스턴스를 초기화합니다. 이렇게 하려면 YAML 파일의 전체 파일 경로가 포함된 파일 이름을 DDM_Analysis에 전달하여 위에서 설명한 메타데이터 및 분석 매개 변수를 제공합니다. 또는 메타데이터와 매개 변수를 Python 사전 데이터 구조로 전달합니다.
  2. 함수 calculate_DDM_matrix를 실행하여 DDM 행렬을 계산합니다. 이 계산은 프레임 크기와 지연 횟수에 따라 몇 분 이상 걸릴 수 있습니다. 일반적인 실행 시간은 그림 2 를 참조하십시오.
  3. 데이터 집합이라고 하는 xarray 패키지의 데이터 구조에 있는 반환된 데이터를 검사합니다. 이 데이터 구조는 속성 ddm_dataset 아래에 저장됩니다.
    참고: DDM 행렬뿐만 아니라 관련 변수 및 메타데이터도 이 데이터 구조에 저장됩니다. 또한 네트워크 공통 데이터 양식(netCDF) 형식으로 디스크에 저장됩니다.
  4. 생성되고 표시될 플롯과 그림을 검사합니다. 이 수치는 데이터 디렉토리에 PDF 파일로도 저장됩니다.
    1. 생성 된 플롯 중 하나가 푸리에 변환 된 이미지의 Equation031 앙상블 평균 제곱 모듈러스를 q의 함수로 보여줍니다. 기본적으로 코드에서는 이를 사용하여 배경 매개 변수 B를 추정합니다. 큰 q의 한계에서 Equation031 B가 배경인 B/2에 접근한다고 가정하여 배경을 추정하십시오.
    2. 큰 q에서 고원에 도달하지 못하면 Equation031 B를 추정하기위한 다른 방법을 사용하십시오. 이렇게 하려면 매개 변수 background_method을 YAML 파일 또는 함수 calculate_DDM_matrix에 대한 선택적 키워드 인수로 설정합니다. B를 추정하는 방법에 대한 자세한 내용은 대표적인 결과 섹션에 제시되어 있다.

Figure 2
그림 2: DDM 행렬을 계산하기 위한 계산 시간. (A) 및 (B)에서, DDM 행렬을 계산하기 위한 시간이, Equation009도시되어 있다. 모든 경우에 사용되는 데이터는 이미지 크기가 512 x 512 픽셀인 5000 프레임의 동영상입니다. DDM 행렬은 1 프레임 (0.01 초)과 1000 프레임 (10 초) 사이에 로그 적으로 간격을 둔 30 지연 시간에 대해 계산되었습니다. 이 코드는 32GB RAM이 있는 Intel i7-10700 2.90GHz 데스크탑 컴퓨터에서 실행되었습니다. (A)에서, 각 지연 시간에 대한 DDM 행렬을 계산하는데 사용되는 이미지 차이의 수를 변화시키는 효과가 도시되어 있다. 이를 위해 이미지는 비닝되어 이미지 크기가 256 x 256이 됩니다. 각각의 지연 시간 Δt에 대해, 그Δt에 의해 분리된 이미지들은 감산되고 결과 매트릭스는 푸리에 변환된다. 주어진 Δt에 대해, 그Δt에 의해 분리된 이미지의 모든 쌍들이 사용될 수 있고(파란색으로 도시됨), 오직 비중첩 이미지 쌍들만이 사용될 수 있고(예를 들어, 프레임 1 및 10, 10 및 19 등; 갈색으로 도시됨), 또는 300개 이하의 이미지 쌍들이 각각의Δt에 대해 사용될 수 있다. (B)에서, 계산 시간에 대한 이미지 크기를 변경하는 효과가 도시되어 있다. 이미지는 2 x 2, 4 x 4 또는 8 x 8 픽셀을 그룹화하여 비닝되어 이미지 크기가 각각 256 x 256, 128 x 128 또는 64 x 64가 되었습니다. 각각에 대해, 약 300개의 이미지 쌍이 각각의Δt에 대한 DDM 행렬을 계산하는데 사용된다. (c) DDM 매트릭스로부터, 중간 산란 함수(ISF)가 추출될 수 있다. 이것은 (A)의 세 가지 경우에 대해 도시된다. 파란색 데이터 포인트(오프셋 없음)는 각Δt에 대해 최대 수의 이미지 쌍이 사용될 때 ISF에 해당합니다. 갈색 데이터 포인트(오프셋이 0.1)는 겹치지 않는 이미지 쌍이 각Δt에 사용될 때 ISF에 해당합니다. 분홍색 데이터 포인트(오프셋이 0.2인 경우)는 각Δt에 대해 최대 300개의 이미지 쌍이 사용될 때 ISF에 해당합니다. 겹치지 않는 이미지 쌍을 사용하여 발견된 ISF는 긴Δt에서 잡음을 나타낸다. 이 경우, 긴 Δt에서 몇 개의 이미지 쌍이 사용된다(예를 들어, 1000 프레임의Δt에 대해, 단지 4개의 이미지 쌍만이 사용된다). (d) ISF를 지수 함수에 피팅함으로써, 각 파수, q에 대한 특성 감쇠 시간, τ가 결정된다. 분홍색에서는 원본 이미지를 2 x 2로 비닝한 후 이미지 크기가 256 x 256이 되는 결과가 표시됩니다. 회색으로, 8 x 8로 비닝한 후 결과가 나타나며, 그 결과 이미지 크기가 64 x 64가 됩니다. 데이터를 비닝하면 더 높은 파수에서 다이내믹에 대한 정보가 손실되지만 64 x 64 이미지에 대한 DDM 행렬을 계산하면 256 x 256 이미지보다 약 16배 빠릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. DDM 매트릭스 또는 ISF 피팅

  1. DDM_Fit 클래스의 인스턴스를 초기화합니다. 이렇게 하려면 이미지 메타데이터 및 피팅 매개 변수가 포함된 YAML 파일의 파일 이름을 DDM_Fit로 전달합니다.
  2. DDM 행렬 또는 ISF가 데이터를 피팅하는 데 사용할 모델을 결정합니다. 함수 print_fitting_models을 실행하여 사용 가능한 모델을 나열합니다. YAML 매개변수 파일에 사용하거나 함수 reload_fit_model_by_name을 사용하여 사용할 모델을 지정합니다.
  3. 제공된 YAML 매개변수 파일에서 선택한 모델의 각 매개변수에 대한 초기 추측 및 경계를 설정합니다. 매개변수에 대한 초기 추측값을 변경하려면 함수 set_parameter_initial_guess을 사용합니다. 함수 set_parameter_bounds을 사용하여 매개 변수의 경계를 설정합니다. 예를 들어, 보충 파일 2에서 볼 수 있듯이 vimentin 네트워크의 추적기 비드 데이터의 경우 붕괴 시간에 대한 초기 추측값은 1초이고 해당 매개 변수의 경계는 0.01초와 2000초였습니다.
  4. 함수 핏으로 핏을 실행합니다. 이 함수의 출력에 변수를 할당하여 결과에 쉽게 액세스할 수 있습니다.
    참고: 이 함수는 많은 선택적 인수를 사용할 수 있습니다. 이러한 인수 목록과 기본값이 아닌 값으로 설정하는 것을 고려해야 하는 경우에 대해서는 코드 설명서 및 제공된 예제를 참조하십시오.

7. 적합 결과 해석

  1. 함수 fit_report을 사용하여 적합 매개변수의 적합치 및 q-의존성을 검사하기 위한 플롯을 생성합니다.
    참고: 이 함수는 일련의 플롯을 생성하며, 이 플롯은 PDF로도 저장됩니다. 이 함수에 대한 선택적 인수를 사용하여 생성된 플롯을 수정할 수 있습니다.
  2. 생성된 플롯 중에는 모델 및 최적 적합 매개변수를 사용하여 계산된 DDM 행렬 또는 ISF와 함께 네 개의 q-값(fit_report에 대한 선택적 인수로 지정됨)에서 DDM 행렬 또는 ISF(선택한 피팅 모델에 따라 다름)를 보여주는 2 x 2 서브플롯이 있는 그림이 있습니다. 대화형 방식으로 가장 적합한 DDM 행렬 또는 ISF를 플로팅하려면 Jupyter 노트북 환경을 사용할 때 제공된 예제와 같이 클래스 Browse_DDM_Fits을 사용합니다.
  3. 특징적인 감쇠 시간 τ 대 파수 q의 플롯으로부터 역학이 확산, 하위 확산, 탄도 또는 다른 유형의 움직임을 따르는지 여부를 결정하십시오. 이것은 τ와 q 사이의 전력 법칙 관계를 찾음으로써 수행 할 수 있습니다.
    참고: 함수 fit_report에 의해 생성된 τ 대 q의 로그 로그 플롯에는 지정된 q 값 범위에 대한 전력 법칙에 해당하는 세 줄이 표시됩니다. 실선 검정 선은 τ 대 q를 전력 법칙에 맞추는 것에 해당하며, τ = 1 / Kq β이며, 여기서 K 및 β는 자유 매개 변수입니다. 주황색의 점선은 단순 확산, τ = 1 / Dq2에 대한 피팅에 해당하며, 여기서 D는 확산 계수입니다. 파란색의 점 점선은 τ = 1 / vq에 맞는 값에 해당하며, 여기서 v는 속도입니다.

8. 결과 저장

  1. 적합의 결과는 xarray 데이터 세트에 저장됩니다. xarray 함수 to_netcdf 또는 Python의 내장 pickle 모듈을 사용하여이 데이터 구조를 디스크에 저장하십시오. xarray 함수 open_dataset를 사용하여 이러한 netCDF 파일을로드하십시오.
  2. 함수 save_fit_results_to_excel를 사용하여 데이터와 함께 적합 결과를 워크시트 파일에 저장합니다.

Representative Results

여기서는 두 가지 실험 집합에서 PyDDM으로 수행된 분석의 예를 보여 줍니다. 한 세트의 실험에서, 서브마이크론 트레이서 비드는 중간 필라멘트 단백질 비멘틴으로 구성된 네트워크에 내장되었고, 100프레임/s에서 브라이트필드 모드에서 100x 대물 렌즈를 사용하여 이미지화되었다(그림 3A). 비멘틴은 중간엽 세포에서 발현되며, 세포질(65)의 기계적 특성 및 제한된 이동을 수행하는 세포에서의 핵의 기계적 안정성(66,67)의 핵심 결정인자이다. 지금까지 재구성 된 vimentin 네트워크는 거시적 유변학64,68,69에 의해 주로 연구되었지만 역학은 비교적 적은 관심을 받았다 13,70,71. 이러한 실험에 대한 추가 세부 사항은 보충 파일 2에서 찾을 수 있습니다. 다른 일련의 실험에서, 활성 세포골격 네트워크는 액틴, 미세소관 및 미오신으로 제조되었다. 분광적으로 구별되는 형광 라벨을 통해 액틴 및 미세소관 필라멘트는 2.78 프레임/s에서 60x 대물 렌즈를 사용하여 2색 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 이미징할 수 있었습니다(그림 3B,C). 액틴과 미세소관 필라멘트는 둘 다 동적 세포 형태 변화의 중요한 동인이며, 그들의 작용은 기계적 및 생화학적 상호작용(72)에 의해 조정된다. 이들 실험의 추가적인 세부사항은도 11에서 찾을 수 있다. 이러한 실험에서 촬영된 이미지 시퀀스로부터의 개별 프레임은 도 3에 도시되어 있다.

Figure 3
그림 3: 시계열 분석으로부터의 이미지 . (A) 비멘틴 네트워크에서 0.6μm 비드의 밝은 필드 이미지. (B,C) 활성 액틴-미세소관 복합체에서 (B) 미세소관 및 (C) 액틴-미세소관 복합체의 이미지는 미세소관 이미징을 위한 561 nm 여기광을 사용하고 액틴 영상화를 위한 488 nm 여기광을 사용하여 레이저 스캐닝 공초점 현미경 상에서 60x 대물렌즈를 촬영하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

vimentin 네트워크의 트레이서 비드 이미지의 경우 100 프레임 / s에서 512 x 512 픽셀 크기의 5000 프레임의 영화가 기록되었습니다. 이들로부터 DDM 행렬은 1 프레임과 1000 프레임 사이의 60 로그 간격 지연 시간 또는 0.01 s 및 10 초로 계산되었습니다. 배경을 추정하기 위해 제곱된 푸리에 변환 이미지의 평균인 Equation031B가 계산되어 55,73과 동일하게 Equation037 설정되었습니다. q-값의 가장 큰 10%에 대해 이 수량은 B/2와 같고 B는 q와 독립적이라는 가정이 이루어졌습니다. 이것은 B를 추정하는 패키지의 기본 방법이지만 background_method 매개 변수를 다른 값으로 설정하여 다른 방법을 사용할 수 있습니다.

매개 변수 A (q) 및 B에서 결정하면 DDM 행렬에서 Equation031중간 산란 함수 (ISF)를 추출 할 수 있습니다. 예제 ISF는 그림 4에 나와 있습니다. 도 4A에서, 19 μM의 비멘틴 농도를 갖는 네트워크에 포매된 0.6 μm 직경의 비드의 이미지로부터의 ISF가 도시되어 있다. 도 4B에서, 34 μM의 비멘틴 농도를 갖는 네트워크 내의 동일한 유형의 비드에 대한 ISF가 도시되어 있다. 흥미롭게도, 어느 경우에도 ISF는 0으로 붕괴되지 않았습니다. 큰 지연 시간에, ISF는 인체 시스템에 대해 0에 접근해야합니다. 즉, 이러한 시스템에서 밀도 변동은 큰 지연 시간에 걸쳐 완전히 장식되어야합니다. 여기서 ISF가 0으로 붕괴되지 않았다는 사실은 계산 된 DDM 행렬에서 ISF를 찾는 데 사용 된 A (q)와 B의 부정확 한 추정치에서 비롯되었을 수 있습니다. 특히, 여기서 사용되는 방법은 특정 시나리오(62)에서 B를 과대 평가할 수 있다. 그러나, 트레이서 비드의 역학은 비드가 네트워크 메쉬 크기와 유사한 크기를 가지며, 따라서 케이지될 수 있기 때문에 진정으로 비ergodic일 가능성이 더 높다. 다른 데이터는 비인간성의 발견을 확증했다. 즉, 비드 크기는, 0.6 μm, 19 μM 농도에 대해 0.4 μm, 34 μM 농도에 대해 0.3 μm의 메쉬 크기에 대해 계산된 평균값보다 컸다. 추가적으로, 나중에 보여지는 이들 트레이서 비드의 단일 입자 추적으로부터의 결과도 제한된 움직임을 보였다.

Figure 4
그림 4: vimentin 네트워크에 대한 여러 파수에서 중간 산란 기능. ISF는 약 1 내지 9 μm-1의 q 값에 대한 지연 시간의 함수로서 플롯팅된다. (A) 비멘틴 농도가 19 μM인 비멘틴 네트워크에서 0.6 μm 비드의 이미지로부터의 ISF를 (B) 비멘틴 농도가 34 μM인 비멘틴 네트워크에서 0.6 μm 비드의 이미지로부터의 ISF이다. 0보다 훨씬 높은 값에서 ISF의 긴 지연 시간 고원은 비인체성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

역학이 비인체적일 가능성이 높다는 것을 감안할 때, ISF는 형태Equation039에 적합하며, 여기서 C는 비인체성 인자(nonergodicity factor)(32)이다. 이러한 형태의 ISF는 액틴-미세소관 네트워크(10)에서 콜로이드 겔(32,74) 또는 트레이서 입자의 것과 같은 비인체역학의 이전 연구에서 사용되어 왔다. 그림 4의 검은색 점선은 데이터와 함께 적합도를 보여줍니다. 이러한 적합에서 이제 감쇠 시간, τ 및 비 인체 성 매개 변수 인 C의 q- 의존성을 볼 수 있습니다.

Figure 5
그림 5: vimentin 네트워크의 붕괴 시간 대 파형 수 적합치에서 ISF까지, 감쇠 시간 τ는 q 값의 범위에 대해 결정된다. 명확성을 위해, 우리는 모든 q에 대해 τ의 값을 표시하는 것이 아니라 대수적으로 간격이있는 집합 만 표시합니다. 청색(tan)은 19 μM(34 μM)의 비멘틴 농도를 갖는 비멘틴 네트워크 내의 0.6 μm 비드의 이미지로부터의 데이터이다. 오차 막대는 여러 영화에서 τ의 표준 편차를 나타냅니다(19μM 네트워크[파란색]이 있는 데이터의 경우 네 개의 영화, 34μM 네트워크[tan]이 있는 데이터의 경우 다섯 개의 영화). 빨간색 대시 점선은 결과에 설명된 대로 시간적 및 공간 해상도의 예상 경계를 표시합니다. 검은 실선은 확산 운동을 나타내는 스케일링을 보여줍니다Equation044. 두 데이터 집합 모두 이 크기 조정을 따르지 않습니다. 오히려, 19 μM 네트워크 내의 비드는 서브확산 운동(Equation010β > 2 포함)을 나타내고, 34μM 네트워크의 비드는 제한되거나 갇힌 움직임을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

붕괴 시간은 그림 5에서 볼 수 있듯이 낮은 q와 높은 q 극단 모두에서 많은 양의 불확실성을 나타냈다. 이 그림의 오류 막대는 낮은 vimentin 농도의 경우 분석 된 네 개의 비디오 또는 더 높은 농도에 대해 분석 된 다섯 개의 비디오 간의 표준 편차를 보여줍니다. 이러한 극단에서 큰 불확실성의 근원을 이해하려면 시간적 및 공간적 해결을 모두 고려하십시오. 해상도의 대략적인 한계는 세 개의 빨간색 대시 점선으로 표시됩니다. 두 개의 수평선은 프로브된 최소 및 최대 지연 시간에 해당합니다. 100 프레임/s의 프레임 속도와 1000 프레임에 해당하는 최대 지연 시간(총 비디오 지속 시간의 20%)을 감안할 때 0.01초보다 빠르거나 10초보다 느리게 발생하는 역학을 측정할 때 정확도가 손실됩니다. 더 낮은 q-값에서, τ에 대한 적합치는 10초보다 컸다. 따라서 최대 지연 시간보다 큰 감쇠 시간에 큰 불확실성이 예상되어야합니다. q-범위의 더 높은 끝에서 감쇠 시간은 0.01 초의 최소 지연 시간에 접근했지만 그 이상으로 유지되었습니다. 시간 분해능에 의해 제한되기보다는, 이러한 더 높은 q 값에서, 공간 분해능은 제한 인자일 수 있다. 0.13 μm의 픽셀 크기를 감안할 때, q에 대한 가장 큰 값은 약 24 μm-1이었다. 그러나, 회절-제한 분해능이 반드시 이러한 높은 공간 주파수에서 역학의 정확한 측정을 허용하는 것은 아니다. 광학 분해능을 근사화하면 대물렌즈의 개구수, NA, 1.4 및 빛의 Equation042파장을 고려할 때 약 16 μm-1의 상파수 한계로 Equation041 이어진다. 그림 5에서 세로 빨간색 대시 점선으로 표시되어 있습니다. 실제로, 데이터는 q의 큰 값에서 시끄 럽습니다. q의 대략적인 상한이 있기 전에도 τ의 불확실성 증가가 관찰되었으며, 이는 qmax를 과대 평가하는 것일 수 있습니다. 예측보다 광학 해상도가 좋지 않은 이유는 오일 침지 렌즈가 커버슬립을 넘어 수성 샘플로 이미지를 촬영하는 데 사용되었거나 콘덴서 렌즈가 불완전하게 정렬되었기 때문일 수 있습니다.

덜 농축된 네트워크(19 μM vimentin)에 포매된 0.6 μm 비드의 경우, 전력 법칙에 부합하는 방식으로 파수에 따라 붕괴 시간이 감소하는 파수 대 파수의 로그 로그 플롯으로부터 관찰할 수 있다(도 5). 그러나 정상적인 확산 운동에 Equation044대해 예상되는 것을 따르지 않는 것 같습니다. 오히려 τ는 q가 증가함에 따라 더 가파르게 감소했습니다. 이것은 하위 확산 운동을 나타내며, 종종 이와 같은 혼잡 한 환경에서 구슬에 대해 발생합니다. 피팅 τ(q) 내지 1.4 μm-1 내지 12.3 μm-1 형태의 전력 법칙 τ = 1/Kq β의 범위에 걸쳐 수송 파라미터 K = 0.0953 μm β/s 및β = 2.2를 산출한다. 지연 시간의 함수로서 트레이서 입자의 평균 제곱 변위 (MSD)의 관점에서 정상 확산 대 계확산에 대해 생각하는 데 더 익숙한 사람들 (즉, MSD = K'Δt α)의 경우,MSD 방정식에서 α 확산 스케일링 지수가 α = 2/β와 동일하다는 것을 인식하는 것이 도움이됩니다. 즉, β = 2.2의 값은 α = 0.9의 MSD 방정식에서 하위 확산 스케일링 지수와 일치합니다. 매개 변수가 YAML 파일에 Good_q_range 된 q 배열의 인덱스를 지정하거나 선택적 인수 forced_qs을 함수 generate_fit_report에 전달하여 PyDDM이이 q-값 범위에 τ (q) 맞도록 PyDDM을 설정합니다. 1.4 μm-1 내지 12.3 μm-1로부터의 q의 범위는 여기서 데이터에 대해, 15 내지 130의 q의 배열의 인덱스에 상응할 것이다.

보다 농축된 네트워크(34 μM)에서 0.6 μm 비드의 경우, 붕괴 시간은 q에 거의 의존하지 않았다. 이것은 더 작은 메쉬 크기의 네트워크에서 비드의 비 인체 성 때문일 수 있습니다. 이 시스템에서 비인체성을 조사하려면 nonergodicity 매개 변수 C를 그림 6에서와 같이 q의 함수로 플로팅해야 합니다. 19 μM 비멘틴 네트워크 내의 0.6 μm 비드의 경우, C≈ 0.2 q에 거의 의존하지 않는다 (도시되지 않음). 그러나, 34 μM 비멘틴을 갖는 네트워크 및 49 μM 비멘틴의 더 높은 농도를 갖는 네트워크의 경우, C의 로그는 도 6에 도시된 바와 같이 q2에 비례하였다. C와 q 사이의 이러한 관계는 제한된 동작에 대해 예상된다. 네트워크의 포켓 내에 갇힌 비드의 경우, MSD는 충분히 긴 래그 시간에서 고원화될 것으로 예상된다(즉, Equation055여기서 Equation056 MSD이고 δ2는 최대 MSD이다). ISF가 MSD와 같이 Equation058표현될 수 있기 때문에, 그리고 비에르고딕 ISF가 긴 지연 시간(즉, )에서 C로 이동하기 때문에, 관계는 Equation06032,75Equation059로 얻어진다. 따라서, C(q)를 사용하여 δ 2를 찾을 수 있고, 이것은 각각 34 및 49 μM 비멘틴 네트워크에 대해 δ 2 = 0.017 μm2 및 0.0032μm2를 산출하였다(δ = 0.13 μm 및 0.057 μm에 해당함).

Figure 6
그림 6: 비멘틴 네트워크의 비인체성 파라미터 대 웨이브 번호. 적합치에서 ISF까지, 비인체성 파라미터 C는 q 값의 범위에 대해 결정됩니다. In tan (red)은 34 μM (49 μM)의 비멘틴 농도를 갖는 비멘틴 네트워크 내의 0.6 μm 비드의 이미지로부터의 데이터이다. 오차 막대는 여러 영화에서 τ의 표준 편차를 나타냅니다(34μM 네트워크[tan]이 있는 데이터의 경우 다섯 개의 영화, 49μM 네트워크[빨간색]을 사용하는 데이터의 경우 네 개의 영화). y축에는 로그 크기 조정이 있습니다. 하나는 뒤에 오는 Equation060C의 q-의존성을 관찰하는데, 이는 최대 평균 제곱 변위를 추출할 수 있게 해주δ2이다. 적합 Equation060 도는 실선과 함께 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

하나는 다른 방법을 사용하여 19 μM 비멘틴 네트워크 내의 비드에 대한 τ(q)를 검사함으로써 발견된 하위 확산 지수뿐만 아니라 데이터로부터 감금 크기 δ을 추출할 수 있다. 첫째, Bayles et al.76 및 Edera et al.77에 의해 기술된 방법을 사용하여 DDM 매트릭스로부터 MSD를 추출할 수 있다. 특히이 방법은 DDM 행렬을 피팅 할 필요가 없습니다. DDM 행렬 인 D (q,Δt 및 A (q) 및Equation070 B를 결정할 수있는 것만으로 계산하면됩니다. 그런 다음 MSD를 찾기 위해 관계를 Equation071사용합니다. MSD를 찾기 위한 이 방법은 입자 변위의 분포가 가우시안이라고 가정하지만, 이전의 연구는 특정 경우에 DDM으로부터 유래된 MSD가 변위가 비가우시안(73)인 경우에도 입자 추적으로부터의 MSD와 동의한다는 것을 보여주었다. 이 시스템의 경우, 예상(78)에 따라, 그림 S1에서 볼 수 있듯이 큰 변위의 분포에 비가우시안티가 존재한다. PyDDM 패키지에서 함수 extract_MSD가 실행되어야 하며, 이 함수는 를 반환합니다Equation056. 둘째, 단일 입자 추적을 사용하여 MSD를 찾을 수 있습니다. DDM은 입자의 고밀도 또는 제한된 광학 해상도로 인해 정확한 입자 국소화를 금지하는 이미지를 분석하는 데 사용될 수 있지만, vimentin 네트워크에서 0.6μm 비드의 이미지에 대해 트랙피 소프트웨어(https://github.com/soft-matter/trackpy)79를 사용하여 비드를 현지화하고 추적할 수 있었습니다. 이 입자 추적 소프트웨어 패키지는 Crocker and Grier80에서 설명한 알고리즘을 사용합니다.

Figure 7
그림 7: vimentin 네트워크의 평균 제곱 변위 대 지연 시간. MSD는 두 가지 방법을 사용하여 결정하였다. 먼저, MSD를 DDM 행렬(솔리드 심볼로 표시)으로부터 계산하였다. 다음으로, MSD를 단일 입자 추적(SPT)을 사용하여 입자 궤적(열린 기호)을 찾아 결정하였다. 오류 막대는 이전 두 그림 범례에서 설명한 것과 동일한 방식으로 결정됩니다. (a) 19 μM 비멘틴 네트워크에서 0.6 μm 비드에 대한 MSD는 MSD를 발견하는 두 가지 방법 사이에 양호한 일치와 함께 서브 확산 운동을 나타낸다. (b) 49 μM 비멘틴 네트워크 내의 0.6 μm 비드에 대한 MSD는 MSD를 발견하는 두 가지 방법과 비인체성 파라미터로부터 발견되는 최대 MSD 사이의 양호한 일치와 함께 케이징 운동을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

19 μM 비멘틴 네트워크 및 49 μM 비멘틴 네트워크에서 0.6 μm 비드에 대한 MSD 대 지연 시간을 도 7에 나타내었다. 두 경우 모두 DDM에서 결정된 MSD는 단일 입자 추적(SPT)을 통해 발견된 MSD와 잘 일치했습니다. 더욱이, 덜 농축된 네트워크의 경우, 서브확산성 스케일링 지수(α에서Equation010)는 약 0.9이었다. 이는 τ(q)를 결정하기 위해 ISF를 피팅함으로써 발견된 τ(q) 스케일링Equation010(즉, 2/2.2 = 0.9)과 일치한다. 보다 집중된 네트워크의 경우, MSD는 더 긴 지연 시간에서 고원화된다. 비인체성 파라미터의 q-의존성을 분석함으로써 발견된 최대 MSD(δ 2 = 0.0032 μm2에서 수평선을 갖는 도 7B에 도시됨)는 SPT 및 DDM 둘 다로부터의 MSD가 앞으로 고원화되는 것처럼 보였던 것과 거의 동일한 값이었다. 도 7A에서 DDM과 SPT로부터 결정된 가장 긴 지연 시간 MSD 사이에는 불일치가 있다. 이것은 제한된 수의 긴 지연 시간 궤적에 기인 할 수 있지만, DDM 행렬이 각 지연 시간에 대해 추정 Equation056 하는 데 사용되는 q 값의 범위를 추가로 최적화하는 경우 (Bayles et al.76 및 Edera et al.77에 의해 수행 됨) 결과가 향상 될 수도 있습니다. 이러한 최적화는 향후 작업의 초점이 될 것입니다.

vimentin 중간 필라멘트 네트워크에 내장 된 트레이서 비드의 이미지 시퀀스가 기록 된 이러한 실험은 DDM (여기에 설명 된 패키지 사용) 및 SPT (trackpy 사용)와 같은 독립적 인 분석을 허용했습니다. 두 분석 모두 하위 확산 및 감금 길이의 정도를 나타낼 수 있으므로 두 개의 독립적 인 이미지 분석 기술을 사용하여 보완적인 메트릭을 제공 할 수 있습니다. SPT 및 DDM에서 비교할 수있는 추가 수량이 있습니다. 예를 들어, 샘플의 역학에서의 이질성은 SPT로부터 결정된 입자 변위(즉, 반호브 분포)의 분포에서뿐만 아니라, 연장된 지수34,35에 맞는 DDM으로부터 결정된 ISF에서 비가우시안성으로서 그 자체를 나타낼 수 있다. 도 S1은 vimentin 네트워크에서 0.6 μm 입자에 대한 밴호브 분포를 도시하고, ISF를 피팅함으로써 발견된 스트레칭 지수(생체 모방 시스템(9,10,47) 또는 다른 혼잡한 환경 내에서 입자의 이질적인 역학을 입증하기 위해 이전 연구에서 함께 사용된 메트릭들(34)에 대해 논의한다. . 다른 예로서, ISF는 SPT로 측정된 입자 궤적으로부터 계산되고 DDM 획득 ISF와 비교될 수 있다. 평균 제곱 변위 및 변위 분포는 SPT 분석에서 가장 자주 가져온 메트릭이지만 다음을 사용하여 입자 궤적에서 ISF를 Equation076 계산할 수도 있습니다 Equation075(그림 S2 참조). 이러한 ISF는 DDM 생성 ISF와 비교될 수 있고, MSD(59)에서 명백하지 않은 동역학을 나타내는데 사용될 수 있다.

네트워크 내에서 트레이서 입자의 이미지를 획득하면 SPT 및 DDM의 상보적 분석 방법을 사용할 수 있지만, SPT에 비해 DDM의 장점은 쉽게 국부화되고 추적될 수 있는 비드(또는 다른 특징)의 이미지를 필요로 하지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 이 점을 입증하기 위해, 우리는 다음으로 액틴과 미세 소관 필라멘트의 활성 네트워크 분석을 강조하는데, 여기서 액틴과 튜불린의 형광 표지는 다색 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 서로 다른 형광단을 통해 서로 구별되는 두 필라멘트 유형의 이미징을 허용합니다.

이미지는 미오신에 의해 구동되는 활성을 갖는 액틴-미세소관 네트워크의 레이저-스캐닝 공초점 현미경으로 획득되었다(토끼 골격근 미오신 II; 세포 골격 #MY02). 실험 및 결과의 세부사항은 앞서 도 11에서 설명하였고, 여기에 도시된 대표적인 결과는 도 11에 대한 보충 자료(영화S1 및 S4)에 제공된 두 편의 영화의 분석으로부터 나온 것이다. 두 이미지 시퀀스 모두 1000 프레임에 대해 2.78 프레임/초로 기록되었습니다.

이러한 이미지를 분석하기 위해, DDM 매트릭스는 0.4 s 내지 252 s (1 프레임 내지 700 프레임) 범위의 50 래그 시간에 대해 계산되었다. 그런 다음 DDM 행렬이 모델에 Equation010적합했으며 중간 산란 함수는 Equation077. 따라서 네 개의 피팅 매개 변수가 있습니다 : A, τ, s 및 B. 이러한 피팅의 결과를 그림 8에 나타내었다. 특정 q-값에 대한 DDM 매트릭스는 낮은 지연 시간에서 고원을 가지며, 지연 시간에 따라 증가한 다음, 큰 지연 시간에서 고원화(또는 고원으로 시작하는 징후를 나타냄)되는 것이 관찰되었다. q 의 더 낮은 값에 대한 DDM 행렬은 긴 지연 시간에서 고원에 도달하지 않았다. 따라서 이러한 낮은 q (큰 길이 스케일) 역학에 대한 감쇠 시간의 측정에서 정확도가 떨어질 것으로 예상해야 합니다.

적합도에서 DDM 행렬까지의 특징적인 감쇠 시간(τ)이 그림 9에 도시되어 있다. 활성 액틴-미세소관 복합 네트워크(영화 S1 11과 유사) 및 활성 액틴 네트워크(영화 S411과유사)에 대한 결과가 제시된다. 두 네트워크 모두 동일한 농도의 액틴과 미오신으로 제조되었지만, 액틴 전용 네트워크는11에 기술된 바와 같이 튜불린 없이 생성되었다. 이 두 가지 유형의 활성 네트워크에 대해 관찰 된 전력 법칙 관계는 Equation010. 이 스케일링은 탄도 운동을 나타내며 미오신 구동 수축과 흐름이 필라멘트의 열 운동보다 지배적입니다. τ = (vq)-1로부터, 활성 액틴-미세소관 네트워크의 경우 약 10nm/s, 활성 액틴 네트워크의 경우 75nm/s의 특징적인 속도, v를 찾을 수 있다. 이들 값은도 11에 도시된 동일한 비디오의 입자 이미지 속도 분석과 일치한다. 스케일링은 Equation010 활성 액틴-미세소관 복합체 네트워크에 대해 더 낮은 q 값에서 유지되지 않았다. 이는 더 낮은 q값에서 이러한 액틴-미세소관 복합 네트워크에 대한 진정한 붕괴 시간이 계산된 DDM 매트릭스의 최대 지연 시간보다 길기 때문일 가능성이 높다. 최대 지연 시간은 그림 9의 수평 빨간색 선으로 표시되며 감쇠 시간은 이러한 긴 시간 근처에서 예상되는 Equation010 스케일링에서 벗어났습니다.

Figure 8
그림 8: 활성 액틴-미세소관 복합 네트워크에 대한 DDM 매트릭스 대 지연 시간. q 의 몇몇 값에 대한 DDM 매트릭스는 2.9 μM 액틴 단량체, 2.9 μM 튜불린 이량체, 및 0.24 μM 미오신으로 구성된 복합 네트워크의 무비로부터의 지연 시간의 함수로서 플롯팅된다. 이 데이터는 다색 시계열 이미지의 미세 소관 채널의 분석만을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
그림 9: 활성 액틴-미세소관 네트워크에 대한 붕괴 시간 대 파형. DDM 행렬을 피팅하는 것으로부터, 붕괴 시간, τ, 파수 q의 함수로서 발견된다. 플롯팅된 τ vs q는 갈색의 활성 액틴-미세소관 네트워크(단지 미세소관 채널만 분석)의 이미지와 녹색의 활성 액틴 네트워크의 이미지에 대해 τ vs q 이다. 두 네트워크 모두 액틴 및 미오신 농도가 동일합니다 (각각 2.9 μM 및 0.24 μM); 액틴-미세소관 복합체는 2.9 μM의 튜불린 이량체를 갖는다. 활성 액틴 네트워크의 붕괴 시간은 활성 액틴-미세소관 네트워크의 붕괴 시간보다 훨씬 작으며, 이는 활성 액틴 네트워크의 더 빠른 움직임을 나타낸다. 두 경우 모두 데이터가 추세를 따르기 때문에 역학은 탄도적입니다Equation010. 인셋: ISFs의 플롯 대 파수(Δt × q)에 의해 스케일링된 지연 시간은 q 값의 범위에 걸친 ISF들의 붕괴를 나타낸다. 이것은 또한 탄도 운동을 나타냅니다. 이 인셋에 표시된 ISF는 활성 액틴 네트워크에서 가져온 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

활성 네트워크의 이 데이터에 대해 DDM 행렬Equation010에 맞게 선택했습니다. 이것은 비멘틴 네트워크에서 비드의 데이터에 대해 행해진 것과 대조되며, 여기서 A (q) 및 B는 ISF, f (q,Δt)를 분리하기 위해 아무런 피팅없이 추정되었다. 이 경우, 활성 네트워크 데이터의 경우, B를 추정하는 데 사용된 방법이 양호한 적합도를 초래하지 않았기 때문에 A 및 B는 피팅 파라미터로 남겨졌다. B를 추정하는 기본 방법은 계산 Equation031 하고 큰 q에서 B / 2로 이동한다고 가정하는 것입니다. 그러나이 방법은 이러한 방식으로 추정 된 B에서 ISF를 계산할 때 (표시되지 않음) 초기 지연 시간에 ISF가 1보다 컸다는 사실에서 볼 수 있습니다 (최대 1에서 0으로 이동해야하거나 지연 시간이 증가함에 따라 일부 비 인체 성 매개 변수로 이동해야합니다). 매개 변수 background_method을 사용하여 B를 추정하는 다른 방법을 선택할 수 있습니다. 이러한 다른 방법 중 하나는 초기 지연 시간(background_method=1로 설정)에서 B를 DDM 행렬의 최소값으로 추정하는 것입니다. 비슷한 방법이 Bayles et al.76에 의해 사용되었지만 B가 q와 일정하다고 가정하지는 않았습니다. 또 다른 옵션은 B를 최대 q(background_method=2로 설정)에서 DDM 행렬의 모든 지연 시간에 대한 평균값으로 추정하는 것입니다. 배경을 추정하기 위한 이러한 다양한 방법뿐만 아니라 B가 자유 피팅 파라미터가 되도록 허용한 결과가 그림 10에 나와 있습니다. 이들 플롯으로부터, 진폭, A가 큰 q에서 고원이 없었기 때문에 프로브된 가장 큰 q 값에서 0에 도달하지 않았다는 것을 알 수 있고(도 10B), D(qmax,Δt)가 더 낮은 지연 시간 고원에서 일부 더 높은 지연 시간 고원으로 이동했기 때문에Equation031(즉, qmax에서, 0이 아닌 A가 존재하였다; 도 10D). 따라서 B를 추정 Equation082 하거나 추정하는 것은 Equation083 적절하지 않습니다. B를 추정하는 Equation031 방법 (또는경우)을 결정하기 전에 q와 D (qmax,Δt) 대 Δ t를 검사해야합니다.

Figure 10
그림 10: 활성 액틴-미세소관 네트워크에 대한 배경 대 파형. DDM 행렬을 맞추는 것으로부터 배경 B를 웨이브 넘버, q의 함수로 찾을 수 있습니다. 도시된 것은 활성 액틴-미세소관 네트워크(단지 미세소관 채널만을 분석함)의 이미지에 대한B 대 q이며 , 이들은 보라색 기호와 맞는다. (A)의 세 실선은 피팅 없이 발견된 배경의 추정치를 보여줍니다. (A)에서 가장 위쪽, 가장 어두운 선은 큰 q에서 일정한 값으로 고원화되는 경우에 Equation031 적절할 수 있는, 를 사용하여 Equation088추정된 배경을 나타낸다. (B)로부터, 프로브된 가장 큰 q에서 상수 값에 아직 도달하지 않았다는 점에 Equation031 유의한다. 따라서이 방법을 사용하면 배경을 과대 평가합니다. (A)의 하단선은 을 사용하여 Equation090추정된 배경을 보여줍니다. DDM 행렬이 적색 선으로 (C)에 표시된 바와 같이 낮은 지연 시간 고원을 표시하는 경우, 이 방법은 배경을 추정하는 데 적합할 수 있다. (A)에서 가장 밝은 중간선은 에서 Equation083추정된 배경을 보여줍니다. 이 방법은 qmax에서 진폭 A가 0에 도달한 경우에 적절할 수 있습니다. (D)로부터, 진폭이 0이 아닌 것을 알 수 있고, 따라서, 이 방법은 배경을 과대 평가한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: 입자 변위의 확률 분포. 입자 변위의 확률 분포는 34 μM 및 49 μM의 비멘틴 농도에 대해 비가우시안성을 나타낸다. 0.6 μm 직경 비드의 단일 입자 추적은 상이한 농도의 비멘틴 네트워크에서 수행되었다. 서로 다른 지연 시간이 세 가지 조건에 대한 변위 분포에 표시됩니다. (A) 19μM 비멘틴 네트워크에서의 입자 변위의 분포는 가우시안 함수에 적합하다. 가우시안의 폭은 지연 시간이 증가함에 따라 증가합니다. (B) 34 μM vimentin 네트워크에서의 입자 변위의 분포는 19 μM의 경우보다 특히 큰 변위에서 더 많은 비가우시안성을 나타낸다. (c) 49 μM 비멘틴 네트워크에서의 입자 변위의 분포는 또한 비가우시안성을 나타낸다. 또한, 분포의 폭은 낮은 비멘틴 농도를 갖는 샘플에서와 같이 지연 시간에 따라 크게 증가하지 않으며, 이는 제한된 움직임을 나타낸다. 비 가우시안 반 호브 분포 (모든 vimentin 샘플에서 볼 수 있지만 더 높은 농도에서 가장 분명 함)는 혼잡하고 제한된 환경에서 입자의 수송에서 종종 볼 수있는 이질적 역학과 관련이 있습니다. DDM 분석으로부터 결정되는 이종 수송의 또 다른 지표는 중간 산란 함수(여기에 사용된 ISF에 대한 방정식의 파라미터 s: Equation077 +Equation061)에 맞추기 위해 사용되는 연신 지수이다. 0.4 μm-1 내지 9.4 μm-1의 q-범위에 걸친 평균 연신 지수는, 최고 비멘틴 농도에서 가장 낮음까지, 0.53 ± 0.07, 0.64 ± 0.02, 및 0.86 ± 0.04(평균 ± 표준 편차)이다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: DDM 및 SPT의 중간 산란 기능. 다섯 개의 서로 다른 파수에 대한 중간 산란 함수(ISF)가 표시됩니다. DDM을 통해 발견된 ISF 대 지연 시간은 원형 마커로 플롯되고, ISF는 열린 사각형을 갖는 단일 입자 궤적으로부터 계산됩니다. 점선으로 표시된 검은색 선은 DDM에서 획득한 ISF에 적합함을 보여줍니다. ISF는 를 사용하여 Equation076단일 입자 궤적에서 계산됩니다Equation075. (A)에서, ISF는 19 μM 비멘틴 네트워크에서 0.6 μm 입자에 대해 나타내었다. (B)에서, ISF는 34 μM 비멘틴 네트워크 내의 0.6 μm 입자에 대해 나타내었다. DDM과 SPT에서 발견 된 ISF의 불일치는 제한된 수의 긴 지연 시간 궤적 때문일 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: DDM을 사용하기 위한 프로토콜. 프로토콜에 표시된 단계의 입력 및 출력이 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: vimentin 네트워크에 대한 샘플 준비 및 예제 매개변수 파일에 대한 세부 정보. vimentin 네트워크에서 샘플 준비 및 이미지 수집을 위한 자세한 단계가 제공됩니다. 추가적으로, vimentin 네트워크의 대표적인 결과 섹션에 제시된 데이터의 분석을 위한 예시적인 파라미터 파일이 또한 제공된다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

여기에 설명된 소프트웨어 패키지는 DDM을 사용하여 광학 현미경을 사용하여 획득한 이미지에서 관찰된 밀도 변동을 분석합니다. 비멘틴 네트워크에 포매된 트레이서 입자의 데이터로부터의 대표적인 결과가 먼저 도시되었다. 이러한 데이터의 분석은 단일 입자 추적이 세포 골격 네트워크(6,12,13)에 대한 많은 과거 연구에서 어떻게 사용되었는지와 유사하게 네트워크의 메쉬 크기 및 강성을 특성화하는데 사용될 수 있다. 단일 입자 추적보다 DDM을 사용하면 DDM이 파티클을 지역화할 필요가 없다는 이점이 있습니다. 따라서 입자 밀도가 너무 높거나 입자가 너무 작아서 국부적으로 추적하지 못하는 이미지에서도 DDM은 여전히 역학을 결정할 수 있습니다. 단일 입자 추적이 유리한 곳은 입자 간 변동성을 검사할 때입니다. DDM을 사용하면 앙상블 평균 역학을 찾을 수 있지만 단일 입자 추적을 사용하면 단일 파티클의 MSD와 앙상블 평균 MSD를 모두 계산할 수 있습니다. 그러나 DDM은 넓은 시야 내에서 여러 관심 영역을 분석하여 이기종 역학을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

다음으로, 두 개의 상이하게 표지된 세포골격 필라멘트 유형으로 구성된 활성 네트워크에서의 형광 표지된 필라멘트의 데이터로부터의 대표적인 결과를도 11에 나타내었다. 이 데이터를 통해 탄도 동작은 이미지 내에서 지역화 가능한 기능이 필요하지 않은 것으로 특성화되었습니다. DDM은 사용자 입력이 거의없는 앙상블 평균 역학을 추출하기 때문에 서로 다른 조건으로 획득 한 이미지 시리즈를 비교하는 것을 간단합니다 (예 : 액틴의 비율이 다른 샘플과 미세 소관 또는 미오신 농도가 다른 샘플을 비교하는 것,50에서 수행 된 것처럼). 또한 형광 이미징을 사용하여 다색 표지를 사용하여 네트워크의 다양한 구성 요소의 역학을 조사 할 수 있습니다. 이것은11,50에서 이루어졌으며, 여기서 액틴과 미세 소관의 역학은 다색 이미징을 사용하여 활성 액틴-미세 소관 복합 네트워크에서 별도로 분석되었습니다. 여기의 대표적인 결과 섹션에서, 미세소관 채널로부터의 결과만이 도시되었지만, 이전 연구에서, 우리는 미세소관과 액틴 필라멘트(11)의 역학을 비교하였다.

우리는 이러한 대표적인 결과가 수동적 인 하위 확산 또는 능동적 인 탄도 운동을 보여줍니다. 중요한 것은 DDM을 사용하여 중간 시간 또는 길이 척도에서 역학 유형에 교차가있는 시스템을 분석 할 수 있다는 것입니다. 예로서, Kurzthaler et al.은 DDM을 활성 야누스 콜로이드 시스템과 함께 사용하여 짧은 시간 스케일에서 능동적 지향 운동을 탐색하고 더 긴 시간 스케일59에서 배향의 무작위화를 탐구했다. Giavazzi et al. 조대 폼과 함께 DDM을 사용하고 버블33의 길이 스케일에 대응하는 역학에서 크로스 오버를 발견했습니다. Cho et al.은 콜로이드 겔과 함께 DDM을 사용했으며 프랙탈 클러스터에서 전체 네트워크(32)에 이르기까지 서로 다른 길이 스케일에서 세 가지 구별 가능한 정권을 발견했습니다.

대표적인 결과 섹션에 포함된 데이터는 브라이트필드 현미경 및 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 획득되었습니다. 그러나 앞서 언급했듯이 DDM은 많은 이미징 형식과 함께 사용할 수 있습니다. 모든 이미징 양식에서 사용자는 광학 단면화의 정도 또는 피사계 심도와 같은 광학 설정을 고려해야합니다. 높은 수준의 광학 단면화는 초점이 맞지 않는 물체로부터의 신호를 감소시킬 수 있지만, 물체가 피사계 심도25,28에서 벗어나는 시간 척도보다 큰 시간 척도에 걸친 역학을 정확하게 측정 할 수는 없습니다. q-의존적 피사계 심도가 DDM 분석에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 보다 철저한 논의는22에서 찾을 수 있다. 브라이트필드 이미징의 경우 사용자는 샘플 두께를 고려해야 할 수도 있습니다. 약하게 산란하는 샘플들에 대해, 더 두꺼운 샘플들은 더 많은 신호(42)를 제공할 수 있는 반면, 탁한 샘플들은 다수의 산란(81)을 설명하도록 분석을 수정하는 것을 요구할 수 있다. 마지막으로, 선형 공간이 불변하지 않은 이미징 방법(즉, 물체의 카메라에 의해 기록된 강도가 해당 물체가 xy 샘플 평면에 있는 위치에 따라 달라지는 경우)의 경우, 암장 DDM27로 입증된 바와 같이 선형 공간 분산을 설명해야 할 수도 있습니다.

DDM을 시작하는 사람들을 위해, 우리는 공간적, 시간적 해상도를 고려하는 것의 중요성을 강조하고자합니다. 결정된 감쇠 시간을 파수의 함수로 검사할 때, 분해능의 한계(즉, 그림 5에서 수행된 바와 같이, 최대 및 최소 지연 시간 및 최대 파수)를 표시하는 것이 중요합니다. 최적의 대물 렌즈, 이미지 크기, 프레임 속도 및 동영상 지속 시간을 선택할 수 있도록 데이터를 수집하기 전에 이러한 제한에 대해 신중하게 생각해야합니다. 다른 중요한 고려 사항은 배경 매개 변수 B를 추정하는 방법입니다. 배경을 추정하기 위한 다수의 방법이 문헌에서 사용되었고, 과대 또는 과소 평가 B의 효과가 선행 간행물62,77에 기술되었다. 그림 10에서 볼 수 있듯이 PyDDM을 사용하면 사용자가 B를 추정하는 다양한 방법을 구현할 수 있으므로 새로운 사용자가 이러한 방법을 시도하고 사용하기에 적합한 방법을 평가할 것을 제안합니다.

이 패키지의 강점은 예제 데이터, 분석이 수행된 방식을 추적하기 위한 메타데이터의 저장 및 구성, DDM 매트릭스를 분석하는 방법의 유연성(다양한 피팅 모델, 배경 파라미터 B를 추정하기 위한 여러 방법, MSD를 찾는 기능)을 갖춘 철저한 문서화 및 연습입니다. 그러나이 코드에는 개선 될 수있는 여러 가지 측면이 있습니다. 현재 이 코드는 빠른 계산 속도를 위해 최적화되지 않았습니다. 계산 속도를 높이기위한 방법은61,62 개로보고되었으며 향후 릴리스에서 구현 될 예정입니다. 또한, 불확실성을 더 잘 예측하고 사용자를 적절한 ISF 모델(62)로 안내하기 위한 시뮬레이션을 사용하기 위해 최근에 보고된 방법을 구현할 계획이다. 다른 개선을 위해, 우리는 사용자가 제안과 함께 저희에게 연락 할 수 있기를 바랍니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구의 일부는 국립 보건원 R15 상 (National Institute of General Medical Sciences Award no. R15GM123420, R.M.R.-A.에 수여 및 R.J.M.), 과학 진흥 연구 공사의 코트렐 학자 상 (27459 호, R.J.M.에 수여), 윌리엄 M. 케크 재단 연구 보조금 (R.M.R-A.에 수여). GHK는 네덜란드 연구위원회 (NWO; NWO 인재 프로그램의 프로젝트 번호 VI.C.182.004)의 재정 지원을 감사하게 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 Hamatsu
F-127 Pluronic Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop Thermo Fisher
Nikon Ti-Eclipse microscope Nikon
PLL-PEG-bio SuSos AG, Dübendorf, Switzerland
Polystyrene beads Sigma Aldrich
Protein dialysis mini-cassette Thermo Fisher
PyDDM University of San Diego N/A Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).
  2. Amblard, F., Maggs, A. C., Yurke, B., Pargellis, A. N., Leibler, S. Subdiffusion and anomalous local viscoelasticity in actin networks. Physical Review Letters. 77 (21), 4470-4473 (1996).
  3. Mizuno, D., Tardin, C., Schmidt, C. F., MacKintosh, F. C. Nonequilibrium mechanics of active cytoskeletal networks. Science. 315 (5810), 370-373 (2007).
  4. Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).
  5. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Physical Review Letters. 102 (18), 188303 (2009).
  6. Stuhrmann, B., Soares e Silva, M., Depken, M., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Nonequilibrium fluctuations of a remodeling in vitro cytoskeleton. Physical Review E. 86 (2), 020901 (2012).
  7. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  8. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  9. Anderson, S. J. et al. Filament rigidity vies with mesh size in determining anomalous diffusion in cytoskeleton. Biomacromolecules. 20 (12),4380-4388 (2019).
  10. Anderson, S. J., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  11. Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).
  12. Wong, I. Y. et al. Anomalous diffusion probes microstructure dynamics of entangled F-actin networks. Physical Review Letters. 92 (17), 178101 (2004).
  13. Köster, S., Lin, Y.-C., Herrmann, H., Weitz, D. A. Nanomechanics of vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 6 (9), 1910-1914 (2010).
  14. Chandrakar, P. et al. Engineering stability, longevity, and miscibility of microtubule-based active fluids. Soft Matter. 18 (9), 1852-1835 (2022).
  15. Alvarado, J., Cipelletti, L., H. Koenderink, G. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).
  16. Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
  17. Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).
  18. Malik-Garbi, M. et al. Scaling behaviour in steady-state contracting actomyosin networks. Nature Physics. 15 (5), 509-516 (2019).
  19. Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (5), e2115895119 (2022).
  20. Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., Nédélec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e714 (2018).
  21. Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).
  22. Giavazzi, F., Brogioli, D., Trappe, V., Bellini, T., Cerbino, R. Scattering information obtained by optical microscopy: differential dynamic microscopy and beyond. Physical Review E. 80 (3), 031403 (2009).
  23. Giavazzi, F., Cerbino, R. Digital Fourier microscopy for soft matter dynamics. Journal of Optics. 16 (8), 083001 (2014).
  24. He, K., Spannuth, M., Conrad, J. C., Krishnamoorti, R. Diffusive dynamics of nanoparticles in aqueous dispersions. Soft Matter. 8 (47), 11933-11938 (2012).
  25. Lu, P. J. et al. Characterizing concentrated, multiply scattering, and actively driven fluorescent systems with confocal differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 108 (21), 218103 (2012).
  26. Giavazzi, F. et al. Viscoelasticity of nematic liquid crystals at a glance. Soft Matter. 10 (22), 3938-3949 (2014).
  27. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Dark-field differential dynamic microscopy. Soft Matter. 12 (8), 2440-2452 (2016).
  28. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. Light-sheet microscopy with digital Fourier analysis measures transport properties over large field-of-view. Optics Express. 24 (18), 20881-20894 (2016).
  29. Richards, J. A., Martinez, V. A., Arlt, J. Particle sizing for flowing colloidal suspensions using flow-differential dynamic microscopy. Soft Matter. 17 (14), 3945-3953 (2021).
  30. Ferri, F. et al. Kinetics of colloidal fractal aggregation by differential dynamic microscopy. The European Physical Journal Special Topics. 199 (1), 139-148 (2011).
  31. Lanfranco, R. et al. Adaptable DNA interactions regulate surface triggered self assembly. Nanoscale. 12 (36), 18616-18620 (2020).
  32. Cho, J. H., Cerbino, R., Bischofberger, I. Emergence of multiscale dynamics in colloidal gels. Physical Review Letters. 124 (8), 088005 (2020).
  33. Giavazzi, F., Trappe, V., Cerbino, R. Multiple dynamic regimes in a coarsening foam. Journal of Physics: Condensed Matter. 33 (2), 024002 (2020).
  34. He, K. et al. Diffusive dynamics of nanoparticles in arrays of nanoposts. ACS Nano. 7 (6), 5122-5130 (2013).
  35. Jacob, J. D. C., He, K., Retterer, S. T., Krishnamoorti, R., Conrad, J. C. Diffusive dynamics of nanoparticles in ultra-confined media. Soft Matter. 11 (38), 7515-7524 (2015).
  36. Sentjabrskaja, T. et al. Anomalous dynamics of intruders in a crowded environment of mobile obstacles. Nature Communications. 7, 11133 (2016).
  37. Hitimana, E., Roopnarine, B. K., Morozova, S. Diffusive dynamics of charged nanoparticles in convex lens-induced confinement. Soft Matter. 18 (4), 832-840 (2022).
  38. Wilson, L. G. et al. Differential dynamic microscopy of bacterial motility. Physical Review Letters. 106 (1), 018101 (2011).
  39. Martinez, V. A. et al. Differential dynamic microscopy: a high-throughput method for characterizing the motility of microorganisms. Biophysical Journal. 103 (8), 1637-1647 (2012).
  40. Germain, D., Leocmach, M., Gibaud, T. Differential dynamic microscopy to characterize Brownian motion and bacteria motility. American Journal of Physics. 84 (3), 202-210 (2016).
  41. Croze, O. A. et al. Helical and oscillatory microswimmer motility statistics from differential dynamic microscopy. New Journal of Physics. 21 (6), 063012 (2019).
  42. Safari, M. S., Vorontsova, M. A., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of weakly scattering and polydisperse protein-rich clusters. Physical Review E. 92 (4), 042712 (2015).
  43. Wang, J., McGorty, R. Measuring capillary wave dynamics using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 15 (37), 7412-7419 (2019).
  44. Cerbino, R., Giavazzi, F., Helgeson, M. E. Differential dynamic microscopy for the characterization of polymer systems. Journal of Polymer Science. 60 (7), 1079-1089 (2021).
  45. Cerbino, R., Cicuta, P. Perspective: differential dynamic microscopy extracts multi-scale activity in complex fluids and biological systems. The Journal of Chemical Physics. 147 (11), 110901 (2017).
  46. Drechsler, M., Giavazzi, F., Cerbino, R., Palacios, I. M. Active diffusion and advection in Drosophila oocytes result from the interplay of actin and microtubules. Nature Communications. 8 (1), 1-11 (2017).
  47. Burla, F., Sentjabrskaja, T., Pletikapic, G., Beugen, J. v., H. Koenderink, G. Particle diffusion in extracellular hydrogels. Soft Matter. 16 (5), 1366-1376 (2020).
  48. Regan, K., Wulstein, D., Rasmussen, H., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. M. Bridging the spatiotemporal scales of macromolecular transport in crowded biomimetic systems. Soft Matter. 15 (6), 1200-1209 (2019).
  49. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).
  50. Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).
  51. Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv:2112.11260 .(2021).
  52. Chen, X. et al. Coaxial differential dynamic microscopy for measurement of Brownian motion in weak optical field. Optics Express. 26 (24), 32083-32090 (2018).
  53. Reufer, M., Martinez, V. A., Schurtenberger, P., Poon, W. C. K. Differential dynamic microscopy for anisotropic colloidal dynamics. Langmuir. 28 (10), 4618-4624 (2012).
  54. Giavazzi, F., Haro-Pérez, C., Cerbino, R. Simultaneous characterization of rotational and translational diffusion of optically anisotropic particles by optical microscopy. Journal of Physics: Condensed Matter. 28 (19), 195201 (2016).
  55. Cerbino, R., Piotti, D., Buscaglia, M., Giavazzi, F. Dark field differential dynamic microscopy enables accurate characterization of the roto-translational dynamics of bacteria and colloidal clusters. Journal of Physics: Condensed Matter. 30 (2), 025901 (2017).
  56. Safari, M. S., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of bidisperse colloidal suspensions. npj Microgravity. 3 (1), 21 (2017).
  57. Giavazzi, F., Pal, A., Cerbino, R. Probing roto-translational diffusion of small anisotropic colloidal particles with a bright-field microscope. The European Physical Journal E. 44 (4), 61 (2021).
  58. Schwarz-Linek, J. et al. Escherichia coli as a model active colloid: a practical introduction. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 137, 2-16 (2016).
  59. Kurzthaler, C. et al. Probing the spatiotemporal dynamics of catalytic Janus particles with single-particle tracking and differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
  60. Mandal, S., Kurzthaler, C., Franosch, T., Löwen, H. Crowding-enhanced diffusion: an exact theory for highly entangled self-propelled stiff filaments. Physical Review Letters. 125 (13), 138002 (2020).
  61. Norouzisadeh, M., Chraga, M., Cerchiari, G., Croccolo, F. The modern structurator: increased performance for calculating the structure function. The European Physical Journal E. 44 (12), 146 (2021).
  62. Gu, M., Luo, Y., He, Y., Helgeson, M. E., Valentine, M. T. Uncertainty quantification and estimation in differential dynamic microscopy. Physical Review E. 104 (3), 034610 (2021).
  63. Hoyer, S., Hamman, J. xarray: N-D labeled arrays and datasets in Python. Journal of Open Research Software. 5 (1), 10 (2017).
  64. Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. Stiffening and inelastic fluidization in vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 15 (36), 7127-7136 (2019).
  65. Guo, M. et al. The role of vimentin intermediate filaments in cortical and cytoplasmic mechanics. Biophysical Journal. 105 (7), 1562-1568 (2013).
  66. Lavenus, S. B., Tudor, S. M., Ullo, M. F., Vosatka, K. W., Logue, J. S. A flexible network of vimentin intermediate filaments promotes migration of amoeboid cancer cells through confined environments. Journal of Biological Chemistry. 295 (19), 6700-6709 (2020).
  67. Patteson, A. E. et al. Loss of vimentin enhances cell motility through small confining spaces. Small. 15 (50), 1903180 (2019).
  68. Lin, Y.-C. et al. Origins of elasticity in intermediate filament networks. Physical Review Letters. 104 (5), 058101 (2010).
  69. Pawelzyk, P., Mücke, N., Herrmann, H., Willenbacher, N. Attractive interactions among intermediate filaments determine network mechanics in vitro. PLOS ONE. 9 (4), e93194 (2014).
  70. Schepers, A. V. et al. Multiscale mechanics and temporal evolution of vimentin intermediate filament networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (27), e2102026118 (2021).
  71. Wu, H. et al. Effect of divalent cations on the structure and mechanics of vimentin intermediate filaments. Biophysical Journal. 119 (1), 55-64 (2020).
  72. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  73. Giavazzi, F., Malinverno, C., Scita, G., Cerbino, R. Tracking-free determination of single-cell displacements and division rates in confluent monolayers. Frontiers in Physics. 6, 120 (2018).
  74. Cho, J. H. Multiscale Probing of Colloidal Gelation Dynamics., Massachusetts Institute of Technology (2018).
  75. Krall, A. H., Weitz, D. A. Internal dynamics and elasticity of fractal colloidal gels. Physical Review Letters. 80 (4), 778-781 (1998).
  76. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Probe microrheology without particle tracking by differential dynamic microscopy. Rheologica Acta. 56 (11), 863-869 (2017).
  77. Edera, P., Bergamini, D., Trappe, V., Giavazzi, F., Cerbino, R. Differential dynamic microscopy microrheology of soft materials: a tracking-free determination of the frequency-dependent loss and storage moduli. Physical Review Materials. 1 (7), 073804 (2017).
  78. Wang, B., Kuo, J., Bae, S. C., Granick, S. When Brownian diffusion is not Gaussian. Nature Materials. 11 (6), 481-485 (2012).
  79. soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0. Zenodo (2021).
  80. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
  81. Nixon-Luke, R., Arlt, J., Poon, W. C. K., Bryant, G., Martinez, V. A. Probing the dynamics of turbid colloidal suspensions using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 18 (9), 1856-1867 (2022).

Tags

생명공학 문제 184
차등 동적 현미경을 사용하여 세포 골격 역학 정량화
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G.,… More

Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G., Petitjean, I. I., Koenderink, G. H., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. J. Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63931, doi:10.3791/63931 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter