Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kvantificering af cytoskeletdynamik ved hjælp af differentiel dynamisk mikroskopi

Published: June 15, 2022 doi: 10.3791/63931
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 2, 2
1Cell Biology, Neurobiology and Biophysics, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 2Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

Summary

Differentiel dynamisk mikroskopi (DDM) kombinerer funktioner i dynamisk lysspredning og mikroskopi. Her præsenteres processen med at bruge DDM til at karakterisere rekonstituerede cytoskeletnetværk ved at kvantificere den subdiffusive og burede dynamik af partikler i vimentinnetværk og den ballistiske bevægelse af aktive myosindrevne actin-mikrotubululkompositter.

Abstract

Celler kan kravle, selvhelbrede og indstille deres stivhed på grund af deres bemærkelsesværdigt dynamiske cytoskelet. Som sådan kan rekonstituerende netværk af cytoskeletale biopolymerer føre til en lang række aktive og tilpasningsdygtige materialer. Imidlertid kræver konstruktion af sådanne materialer med præcist indstillede egenskaber måling af, hvordan dynamikken afhænger af netværkssammensætningen og syntesemetoderne. Kvantificering af en sådan dynamik udfordres af variationer på tværs af tid, rum og formuleringsrum i sammensatte netværk. Protokollen beskriver her, hvordan Fourier-analyseteknikken, differentialdynamisk mikroskopi (DDM), kan kvantificere dynamikken i biopolymernetværk og er særligt velegnet til studier af cytoskeletnetværk. DDM arbejder på tidssekvenser af billeder erhvervet ved hjælp af en række mikroskopimodaliteter, herunder laserscanning confocal, widefield fluorescens og brightfield imaging. Fra sådanne billedsekvenser kan man udtrække karakteristiske dekoderingstider for tæthedsudsving over et spænd af bølgevektorer. En brugervenlig, open source Python-pakke til udførelse af DDM-analyse er også udviklet. Med denne pakke kan man måle dynamikken i mærkede cytoskeletkomponenter eller indlejrede sporpartikler, som demonstreret her med data fra mellemliggende filamentnetværk (vimentin) og aktive actin-mikrotubulusnetværk. Brugere uden forudgående programmerings- eller billedbehandlingserfaring vil være i stand til at udføre DDM ved hjælp af denne softwarepakke og tilhørende dokumentation.

Introduction

Cytoskelettet er et netværk af proteinfilamenter, der spænder over cytoplasmaet af eukaryote celler, der forbinder celleoverfladen til kernen. Det har unikke materialeegenskaber, der giver mekanisk beskyttelse mod store og gentagne mekaniske belastninger, men også driver dynamiske celleformændringer1. Rekonstituerede cytoskeletnetværk kan give anledning til en række interessante dynamiske adfærd, fra burning af indlejrede partikler til ballistisk bevægelse drevet af molekylære motorer 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Metoder til at analysere dynamikken i sådanne netværk inkluderer sporing af bevægelsen af indlejrede spormikrosfærer 6,7,12,13,14, billedanalyse for at spore størrelsen af proteintætte klynger over tid8, dynamisk lysspredning15, partikelbillede velocimetri 4,16,17,18,19 , beregning af effektspektraltætheden af billeder over tid19 og kymografanalyse20. Efterhånden som flere undersøgelser af rekonstituerede cytoskeletnetværk udføres, hvad enten det er for at forstå cellulær mekanik eller aktivt stof, er robuste, upartiske og reproducerbare metoder til karakterisering af dynamikken i stigende grad nødvendige. Differentiel dynamisk mikroskopi (DDM)21,22, en relativt ny teknik, der er blevet brugt til at studere cytoskeletdynamik, er en sådan teknik, der effektivt kvantificerer dynamik med få brugerdefinerede parametre. Med den softwarepakke, der er beskrevet her, vil forskere med ringe erfaring inden for programmering eller billedanalyse kunne udnytte DDM til deres eget arbejde.

DDM er en billedanalyseteknik til at udtrække en prøves dynamik. Ligesom partikelsporing eller partikelbilledvelocimetri kræver DDM en tidsserie af billeder (ofte tusindvis af billeder), typisk optaget med et mikroskop. I modsætning til partikelsporing behøver individuelle funktioner eller sporperler ikke at være lokaliseret (eller endda være lokaliserelige) i billedet. I modsætning til både partikelsporing og partikelbilledvelocimetri genvinder man ensembledynamikken med DDM med relativt få brugerspecificerede parametre. Med DDM analyseres billeder i Fourier-rummet for at bestemme henfaldstiden for tæthedsudsving over en række bølgetal, q, hvor q = 2πu, og u er størrelsen af de rumlige frekvenser, Equation004. Man får spredningslignende oplysninger, men med virkelige rumbilleder erhvervet på et mikroskop 21,22,23. Derfor kan man drage fordel af de forskellige kontrastgenererende metoder til mikroskopi, såsom widefield fluorescens22,24, konfokal fluorescens25, polariseret26, mørkfelt27 eller lysark fluorescens28 mikroskopier. Desuden kan billeder, der anvendes til DDM-analyse, anvendes til partikelsporing eller partikelbilledvelocimetri for at give supplerende information.

Denne kombination af funktioner fra dynamisk lysspredning og optisk mikroskopi gør DDM til en kraftfuld og alsidig teknik. Siden den første beskrivelse af Cerbino og Trappe i 200821, hvor DDM blev påvist at måle diffusionen af 73 nm kolloide partikler, er DDM blevet brugt til at måle flydende kolloider29, kolloid aggregering30,31, viskoelasticiteten af nematiske flydende krystaller26, dynamikken i kolloide geler32, grovskum33, nanopartikler i lukkede miljøer34, 35,36,37, bakteriel motilitet 38,39,40,41, diffusion af svagt spredende proteinklynger 42, kapillærbølger ved væskegrænseflader43 og andre systemer. De, der søger en mere komplet liste over publikationer, der anvender DDM, kan henvise til grundige gennemgangspapirer om emnet 22,23,44,45.

DDM er også blevet brugt til at undersøge dynamikken i biologiske netværk. Drechsler et al. brugte DDM til at måle dynamikken i actin i levende Drosophila oocytter46. Burla et al. kvantificerede dynamikken i sporstofpartikler i netværk af hyaluronan og hyaluronan-kollagenkompositter47. Flere anvendelser af DDM til at studere dynamikken af sporstofpartikler i rekonstituerede cytoskeletnetværk 9,10, transport af DNA-molekyler i sådanne netværk48,49 og dynamikken i aktive rekonstituerede netværk er også dokumenteret 11,50,51. En fordel ved DDM til måling af dynamikken i sådanne systemer er, at individuelle partikler eller molekyler ikke behøver at blive lokaliseret og sporet. Så for eksempel kan dynamikken i DNA-molekyler i overfyldte miljøer måles med DDM på trods af vanskeligheden ved at spore sådanne små og ikke-sfæriske molekyler. Desuden kan man med fluorescensmikroskopi bruge flerfarvet mærkning til selektivt at måle dynamikken i individuelle bestanddele i en kompleks sammensætning.

For at udføre DDM tages en sekvens af billeder over tid, I (x, y, t). For en given forsinkelsestid findes Δt, alle (eller en delmængde af) par billeder adskilt af den pågældende forsinkelsestid. Den kvadrerede Fourier-transformation af forskellen mellem hvert par,

Equation007

beregnes og beregnes sammen. Denne mængde, Equation008, er radialt gennemsnitlig, forudsat at dynamikken er isotrop. Dette giver DDM-matrixen (også kaldet billedstrukturfunktionen), Equation009. Denne proces er vist grafisk i figur 1. For at bestemme prøvens dynamik fra denne DDM-matrix antages DDM-matrixen at have form

Equation010

hvor A er amplituden, som afhænger af mikroskopets detaljer og prøvens struktur, B er baggrunden, som afhænger af støjen i billederne, og f (q, Δt) er den mellemliggende spredningsfunktion (ISF), som indeholder information om dynamikken21,22. I enkle tilfælde,

Equation014

hvor τ er en karakteristisk henfalds- eller dekoderingstid. En sådan ISF er blevet anvendt i flere undersøgelser, der anvender DDM på ergodiske systemer som fortyndede kolloide suspensioner 21,24,27,37,40,52. Imidlertid kan andre former for ISF bruges til at modellere forskellige typer dynamikker. For eksempel kan man bruge en cumulant ekspansion til at modellere ISF for polydisperse prøver som

Equation016

hvor μ er et mål for polydispersiteten42,53; hvis densitetsudsving henfalder med to separate tilstande, kan man bruge en ISF som

Equation01826, 54, 55, 56, 57;

andre ISF'er kan anvendes til svømning af mikroorganismer eller andre aktive partikler 38,39,40,41,58,59.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over DDM-analyse. Fra tidsserien af billeder beregnes Fourier-transformationen af billedforskelle for at beregne DDM-matrixen. DDM-matrixen kan tilpasses en model for at bestemme tidsskalaen for densitetsudsving over en række q-værdier . Klik her for at se en større version af denne figur.

Her beskrives brugen af en DDM-analysesoftwarepakke udviklet i Python, PyDDM. Denne softwarepakke bygger på det arbejde, der er udført af vores forskningslaboratorier og andre offentliggjorte undersøgelser i løbet af de sidste mange år. Primære motivationsfaktorer for at oprette denne softwarepakke inkluderer behovet for (1) at holde styr på og gemme metadata og parametre, der bruges i analysen; (2) grundig dokumentation med detaljerede eksempler på analyse fra start til slut; og (3) en nem måde at anvende forskellige (eller oprette nye) matematiske modeller til tilpasning af dataene (f.eks. tilføjelse af ISF-modeller, såsom dem, der for nylig er udviklet til aktive filamenter60, ville være ligetil). Der findes også andre softwarepakker til DDM-analyse, men ikke alle er veldokumenterede og skrevet i et open source-programmeringssprog. For eksempel er der C++-kode med computing på GPU'er (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, C++-kode, der bruger Fourier-transformationer i tide til at fremskynde beregninger (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, MATLAB- og Python-versioner (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, MATLAB-kode (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 og MATLAB-kode med usikkerhedskvantificering ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Da denne PyDDM-pakke er veldokumenteret og giver en masse fleksibilitet i, hvordan DDM-matrixen beregnes og analyseres, kan den forhåbentlig være nyttig for forskere, der ønsker at implementere DDM uanset deres baggrund i programmering eller billedanalyse.

Protokollen viser, hvordan denne softwarepakke kan bruges til at kvantificere dynamikken i in vitro-rekonstituerede cytoskeletnetværk. Dette gøres ved at bruge to forskellige sæt billeddata: (1) billeder af submikronsporepartikler indlejret i et vimentinnetværk taget med brightfieldmikroskopi og (2) billeder af fluorescerende mærkede actin- og mikrotubulilofilamenter i et sammenfiltret sammensat netværk med myosindrevet aktivitet taget med laserscanning konfokal mikroskopi. Analyserne af disse to datasæt fremhæver bemærkelsesværdige styrker ved DDM, herunder dets evne til at analysere billeder taget med en række billeddannelsesmetoder (f.eks. Brightfield eller konfokal fluorescens), at udtrække dynamik fra enten indlejrede sporstoffer eller fra mærkede filamenter og at kvantificere en række dynamikker (f.eks. Subdiffusive og begrænsede eller ballistiske).

Protocol

BEMÆRK: En Jupyter Notebook-fil, der indeholder koden til at gå sammen med hvert trin i den følgende protokol, findes på følgende GitHub-lager, https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. En PDF-fil af denne fil er inkluderet i supplerende fil 1. Derudover kan en gennemgang af koden og dokumentationen for hver funktion og klasse findes på hjemmesiden, https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.

1. Installation af software

  1. For at følge med eksemplet DDM-analysefiler skal du installere Jupyter Notebook til kørsel af koden. Installer andre nødvendige almindelige Python-pakker, herunder også NumPy og Matplotlib. Disse pakker leveres alle sammen med Anaconda-distributionen (se https://www.anaconda.com/products/individual).
  2. Installer Python-pakken xarray63. Denne pakke er nødvendig for at organisere og gemme metadata og analyseparametre. Hvis du bruger Anaconda-distributionen, skal du installere xarray (sammen med dens anbefalede afhængigheder) ved hjælp af kommandoen:
    conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 flaskehals
  3. Installer PyYAML-pakken ved hjælp af kommandoen:
    conda install -c anaconda yaml
    Denne pakke er nødvendig for at læse metadata om de billeder, der skal analyseres, og de parametre, som brugeren har indstillet til analyse og tilpasning.
  4. Installer PyDDM-pakken ved at downloade fra GitHub-lageret eller bruge git-kommandoen:
    git klon https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git

2. Planlægning af billedbehandlingssessionerne

  1. Vælg den optimale tilgængelige billedbehandlingsmodalitet og optiske indstillinger. Som nævnt kan DDM anvendes med en række mikroskopimetoder.
  2. For at hjælpe med at planlægge den passende objektive linse og billedstørrelse, der skal bruges, skal du bestemme rækkevidden af bølgetal, q, der vil blive undersøgt baseret på pixelstørrelsen og den samlede billedstørrelse. Bekræft, at valget af forstørrelse og synsfelt er optimalt for eksperimentet baseret på disse beregninger. For de billeder, der analyseres her, blev der anvendt et 60x 1,4 NA-mål og en billedstørrelse på 256 x 256 pixels med en pixelstørrelse på 0,83 μm til det aktive actin-mikrotubuluskompositnetværk. Til billederne af perler indlejret i et vimentin-netværk blev der anvendt et 100x 1,4 NA-mål og en billedstørrelse på 512 x 512 pixels med en pixelstørrelse på 0,13 μm.
    BEMÆRK: Minimum q er indstillet til 2π/NΔx, hvor billedstørrelsen (antages at være kvadratisk) er N × N pixels med en pixelstørrelse på Δx. Det maksimale q er minimum π/Δx og 2π NA/λ, hvor NA er billedmålets numeriske blænde, og λ er lysets bølgelængde (til brightfield imaging kan man erstatte NA med (NAobjective + NAcondenser)/2).
  3. Overvej derefter rækkevidden af tidsplaner, der skal undersøges. Typisk udføres DDM-analyse på sekvenser på mindst 1000 billeder.
    1. For at bestemme den passende billedhastighed skal du overveje den forventede tid, det vil tage for funktioner i prøven at flytte en afstand i rækkefølgen af den mindste opløselige længdeskala (svarende til den maksimale q).
    2. Når du overvejer den øvre grænse for det undersøgte tidsinterval, skal du erkende, at effektspektret for hundredvis af billedforskelle i en given forsinkelsestid Δt typisk er gennemsnitligt sammen for at give tilstrækkelig statistik til at reducere støj. Indhent derfor billedsekvenser, der er længere end den maksimale tidsskala, der undersøges.
      BEMÆRK: Hvis en forventet diffusionskoefficient, D eller hastighed, v, er kendt, kan man estimere forventede karakteristiske henfaldstider ved hjælp af τ = 1 / Dq2 eller τ = 1 / vq sammen med området q, som blev bestemt ud fra synsfeltet og pixelstørrelsen. Intervallet af forventede τ-værdier over det tilgængelige q-område kan hjælpe med at styre valget af billedhastighed og antallet af rammer, der skal erhverves.

3. Prøveforberedelse og billedoptagelse

BEMÆRK: For detaljer om prøveforberedelses- og billeddannelsesindstillingerne, der anvendes til de data, der præsenteres i afsnittet om repræsentative resultater, se tidligere publikationer fra forfatterne 11,51,64 og supplerende fil 2.

  1. Baseret på overvejelsen af tids- og længdeskalaerne til sonde, erhverve billedsekvenser på ideelt set over 1000 billeder.
    BEMÆRK: Koden analyserer firkantede billeder eller firkantede områder af interesse i billedet, så juster rammestørrelsen i overensstemmelse hermed.
  2. Gem billedsekvenser som en tredimensionel TIFF-tIFF-stak med gråtoner. Alternativt kan det format, der bruges af Nikon Instruments-systemer, ND2-format, læses af den installerede pakke. Hvis billeder gemmes i et andet format, skal du bruge ImageJ eller et andet billedbehandlingsprogram til at konvertere billederne til en TIFF-stak.
    BEMÆRK: Hvis du bruger ND2-filer, skal pakken nd2reader fra https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader være installeret.

4. Opsætning af parameter

  1. Lav en kopi af parameterfilen example_parameter_file.yml, der findes i PyDDM-kodelageret under eksempelmappen. Åbn denne YAML-fil med en teksteditor som NotePad ++ eller teksteditoren i JupyterLab. Se supplerende fil 2 for et eksempel på YAML-parameterfil, der anvendes til analyse af data, der præsenteres i afsnittet repræsentative resultater.
  2. I den kopierede YAML-fil skal du angive datamappen og filnavnet, der svarer til den billedsekvens, der skal analyseres. Under metadataafsnittet skal du angive pixelstørrelsen og billedhastigheden.
  3. Under afsnittet Analysis_parameters skal du give oplysninger om, hvordan DDM-matrixen skal beregnes. Nogle parametre her er valgfrie.
    1. Angiv som minimum værdier for parametrene number_lag_times og last_lag_time. Disse svarer til antallet af forskellige forsinkelsestider, som henholdsvis DDM-matrixen skal beregnes for, og den længste forsinkelsestid (i rammer), der skal bruges. For data om sporperler i vimentinnetværk, der blev brugt her, var parametrene number_lag_times og last_lag_time henholdsvis 60 og 1000. Koden beregner DDM-matrixen for forsinkelsestider fra 1 ramme (eller en anden minimumstid, hvis den valgfrie parameter first_lag_time er angivet) til last_lag_time med logaritmisk afstand.
      BEMÆRK: Hvis M-rammer blev erhvervet, kunne man beregne DDM-matrixen for en forsinkelsestid så stor som M-1. Men med dårlig statistik på så stor en forsinkelsestid vil dataene sandsynligvis være støjende. Den længste forsinkelsestid, som DDM-matrixen skal beregnes for, afhænger af detaljerne i dataene, men vi foreslår at prøve omkring en tredjedel af den samlede billedserievarighed.
  4. Angiv detaljer om, hvordan DDM-matrixen eller den mellemliggende spredningsfunktion (ISF) skal passe i afsnittet Fitting_parameters. Angiv navnet på modellen under modelparameteren. Angiv det indledende gæt, nedre grænse og øvre grænse for hver af tilpasningsparametrene i den valgte model.
    BEMÆRK: For at få vist en liste over de mulige monteringsmodeller skal du køre funktionen print_fitting_models. Modellerne kan også findes i onlinedokumentationen på PyDDM-webstedet.

5. Beregning af DDM-matrixen

  1. Initialiser en forekomst af DDM_Analysis klassen. For at gøre dette skal du angive de metadata og analyseparametre, der er diskuteret ovenfor, ved at overføre filnavnet med den fulde filsti inkluderet på YAML-filen til DDM_Analysis. Alternativt kan du videregive metadataene og parametrene som en Python-ordbogsdatastruktur.
  2. Kør funktionen calculate_DDM_matrix for at beregne DDM-matrixen. Denne beregning kan tage flere minutter eller længere afhængigt af rammestørrelsen og antallet af forsinkelsestider. Se figur 2 for typiske køretider.
  3. Undersøg de returnerede data, som vil være i en datastruktur fra xarray-pakken kendt som et datasæt. Denne datastruktur gemmes under attributten ddm_dataset.
    BEMÆRK: Ikke kun DDM-matrixen, men også tilknyttede variabler og metadata gemmes i denne datastruktur. Det gemmes også på disken i et NetCDF-format (Network Common Data Form).
  4. Undersøg de plots og figurer, som vil blive genereret og vist. Disse tal gemmes også som en PDF-fil i datamappen.
    1. Se, at et af de genererede plot viser det ensemble-gennemsnitlige kvadrerede modul af fourier-transformerede billeder Equation031 som en funktion af q. Som standard bruger koden dette til at estimere baggrundsparameteren B. Vurder baggrunden ud fra Equation031 ved at antage, at den i grænsen for stort q vil nærme sig B/2, hvor B er baggrunden.
    2. Hvis Equation031 du ikke når et plateau ved stort q, skal du bruge en anden metode til estimering af B. For at opnå dette skal du indstille parameteren background_method i enten YAML-filen eller som et valgfrit nøgleordsargument til den funktion, calculate_DDM_matrix. Flere detaljer om metoderne til estimering af B er præsenteret i afsnittet repræsentative resultater.

Figure 2
Figur 2: Beregningstid til beregning af DDM-matrixen. I (A) og (B) vises tidspunktet for beregning af DDM-matrixen, Equation009, . De anvendte data er i alle tilfælde en film med 5000 rammer med en billedstørrelse på 512 x 512 pixels. DDM-matrixen blev beregnet for 30 forsinkelsestider, logaritmisk fordelt mellem 1 ramme (0,01 s) og 1000 rammer (10 s). Koden blev kørt på en Intel i7-10700 2, 90 GHz stationær computer med 32 GB RAM. I (A) vises effekten af at variere, hvor mange billedforskelle der bruges til beregning af DDM-matrixen for hver forsinkelsestid. Til dette er billederne binned for at resultere i en billedstørrelse på 256 x 256. For hver forsinkelsestid Δt trækkes billeder adskilt af den Δt , og den resulterende matrix transformeres Fourier. For en given Δt kan alle par billeder adskilt af det Δt bruges (vist med blåt), kun ikke-overlappende billedpar kan bruges (f.eks. Rammer 1 og 10, 10 og 19 osv.; vist med brun), eller 300 billedpar eller færre kan bruges til hver Δt. I (B) vises effekten af at ændre billedstørrelsen på beregningstiden. Billederne blev kasseret enten ved at gruppere 2 x 2, 4 x 4 eller 8 x 8 pixels, hvilket resulterede i billedstørrelser på henholdsvis 256 x 256, 128 x 128 eller 64 x 64. For hver anvendes ca. 300 billedpar til beregning af DDM-matrixen for hver Δt. (C) Fra DDM-matrixen kan den mellemliggende spredningsfunktion (ISF) ekstraheres. Dette fremgår for de tre tilfælde i (A). De blå datapunkter (uden forskydning) svarer til ISF, når det maksimale antal billedpar anvendes for hver Δt; de brune datapunkter (med en forskydning på 0,1) svarer til ISF, når der anvendes ikke-overlappende billedpar for hver Δt og de lyserøde datapunkter (med en forskydning på 0,2) svarer til ISF, når der højst anvendes 300 billedpar for hver Δt. Isf fundet ved hjælp af ikke-overlappende billedpar viser støj ved lang Δt. I så fald bruges få billedpar ved lang Δt (f.eks. for Δt på 1000 billeder bruges kun 4 billedpar). (D) Ved at tilpasse ISF til en eksponentiel funktion bestemmes den karakteristiske henfaldstid, τ, for hvert bølgetal, q. I lyserød vises resultaterne efter binning af de originale billeder med 2 x 2, hvilket resulterer i en billedstørrelse på 256 x 256. I grå vises resultaterne efter binning med 8 x 8, hvilket resulterer i en billedstørrelse på 64 x 64. Ved at kassere dataene går information om dynamikken ved højere bølgetal tabt, men beregning af DDM-matrixen for 64 x 64-billederne er ca. 16 gange hurtigere end for 256 x 256-billederne. Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Tilpasning af DDM-matrixen eller ISF

  1. Initialiser en forekomst af DDM_Fit klassen. For at gøre det skal du videregive filnavnet på YAML-filen, der indeholder billedmetadata og parametre til montering, til DDM_Fit.
  2. Beslut, hvilken model for DDM-matrixen eller ISF der skal bruges til tilpasning af dataene. Angiv de tilgængelige modeller ved at udføre funktionen print_fitting_models. Angiv den model, der skal bruges i YAML-parameterfilen, eller ved hjælp af funktionen reload_fit_model_by_name.
  3. Angiv de indledende gæt og grænser for hver parameter i den valgte model i den medfølgende YAML-parameterfil. For at ændre det oprindelige gæt for en parameter skal du bruge funktionen set_parameter_initial_guess. Indstil grænser for parametrene med funktionen set_parameter_bounds. For eksempel, som det ses i supplerende fil 2, for dataene for sporperler i vimentinnetværket, var det oprindelige gæt for henfaldstiden 1 s, og grænserne for denne parameter var 0,01 s og 2000 s.
  4. Udfør pasformen med funktionstilpasningen. Tildel en variabel til outputtet af denne funktion for nemt at få adgang til resultaterne.
    BEMÆRK: Denne funktion kan tage mange valgfrie argumenter. Se kodedokumentationen og de angivne eksempler for en liste over sådanne argumenter, og hvornår du skal overveje at indstille dem til ikke-standardværdier.

7. Fortolkning af tilpasningsresultaterne

  1. Generer plots til inspektion af pasformerne og q-afhængigheden af tilpasningsparametrene med funktionen fit_report.
    BEMÆRK: Denne funktion genererer en række plots, som også gemmes som en PDF. Valgfrie argumenter til denne funktion kan bruges til at ændre de producerede plots.
  2. Blandt de genererede plots vil være en figur med 2 x 2 delplots, der viser DDM-matrixen eller ISF (afhængigt af den valgte tilpasningsmodel) ved fire q-værdier (specificeret som et valgfrit argument for at fit_report) sammen med den beregnede DDM-matrix eller ISF ved hjælp af modellen og bedst egnede parametre. Hvis du vil plotte DDM-matrixen eller ISF'en sammen med den bedste pasform på en interaktiv måde, skal du bruge klassen Browse_DDM_Fits som vist i de angivne eksempler, når Jupyter Notebook-miljøet bruges.
  3. Fra plottet af den karakteristiske henfaldstid τ vs. bølgetallet q skal du afgøre, om dynamikken følger diffusiv, subdiffusiv, ballistisk eller en anden form for bevægelse. Dette kan gøres ved at lede efter magtlovsforholdet mellem τ og q.
    BEMÆRK: På log-log-plottet for τ vs. q genereret af funktionen fit_report vises tre linjer svarende til effektlov passer over et specificeret interval af q-værdier . Den faste sorte linje svarer til at passe τ vs. q til en effektlov, τ = 1 / Kqβ, hvor K og β er frie parametre. Den stiplede linje i orange svarer til montering til simpel diffusion, τ = 1 / Dq2, hvor D er en diffusionskoefficient. Den stiplede linje i blåt svarer til montering til τ = 1 / vq, hvor v er en hastighed.

8. Gemme resultaterne

  1. Resultaterne af tilpasningen gemmes i et xarray-datasæt. Brug xarray-funktionen to_netcdf eller Pythons indbyggede pickle-modul til at gemme denne datastruktur på disken. Brug xarray-funktionen open_dataset til at indlæse disse netCDF-filer.
  2. Brug funktionen save_fit_results_to_excel til at gemme tilpasningsresultaterne sammen med dataene i en regnearksfil.

Representative Results

Her viser vi eksempler på analysen udført med PyDDM fra to forskellige sæt eksperimenter. I et sæt eksperimenter blev submikron sporstofperler indlejret i netværk bestående af det mellemliggende filamentprotein vimentin og afbildet ved hjælp af en 100x objektiv linse i brightfield-tilstand ved 100 billeder / s (figur 3A). Vimentin udtrykkes i mesenkymale celler og er en nøgledeterminant for cytoplasmaets mekaniske egenskaber65 og kernens mekaniske stabilitet i celler, der udfører begrænset migration66,67. Indtil videre er rekonstituerede vimentinnetværk primært blevet undersøgt af makroskopisk reologi 64,68,69, mens dynamikken har fået forholdsvis lidt opmærksomhed 13,70,71. Yderligere oplysninger om disse eksperimenter findes i supplerende fil 2. I det andet sæt eksperimenter blev aktive cytoskeletnetværk fremstillet med actin, mikrotubuli og myosin. Spektralt forskellige fluorescerende etiketter gjorde det muligt at afbilde actin- og mikrotubulilofilamenterne med et tofarvet laserscanningskonfokalmikroskop ved hjælp af en 60x objektiv linse ved 2,78 billeder / s (figur 3B, C). Actin- og mikrotubulilofilamenter er begge vigtige drivkræfter for dynamiske celleformændringer, hvor deres handlinger koordineres af mekaniske og biokemiske interaktioner72. Yderligere detaljer om disse eksperimenter findes i11. Individuelle rammer fra billedsekvenser taget i disse eksperimenter er vist i figur 3.

Figure 3
Figur 3: Billeder fra den analyserede tidsserie. (A) Brightfield-billede af 0,6 μm perler i et vimentin-netværk. (B,C) Billede af (B) mikrotubuli og (C) actin i en aktiv actin-mikrotubuluskomposit taget med et 60x mål på et laserscanningskonfokalmikroskop ved anvendelse af 561 nm excitationslys til mikrotubulusbilleddannelsen og 488 nm excitationslys til actin-billeddannelsen. Klik her for at se en større version af denne figur.

For billeder af sporstofperler i vimentin-netværk blev der optaget film med 5000 billeder med en størrelse på 512 x 512 pixels ved 100 billeder/s. Ud fra disse blev DDM-matrixen beregnet ved 60 logaritmisk fordelte forsinkelsestider mellem 1 og 1000 rammer eller 0,01 s og 10 s. For at estimere baggrunden blev B, middelværdien af de kvadrerede Fourier-transformerede billeder, Equation031beregnet og indstillet lig med Equation03755,73. Det blev antaget, at denne mængde over de største 10% af q-værdierne er lig med B/2, og at B er uafhængig af q. Dette er pakkens standardmetode til estimering af B, men andre metoder er mulige ved at indstille parameteren background_method til en anden værdi.

Med parametrene A(q) og B bestemt ud fra Equation031, kan man udtrække den mellemliggende spredningsfunktion (ISF) fra DDM-matrixen. Eksempler på ISF'er er vist i figur 4. I figur 4A vises ISF fra billeder med perler med en diameter på 0,6 μm indlejret i et netværk med en vimentinkoncentration på 19 μM. I figur 4B er ISF for samme type perler i et netværk med en vimentinkoncentration på 34 μM vist. Interessant nok henfaldt ISF i ingen af tilfældene til nul. Ved store forsinkelsestider bør ISF nærme sig nul for ergodiske systemer. Det vil sige i sådanne systemer, at tæthedsudsving fuldstændigt skal afkodes over store forsinkelsestider. Det faktum, at ISF her ikke henfaldt til nul, kunne have været resultatet af unøjagtige estimater af A (q) og B, som blev brugt til at finde ISF fra den beregnede DDM-matrix. Især kan den metode, der anvendes her, overvurdere B i visse scenarier62. Det er dog mere sandsynligt, at sporperlernes dynamik virkelig er ikke-godisk, da perlerne har en størrelse, der kan sammenlignes med netværksmaskestørrelsen og derfor kan blive buret. Andre data bekræftede konstateringen af nonergodicitet. Perlestørrelsen, 0,6 μm, var nemlig større end den beregnede gennemsnitsværdi for maskestørrelserne på 0,4 μm for koncentrationen på 19 μM og 0,3 μm for 34 μM-koncentrationen. Derudover viste resultaterne fra enkeltpartikelsporing af disse sporperler, som vises senere, også begrænset bevægelse.

Figure 4
Figur 4: Mellemliggende spredningsfunktioner ved flere bølgetal for vimentinnetværk. ISF afbildes som en funktion af forsinkelsestiden for q-værdier fra ca. 1 til 9 μm-1. (A) ISF fra billeder af 0,6 μm perler i et vimentinnetværk med vimentinkoncentration på 19 μM. (B) ISF fra billeder af 0,6 μm perler i et vimentinnetværk med vimentinkoncentration på 34 μM. ISF's lange forsinkelsestidsplateau ved en værdi langt over nul indikerer nonergodicitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

I betragtning af at dynamikken sandsynligvis er ikke-godisk, er FSI'erne egnede til formen Equation039, hvor C er nonergodicitetsfaktoren 32. Denne form for ISF er blevet anvendt i tidligere undersøgelser af ikke-ergodisk dynamik, såsom kolloide geler32,74 eller sporpartikler i actin-mikrotubulusnetværk 10. De stiplede sorte linjer i figur 4 viser passer sammen med dataene. Fra disse passer kan man nu se på q-afhængigheden af henfaldstiden, τ, og af nonergodicitetsparameteren, C.

Figure 5
Figur 5: Henfaldstid vs. bølgetal for vimentin-netværk. Fra passer til ISF bestemmes henfaldstiden τ for en række q-værdier . For klarhedens skyld viser vi ikke værdien af τ for hvert q, men blot et logaritmisk mellemrum. I blå (tan) er dataene fra billeder af 0,6 μm perler inden for vimentinnetværk med en vimentinkoncentration på 19 μM (34 μM). Fejlbjælkerne repræsenterer standardafvigelserne i τ på tværs af flere film (fire film for dataene med 19 μM-netværket [blå] og fem film for dataene med 34 μM-netværket [tan]). Røde stiplede linjer markerer estimerede grænser for vores tidsmæssige og rumlige opløsning, som beskrevet i resultaterne. Den solide sorte linje viser Equation044 skalering, hvilket ville indikere diffus bevægelse. Ingen af datasættene følger denne skalering. Snarere viser perler i 19 μM-netværket subdiffusiv bevægelse (Equation010med β > 2), og perler i 34 μM-netværket viser begrænset eller buret bevægelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Henfaldstiderne viste stor usikkerhed, både ved de lave q og høje q ekstremer, som det ses i figur 5. Fejlbjælkerne på dette plot viser standardafvigelsen blandt fire videoer analyseret for det lavere vimentinkoncentrationstilfælde eller fem videoer analyseret for den højere koncentration. For at forstå kilden til den store usikkerhed ved disse ekstremer skal du overveje både den tidsmæssige og rumlige opløsning. Omtrentlige grænser for opløsningen vises med tre røde bindestregsprikkede linjer. De to vandrette linjer svarer til de undersøgte minimums- og maksimumsforsinkelser. I betragtning af billedhastigheden på 100 billeder / s og den maksimale forsinkelsestid svarende til 1000 billeder (20% af den samlede videovarighed) gik nøjagtigheden tabt, når måling af dynamik, der forekommer hurtigere end 0,01 s eller langsommere end 10 s. Ved de lavere q-værdier var de monterede værdier for τ større end 10 s. Derfor bør der forventes store usikkerheder i forfaldstider, der er større end den maksimale forsinkelsestid. I den højere ende af q-området nærmede henfaldstiden sig den mindste forsinkelsestid på 0,01 s, men forblev over den. I stedet for at være begrænset af den tidsmæssige opløsning, ved disse højere q-værdier , kan den rumlige opløsning være den begrænsende faktor. I betragtning af pixelstørrelsen på 0,13 μm var den største værdi for q ca. 24 μm-1. Den diffraktionsbegrænsede opløsning tillader imidlertid ikke nødvendigvis nøjagtige målinger af dynamikken ved disse høje rumlige frekvenser. Tilnærmelse af den optiske opløsning som Equation041 fører til en øvre bølgetalsgrænse på ca. 16 μm-1, givet objektivobjektivets numeriske blænde, NA, på 1,4 og bølgelængde af lys, Equation042. Dette markeres af den lodrette røde stiplede linje i figur 5. Faktisk var dataene støjende ved store værdier af q. Allerede før denne omtrentlige øvre grænse på q blev der set øget usikkerhed i τ, og dette kunne skyldes overvurdering af qmax. Dårligere optisk opløsning end forudsagt kan skyldes, at en oliedypningslinse blev brugt til at afbilde ud over dækslen i en vandig prøve, eller fordi kondensatorlinsen var ufuldstændigt justeret.

For de 0,6 μm perler, der er indlejret i det mindre koncentrerede netværk (19 μM vimentin), kan det observeres fra log-log-plottet for henfaldstiden vs. bølgetallet, at henfaldstiden faldt med bølgetal på en måde, der er i overensstemmelse med en effektlov (figur 5). Det ser dog ikke ud til at følge, hvad der forventes for normal diffusiv bevægelse, hvor Equation044. Snarere faldt τ mere stejlt med stigende q. Dette er tegn på subdiffusiv bevægelse, som ofte forekommer for perler i overfyldte miljøer som disse. Tilpasning af τ(q) over området 1,4 μm-1 til 12,3 μm-1 til en effektlov af formen τ = 1/Kqβ giver transportparametrene K = 0,0953 μmβ / s og β = 2,2. For dem, der er mere vant til at tænke på normal diffusion vs. subdiffusion med hensyn til den gennemsnitlige kvadrerede forskydning (MSD) af sporstofpartikler som en funktion af forsinkelsestiden (dvs. MSD = K 'Δtα), er det nyttigt at erkende, at den subdiffusive skaleringseksponent i MSD-ligningen , α, svarer til α = 2 / β. Med andre ord er værdien af β = 2,2 i overensstemmelse med en subdiffusiv skaleringseksponent i MSD-ligningen for α = 0,9. Man ville indstille PyDDM til at passe τ (q) over dette interval af q-værdier ved at specificere indekserne for arrayet af q med enten parameteren Good_q_range i YAML-filen eller ved at overføre det valgfri argument forced_qs til funktionen generate_fit_report. Området q fra 1,4 μm-1 til 12,3 μm-1 ville for dataene her svare til indekser for arrayet af q fra 15 til 130.

For 0,6 μm perlerne i det mere koncentrerede netværk (34 μM) viste henfaldstiden ringe afhængighed af q. Dette skyldes sandsynligvis ikke-godiciteten af perler i et netværk med en mindre maskestørrelse. For at undersøge nonergodiciteten i dette system skal nonergodicitetsparameteren, C, afbildes som en funktion af q, som i figur 6. For 0,6 μm perlerne i 19 μM vimentinnetværket ≈ C 0,2 med ringe afhængighed af q (ikke vist). For netværket med 34 μM vimentin og for et netværk med en endnu højere koncentration på 49 μM vimentin var loggen af C imidlertid proportional med q2 som vist i figur 6. Dette forhold mellem C og q forventes for begrænset bevægelse. For perler, der er fanget i lommer af netværket, forventes MSD at plateau på lange nok forsinkelsestider (dvs. Equation055hvor Equation056 er MSD og δ2 er den maksimale MSD). Da ISF kan udtrykkes i form af MSD som Equation058, og da den ikke-gudiske ISF går til C ved lange forsinkelsestider (dvs.Equation059), opnås forholdet Equation06032,75. Derfor kan man bruge C(q) til at finde δ2, og dette gav δ2 = 0,017 μm2 og 0,0032 μm2 for henholdsvis 34 og 49 μM vimentinnetværk (svarende til δ = 0,13 μm og 0,057 μm).

Figure 6
Figur 6: Nonergodicity parameter vs. wavenumber for vimentin netværk. Fra passer til ISF bestemmes nonergodicitetsparameteren C for et interval af q-værdier . I tan (rød) er dataene fra billeder af 0,6 μm perler inden for vimentinnetværk med en vimentinkoncentration på 34 μM (49 μM). Fejlbjælkerne repræsenterer standardafvigelserne i τ på tværs af flere film (fem film for dataene med 34 μM-netværket [tan] og fire film for dataene med 49 μM-netværket [rød]). Y-aksen har logaritmisk skalering. Man observerer en q-afhængighed af C , der følger Equation060, som gør det muligt at udtrække den maksimale gennemsnitlige kvadrerede forskydning, δ2. Passer til Equation060 vises med de faste linjer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Man kan bruge andre metoder til at udtrække indeslutningsstørrelsen δ fra dataene såvel som den subdiffusive eksponent, der findes ved at undersøge τ (q) for perler inden for 19 μM vimentin-netværket. For det første kan man bruge metoden beskrevet af Bayles et al.76 og Edera et al.77 til at ekstrahere MSD fra DDM-matrixen. Især kræver denne metode ingen tilpasning af DDM-matrixen. Man behøver kun at beregne DDM-matrixen, D(q, Δt), og Equation070 (hvorfra A(q) og B kan bestemmes). Derefter, for at finde MSD, bruger man forholdet Equation071. Bemærk, at denne metode til at finde MSD antager, at fordelingen af partikelforskydninger er gaussisk, selvom tidligere arbejde har vist, at MSD'er afledt af DDM i visse tilfælde er enige med MSD'er fra partikelsporing, selv når forskydningerne er ikke-gaussiske73. For dette system er der som forventet78 ikke-gaussianitet i fordelingen af store forskydninger, som det ses i figur S1. I PyDDM-pakken skal funktionen extract_MSD udføres, som returnerer Equation056. For det andet kan man bruge enkeltpartikelsporing til at finde MSD. Selvom DDM kan bruges til at analysere billeder, hvor enten den høje densitet af partikler eller den begrænsede optiske opløsning forbyder nøjagtig partikellokalisering, var vi for billederne af 0,6 μm perler i vimentin-netværk i stand til at lokalisere og spore perler ved hjælp af trackpy-softwaren (https://github.com/soft-matter/trackpy)79. Denne partikelsporingssoftwarepakke bruger algoritmerne beskrevet af Crocker og Grier80.

Figure 7
Figur 7: Gennemsnitlig kvadreret forskydning vs. forsinkelsestid for vimentin-netværk. Muskel- og skeletbesvær blev bestemt ved hjælp af to metoder. For det første blev MSD beregnet ud fra DDM-matrixen (vist med faste symboler). Dernæst blev MSD bestemt ved hjælp af enkeltpartikelsporing (SPT) for at finde partikelbaner (åbne symboler). Fejllinjer bestemmes på samme måde som beskrevet i de to foregående figurforklaringer. (A) Muskel- og skeletbesvær for 0,6 μm perler i 19 μM vimentinnetværket indikerer subdiffusiv bevægelse med god overensstemmelse mellem de to metoder til at finde muskel- og skeletbesvær. B) Muskel- og skeletbesvær for 0,6 μm perler i 49 μM vimentinnetværket indikerer bevægelse i bur med god overensstemmelse mellem de to metoder til at finde muskel- og skeletbesvær og med den maksimale muskel- og skeletbesvær, der findes fra nonergodicitetsparameteren. Klik her for at se en større version af denne figur.

Msd'erne vs. forsinkelsestiden for 0,6 μm perler i 19 μM vimentin-netværket og i 49 μM vimentin-netværket er vist i figur 7. I begge tilfælde stemte MSD bestemt fra DDM godt overens med MSD fundet gennem enkeltpartikelsporing (SPT). For det mindre koncentrerede netværk var den subdiffusive skaleringseksponent (α i Equation010) ca. 0,9. Dette er i overensstemmelse med τ(q)-skaleringen af Equation010 fundet ved at tilpasse ISF til at bestemme τ(q) (dvs. 2/2,2 = 0,9). For det mere koncentrerede netværk plateauer muskel- og skeletbesvær ved længere forsinkelsestider. Den maksimale MSD, der blev fundet ved at analysere q-afhængigheden af nonergodicitetsparameteren (vist i figur 7B med den vandrette linje ved δ2 = 0,0032 μm2) var omtrent den samme værdi, som MSD'erne fra både SPT og DDM syntes at plateauere mod. Der er en uoverensstemmelse mellem de længste forsinkelses-MSD'er bestemt ud fra DDM og SPT i figur 7A. Selvom dette kan skyldes et begrænset antal lange forsinkelsesbaner, kan det også være tilfældet, at yderligere optimering af rækken af q-værdier , som DDM-matrixen bruges til at estimere Equation056 for hver forsinkelsestid (som gjort af Bayles et al.76 og Edera et al.77) ville forbedre vores resultater, og en sådan optimering vil være fokus for det fremtidige arbejde.

Disse eksperimenter, hvor billedsekvenser blev registreret af sporstofperler indlejret i et netværk af vimentinmellemfilamenter, tillod uafhængige analyser: DDM (ved hjælp af pakken beskrevet her) og SPT (ved hjælp af trackpy). Begge analyser kan afsløre graden af subdiffusion og indeslutningslængde, hvilket gør det muligt for en at bruge to uafhængige billedanalyseteknikker til at give komplementære målinger. Der er yderligere mængder, man kan sammenligne fra SPT og DDM. For eksempel kan heterogenitet i prøvens dynamik afsløre sig som ikke-gaussianitet i fordelingen af partikelforskydninger (dvs. van Hove-fordelingen) bestemt ud fra SPT såvel som i en ISF bestemt ud fra DDM, der passer til en strakt eksponentiel34,35. Figur S1 viser van Hove-fordelingen for 0,6 μm partiklerne i vimentinnetværk og diskuterer den strækningseksponent, der er fundet ved at passe til ISF'erne - målinger, der er brugt sammen i tidligere undersøgelser for at demonstrere den heterogene dynamik af partikler inden for biomimetiske systemer 9,10,47 eller andre overfyldte miljøer 34 . Som et andet eksempel kan ISF beregnes ud fra partikelbaner målt med SPT og sammenlignet med de DDM-erhvervede ISF'er. Mens de gennemsnitlige kvadrerede forskydninger og forskydningsfordelinger er de målinger, der oftest trækkes fra SPT-analyse, kan man også beregne ISF fra partikelbaner Equation075ved hjælp af Equation076 (se figur S2). Denne ISF kan sammenlignes med DDM-genererede ISF'er og bruges til at afsløre dynamikker, der ikke er synlige i MSD59.

Mens erhvervelse af billeder af sporpartikler inden for et netværk kan give en mulighed for at bruge de komplementære analysemetoder for SPT og DDM, er det vigtigt at bemærke, at en fordel ved DDM i forhold til SPT er, at det ikke kræver billeder af perler (eller andre funktioner), der let kan lokaliseres og spores. For at demonstrere dette punkt fremhæver vi dernæst analysen af aktive netværk af actin- og mikrotubuliloamenter, hvor fluorescerende mærkning af actin og tubulin muliggør billeddannelse af begge filamenttyper, adskilt fra hinanden via forskellige fluorophorer, med et flerfarvet laserscanning konfokalmikroskop.

Billeder blev erhvervet med et laserscanning konfokalt mikroskop af actin-mikrotubuli netværk med aktivitet drevet af myosin (kanin skeletmuskel myosin II; Cytoskelet #MY02). Detaljer om eksperimenterne og resultaterne er tidligere beskrevet11, og de repræsentative resultater, der vises her, er fra analysen af to film, der leveres i det supplerende materiale (film S1 og S4) for11. Begge billedsekvenser blev optaget ved 2,78 billeder/s for 1000 billeder.

For at analysere disse billeder blev DDM-matrixen beregnet for 50 forsinkelsestider fra 0, 4 s til 252 s (1 ramme til 700 rammer). DDM-matrixen blev derefter tilpasset modellen Equation010, hvor den mellemliggende spredningsfunktion var Equation077. Der er derfor fire passende parametre: A, τ, s og B. Resultaterne af disse tilpasninger er vist i figur 8. Det blev observeret, at DDM-matrixen for en bestemt q-værdi havde et plateau ved lave forsinkelsestider, steg med forsinkelsestid og derefter plateauede (eller viste tegn på at begynde at plateau) ved store forsinkelsestider. DDM-matrixen for de lavere værdier af q nåede ikke et plateau ved lange forsinkelsestider. Man bør derfor forvente dårlig nøjagtighed i målingen af henfaldstiden for disse lave q (stor længde skala) dynamik.

De karakteristiske henfaldstider, τ, fra passerne til DDM-matrixen er vist i figur 9. Resultaterne præsenteres for et aktivt actin-mikrotubuluskompositnetværk (svarende til film S111) og for et aktivt actin-netværk (svarende til film S411). Begge netværk blev forberedt med de samme koncentrationer af actin og myosin, men actin-only-netværket blev oprettet uden tubulin, som beskrevet i11. For disse to typer aktive netværk var Equation010det observerede magtlovsforhold . Denne skalering indikerer ballistisk bevægelse, og at den myosindrevne sammentrækning og strømning dominerer over filamenternes termiske bevægelse. Fra τ = (vq)-1 kunne der findes en karakteristisk hastighed, v, på ca. 10 nm/s for det aktive actin-mikrotubulusnetværk og 75 nm/s for det aktive actinnetværk. Disse værdier er i overensstemmelse med partikelbilledets velocimetrianalyse af de samme videoer vist i11. Skaleringen Equation010 holdt ikke ved de lavere q-værdier for det aktive actin-mikrotubululkompositnetværk. Dette skyldes sandsynligvis, at de sande henfaldstider for dette actin-mikrotubululkompositnetværk ved de lavere q-værdier er længere end den maksimale forsinkelsestid for den beregnede DDM-matrix. Den maksimale forsinkelsestid er angivet med den vandrette røde linje i figur 9, og henfaldstiderne afveg fra den forventede Equation010 skalering nær disse længere tider.

Figure 8
Figur 8: DDM-matrix vs. forsinkelsestid for et aktivt actin-mikrotubuluskompositnetværk. DDM-matrixen for flere værdier af q afbildes som en funktion af forsinkelsestid fra en film af et sammensat netværk sammensat af 2,9 μM actinmonomerer, 2,9 μM tubulindimere og 0,24 μM myosin. Disse data viser analysen af kun mikrotubuluskanalen i en flerfarvet tidsserie af billeder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Henfaldstid vs. bølgetal for aktive actin-mikrotubulusnetværk. Fra montering af DDM-matrixen findes henfaldstiden, τ, som en funktion af bølgetal, q. Plottet er τ vs q for billeder af et aktivt actin-mikrotubulusnetværk (analyserer kun mikrotubuluskanalen) i brun og for billeder af et aktivt actin-netværk i grønt. Begge netværk har de samme koncentrationer af actin og myosin (henholdsvis 2,9 μM og 0,24 μM); actin-mikrotubuluskompositten har 2,9 μM tubulindimere. Henfaldstiderne for det aktive actin-netværk er meget mindre end henfaldstiderne for det aktive actin-mikrotubulusnetværk, hvilket indikerer hurtigere bevægelse af det aktive actin-netværk. I begge tilfælde er dynamikken ballistisk, da dataene følger en Equation010 tendens. Indsat: plottet af ISF'erne vs. forsinkelsestiden skaleret af bølgetallet (Δt × q) viser et sammenbrud af FSI'erne over en række q-værdier . Dette indikerer også ballistisk bevægelse. De ISF'er, der vises i denne indsats, er fra det aktive actin-netværk. Klik her for at se en større version af denne figur.

Til disse data fra aktive netværk valgte vi at passe til DDM-matrixen, Equation010. Dette står i kontrast til, hvad der blev gjort for data for perler i vimentinnetværket, hvor A (q) og B blev estimeret uden nogen tilpasning til at isolere ISF, f (q, Δt). I dette tilfælde blev A og B for de aktive netværksdata efterladt som passende parametre, fordi de metoder, der blev brugt til at estimere B , ikke resulterede i gode pasformer. Standardmetoden til at estimere B er at beregne Equation031 og antage, at dette i det store og hele q går til B/2. Denne metode overvurderede imidlertid B for disse data, hvilket blev set i det faktum, at ISF'erne ved beregning af FSI'erne fra B estimeret på denne måde (ikke vist) var større end 1 på tidlige forsinkelsestider (mens de skulle gå fra maksimalt 1 til enten nul eller en ikke-godicitetsparameter med stigende forsinkelsestid). Man kan vælge andre metoder til estimering af B ved hjælp af parameteren background_method. En af disse andre metoder er at estimere B til at være minimum af DDM-matrixen ved tidlige forsinkelsestider (indstillet med background_method = 1). En lignende metode blev brugt af Bayles et al.76, selvom de ikke antog, at B var konstant med q. En anden mulighed er at estimere B til at være gennemsnitsværdien over alle forsinkelsestider for DDM-matrixen ved det maksimale q (indstillet med background_method = 2). Disse forskellige metoder til estimering af baggrunden samt resultaterne for at tillade B at være en frit tilpasningsparameter er vist i figur 10. Fra disse plots kan man se, at amplituden, A, ikke nåede nul ved de største q-værdier , der blev undersøgt, da Equation031 den ikke plateau ved stor q (figur 10B), og da D (qmax, Δt) gik fra et lavere lagtidsplateau til et højere lagtidsplateau (dvs. ved qmax var der et ikke-nul A; Figur 10D). Det vil derfor hverken være hensigtsmæssigt at vurdere B som Equation082 eller som Equation083. Man bør inspicere Equation031 vs. q og D(qmax, Δt) vs. Δt, før man beslutter sig for, hvordan (eller hvis) man skal estimere B.

Figure 10
Figur 10: Baggrund vs. bølgetal for aktive actin-mikrotubulusnetværk. Fra montering af DDM-matrixen kan man finde baggrunden, B, som en funktion af bølgetal, q. Vist er B vs. q for billeder af et aktivt actin-mikrotubulusnetværk (analyserer kun mikrotubuluskanalen) bestemt ud fra disse passer med de lilla symboler. De tre faste linjer i (A) viser estimater af baggrunden fundet uden nogen montering. Den øverste, mørkeste linje i (A) viser den estimerede baggrund ved hjælp af Equation088, hvilket kan være hensigtsmæssigt, hvis Equation031 plateauer til en konstant værdi ved stort q. Fra (B), bemærk, at det Equation031 endnu ikke har nået en konstant værdi ved den største q sonderede. Derfor overvurderer denne metode baggrunden ved hjælp af denne metode. Bundlinjen i (A) viser den estimerede baggrund ved hjælp af Equation090. Hvis DDM-matrixen viser et lavt forsinkelsestidsplateau som vist i (C) med den røde linje, kan denne metode være egnet til at estimere baggrunden. Den midterste, letteste linje i (A) viser den estimerede baggrund fra Equation083. Denne metode kan være hensigtsmæssig, hvis amplituden, A, ved qmax har nået nul. Fra (D) ses det, at amplituden ikke er nul, og derfor overvurderer denne metode baggrunden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Sandsynlighedsfordelinger af partikelforskydninger. Sandsynlighedsfordelinger af partikelforskydninger viser ikke-gaussianitet for vimentinkoncentrationer på 34 μM og 49 μM. Enkeltpartikelsporing af perler med en diameter på 0,6 μm blev udført i vimentinnetværk med forskellige koncentrationer. Forskellige forsinkelsestider vises i forskydningsfordelingerne for de tre betingelser. (A) Fordelingen af partikelforskydninger i et 19 μM vimentinnetværk passer til en gaussisk funktion. Bredden af gaussianen øges med stigende forsinkelsestid. (B) Fordelingen af partikelforskydninger i et 34 μM vimentinnetværk viser mere ikke-gaussianitet, især ved store forskydninger, end for 19 μM-sagen. (C) Fordelingen af partikelforskydninger i et 49 μM vimentinnetværk viser også ikke-gaussianitet. Endvidere øges bredden af fordelingerne ikke med forsinkelsestid så signifikant som i prøverne med lavere vimentinkoncentrationer, hvilket indikerer begrænset bevægelse. Ikke-gaussiske van Hove-fordelinger (set for alle vimentinprøver, men mest tydelige i de højere koncentrationer) er forbundet med heterogen dynamik, som det ofte ses ved transport af partikler i overfyldte og lukkede miljøer. En anden indikator for heterogen transport, der bestemmes ud fra DDM-analyse, er strækningseksponenten, der bruges til at passe til den mellemliggende spredningsfunktion (parameteren s i ligningen for ISF, der anvendes her: Equation077 + Equation061). De gennemsnitlige strækningseksponenter over q-området fra 0,4 μm-1 til 9,4 μm-1 er fra højeste vimentinkoncentration til laveste 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 og 0,86 ± 0,04 (gennemsnitlig ± standardafvigelse). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: De mellemliggende spredningsfunktioner fra DDM og SPT. De mellemliggende spredningsfunktioner (ISF) for fem forskellige bølgetal vises. ISF versus forsinkelsestiden fundet gennem DDM er plottet med cirkulære markører, og ISF beregnet ud fra enkeltpartikelbaner med åbne firkanter. Stiplede sorte linjer viser pasformerne til de DDM-erhvervede ISF'er. ISF beregnes ud fra enkeltpartikelbaner, Equation075ved hjælp af Equation076. I (A) er ISF vist for 0,6 μm partikler i 19 μM vimentinnetværk. I (B) er ISF vist for 0,6 μm partikler i 34 μM vimentinnetværkene. De uoverensstemmelser i ISF, der er fundet fra DDM og SPT, skyldes sandsynligvis et begrænset antal lange forsinkelsesbaner. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Protokol til brug af DDM. Input og output af de trin, der er vist i protokollen, præsenteres. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Detaljer om prøveforberedelse og eksempelparameterfiler til vimentin-netværk. Detaljerede trin til prøveforberedelse og billedoptagelse på vimentin-netværk leveres. Derudover findes der også en eksempelparameterfil til analyse af data, der præsenteres i afsnittet om repræsentative resultater om vimentin-netværk. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den softwarepakke, der er beskrevet her, bruger DDM til at analysere tæthedsudsving observeret i billeder erhvervet ved hjælp af et optisk mikroskop. Repræsentative resultater fra data fra sporstofpartikler indlejret i vimentinnetværk blev først vist. Analysen af sådanne data kan bruges til at karakterisere netværkets maskestørrelse og stivhed på samme måde som enkeltpartikelsporing er blevet brugt i mange tidligere undersøgelser af cytoskeletnetværk 6,12,13. En fordel ved at bruge DDM frem for enkeltpartikelsporing er, at DDM ikke kræver, at partiklerne er lokaliserede. Derfor, selv i billeder, hvor partikeltætheden er for høj eller partiklerne for små til at lokalisere og spore, kan DDM stadig bestemme dynamikken. Hvor enkeltpartikelsporing ville være fordelagtig, er ved inspektion af partikel-til-partikelvariation. Med DDM finder man ensemblets gennemsnitlige dynamik, mens man med enkeltpartikelsporing kan beregne både en enkelt partikels MSD og den ensemble-gennemsnitlige MSD. DDM kan dog bruges til at undersøge heterogen dynamik ved at analysere flere regioner af interesse inden for et stort synsfelt.

Dernæst blev der vist repræsentative resultater fra data fra fluorescerende mærkede filamenter i et aktivt netværk sammensat af to forskelligt mærkede cytoskeletale filamenttyper11. Med disse data blev den ballistiske bevægelse karakteriseret uden behov for lokaliserede funktioner i billedet. Da DDM udtrækker ensemblets gennemsnitlige dynamik med få brugerinput, gør det sammenligning af billedserier erhvervet med forskellige forhold ligetil (f.eks. Sammenligning af prøver med forskellige forhold mellem actin og mikrotubuli eller prøver med forskellige koncentrationer af myosin, som gjort i50). Derudover kan vi ved hjælp af fluorescerende billeddannelse undersøge dynamikken i forskellige komponenter i et netværk ved hjælp af flerfarvet mærkning. Dette blev gjort i 11,50, hvor dynamikken i actin og mikrotubuli blev analyseret separat i et aktivt actin-mikrotubuluskompositnetværk ved hjælp af flerfarvet billeddannelse. I afsnittet om repræsentative resultater her blev kun resultaterne fra mikrotubuluskanalen vist, men i tidligere arbejde sammenlignede vi dynamikken i mikrotubulus- og actinfilamenterne11.

Vi bemærker, at disse repræsentative resultater viser enten passiv subdiffusion eller aktiv ballistisk bevægelse. Det er vigtigt, at DDM kan bruges til at analysere systemer, hvor der er en crossover i typen af dynamik på mellemtids- eller længdeskalaer. Som eksempler brugte Kurzthaler et al. DDM med et system af aktive Janus-kolloider til at udforske aktiv rettet bevægelse på korte tidsskalaer og randomisering af orienteringen på længere tidsskalaer59; Giavazzi et al. brugte DDM med et grovskum og fandt en crossover i dynamikken svarende til længdeskalaen for en boble33; og Cho et al. brugte DDM med kolloide geler og fandt tre skelnelige regimer i forskellige længdeskalaer, der spænder fra fraktalklyngerne til hele netværket32.

Dataene i afsnittet om repræsentative resultater blev erhvervet med brightfieldmikroskopi og laserscanning konfokal mikroskopi. Som tidligere nævnt kan DDM imidlertid bruges med mange billeddannelsesmetoder. Med enhver billedbehandlingsmodalitet bør brugerne overveje optiske indstillinger såsom graden af optisk sektionering eller dybdeskarpheden. En høj grad af optisk sektionering kan reducere signalet fra objekter, der er ude af fokus, men man vil ikke være i stand til nøjagtigt at måle dynamik over tidsskalaer, der er større end tidsskalaen for objekter til at bevæge sig ud af dybdeskarpheden25,28. En mere grundig diskussion af, hvordan den q-afhængige dybdeskarphed påvirker DDM-analysen, findes i22. Til brightfield-billeddannelse skal brugerne muligvis også overveje prøvetykkelsen. Mens tykkere prøver for svagt spredte prøver kan give mere signal42, kan uklare prøver kræve ændring af analysen for at tage højde for flere spredning81. Endelig skal man for billeddannelsesmetoder, der ikke er lineære ruminvariante (det vil sige, hvor intensiteten optaget af kameraet af et objekt afhænger af, hvor objektet er i x-y-prøveplanet), muligvis tage højde for den lineære rumvarians, som demonstreret med mørkfelt DDM27.

For dem, der kommer i gang med DDM, ønsker vi at understrege vigtigheden af at overveje den rumlige og tidsmæssige opløsning. Når man inspicerer de bestemte henfaldstider som funktion af bølgetal, er det vigtigt at markere grænserne for ens opløsning (dvs. de maksimale og minimale forsinkelsestider og det maksimale bølgetal, som gjort i figur 5). Man bør tænke nøje over disse grænser, inden man indsamler data, så den optimale objektive linse, billedstørrelse, billedhastighed og filmvarighed kan vælges. Den anden vigtige overvejelse er, hvordan man estimerer baggrundsparameteren B. Der er anvendt flere metoder til at estimere baggrunden i litteraturen, og virkningerne af at over- eller undervurdere B er beskrevet i tidligere publikationer62,77. Som vist i figur 10 giver PyDDM brugerne mulighed for at implementere forskellige metoder til estimering af B, og vi foreslår, at nye brugere prøver disse metoder og evaluerer, hvilke der er passende at bruge.

En styrke ved denne pakke er dens grundige dokumentation og gennemgange med eksempeldata, lagring og organisering af metadata for at holde styr på, hvordan analyser blev udført, og fleksibiliteten i, hvordan man analyserer DDM-matrixen (forskellige tilpasningsmodeller, flere metoder til estimering af baggrundsparameteren B, evnen til at finde MSD). Der er dog flere aspekter af denne kode, der kan forbedres. I øjeblikket er koden ikke optimeret til hurtig beregningshastighed. Metoder til at fremskynde beregningen er blevet rapporteret61,62, og disse vil blive implementeret i fremtidige udgivelser. Derudover planlægger vi at implementere nyligt rapporterede metoder til bedre at estimere usikkerheder og anvende simuleringer til at guide brugerne til den relevante ISF-model62. For andre forbedringer håber vi, at brugerne vil kontakte os med forslag.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dele af denne forskning blev finansieret af en National Institutes of Health R15 Award (National Institute of General Medical Sciences award nr. R15GM123420, tildelt R.M.R.-A. og R.J.M.), en Cottrell Scholar Award fra Research Corporation for Science Advancement (pris nr. 27459, tildelt R.J.M.) og et William M. Keck Foundation Research Grant (tildelt R.M.R-A.). GHK anerkender taknemmeligt økonomisk støtte fra det hollandske forskningsråd (NWO; projektnummer VI.C.182.004 i NWO Talent Programme).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 Hamatsu
F-127 Pluronic Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop Thermo Fisher
Nikon Ti-Eclipse microscope Nikon
PLL-PEG-bio SuSos AG, Dübendorf, Switzerland
Polystyrene beads Sigma Aldrich
Protein dialysis mini-cassette Thermo Fisher
PyDDM University of San Diego N/A Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).
  2. Amblard, F., Maggs, A. C., Yurke, B., Pargellis, A. N., Leibler, S. Subdiffusion and anomalous local viscoelasticity in actin networks. Physical Review Letters. 77 (21), 4470-4473 (1996).
  3. Mizuno, D., Tardin, C., Schmidt, C. F., MacKintosh, F. C. Nonequilibrium mechanics of active cytoskeletal networks. Science. 315 (5810), 370-373 (2007).
  4. Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).
  5. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Physical Review Letters. 102 (18), 188303 (2009).
  6. Stuhrmann, B., Soares e Silva, M., Depken, M., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Nonequilibrium fluctuations of a remodeling in vitro cytoskeleton. Physical Review E. 86 (2), 020901 (2012).
  7. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  8. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  9. Anderson, S. J. et al. Filament rigidity vies with mesh size in determining anomalous diffusion in cytoskeleton. Biomacromolecules. 20 (12),4380-4388 (2019).
  10. Anderson, S. J., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  11. Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).
  12. Wong, I. Y. et al. Anomalous diffusion probes microstructure dynamics of entangled F-actin networks. Physical Review Letters. 92 (17), 178101 (2004).
  13. Köster, S., Lin, Y.-C., Herrmann, H., Weitz, D. A. Nanomechanics of vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 6 (9), 1910-1914 (2010).
  14. Chandrakar, P. et al. Engineering stability, longevity, and miscibility of microtubule-based active fluids. Soft Matter. 18 (9), 1852-1835 (2022).
  15. Alvarado, J., Cipelletti, L., H. Koenderink, G. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).
  16. Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
  17. Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).
  18. Malik-Garbi, M. et al. Scaling behaviour in steady-state contracting actomyosin networks. Nature Physics. 15 (5), 509-516 (2019).
  19. Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (5), e2115895119 (2022).
  20. Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., Nédélec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e714 (2018).
  21. Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).
  22. Giavazzi, F., Brogioli, D., Trappe, V., Bellini, T., Cerbino, R. Scattering information obtained by optical microscopy: differential dynamic microscopy and beyond. Physical Review E. 80 (3), 031403 (2009).
  23. Giavazzi, F., Cerbino, R. Digital Fourier microscopy for soft matter dynamics. Journal of Optics. 16 (8), 083001 (2014).
  24. He, K., Spannuth, M., Conrad, J. C., Krishnamoorti, R. Diffusive dynamics of nanoparticles in aqueous dispersions. Soft Matter. 8 (47), 11933-11938 (2012).
  25. Lu, P. J. et al. Characterizing concentrated, multiply scattering, and actively driven fluorescent systems with confocal differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 108 (21), 218103 (2012).
  26. Giavazzi, F. et al. Viscoelasticity of nematic liquid crystals at a glance. Soft Matter. 10 (22), 3938-3949 (2014).
  27. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Dark-field differential dynamic microscopy. Soft Matter. 12 (8), 2440-2452 (2016).
  28. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. Light-sheet microscopy with digital Fourier analysis measures transport properties over large field-of-view. Optics Express. 24 (18), 20881-20894 (2016).
  29. Richards, J. A., Martinez, V. A., Arlt, J. Particle sizing for flowing colloidal suspensions using flow-differential dynamic microscopy. Soft Matter. 17 (14), 3945-3953 (2021).
  30. Ferri, F. et al. Kinetics of colloidal fractal aggregation by differential dynamic microscopy. The European Physical Journal Special Topics. 199 (1), 139-148 (2011).
  31. Lanfranco, R. et al. Adaptable DNA interactions regulate surface triggered self assembly. Nanoscale. 12 (36), 18616-18620 (2020).
  32. Cho, J. H., Cerbino, R., Bischofberger, I. Emergence of multiscale dynamics in colloidal gels. Physical Review Letters. 124 (8), 088005 (2020).
  33. Giavazzi, F., Trappe, V., Cerbino, R. Multiple dynamic regimes in a coarsening foam. Journal of Physics: Condensed Matter. 33 (2), 024002 (2020).
  34. He, K. et al. Diffusive dynamics of nanoparticles in arrays of nanoposts. ACS Nano. 7 (6), 5122-5130 (2013).
  35. Jacob, J. D. C., He, K., Retterer, S. T., Krishnamoorti, R., Conrad, J. C. Diffusive dynamics of nanoparticles in ultra-confined media. Soft Matter. 11 (38), 7515-7524 (2015).
  36. Sentjabrskaja, T. et al. Anomalous dynamics of intruders in a crowded environment of mobile obstacles. Nature Communications. 7, 11133 (2016).
  37. Hitimana, E., Roopnarine, B. K., Morozova, S. Diffusive dynamics of charged nanoparticles in convex lens-induced confinement. Soft Matter. 18 (4), 832-840 (2022).
  38. Wilson, L. G. et al. Differential dynamic microscopy of bacterial motility. Physical Review Letters. 106 (1), 018101 (2011).
  39. Martinez, V. A. et al. Differential dynamic microscopy: a high-throughput method for characterizing the motility of microorganisms. Biophysical Journal. 103 (8), 1637-1647 (2012).
  40. Germain, D., Leocmach, M., Gibaud, T. Differential dynamic microscopy to characterize Brownian motion and bacteria motility. American Journal of Physics. 84 (3), 202-210 (2016).
  41. Croze, O. A. et al. Helical and oscillatory microswimmer motility statistics from differential dynamic microscopy. New Journal of Physics. 21 (6), 063012 (2019).
  42. Safari, M. S., Vorontsova, M. A., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of weakly scattering and polydisperse protein-rich clusters. Physical Review E. 92 (4), 042712 (2015).
  43. Wang, J., McGorty, R. Measuring capillary wave dynamics using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 15 (37), 7412-7419 (2019).
  44. Cerbino, R., Giavazzi, F., Helgeson, M. E. Differential dynamic microscopy for the characterization of polymer systems. Journal of Polymer Science. 60 (7), 1079-1089 (2021).
  45. Cerbino, R., Cicuta, P. Perspective: differential dynamic microscopy extracts multi-scale activity in complex fluids and biological systems. The Journal of Chemical Physics. 147 (11), 110901 (2017).
  46. Drechsler, M., Giavazzi, F., Cerbino, R., Palacios, I. M. Active diffusion and advection in Drosophila oocytes result from the interplay of actin and microtubules. Nature Communications. 8 (1), 1-11 (2017).
  47. Burla, F., Sentjabrskaja, T., Pletikapic, G., Beugen, J. v., H. Koenderink, G. Particle diffusion in extracellular hydrogels. Soft Matter. 16 (5), 1366-1376 (2020).
  48. Regan, K., Wulstein, D., Rasmussen, H., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. M. Bridging the spatiotemporal scales of macromolecular transport in crowded biomimetic systems. Soft Matter. 15 (6), 1200-1209 (2019).
  49. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).
  50. Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).
  51. Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv:2112.11260 .(2021).
  52. Chen, X. et al. Coaxial differential dynamic microscopy for measurement of Brownian motion in weak optical field. Optics Express. 26 (24), 32083-32090 (2018).
  53. Reufer, M., Martinez, V. A., Schurtenberger, P., Poon, W. C. K. Differential dynamic microscopy for anisotropic colloidal dynamics. Langmuir. 28 (10), 4618-4624 (2012).
  54. Giavazzi, F., Haro-Pérez, C., Cerbino, R. Simultaneous characterization of rotational and translational diffusion of optically anisotropic particles by optical microscopy. Journal of Physics: Condensed Matter. 28 (19), 195201 (2016).
  55. Cerbino, R., Piotti, D., Buscaglia, M., Giavazzi, F. Dark field differential dynamic microscopy enables accurate characterization of the roto-translational dynamics of bacteria and colloidal clusters. Journal of Physics: Condensed Matter. 30 (2), 025901 (2017).
  56. Safari, M. S., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of bidisperse colloidal suspensions. npj Microgravity. 3 (1), 21 (2017).
  57. Giavazzi, F., Pal, A., Cerbino, R. Probing roto-translational diffusion of small anisotropic colloidal particles with a bright-field microscope. The European Physical Journal E. 44 (4), 61 (2021).
  58. Schwarz-Linek, J. et al. Escherichia coli as a model active colloid: a practical introduction. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 137, 2-16 (2016).
  59. Kurzthaler, C. et al. Probing the spatiotemporal dynamics of catalytic Janus particles with single-particle tracking and differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
  60. Mandal, S., Kurzthaler, C., Franosch, T., Löwen, H. Crowding-enhanced diffusion: an exact theory for highly entangled self-propelled stiff filaments. Physical Review Letters. 125 (13), 138002 (2020).
  61. Norouzisadeh, M., Chraga, M., Cerchiari, G., Croccolo, F. The modern structurator: increased performance for calculating the structure function. The European Physical Journal E. 44 (12), 146 (2021).
  62. Gu, M., Luo, Y., He, Y., Helgeson, M. E., Valentine, M. T. Uncertainty quantification and estimation in differential dynamic microscopy. Physical Review E. 104 (3), 034610 (2021).
  63. Hoyer, S., Hamman, J. xarray: N-D labeled arrays and datasets in Python. Journal of Open Research Software. 5 (1), 10 (2017).
  64. Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. Stiffening and inelastic fluidization in vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 15 (36), 7127-7136 (2019).
  65. Guo, M. et al. The role of vimentin intermediate filaments in cortical and cytoplasmic mechanics. Biophysical Journal. 105 (7), 1562-1568 (2013).
  66. Lavenus, S. B., Tudor, S. M., Ullo, M. F., Vosatka, K. W., Logue, J. S. A flexible network of vimentin intermediate filaments promotes migration of amoeboid cancer cells through confined environments. Journal of Biological Chemistry. 295 (19), 6700-6709 (2020).
  67. Patteson, A. E. et al. Loss of vimentin enhances cell motility through small confining spaces. Small. 15 (50), 1903180 (2019).
  68. Lin, Y.-C. et al. Origins of elasticity in intermediate filament networks. Physical Review Letters. 104 (5), 058101 (2010).
  69. Pawelzyk, P., Mücke, N., Herrmann, H., Willenbacher, N. Attractive interactions among intermediate filaments determine network mechanics in vitro. PLOS ONE. 9 (4), e93194 (2014).
  70. Schepers, A. V. et al. Multiscale mechanics and temporal evolution of vimentin intermediate filament networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (27), e2102026118 (2021).
  71. Wu, H. et al. Effect of divalent cations on the structure and mechanics of vimentin intermediate filaments. Biophysical Journal. 119 (1), 55-64 (2020).
  72. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  73. Giavazzi, F., Malinverno, C., Scita, G., Cerbino, R. Tracking-free determination of single-cell displacements and division rates in confluent monolayers. Frontiers in Physics. 6, 120 (2018).
  74. Cho, J. H. Multiscale Probing of Colloidal Gelation Dynamics., Massachusetts Institute of Technology (2018).
  75. Krall, A. H., Weitz, D. A. Internal dynamics and elasticity of fractal colloidal gels. Physical Review Letters. 80 (4), 778-781 (1998).
  76. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Probe microrheology without particle tracking by differential dynamic microscopy. Rheologica Acta. 56 (11), 863-869 (2017).
  77. Edera, P., Bergamini, D., Trappe, V., Giavazzi, F., Cerbino, R. Differential dynamic microscopy microrheology of soft materials: a tracking-free determination of the frequency-dependent loss and storage moduli. Physical Review Materials. 1 (7), 073804 (2017).
  78. Wang, B., Kuo, J., Bae, S. C., Granick, S. When Brownian diffusion is not Gaussian. Nature Materials. 11 (6), 481-485 (2012).
  79. soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0. Zenodo (2021).
  80. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
  81. Nixon-Luke, R., Arlt, J., Poon, W. C. K., Bryant, G., Martinez, V. A. Probing the dynamics of turbid colloidal suspensions using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 18 (9), 1856-1867 (2022).

Tags

Bioengineering udgave 184
Kvantificering af cytoskeletdynamik ved hjælp af differentiel dynamisk mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G.,… More

Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G., Petitjean, I. I., Koenderink, G. H., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. J. Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63931, doi:10.3791/63931 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter