Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kvantifisere Cytoskeleton-dynamikken ved hjelp av differensial dynamisk mikroskopi

Published: June 15, 2022 doi: 10.3791/63931
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 2, 2
1Cell Biology, Neurobiology and Biophysics, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 2Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

Summary

Differensial dynamisk mikroskopi (DDM) kombinerer egenskaper ved dynamisk lysspredning og mikroskopi. Her presenteres prosessen med å bruke DDM til å karakterisere rekonstituerte cytoskjelettnettverk ved å kvantifisere den subdiffusive og burede dynamikken av partikler i vimentinnettverk og den ballistiske bevegelsen av aktive myosindrevne aktin-mikrotubule kompositter.

Abstract

Celler kan krype, helbrede seg selv og justere stivheten på grunn av deres bemerkelsesverdig dynamiske cytoskjelett. Som sådan kan rekonstituering av nettverk av cytoskeletal biopolymerer føre til en rekke aktive og tilpasningsdyktige materialer. Imidlertid krever prosjektering av slike materialer med nøyaktig innstilte egenskaper å måle hvordan dynamikken avhenger av nettverkssammensetningen og syntesemetodene. Kvantifisering av slik dynamikk utfordres av variasjoner på tvers av tid, rom og formuleringsrom for sammensatte nettverk. Protokollen her beskriver hvordan Fourier-analyseteknikken, differensial dynamisk mikroskopi (DDM), kan kvantifisere dynamikken i biopolymernettverk og er spesielt godt egnet for studier av cytoskjelettnettverk. DDM arbeider med tidssekvenser av bilder som er anskaffet ved hjelp av en rekke mikroskopimodaliteter, inkludert laserskanning konfokal, widefield fluorescens og brightfield-avbildning. Fra slike bildesekvenser kan man trekke ut karakteristiske dekorasjonstider for tetthetssvingninger over et spenn av bølgevektorer. En brukervennlig Python-pakke med åpen kildekode for å utføre DDM-analyse er også utviklet. Med denne pakken kan man måle dynamikken i merkede cytoskjelettkomponenter eller innebygde tracerpartikler, som vist her med data fra mellomliggende filamentnettverk (vimentin) og aktive actin-microtubule-nettverk. Brukere uten tidligere programmerings- eller bildebehandlingserfaring vil kunne utføre DDM ved hjelp av denne programvarepakken og tilhørende dokumentasjon.

Introduction

Cytoskjelettet er et nettverk av proteinfilamenter som spenner over cytoplasma av eukaryote celler, og forbinder celleoverflaten med kjernen. Den har unike materialegenskaper, noe som gir mekanisk beskyttelse mot store og gjentatte mekaniske belastninger, men driver også dynamisk celleformendringer1. Rekonstituerte cytoskjelettnettverk kan gi opphav til en rekke interessante dynamiske atferd, fra kaging av innebygde partikler til ballistisk bevegelse drevet av molekylære motorer 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Metoder for å analysere dynamikken i slike nettverk inkluderer sporing av bevegelsen til innebygde tracermikrosfærer 6,7,12,13,14, bildeanalyse for å spore størrelsen på protein-tette klynger over tid8, dynamisk lysspredning15, partikkelbilde velocimetry 4,16,17,18,19 , beregne kraftspektral tettheten til bilder over tid19 og kymografianalyse20. Etter hvert som flere studier på rekonstituerte cytoskjelettnettverk utføres, blir det stadig mer nødvendig å forstå cellulær mekanikk eller aktiv materie, robuste, objektive og reproduserbare metoder for å karakterisere dynamikken. Differensial dynamisk mikroskopi (DDM)21,22, en relativt ny teknikk som har blitt brukt til å studere cytoskjelettdynamikk, er en slik teknikk som effektivt kvantifiserer dynamikken med få brukerdefinerte parametere. Med programvarepakken som er beskrevet her, vil forskere med liten erfaring innen programmering eller bildeanalyse kunne utnytte DDM for sitt eget arbeid.

DDM er en bildeanalyseteknikk for å trekke ut et utvalgsdynamikk. I likhet med partikkelsporing eller partikkelbildehastighet krever DDM en tidsserie med bilder (ofte tusenvis av bilder), vanligvis tatt opp med et mikroskop. I motsetning til partikkelsporing trenger ikke individuelle funksjoner eller tracerperler å lokaliseres (eller til og med være lokalisert) i bildet. I motsetning til både partikkelsporing og partikkelbildehastighet, gjenoppretter man ensembledynamikken med DDM med relativt få brukerspesifiserte parametere. Med DDM analyseres bilder i Fourier-rommet for å bestemme forfallstiden for tetthetssvingninger over en rekke bølgetall, q, hvor q = 2πu, og u er størrelsen på de romlige frekvensene, Equation004. Man får spredningslignende informasjon, men med bilder fra det virkelige rommet ervervet på et mikroskop 21,22,23. Derfor kan man dra nytte av de forskjellige kontrastgenererende metodene for mikroskopi, for eksempel widefield fluorescens22,24, konfomisk fluorescens25, polarisert26, mørkfelt27 eller lysarkfluorescens28 mikroskopier. Videre kan bilder som brukes til DDM-analyse brukes til partikkelsporing eller partikkelbildehastighet for å gi komplementær informasjon.

Denne kombinasjonen av funksjoner fra dynamisk lysspredning og optisk mikroskopi gjør DDM til en kraftig og allsidig teknikk. Siden den første beskrivelsen av Cerbino og Trappe i 200821, der DDM ble demonstrert for å måle diffusjonen av 73 nm kolloidale partikler, har DDM blitt brukt til å måle flytende kolloider29, kolloidal aggregering30,31, viskoelastisiteten til nematiske væskekrystaller26, dynamikken i kolloidale geler32, grove skum33, nanopartikler i trange miljøer34, 35,36,37, bakteriell bevegelighet 38,39,40,41, diffusjon av svakt spredning protein klynger 42, kapillære bølger ved flytende grensesnitt43, og andre systemer. De som leter etter en mer fullstendig liste over publikasjoner som bruker DDM, kan se grundige gjennomgangsartikler om emnet 22,23,44,45.

DDM har også blitt brukt til å undersøke dynamikken i biologiske nettverk. Drechsler et al. brukte DDM til å måle dynamikken i aktin i levende Drosophila oocytter46. Burla et al. kvantifiserte dynamikken i sporstoffpartikler i nettverk av hyaluronan og hyaluronan-kollagenkompositter47. Flere bruksområder for DDM for å studere dynamikken i sporstoffpartikler i rekonstituerte cytoskjelettnettverk 9,10, transport av DNA-molekyler i slike nettverk48,49, og dynamikken i aktive rekonstituerte nettverk har også blitt dokumentert 11,50,51. En fordel med DDM i å måle dynamikken i slike systemer er at individuelle partikler eller molekyler ikke trenger å lokaliseres og spores. Så for eksempel kan dynamikken i DNA-molekyler i overfylte miljøer måles med DDM til tross for vanskeligheten med å spore slike små og ikke-sfæriske molekyler. Videre, med fluorescensmikroskopi, kan man bruke flerfarget merking for å selektivt måle dynamikken til individuelle bestanddeler i en kompleks kompositt.

For å utføre DDM blir en sekvens av bilder tatt over tid, I (x, y, t). For en gitt oppholdstid blir Δt, alle (eller et delsett av) par med bilder atskilt med denne oppholdstiden funnet. Den kvadrert Fourier-transformasjonen av forskjellen i hvert par,

Equation007

beregnes og beregnes sammen. Denne mengden, Equation008, er radialt gjennomsnittet, forutsatt at dynamikken er isotropisk. Dette gir DDM-matrisen (også kalt bildestrukturfunksjonen), Equation009. Denne prosessen vises grafisk i figur 1. For å bestemme utvalgets dynamikk fra denne DDM-matrisen antas DDM-matrisen å ta skjemaet

Equation010

hvor A er amplituden, som avhenger av detaljene i mikroskopet og strukturen til prøven, B er bakgrunnen, som avhenger av støyen i bildene, og f (q, Δt) er mellomliggende spredningsfunksjon (ISF), som inneholder informasjon om dynamikken21,22. I enkle tilfeller

Equation014

der τ er en karakteristisk forfalls- eller dekorasjonstid. En slik ISF har blitt brukt i flere studier som benytter DDM på ergodiske systemer som fortynnede kolloidale suspensjoner 21,24,27,37,40,52. Andre former for ISF kan imidlertid brukes til å modellere ulike typer dynamikk. Man kan for eksempel bruke en kumulantutvidelse til å modellere ISF for polydisperseprøver som

Equation016

hvor μ er et mål på polydispersiteten42,53; hvis tetthetssvingninger forfaller med to separate moduser, kan man bruke en ISF-lignende

Equation01826, 54, 55, 56, 57;

andre ISF-er kan brukes til svømming av mikroorganismer eller andre aktive partikler 38,39,40,41,58,59.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over DDM-analyse. Fra tidsserien med bilder beregnes Fourier-transformeringen av bildeforskjeller for å beregne DDM-matrisen. DDM-matrisen kan tilpasses en modell for å bestemme tidsskalaen for tetthetssvingninger på tvers av en rekke q-verdier . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Her beskrives bruken av en DDM-analyseprogramvarepakke utviklet i Python, PyDDM. Denne programvarepakken bygger på arbeidet som er gjort av våre forskningslaboratorier og andre publiserte studier de siste årene. Primære motivatorer for å lage denne programvarepakken inkluderer behovet for (1) å holde oversikt over og lagre metadata og parametere som brukes i analysen; (2) grundig dokumentasjon med detaljerte eksempler på analyse fra start til slutt; og (3) en enkel måte å bruke forskjellige (eller lage nye) matematiske modeller for å tilpasse dataene (f.eks. å legge til ISF-modeller, for eksempel de som nylig er utviklet for aktive filamenter60, ville være enkle). Andre programvarepakker for DDM-analyse eksisterer også, men ikke alle er godt dokumentert og skrevet i et åpen kildekode-programmeringsspråk. Det finnes for eksempel C++-kode med databehandling på GPU-er (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, C++-kode som bruker Fourier-transformeringer i tide for å øke hastigheten på beregninger (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61-, MATLAB- og Python-versjoner (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, MATLAB-kode (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 og MATLAB-kode med usikkerhets kvantifisering ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Siden denne PyDDM-pakken er godt dokumentert og gir mye fleksibilitet i hvordan DDM-matrisen beregnes og analyseres, kan den forhåpentligvis være nyttig for forskere som ønsker å implementere DDM uavhengig av bakgrunn i programmering eller bildeanalyse.

Protokollen viser hvordan denne programvarepakken kan brukes til å kvantifisere dynamikken i in vitro rekonstituerte cytoskeletonnettverk. Dette gjøres ved hjelp av to forskjellige sett med bildedata: (1) bilder av submikronsporerpartikler innebygd i et vimentinnettverk tatt med brightfield-mikroskopi og (2) bilder av fluorescerende merket aktin- og mikrotubulfilamenter i et innviklet komposittnettverk med myosindrevet aktivitet tatt med laserskanning konfokal mikroskopi. Analysene av disse to datasettene fremhever bemerkelsesverdige styrker av DDM, inkludert dens evne til å analysere bilder tatt med en rekke bildemodaliteter (f.eks. brightfield eller confocal fluorescence), for å trekke ut dynamikk fra enten innebygde sporstoffer eller fra merkede filamenter, og for å kvantifisere en rekke dynamikker (f.eks. subdiffusive og begrensede eller ballistiske).

Protocol

MERK: En Jupyter Notebook-fil som inneholder koden som skal følges med hvert trinn i følgende protokoll, finner du på følgende GitHub-repositorium, https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. En PDF-fil av denne filen er inkludert i tilleggsfil 1. I tillegg finner du en gjennomgang av koden og dokumentasjonen for hver funksjon og klasse på nettstedet, https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.

1. Programvareinstallasjon

  1. Hvis du vil følge med på eksemplet DDM-analysefiler, installerer du Jupyter Notebook for å kjøre koden. Installer andre nødvendige vanlige Python-pakker, inkludert NumPy og Matplotlib også. Disse pakkene leveres alle sammen med Anaconda-distribusjonen (se https://www.anaconda.com/products/individual).
  2. Installer Python-pakken xarray63. Denne pakken er nødvendig for å organisere og lagre metadata og analyseparametere. Hvis du bruker Anaconda-distribusjonen, installerer du xarray (sammen med de anbefalte avhengighetene) ved hjelp av kommandoen:
    conda installere -c conda-smi xarray dask netCDF4 flaskehals
  3. Installer PyYAML-pakken ved hjelp av kommandoen:
    conda installere -c anaconda yaml
    Denne pakken er nødvendig for å lese metadata om bildene som skal analyseres og parametrene som er angitt av brukeren for analyse og tilpasning.
  4. Installer PyDDM-pakken ved å laste ned fra GitHub-repositoriet eller bruke git-kommandoen:
    git klone https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git

2. Planlegge bildebehandlingsøktene

  1. Velg optimal tilgjengelig bildemodalitet og optiske innstillinger. Som nevnt kan DDM brukes med en rekke mikroskopimetoder.
  2. For å hjelpe til med å planlegge riktig objektiv og bildestørrelse som skal brukes, må du bestemme rekkevidden av bølgetall, q, som skal undersøkes basert på pikselstørrelsen og den totale bildestørrelsen. Bekreft at valget av forstørrelse og synsfelt er optimalt for eksperimentet, basert på disse beregningene. For bildene som ble analysert her, ble et mål på 60x 1,4 NA og en bildestørrelse på 256 x 256 piksler med en pikselstørrelse på 0,83 μm brukt til det aktive aktinmikrotubule sammensatte nettverket. For bilder av perler innebygd i et vimentinnettverk ble det brukt et mål på 100x 1,4 NA og en bildestørrelse på 512 x 512 piksler med en pikselstørrelse på 0,13 μm.
    MERK: Minimum q angis med 2π/NΔx, der bildestørrelsen (antas å være kvadratisk) er N × N piksler med en pikselstørrelse på Δx. Maksimum q er minimum π/Δx og 2π NA/λ, hvor NA er bildemålets numeriske blenderåpning, og λ er lysbølgelengden (for brightfield-avbildning kan man erstatte NA med (NA-objektiv +NA-kondensator)/2).
  3. Deretter bør du vurdere omfanget av tidsskalaer som skal undersøkes. Vanligvis gjøres DDM-analyse på sekvenser på minst 1000 rammer.
    1. For å bestemme riktig bildefrekvens, bør du vurdere forventet tid det vil ta for funksjoner i prøven å flytte en avstand på rekkefølgen til den minste løsbare lengdeskalaen (tilsvarende maksimum q).
    2. Når du vurderer den øvre grensen for tidsskalaene som er undersøkt, må du erkjenne at kraftspekteret av hundrevis av bildeforskjeller i en gitt oppholdstid Δt er gjennomsnittet sammen for å gi tilstrekkelig statistikk for å redusere støy. Hent derfor bildesekvenser som er lengre enn den maksimale tidsskalaen som er undersøkt.
      MERK: Hvis en forventet diffusjonskoeffisient, D eller hastighet, v, er kjent, kan man estimere forventede karakteristiske forfallstider ved hjelp av τ = 1/Dq2 eller τ = 1/vq sammen med q-området, som ble bestemt basert på synsfelt og pikselstørrelse. Utvalget av forventede τ-verdier over det tilgjengelige q-området kan hjelpe deg med å styre valget av bildefrekvens og antall rammer som skal hentes.

3. Prøveforberedelse og bildeanskaffelse

MERK: For detaljer om prøveforberedelses- og bildeinnstillingene som brukes for dataene som presenteres i delen for representative resultater, se tidligere publikasjoner fra forfatterne 11,51,64 og Supplementary File 2.

  1. Basert på hensynet til tids- og lengdeskalaene for å sondere, må du skaffe bildesekvenser av ideelt sett over 1000 bilder.
    MERK: Koden analyserer firkantede bilder eller firkantede interesseområder i bildet, så juster rammestørrelsen tilsvarende.
  2. Lagre bildesekvenser som en tredimensjonal TIFF-stakk i gråtoner. Alternativt kan formatet som brukes av Nikon Instruments-systemer, ND2-format, leses av den installerte pakken. Hvis bilder lagres i et annet format, bruker du ImageJ eller et annet bildebehandlingsprogram til å konvertere bildene til en TIFF-stakk.
    MERK: Hvis du bruker ND2-filer, må pakningsleseren fra https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader være installert.

4. Parameteroppsett

  1. Lag en kopi av parameterfilen example_parameter_file.yml som finnes i PyDDM-koderepositoriet under eksempelmappen. Åpne denne YAML-filen med et tekstredigeringsprogram som NotePad ++ eller tekstredigereren i JupyterLab. Se Tilleggsfil 2 for eksempel YAML-parameterfil som brukes i analysen av data presentert i delen representative resultater.
  2. I den kopierte YAML-filen oppgir du datakatalogen og filnavnet som tilsvarer bildesekvensen som skal analyseres. Angi pikselstørrelsen og bildefrekvensen under metadatadelen.
  3. Under Analysis_parameters-delen gir du detaljer om hvordan DDM-matrisen skal beregnes. Noen parametere her er valgfrie.
    1. Som et minimum angir du verdier for parameterne number_lag_times og last_lag_time. Disse tilsvarer antall forskjellige oppholdstider som DDM-matrisen skal beregnes for, og den lengste oppholdstiden (i rammer) som skal brukes. For dataene til tracerperler i vimentinnettverk som brukes her, var parametrene number_lag_times og last_lag_time henholdsvis 60 og 1000. Koden beregner DDM-matrisen for oppholdstider fra 1 bilde (eller en annen minimum oppholdstid hvis den valgfrie parameteren first_lag_time er angitt) til last_lag_time med logaritmisk avstand.
      MERK: Hvis M-rammene ble anskaffet, kunne man beregne DDM-matrisen for en oppholdstid så stor som M-1. Men med dårlig statistikk på så stor oppholdstid, vil dataene sannsynligvis være støyende. Den lengste oppholdstiden for å beregne DDM-matrisen vil avhenge av detaljene i dataene, men vi foreslår at du prøver rundt en tredjedel av den totale bildeserievarigheten.
  4. Angi detaljer for hvordan DDM-matrisen eller den mellomliggende spredningsfunksjonen (ISF) skal passe i Fitting_parameters delen. Gi navnet på modellen under modellparameteren. Angi den første gjetningen, nedre grensen og den øvre grensen for hver av tilpasningsparameterne i den valgte modellen.
    MERK: For å vise en liste over mulige monteringsmodeller, kjør funksjonen print_fitting_models. Modellene finnes også i den elektroniske dokumentasjonen på PyDDM-nettstedet.

5. Beregne DDM-matrisen

  1. Initialiser en forekomst av den DDM_Analysis klassen. For å gjøre dette, oppgi metadata- og analyseparameterne som er diskutert ovenfor ved å sende filnavnet, med den fullstendige filbanen inkludert, av YAML-filen til DDM_Analysis. Alternativt kan du sende metadataene og parameterne som en Python-ordbokdatastruktur.
  2. Kjør funksjonen calculate_DDM_matrix for å beregne DDM-matrisen. Denne beregningen kan ta flere minutter eller mer, avhengig av rammestørrelsen og antall oppholdstider. Se figur 2 for vanlige kjøretider.
  3. Undersøk de returnerte dataene, som vil være i en datastruktur fra xarray-pakken kjent som et datasett. Denne datastrukturen lagres under attributtet ddm_dataset.
    MERK: Ikke bare DDM-matrisen, men også tilknyttede variabler og metadata vil bli lagret i denne datastrukturen. Den vil også bli lagret på disk i et NetCDF-format (Network Common Data Form).
  4. Inspiser plottene og figurene, som vil bli generert og vist. Disse tallene lagres også som en PDF-fil i datakatalogen.
    1. Se at en av de genererte plottene viser ensemble-gjennomsnittet kvadrert modulus av Fourier-transformerte bilder, Equation031 som en funksjon av q. Som standard bruker koden dette til å estimere bakgrunnsparameteren B. Beregn bakgrunnen fra Equation031 ved å anta at den, i grense for stor q, vil nærme seg B / 2, hvor B er bakgrunnen.
    2. Hvis Equation031 ikke når et platå på stor q, bruk en annen metode for å estimere B. Du kan gjøre dette ved å angi parameteren background_method i YAML-filen eller som et valgfritt nøkkelordargument til funksjonen calculate_DDM_matrix. Mer informasjon om metodene for estimering av B presenteres i avsnittet for representative resultater.

Figure 2
Figur 2: Beregningstid for beregning av DDM-matrisen. I (A) og (B) vises klokkeslettet for beregning av DDM-matrisen Equation009, . Dataene som brukes i alle tilfeller er en film med 5000 bilder med en bildestørrelse på 512 x 512 piksler. DDM-matrisen ble beregnet for 30 oppholdstider, logaritmisk mellom 1 bilde (0,01 s) og 1000 bilder (10 s). Koden ble kjørt på en Intel i7-10700 2,90 GHz stasjonær datamaskin med 32 GB RAM. I (A) vises effekten av å variere hvor mange bildeforskjeller som brukes til å beregne DDM-matrisen for hver oppholdstid. For dette er bildene binned for å resultere i en bildestørrelse på 256 x 256. For hver oppholdstid Δt blir bilder atskilt med den Δt trukket fra, og den resulterende matrisen er Fourier forvandlet. For en gitt Δt kan alle par bilder atskilt med den Δt brukes (vist i blått), bare ikke-overlappende bildepar kan brukes (f.eks. rammer 1 og 10, 10 og 19 osv., vist i brunt), eller 300 bildepar eller færre kan brukes for hver Δt. I (B) vises effekten av å endre bildestørrelsen på beregningstiden. Bildene ble binnert enten ved å gruppere 2 x 2, 4 x 4 eller 8 x 8 piksler, noe som resulterte i bildestørrelser på henholdsvis 256 x 256, 128 x 128 eller 64 x 64. For hver brukes omtrent 300 bildepar til å beregne DDM-matrisen for hver Δt. (C) Fra DDM-matrisen kan mellomliggende spredningsfunksjon (ISF) trekkes ut. Dette vises for de tre tilfellene i (A). De blå datapunktene (uten forskyvning) tilsvarer ISF når maksimalt antall bildepar brukes for hver Δt; De brune datapunktene (med en forskyvning på 0,1) tilsvarer ISF når ikke-overlappende bildepar brukes for hver Δt; og de rosa datapunktene (med en forskyvning på 0,2) tilsvarer ISF når maksimalt 300 bildepar brukes for hver Δt. Isf funnet ved hjelp av ikke-overlappende bildepar viser støy ved lang Δt. For dette tilfellet brukes få bildepar ved lange Δt (f.eks. for Δt av 1000 bilder brukes bare 4 bildepar). (D) Ved å tilpasse ERF til en eksponentiell funksjon, bestemmes den karakteristiske forfallstiden, τ, for hvert bølgenummer, q. I rosa vises resultatene etter at de opprinnelige bildene er skuffet med 2 x 2, noe som resulterer i en bildestørrelse på 256 x 256. I grått vises resultatene etter binning med 8 x 8, noe som resulterer i en bildestørrelse på 64 x 64. Ved å binning dataene, informasjon om dynamikken ved høyere bølgetall går tapt, men beregning av DDM matrise for 64 x 64 bilder er ca 16x raskere enn for 256 x 256 bilder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Montering av DDM-matrisen eller ISF

  1. Initialiser en forekomst av den DDM_Fit klassen. Hvis du vil gjøre dette, sender du til DDM_Fit filnavnet på YAML-filen som inneholder bildemetadataene og parameterne for tilpassing.
  2. Bestem hvilken modell for DDM-matrisen eller ISF-en som skal brukes til å tilpasse dataene. Før opp de tilgjengelige modellene ved å utføre funksjonen print_fitting_models. Angi modellen som skal brukes i YAML-parameterfilen eller ved hjelp av funksjonen reload_fit_model_by_name.
  3. Angi de første gjetningene og grensene for hver parameter i den valgte modellen i den angitte YAML-parameterfilen. Hvis du vil endre den første gjetningen for en parameter, bruker du funksjonen set_parameter_initial_guess. Angi grenser for parameterne med funksjonen set_parameter_bounds. For eksempel, som vist i Supplementary File 2, for dataene til tracerperler i vimentin-nettverket, var den første gjetningen for forfallstiden 1 s og grensene på den parameteren var 0,01 s og 2000 s.
  4. Utfør tilpasningen med funksjonstilpasning. Tilordne en variabel til utdataene for denne funksjonen for å få enkel tilgang til resultatene.
    MERK: Denne funksjonen kan ta mange valgfrie argumenter. Se kodedokumentasjonen og eksempler på en liste over slike argumenter, og når du bør vurdere å sette dem til ikke-standardverdier.

7. Tolking av passformresultatene

  1. Generer plott for inspeksjon av passformene og q-avhengigheten til tilpasningsparameterne med funksjonen fit_report.
    MERK: Denne funksjonen vil generere en rekke tomter, som også vil bli lagret som en PDF. Valgfrie argumenter for denne funksjonen kan brukes til å endre de produserte plottene.
  2. Blant de genererte plottene vil være en figur med 2 x 2 subplots som viser DDM-matrisen eller ISF (avhengig av den valgte tilpasningsmodellen) ved fire q-verdier (spesifisert som et valgfritt argument for å fit_report), sammen med den beregnede DDM-matrisen eller ISF ved hjelp av modellen og best tilpass parametere. Hvis du vil tegne inn DDM-matrisen eller ISF-en sammen med den beste tilpasningen på en interaktiv måte, bruker du klassen Browse_DDM_Fits som vist i eksemplene som vises når Jupyter Notebook-miljøet brukes.
  3. Fra plottet til den karakteristiske forfallstiden τ vs. bølgenummer q, bestem om dynamikken følger diffusiv, subdiffusiv, ballistisk eller en annen type bevegelse. Dette kan gjøres ved å se etter maktlovforholdet mellom τ og q.
    MERK: På loggloggplottet til τ vs. q generert av funksjonen fit_report, vil tre linjer vises, tilsvarende strømloven passer over et bestemt område av q-verdier . Den heldekkende svarte linjen tilsvarer tilpasning av τ vs. q til en strømlov, τ = 1 / Kqβ, hvor K og β er frie parametere. Den stiplede linjen i oransje tilsvarer tilpasning til enkel diffusjon, τ = 1 / Dq2, hvor D er en diffusjonskoeffisient. Den prikk-stiplede linjen i blått tilsvarer tilpasning til τ = 1 / vq, hvor v er en hastighet.

8. Lagre resultatene

  1. Resultatene av tilpasningen vil bli lagret i et xarray-datasett. Bruk xarray-funksjonen to_netcdf eller Pythons innebygde pickle-modul for å lagre denne datastrukturen på disken. Bruk xarray-funksjonen open_dataset til å laste disse netCDF filer.
  2. Bruk funksjonen save_fit_results_to_excel til å lagre tilpasningsresultatene, sammen med dataene, i en regnearkfil.

Representative Results

Her viser vi eksempler på analysen gjort med PyDDM fra to forskjellige sett med eksperimenter. I ett sett med eksperimenter ble submikron tracer perler innebygd i nettverk som består av mellomliggende filamentprotein vimentin og avbildet ved hjelp av en 100x objektiv linse i brightfield-modus ved 100 bilder / s (figur 3A). Vimentin uttrykkes i mesenchymale celler og er en viktig determinant for de mekaniske egenskapene til cytoplasma65 og den mekaniske stabiliteten til kjernen i celler som utfører begrenset migrasjon66,67. Så langt har rekonstituerte vimentinnettverk blitt studert hovedsakelig av makroskopisk reeologi 64,68,69, mens dynamikken har fått relativt liten oppmerksomhet 13,70,71. Ytterligere detaljer om disse eksperimentene finner du i Supplementary File 2. I det andre settet med eksperimenter ble aktive cytoskjelettnettverk utarbeidet med aktin, mikrotubuler og myosin. Spektralt distinkte fluorescerende etiketter gjorde det mulig å avbilde aktin- og mikrotubulfilamenter med et tofarget laserskanningskonfokalt mikroskop ved hjelp av et 60x objektiv ved 2,78 bilder/s (figur 3B, C). Aktin- og mikrotubulfilamenter er begge viktige drivere for dynamiske celleformendringer, med deres handlinger koordinert av mekaniske og biokjemiske interaksjoner72. Ytterligere detaljer om disse eksperimentene finner du i11. Individuelle delbilder fra bildesekvenser som er tatt i disse eksperimentene, vises i figur 3.

Figure 3
Figur 3: Bilder fra tidsserien analysert. (A) Brightfield-bilde av 0,6 μm perler i et vimentinnettverk. (B,C) Bilde av (B) mikrotubuler og (C) aktin i en aktiv aktin-mikrotubule kompositt tatt med en 60x mål på en laser-skanning confocal mikroskop, ved hjelp av 561 NM excitation lys for mikrotubule bildebehandling og 488 nm excitation lys for aktin imaging. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For bilder av tracerperler i vimentinnettverk ble filmer på 5000 bilder med en størrelse på 512 x 512 piksler ved 100 bilder / s spilt inn. Fra disse ble DDM-matrisen beregnet til 60 logaritmisk fordelte oppholdstider mellom 1 og 1000 bilder, eller 0,01 s og 10 s. Hvis du vil beregne bakgrunnen B, ble gjennomsnittet av de kvadrert Fourier-transformerte bildene Equation031beregnet og satt til Equation03755 73. Det ble lagt til grunn at over de største 10 % av q-verdiene er dette antallet lik B/2, og at B er uavhengig av q. Dette er pakkens standardmetode for estimering av B, men andre metoder er mulige ved å sette parameteren background_method til en annen verdi.

Når parameterne A(q) og B er bestemt fra Equation031, kan man trekke ut den mellomliggende spredningsfunksjonen (ISF) fra DDM-matrisen. Eksempel-ISFer vises i figur 4. I figur 4A vises ISF fra bilder med 0,6 μm diameter perler innebygd i et nettverk med en vimentinkonsentrasjon på 19 μM. I figur 4B vises ISF for samme type perler i et nettverk med en vimentinkonsentrasjon på 34 μM. Interessant nok forfalt ISF i ingen av kabinettene til null. I store oppholdstider bør ISF nærme seg null for ergodiske systemer. Det vilt, i slike systemer, bør tetthetssvingninger helt dekorrelere over store forsinkelser. Det faktum at ISF her ikke forfalt til null kunne ha resultert i unøyaktige estimater av A (q) og B, som ble brukt til å finne ISF fra den beregnede DDM-matrisen. Spesielt kan metoden som brukes her overvurdere B i visse scenarier62. Det er imidlertid mer sannsynlig at dynamikken i tracerperlene virkelig er ikke-allgod, da perlene har en sammenlignbar størrelse som nettverksnettstørrelsen og derfor kan bli buret. Andre data bekreftet funn av ikke-ærverdighet. Nemlig perlestørrelsen, 0,6 μm, var større enn den beregnede gjennomsnittsverdien for maskestørrelsene på 0,4 μm for 19 μM-konsentrasjonen og 0,3 μm for 34 μM-konsentrasjonen. I tillegg viste resultatene fra enkel partikkelsporing av disse tracerperlene, som vises senere, også begrenset bevegelse.

Figure 4
Figur 4: Mellomliggende spredningsfunksjoner ved flere bølgetall for vimentinnettverk. ERF tegnes inn som en funksjon av oppholdstid for q-verdier fra ca. 1 til 9 μm-1. (A) ISF fra bilder av 0,6 μm perler i et vimentinnettverk med vimentinkonsentrasjon på 19 μM. (B) ISF fra bilder av 0,6 μm perler i et vimentinnettverk med vimentinkonsentrasjon på 34 μM. Isf-platåets lange oppholdstid til en verdi godt over null indikerer ikke-godhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Gitt at dynamikken sannsynligvis er ikke-god, er ISF-ene egnet til skjemaet Equation039, der C er ikke-faktor 32. Denne formen for ISF har blitt brukt i tidligere studier av ikke-ergodisk dynamikk, for eksempel for kolloidale geler32,74 eller tracerpartikler i aktin-mikrotubule nettverk 10. De prikkede svarte linjene i figur 4 viser anfallene sammen med dataene. Fra disse passformene kan man nå se på q-avhengigheten av forfallstiden, τ og den ikke-allmektighetsparameteren C.

Figure 5
Figur 5: Forfallstid vs. bølgenummer for vimentin-nettverk. Fra anfall til ISF bestemmes forfallstiden τ for en rekke q-verdier . For klarhetsmessig viser vi ikke verdien av τ for hver q, men bare et logaritmisk spredt sett. I blått (brunfarge) er dataene fra bilder av 0,6 μm perler i vimentinnettverk med en vimentinkonsentrasjon på 19 μM (34 μM). Feilfeltene representerer standardavvikene i τ på tvers av flere filmer (fire filmer for dataene med 19 μM-nettverket [blå] og fem filmer for dataene med 34 μM-nettverket [brunfarge]). Røde, stiplede linjer markerer estimerte grenser for vår tidsmessige og romlige oppløsning, som beskrevet i resultatene. Den heldekkende svarte linjen viser Equation044 skalering, noe som indikerer diffusiv bevegelse. Ingen av datasettene følger denne skaleringen. Snarere viser perler i 19 μM-nettverket subdiffusiv bevegelse (Equation010 med β > 2), og perler i 34 μM-nettverket viser begrenset eller buret bevegelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Forfallstidene viste stor usikkerhet, både ved lave q - og høye q-ytterpunkter , som vist i figur 5. Feilfeltene på dette plottet viser standardavviket blant fire videoer analysert for det nedre vimentinkonsentrasjonstilfellet eller fem videoer analysert for høyere konsentrasjon. For å forstå kilden til den store usikkerheten ved disse ytterpunktene, bør du vurdere både den tidsmessige og romlige oppløsningen. Omtrentlige grenser for oppløsningen vises med tre røde, stiplede linjer. De to horisontale linjene tilsvarer minimums- og maksimumstiden som er undersøkt. Gitt bildefrekvensen på 100 bilder og maksimal oppholdstid tilsvarende 1000 bilder (20% av den totale videovarigheten), gikk nøyaktigheten tapt ved måling av dynamikk som forekommer raskere enn 0,01 s eller langsommere enn 10 s. Ved lavere q-verdier var de monterte verdiene for τ større enn 10 s. Derfor bør det forventes store usikkerheter i forfallstider som er større enn maksimal oppholdstid. I den høyere enden av q-området nærmet forfallstiden seg minimum oppholdstid på 0,01 s, men forble over den. I stedet for å være begrenset av den tidsmessige oppløsningen, med disse høyere q-verdiene , kan den romlige oppløsningen være den begrensende faktoren. Gitt pikselstørrelsen på 0,13 μm, var den største verdien for q ca. 24 μm-1. Den diffraksjonsbegrensede oppløsningen tillater imidlertid ikke nødvendigvis nøyaktige målinger av dynamikken ved disse høye romlige frekvensene. Tilnærmet den optiske oppløsningen som Equation041 fører til en øvre bølgenummergrense på ca 16 μm-1, gitt objektivets numeriske blenderåpning, NA, på 1,4 og bølgelengde av lys, Equation042. Dette demerkes av den loddrette, røde stiplede linjen i figur 5. Faktisk var dataene støyende på store verdier av q. Allerede før denne omtrentlige øvre grensen på q, ble det sett økt usikkerhet i τ, og dette kan være fra å overvurdere qmaks. Dårligere optisk oppløsning enn forventet kan skyldes at et oljeinnlevelsesobjektiv ble brukt til å se forbi dekslene i en vandig prøve eller fordi kondensatorlinsen var ufullkommen justert.

For de 0,6 μm perlene som er innebygd i det mindre konsentrerte nettverket (19 μM vimentin), kan det observeres fra tømmerloggplottet i forfallstiden vs. bølgenummer at forfallstiden gikk ned med bølgenummer på en måte som samsvarer med en kraftlov (figur 5). Det ser imidlertid ikke ut til å følge det som forventes for normal diffusiv bevegelse, hvor Equation044. Snarere gikk τ mer bratt ned med økende q. Dette indikerer subdiffusiv bevegelse, som ofte oppstår for perler i overfylte miljøer som disse. Montering av τ(q) over området 1,4 μm-1 til 12,3 μm-1 til en kraftlov i formen τ = 1/Kqβ gir transportparametrene K = 0,0953 μmβ / s og β = 2,2. For de som er mer vant til å tenke på normal diffusjon vs. subdiffusion når det gjelder gjennomsnittlig kvadrert forskyvning (MSD) av sporstoffpartikler som en funksjon av forsinkelsestid (dvs. MSD = K' Δtα), er det nyttig å gjenkjenne at subdiffusiv skalering eksponent i MSD-ligningen, α, tilsvarer α = 2 / β. Verdien av β = 2,2 samsvarer med andre ord en subdiffusiv skaleringseksponent i MSD-ligningen for α = 0,9. Man ville sette PyDDM til å passe τ(q) over dette området av q-verdier ved å angi indeksene for matrisen til q med enten parameteren Good_q_range i YAML-filen eller ved å sende det valgfrie argumentet forced_qs til funksjonen generate_fit_report. Området q fra 1,4 μm-1 til 12,3 μm-1 vil for dataene her tilsvare indekser av matrisen av q fra 15 til 130.

For de 0,6 μm perlene i det mer konsentrerte nettverket (34 μM) viste forfallstiden liten avhengighet av q. Dette skyldes sannsynligvis ikke-tegn på perler i et nettverk med mindre maskestørrelse. For å undersøke nonergodicity i dette systemet, bør nonergodicity-parameteren, C, plottes som en funksjon av q, som i figur 6. For 0,6 μm perler i 19 μM vimentin-nettverket, C ≈ 0,2 med liten avhengighet av q (ikke vist). Men for nettverket med 34 μM vimentin og for et nettverk med en enda høyere konsentrasjon på 49 μM vimentin, var loggen til C proporsjonal med q2 som vist i figur 6. Dette forholdet mellom C og q forventes for begrenset bevegelse. For perler som er fanget i lommene på nettverket, forventes msd å platå på lange nok oppholdstider (dvs. Equation055, hvor Equation056 er MSD og δ2 er maksimal MSD). Siden ISF kan uttrykkes i form av MSD som Equation058, og siden den ikke-amerikanske ISF går til C ved lange oppholdstider (dvs. Equation059), oppnås forholdet Equation06032,75. Derfor kan man bruke C(q) for å finne δ2, og dette ga δ2 = 0,017 μm2 og 0,0032 μm2 for henholdsvis 34 og 49 μM vimentin-nettverk (tilsvarende δ = 0,13 μm og 0,057 μm).

Figure 6
Figur 6: Parameteren Nonergodicity vs. wavenumber for vimentin-nettverk. Fra tilpassing til ISF bestemmes nonergodicity-parameteren C for et område med q-verdier . I brunfarge (rød) er dataene fra bilder av 0,6 μm perler i vimentinnettverk med en vimentinkonsentrasjon på 34 μM (49 μM). Feilfeltene representerer standardavvikene i τ på tvers av flere filmer (fem filmer for dataene med 34 μM-nettverket [brunfarge] og fire filmer for dataene med 49 μM-nettverket [rød]). Y-aksen har logaritmisk skalering. Man observerer en q-avhengighet av C som følger Equation060, noe som gjør det mulig å trekke ut maksimal gjennomsnittlig kvadrert forskyvning, δ2. Passer til Equation060 vises med de heltrukne linjene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Man kan bruke andre metoder for å trekke ut innesperringsstørrelsen δ fra dataene, så vel som den subdiffusive eksponenten som finnes ved å undersøke τ(q) for perler innenfor 19 μM vimentin-nettverket. For det første kan man bruke metoden beskrevet av Bayles et al.76 og Edera et al.77 for å trekke ut MSD fra DDM-matrisen. Spesielt krever denne metoden ingen montering av DDM-matrisen. Man trenger bare å beregne DDM-matrisen, D(q, Δt) og Equation070 (hvorfra A(q) og B kan bestemmes). Deretter bruker man relasjonen Equation071til å finne MSD. Merk at denne metoden for å finne MSD antar at fordelingen av partikkelforskyvninger er gaussisk, selv om tidligere arbeid har vist at I visse tilfeller er MSD-er avledet fra DDM enige med MSD-er fra partikkelsporing, selv når forskyvningene ikke er gaussiske73. For dette systemet, som forventet78, er det ikke-gaussianitet i fordelingen av store forskyvninger, som vist i figur S1. I PyDDM-pakken skal funksjonen extract_MSD utføres, som returnerer Equation056. For det andre kan man bruke enkel partikkelsporing for å finne MSD. Selv om DDM kan brukes til å analysere bilder der enten den høye tettheten av partikler eller den begrensede optiske oppløsningen forbyr nøyaktig partikkellokalisering, for bildene av 0,6 μm perler i vimentinnettverk, kunne vi lokalisere og spore perler ved hjelp av trackpy programvare (https://github.com/soft-matter/trackpy)79. Denne partikkelsporingsprogramvarepakken bruker algoritmene beskrevet av Crocker og Grier80.

Figure 7
Figur 7: Gjennomsnittlig kvadrert forskyvning vs. oppholdstid for vimentin-nettverk. Msd ble fastslått ved hjelp av to metoder. For det første ble MSD beregnet fra DDM-matrisen (vist med solide symboler). Deretter ble MSD bestemt ved å bruke enkeltpartikkelsporing (SPT) for å finne partikkelbaner (åpne symboler). Feilfelt bestemmes på samme måte som beskrevet i de to foregående figurforklaringene. (A) MSD-er for 0,6 μm perler i 19 μM vimentin-nettverket indikerer subdiffusiv bevegelse, med god enighet mellom de to metodene for å finne MSD. (B) MSD-er for 0,6 μm perler i 49 μM vimentin-nettverket indikerer burbevegelse, med god enighet mellom de to metodene for å finne MSD og med maksimal MSD funnet fra nonergodicity-parameteren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

MSD-ene vs. oppholdstid for 0,6 μm perler i 19 μM vimentin-nettverket og i 49 μM vimentin-nettverket er vist i figur 7. I begge tilfeller var MSD bestemt fra DDM godt enig med MSD funnet gjennom enkeltpartikkelsporing (SPT). Videre, for det mindre konsentrerte nettverket, var den subdiffusive skaleringseksponenten (α i Equation010) ca. 0,9. Dette samsvarer med τ(q)-skaleringen Equation010 som ble funnet, ved å tilpasse ISF til å bestemme τ(q) (det vil si 2/2,2 = 0,9). For det mer konsentrerte nettverket, msd platåer på lengre forsinkelser. Den maksimale MSD-en som ble funnet ved å analysere q-avhengigheten til nonergodicity-parameteren (vist i figur 7B med den horisontale linjen ved δ2 = 0,0032 μm2) var omtrent den samme verdien som MSD-ene fra både SPT og DDM så ut til å være platående mot. Det er et avvik mellom de lengste etterslepstiden som er bestemt fra DDM og SPT i figur 7A. Selv om dette kan skyldes et begrenset antall lange forsinkelsestidsbaner, kan det også være tilfelle at ytterligere optimalisering av rekkevidden av q-verdier som DDM-matrisen brukes til å estimere Equation056 for hver forsinkelse (som gjort av Bayles et al.76 og Edera et al.77) vil forbedre resultatene våre, og slik optimalisering vil være fokus for fremtidig arbeid.

Disse eksperimentene der bildesekvenser ble registrert av tracerperler innebygd i et nettverk av vimentin mellomliggende filamenter tillatt for uavhengige analyser: DDM (ved hjelp av pakken beskrevet her) og SPT (ved hjelp av trackpy). Begge analysene kan avdekke graden av subdiffusion og innesperringslengde, slik at man kan bruke to uavhengige bildeanalyseteknikker for å gi komplementære beregninger. Det er flere mengder man kan sammenligne fra SPT og DDM. For eksempel kan heterogenitet i dynamikken i prøven avsløre seg selv som ikke-Gaussianity i fordelingen av partikkelforskyvninger (dvs. van Hove-fordelingen) bestemt fra SPT, så vel som i en ISF bestemt fra DDM som passer til en strukket eksponentiell34,35. Figur S1 viser van Hove-fordelingen for 0,6 μm-partiklene i vimentinnettverk og diskuterer den strekkende eksponenten som finnes ved å tilpasse ISF-ene – beregninger som brukes sammen i tidligere studier for å demonstrere den heterogene dynamikken i partikler i biomimetiske systemer 9,10,47 eller andre overfylte miljøer 34 . Som et annet eksempel kan ISF beregnes fra partikkelbaner målt med SPT og sammenlignet med de DDM-oppkjøpte ISF-ene. Mens de gjennomsnittlige kvadrrte forskyvningene og forskyvningsfordelingene er målingene som oftest trekkes fra SPT-analyse, kan man også beregne ISF fra partikkelbaner, Equation075ved hjelp av Equation076 (se figur S2). Denne ISF-en kan sammenlignes med DDM-genererte ISFer og brukes til å avsløre dynamikk som ikke er synlig i MSD59.

Selv om det å anskaffe bilder av sporstoffer i et nettverk kan tillate en å bruke de komplementære analysemetodene til SPT og DDM, er det viktig å merke seg at en fordel med DDM over SPT er at det ikke krever bilder av perler (eller andre funksjoner) som lett kan lokaliseres og spores. For å demonstrere dette punktet, fremhever vi deretter analysen av aktive nettverk av aktin- og mikrotubulfilamenter, der fluorescerende merking av aktin og tubulin muliggjør avbildning av begge filamenttyper, skilt fra hverandre via forskjellige fluoroforer, med et flerfarget laserskanningskonfokalt mikroskop.

Bilder ble anskaffet med et laserskanningskonfokalt mikroskop av aktinmikrotubule nettverk med aktivitet drevet av myosin (kanin skjelettmuskel myosin II; Cytoskeleton #MY02). Detaljer om forsøkene og resultatene er tidligere beskrevet11, og de representative resultatene som vises her er fra analysen av to filmer levert i tilleggsmaterialet (filmer S1 og S4) for11. Begge bildesekvensene ble tatt opp med 2,78 bilder/s for 1000 bilder.

For å analysere disse bildene ble DDM-matrisen beregnet for 50 oppholdstider fra 0,4 s til 252 s (1 ramme til 700 bilder). DDM-matrisen ble deretter tilpasset modellen Equation010, der den mellomliggende spredningsfunksjonen var Equation077. Det finnes derfor fire tilpasningsparametere: A, τ, s og B. Resultatene av disse anfallene er vist i figur 8. Det ble observert at DDM-matrisen for en bestemt q-verdi hadde et platå ved lave oppholdstider, økt med forsinkelse, og deretter platået (eller viste tegn på å begynne å platå) på store etterslep. DDM-matrisen for de lavere verdiene av q nådde ikke et platå på lange oppholdstider. Man bør derfor forvente dårlig nøyaktighet i målingen av forfallstiden for disse lave q (stor lengdeskala) dynamikken.

De karakteristiske forfallstidene, τ, fra anfallene til DDM-matrisen er vist i figur 9. Resultatene presenteres for et aktivt aktin-mikrotubule komposittnettverk (lik filmen S111) og for et aktivt aktinnettverk (ligner på filmen S411). Begge nettverkene ble utarbeidet med de samme konsentrasjonene av aktin og myosin, men det eneste nettverket ble opprettet uten tubulin, som beskrevet i11. For disse to typer aktive nettverk var Equation010det observerte maktlovforholdet . Denne skaleringen indikerer ballistisk bevegelse og at den myosindrevne sammentrekningen og strømmen dominerer over filamentenes termiske bevegelse. Fra τ = (vq)-1 ble det funnet en karakteristisk hastighet, v, på ca. 10 nm/s for det aktive actin-microtubule-nettverket og 75 nm/s for det aktive aktinnettverket. Disse verdiene samsvarer med partikkelbildehastighetsanalysen av de samme videoene som vises i11. Skaleringen Equation010 holdt ikke på de lavere q-verdiene for det aktive komposittnettverket actin-microtubule. Dette skyldes sannsynligvis at de virkelige forfallstidene for dette komposittnettverket i aktin-mikrotubule ved lavere q-verdier er lengre enn den maksimale oppholdstiden for den beregnede DDM-matrisen. Maksimal oppholdstid er angitt med den horisontale røde linjen i figur 9, og forfallstiden avviker fra forventet Equation010 skalering nær disse lengre tidene.

Figure 8
Figur 8: DDM-matrise kontra oppholdstid for et aktivt aktinmikrotubulkomposittnettverk. DDM-matrisen for flere verdier av q er plottet som en funksjon av oppholdstid fra en film av et sammensatt nettverk som består av 2,9 μM aktinmonomerer, 2,9 μM tubulin dimmere og 0,24 μM myosin. Disse dataene viser analysen av bare mikrotubulkanalen til en flerfarget tidsserie med bilder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Forfallstid vs. bølgenummer for aktive aktinmikrotubulenettverk. Fra å montere DDM-matrisen, er forfallstiden, τ, som en funksjon av bølgenummer, q, funnet. Plottet er τ vs q for bilder av et aktivt actin-microtubule nettverk (analysere bare mikrotubule kanalen) i brun og for bilder av en aktiv actin nettverk i grønt. Begge nettverkene har de samme konsentrasjonene av aktin og myosin (henholdsvis 2,9 μM og 0,24 μM); aktinmikrotubulkompositten har 2,9 μM tubulin dimmere. Forfallstidene for det aktive aktinnettverket er mye mindre enn forfallstidene for det aktive actin-microtubule-nettverket, noe som indikerer raskere bevegelse av det aktive aktinnettverket. I begge tilfeller er dynamikken ballistisk ettersom dataene følger en Equation010 trend. Innsett: Plottet til ISF-ene i forhold til oppholdstiden skalert av bølgenummeret (Δt × q) viser en kollaps av ISF-ene over et område med q-verdier . Dette indikerer også ballistisk bevegelse. Internett-filene som vises i dette innsettet, er fra det aktive aktinnettverket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For disse dataene fra aktive nettverk valgte vi å passe til DDM-matrisen, Equation010. Dette står i kontrast til det som ble gjort for data fra perler i vimentinnettverket, der A (q) og B ble estimert uten noen tilpasning for å isolere ISF, f (q, Δt). I dette tilfellet, for de aktive nettverksdataene, ble A og B igjen som tilpasningsparametere fordi metodene som brukes til å estimere B ikke resulterte i gode passformer. Standardmetoden for å beregne B er å beregne Equation031 og anta at dette i stor grad går til B/2. Denne metoden overvurderte imidlertid B for disse dataene, noe som ble sett i det faktum at når du beregner ISF-ene fra B estimert på denne måten (ikke vist), var ISF-ene større enn 1 ved tidlige oppholdstider (mens de skulle gå fra maksimalt 1 til enten null eller en ikke-tillatt parameter med økende oppholdstid). Man kan velge andre metoder for å estimere B ved hjelp av parameteren background_method. En av disse andre metodene er å estimere B til å være minimum av DDM-matrisen ved tidlige oppholdstider (satt med background_method = 1). En lignende metode ble brukt av Bayles et al.76, selv om de ikke antok at B var konstant med q. Et annet alternativ er å estimere B til å være gjennomsnittsverdien over alle oppholdstider for DDM-matrisen ved maksimalt antall (angitt med background_method=2). Disse forskjellige metodene for å estimere bakgrunnen, samt resultatene for å tillate B å være en fri tilpasningsparameter, vises i figur 10. Fra disse tomtene kan man se at amplituden, A, ikke nådde null ved de største q-verdiene som ble undersøkt, siden Equation031 det ikke var platå på stor q (figur 10B), og siden D(qmax, Δt) gikk fra et lavere oppholdstidsplatå til et høyere ettersleptidplatå (dvs. ved qmax, var det en ikke-null A; Figur 10D). Derfor verken estimere b som Equation082 eller som Equation083 ville være hensiktsmessig. Man bør inspisere Equation031 vs. q og D (qmax, Δt) vs. Δt før man bestemmer seg for hvordan (eller om) skal estimere B.

Figure 10
Figur 10: Bakgrunn vs. bølgenummer for aktive aktinmikrotubulenettverk. Fra å montere DDM-matrisen, kan man finne bakgrunnen, B, som en funksjon av bølgenummer, q. Vist er B vs. q for bilder av et aktivt aktin-mikrotubule nettverk (analyserer bare mikrotubulkanalen) bestemt fra disse passer med de lilla symbolene. De tre heltrukne linjene i (A) viser estimater av bakgrunnen som ble funnet uten tilpasning. Den øverste, mørkeste linjen i (A) viser beregnet bakgrunn ved hjelp av Equation088, som kan være aktuelt hvis Equation031 platåer til en konstant verdi i stort kv. Fra (B) legg merke til at Equation031 du ennå ikke har nådd en konstant verdi på den største q-probeden. Derfor overvurderer bakgrunnen ved hjelp av denne metoden. Hovedpoenget i (A) viser beregnet bakgrunn ved hjelp av Equation090. Hvis DDM-matrisen viser et platå med lav oppholdstid som vist i (C) med den røde linjen, kan denne metoden være egnet for å estimere bakgrunnen. Den midterste, lyseste linjen i (A) viser beregnet bakgrunn fra Equation083. Denne metoden kan være hensiktsmessig hvis amplituden A ved q max har nådd null. Fra (D) ses det at amplituden ikke er null, og derfor overvurderer denne metoden bakgrunnen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur S1: Sannsynlighetsfordelinger av partikkelforskyvninger. Sannsynlighetsfordelinger av partikkelforskyvninger viser ikke-Gaussianity for vimentinkonsentrasjoner på 34 μM og 49 μM. Enkeltpartikkelsporing av 0,6 μm diameter perler ble utført i vimentinnettverk av forskjellige konsentrasjoner. Ulike oppholdstider vises i forskyvningsfordelingene for de tre forholdene. (A) Fordelingen av partikkelforskyvninger i et 19 μM vimentinnettverk passer med en gaussisk funksjon. Bredden på gaussianeren øker med økende oppholdstid. (B) Fordelingen av partikkelforskyvninger i et 34 μM vimentinnettverk viser mer ikke-gaussianitet, spesielt ved store forskyvninger, enn for 19 μM-saken. (C) Fordelingen av partikkelforskyvninger i et 49 μM vimentinnettverk viser også ikke-gaussianitet. Videre øker bredden på fordelingene ikke med forsinkelser så betydelig som i prøvene med lavere vimentinkonsentrasjoner, noe som indikerer begrenset bevegelse. Ikke-gaussiske van Hove-distribusjoner (sett for alle vimentinprøver, men mest tydelige i de høyere konsentrasjonene) er forbundet med heterogen dynamikk som ofte sett i transport av partikler i overfylte og begrensede miljøer. En annen indikator på heterogen transport som bestemmes fra DDM-analyse, er den strekkende eksponenten som brukes til å passe til den mellomliggende spredningsfunksjonen (parameteren s i ligningen for ISF som brukes her: Equation077 + Equation061). De gjennomsnittlige strekkeksponentene over q-området på 0,4 μm-1 til 9,4 μm-1 er, fra høyeste vimentinkonsentrasjon til laveste, 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 og 0,86 ± 0,04 (gjennomsnittlig ± standardavvik). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: De mellomliggende spredningsfunksjonene fra DDM og SPT. De mellomliggende spredningsfunksjonene (ISF) for fem forskjellige bølgetall vises. ISF versus oppholdstid funnet gjennom DDM er plottet med sirkulære markører, og ISF beregnet fra enpartikkelbaner med åpne firkanter. Prikkede svarte linjer viser anfallene til de DDM-anskaffede ISF-ene. ISF beregnes fra enpartikkelbaner ved Equation075hjelp av Equation076. I (A) vises ISF for 0,6 μm partikler i 19 μM vimentin-nettverkene. I (B) vises ISF for 0,6 μm partikler i 34 μM vimentin-nettverkene. Avvikene i ISF funnet fra DDM og SPT skyldes sannsynligvis et begrenset antall lange oppholdstidsbaner. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Protokoll for bruk av DDM. Inndataene og utdataene for trinnene som vises i protokollen, vises. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Detaljer om prøveforberedelse og eksempelparameterfiler for vimentin-nettverk. Detaljerte trinn for prøveforberedelse og bildeanskaffelse på vimentinnettverk er gitt. I tillegg er det også gitt et eksempelparameterfil for analyse av data presentert i den representative resultatdelen på vimentinnettverk. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Programvarepakken som er beskrevet her, bruker DDM til å analysere tetthetssvingninger observert i bilder som er anskaffet ved hjelp av et optisk mikroskop. Representative resultater fra data fra sporstoffer partikler innebygd i vimentin nettverk ble først vist. Analysen av slike data kan brukes til å karakterisere nettverkets maskestørrelse og stivhet på samme måte som hvordan enkeltpartikkelsporing har blitt brukt i mange tidligere studier av cytoskjelettnettverk 6,12,13. En fordel med å bruke DDM over enkeltpartikkelsporing er at DDM ikke krever at partiklene lokaliseres. Derfor, selv i bilder der partikkeltettheten er for høy eller partiklene for små til å lokalisere og spore, kan DDM fortsatt bestemme dynamikken. Hvor enkeltpartikkelsporing vil være fordelaktig er ved inspeksjon av partikkel-til-partikkelvariabilitet. Med DDM finner man ensemblets gjennomsnittlige dynamikk, mens man med enkeltpartikkelsporing kan beregne både en enkelt partikkels MSD og den ensemblegjennomsnittte MSD. DDM kan imidlertid brukes til å undersøke heterogen dynamikk ved å analysere flere interesseområder innenfor et stort synsfelt.

Deretter ble representative resultater fra data av fluorescerende merkede filamenter i et aktivt nettverk sammensatt av to forskjellige merkede cytoskeletale filamenttyper vist11. Med disse dataene ble den ballistiske bevegelsen karakterisert uten å trenge noen lokaliserte funksjoner i bildet. Siden DDM trekker ut ensemblets gjennomsnittlige dynamikk med få brukerinnganger, gjør det det enkelt å sammenligne bildeserier oppnådd med forskjellige forhold (f.eks. sammenligne prøver med forskjellige forhold mellom aktin og mikrotubuler eller prøver med forskjellige konsentrasjoner av myosin, som gjort i50). I tillegg, ved hjelp av fluorescerende avbildning, kan vi undersøke dynamikken i forskjellige komponenter i et nettverk ved hjelp av flerfarget merking. Dette ble gjort i 11,50, hvor dynamikken i aktin og mikrotubuler ble separat analysert i et aktivt aktin-mikrotubul sammensatt nettverk ved hjelp av flerfarget bildebehandling. I den representative resultatseksjonen her ble bare resultatene fra mikrotubulkanalen vist, men i tidligere arbeid sammenlignet vi dynamikken i mikrotubulen og aktinfilamentene11.

Vi merker oss at disse representative resultatene viser enten passiv subdiffusion eller aktiv ballistisk bevegelse. Det er viktig at DDM brukes til å analysere systemer der det er en crossover i typen dynamikk på mellomtids- eller lengdeskalaer. Som eksempler brukte Kurzthaler et al. DDM med et system av aktive Janus-kolloider for å utforske aktiv rettet bevegelse på korte tidsskalaer og randomisering av orienteringen på lengre tidsskalaer59; Giavazzi et al. brukte DDM med grovt skum og fant en crossover i dynamikken som tilsvarer lengdeskalaen til en boble33; og Cho et al. brukte DDM med kolloidale geler og fant tre skilleregimer i forskjellige lengdeskalaer som spenner fra fraktalklyngene til hele nettverket32.

Dataene som inngår i den representative resultatseksjonen ble innhentet med brightfield mikroskopi og laserskanning konfektmikroskopi. Som tidligere nevnt kan imidlertid DDM brukes med mange bildemodaliteter. Med enhver bildemodalitet bør brukerne vurdere optiske innstillinger som graden av optisk seksjonering eller dybdeskarpheten. En høy grad av optisk seksjonering kan redusere signalet fra objekter utenfor fokus, men man vil ikke kunne måle dynamikken nøyaktig over tidsskalaer som er større enn tidsskalaen for objekter å bevege seg ut av dybdefeltet25,28. En grundigere drøfting av hvordan den q-avhengige dybdeskarpheten påvirker DDM-analysen finner du i22. For brightfield-avbildning kan det hende at brukerne også må vurdere prøvetykkelsen. Mens for svakt spredning av prøver kan tykkere prøver gi mer signal42, turbid prøver kan kreve endring av analysen for å gjøre rede for flere spredning81. Til slutt, for avbildningsmetoder som ikke er lineære rominvariante (det vil si hvor intensiteten som registreres av kameraet til et objekt, avhenger av hvor objektet er i x-y-prøveplanet), kan det hende man må ta hensyn til den lineære romvariasjonen, som vist med mørkt felt DDM27.

For de som kommer i gang med DDM, ønsker vi å understreke viktigheten av å vurdere den romlige og tidsmessige oppløsningen. Ved inspeksjon av de fastsatte forfallstidene som en funksjon av bølgenummer, er det viktig å markere grensene for ens oppløsning (dvs. maksimal og minimum oppholdstid og maksimalt bølgenummer, som gjort i figur 5). Man bør tenke nøye gjennom disse grensene før man samler inn data, slik at det optimale objektivet, bildestørrelsen, bildefrekvensen og filmvarigheten kan velges. Det andre viktige hensynet er hvordan du estimerer bakgrunnsparameteren B. Flere metoder for å estimere bakgrunnen er brukt i litteraturen, og effektene av over- eller underestimering av B er beskrevet i tidligere publikasjoner62,77. Som vist i figur 10, lar PyDDM brukere implementere forskjellige metoder for å estimere B, og vi foreslår at nye brukere prøver disse metodene og evaluerer hvilke som er hensiktsmessige å bruke.

En styrke for denne pakken er dens grundige dokumentasjon og gjennomganger med eksempeldata, lagring og organisering av metadata for å holde oversikt over hvordan analyser ble utført, og fleksibiliteten i hvordan man analyserer DDM-matrisen (ulike tilpasningsmodeller, flere metoder for å estimere bakgrunnsparameteren B, evnen til å finne MSD). Det er imidlertid flere aspekter ved denne koden som kan forbedres. Koden er for øyeblikket ikke optimalisert for rask beregningshastighet. Metoder for å fremskynde beregningen er rapportert61,62, og disse vil bli implementert i fremtidige utgivelser. I tillegg planlegger vi å implementere nylig rapporterte metoder for å bedre estimere usikkerheter og bruke simuleringer for å veilede brukere til riktig ISF-modell62. For andre forbedringer håper vi brukerne vil kontakte oss med forslag.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Deler av denne forskningen ble finansiert av National Institutes of Health R15 Award (National Institute of General Medical Sciences award no. R15GM123420, tildelt R.M.R.-A. og R.J.M.), en Cottrell Scholar Award fra Research Corporation for Science Advancement (pris nr. 27459, tildelt R.J.M.), og en William M. Keck Foundation Research Grant (tildelt R.M.R-A.). GHK anerkjenner takknemlig økonomisk støtte fra Det nederlandske forskningsrådet (NWO; prosjektnummer VI.C.182.004 i NWO Talent Program).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 Hamatsu
F-127 Pluronic Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop Thermo Fisher
Nikon Ti-Eclipse microscope Nikon
PLL-PEG-bio SuSos AG, Dübendorf, Switzerland
Polystyrene beads Sigma Aldrich
Protein dialysis mini-cassette Thermo Fisher
PyDDM University of San Diego N/A Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).
  2. Amblard, F., Maggs, A. C., Yurke, B., Pargellis, A. N., Leibler, S. Subdiffusion and anomalous local viscoelasticity in actin networks. Physical Review Letters. 77 (21), 4470-4473 (1996).
  3. Mizuno, D., Tardin, C., Schmidt, C. F., MacKintosh, F. C. Nonequilibrium mechanics of active cytoskeletal networks. Science. 315 (5810), 370-373 (2007).
  4. Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).
  5. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Physical Review Letters. 102 (18), 188303 (2009).
  6. Stuhrmann, B., Soares e Silva, M., Depken, M., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Nonequilibrium fluctuations of a remodeling in vitro cytoskeleton. Physical Review E. 86 (2), 020901 (2012).
  7. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  8. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  9. Anderson, S. J. et al. Filament rigidity vies with mesh size in determining anomalous diffusion in cytoskeleton. Biomacromolecules. 20 (12),4380-4388 (2019).
  10. Anderson, S. J., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  11. Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).
  12. Wong, I. Y. et al. Anomalous diffusion probes microstructure dynamics of entangled F-actin networks. Physical Review Letters. 92 (17), 178101 (2004).
  13. Köster, S., Lin, Y.-C., Herrmann, H., Weitz, D. A. Nanomechanics of vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 6 (9), 1910-1914 (2010).
  14. Chandrakar, P. et al. Engineering stability, longevity, and miscibility of microtubule-based active fluids. Soft Matter. 18 (9), 1852-1835 (2022).
  15. Alvarado, J., Cipelletti, L., H. Koenderink, G. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).
  16. Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
  17. Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).
  18. Malik-Garbi, M. et al. Scaling behaviour in steady-state contracting actomyosin networks. Nature Physics. 15 (5), 509-516 (2019).
  19. Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (5), e2115895119 (2022).
  20. Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., Nédélec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e714 (2018).
  21. Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).
  22. Giavazzi, F., Brogioli, D., Trappe, V., Bellini, T., Cerbino, R. Scattering information obtained by optical microscopy: differential dynamic microscopy and beyond. Physical Review E. 80 (3), 031403 (2009).
  23. Giavazzi, F., Cerbino, R. Digital Fourier microscopy for soft matter dynamics. Journal of Optics. 16 (8), 083001 (2014).
  24. He, K., Spannuth, M., Conrad, J. C., Krishnamoorti, R. Diffusive dynamics of nanoparticles in aqueous dispersions. Soft Matter. 8 (47), 11933-11938 (2012).
  25. Lu, P. J. et al. Characterizing concentrated, multiply scattering, and actively driven fluorescent systems with confocal differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 108 (21), 218103 (2012).
  26. Giavazzi, F. et al. Viscoelasticity of nematic liquid crystals at a glance. Soft Matter. 10 (22), 3938-3949 (2014).
  27. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Dark-field differential dynamic microscopy. Soft Matter. 12 (8), 2440-2452 (2016).
  28. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. Light-sheet microscopy with digital Fourier analysis measures transport properties over large field-of-view. Optics Express. 24 (18), 20881-20894 (2016).
  29. Richards, J. A., Martinez, V. A., Arlt, J. Particle sizing for flowing colloidal suspensions using flow-differential dynamic microscopy. Soft Matter. 17 (14), 3945-3953 (2021).
  30. Ferri, F. et al. Kinetics of colloidal fractal aggregation by differential dynamic microscopy. The European Physical Journal Special Topics. 199 (1), 139-148 (2011).
  31. Lanfranco, R. et al. Adaptable DNA interactions regulate surface triggered self assembly. Nanoscale. 12 (36), 18616-18620 (2020).
  32. Cho, J. H., Cerbino, R., Bischofberger, I. Emergence of multiscale dynamics in colloidal gels. Physical Review Letters. 124 (8), 088005 (2020).
  33. Giavazzi, F., Trappe, V., Cerbino, R. Multiple dynamic regimes in a coarsening foam. Journal of Physics: Condensed Matter. 33 (2), 024002 (2020).
  34. He, K. et al. Diffusive dynamics of nanoparticles in arrays of nanoposts. ACS Nano. 7 (6), 5122-5130 (2013).
  35. Jacob, J. D. C., He, K., Retterer, S. T., Krishnamoorti, R., Conrad, J. C. Diffusive dynamics of nanoparticles in ultra-confined media. Soft Matter. 11 (38), 7515-7524 (2015).
  36. Sentjabrskaja, T. et al. Anomalous dynamics of intruders in a crowded environment of mobile obstacles. Nature Communications. 7, 11133 (2016).
  37. Hitimana, E., Roopnarine, B. K., Morozova, S. Diffusive dynamics of charged nanoparticles in convex lens-induced confinement. Soft Matter. 18 (4), 832-840 (2022).
  38. Wilson, L. G. et al. Differential dynamic microscopy of bacterial motility. Physical Review Letters. 106 (1), 018101 (2011).
  39. Martinez, V. A. et al. Differential dynamic microscopy: a high-throughput method for characterizing the motility of microorganisms. Biophysical Journal. 103 (8), 1637-1647 (2012).
  40. Germain, D., Leocmach, M., Gibaud, T. Differential dynamic microscopy to characterize Brownian motion and bacteria motility. American Journal of Physics. 84 (3), 202-210 (2016).
  41. Croze, O. A. et al. Helical and oscillatory microswimmer motility statistics from differential dynamic microscopy. New Journal of Physics. 21 (6), 063012 (2019).
  42. Safari, M. S., Vorontsova, M. A., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of weakly scattering and polydisperse protein-rich clusters. Physical Review E. 92 (4), 042712 (2015).
  43. Wang, J., McGorty, R. Measuring capillary wave dynamics using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 15 (37), 7412-7419 (2019).
  44. Cerbino, R., Giavazzi, F., Helgeson, M. E. Differential dynamic microscopy for the characterization of polymer systems. Journal of Polymer Science. 60 (7), 1079-1089 (2021).
  45. Cerbino, R., Cicuta, P. Perspective: differential dynamic microscopy extracts multi-scale activity in complex fluids and biological systems. The Journal of Chemical Physics. 147 (11), 110901 (2017).
  46. Drechsler, M., Giavazzi, F., Cerbino, R., Palacios, I. M. Active diffusion and advection in Drosophila oocytes result from the interplay of actin and microtubules. Nature Communications. 8 (1), 1-11 (2017).
  47. Burla, F., Sentjabrskaja, T., Pletikapic, G., Beugen, J. v., H. Koenderink, G. Particle diffusion in extracellular hydrogels. Soft Matter. 16 (5), 1366-1376 (2020).
  48. Regan, K., Wulstein, D., Rasmussen, H., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. M. Bridging the spatiotemporal scales of macromolecular transport in crowded biomimetic systems. Soft Matter. 15 (6), 1200-1209 (2019).
  49. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).
  50. Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).
  51. Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv:2112.11260 .(2021).
  52. Chen, X. et al. Coaxial differential dynamic microscopy for measurement of Brownian motion in weak optical field. Optics Express. 26 (24), 32083-32090 (2018).
  53. Reufer, M., Martinez, V. A., Schurtenberger, P., Poon, W. C. K. Differential dynamic microscopy for anisotropic colloidal dynamics. Langmuir. 28 (10), 4618-4624 (2012).
  54. Giavazzi, F., Haro-Pérez, C., Cerbino, R. Simultaneous characterization of rotational and translational diffusion of optically anisotropic particles by optical microscopy. Journal of Physics: Condensed Matter. 28 (19), 195201 (2016).
  55. Cerbino, R., Piotti, D., Buscaglia, M., Giavazzi, F. Dark field differential dynamic microscopy enables accurate characterization of the roto-translational dynamics of bacteria and colloidal clusters. Journal of Physics: Condensed Matter. 30 (2), 025901 (2017).
  56. Safari, M. S., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of bidisperse colloidal suspensions. npj Microgravity. 3 (1), 21 (2017).
  57. Giavazzi, F., Pal, A., Cerbino, R. Probing roto-translational diffusion of small anisotropic colloidal particles with a bright-field microscope. The European Physical Journal E. 44 (4), 61 (2021).
  58. Schwarz-Linek, J. et al. Escherichia coli as a model active colloid: a practical introduction. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 137, 2-16 (2016).
  59. Kurzthaler, C. et al. Probing the spatiotemporal dynamics of catalytic Janus particles with single-particle tracking and differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
  60. Mandal, S., Kurzthaler, C., Franosch, T., Löwen, H. Crowding-enhanced diffusion: an exact theory for highly entangled self-propelled stiff filaments. Physical Review Letters. 125 (13), 138002 (2020).
  61. Norouzisadeh, M., Chraga, M., Cerchiari, G., Croccolo, F. The modern structurator: increased performance for calculating the structure function. The European Physical Journal E. 44 (12), 146 (2021).
  62. Gu, M., Luo, Y., He, Y., Helgeson, M. E., Valentine, M. T. Uncertainty quantification and estimation in differential dynamic microscopy. Physical Review E. 104 (3), 034610 (2021).
  63. Hoyer, S., Hamman, J. xarray: N-D labeled arrays and datasets in Python. Journal of Open Research Software. 5 (1), 10 (2017).
  64. Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. Stiffening and inelastic fluidization in vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 15 (36), 7127-7136 (2019).
  65. Guo, M. et al. The role of vimentin intermediate filaments in cortical and cytoplasmic mechanics. Biophysical Journal. 105 (7), 1562-1568 (2013).
  66. Lavenus, S. B., Tudor, S. M., Ullo, M. F., Vosatka, K. W., Logue, J. S. A flexible network of vimentin intermediate filaments promotes migration of amoeboid cancer cells through confined environments. Journal of Biological Chemistry. 295 (19), 6700-6709 (2020).
  67. Patteson, A. E. et al. Loss of vimentin enhances cell motility through small confining spaces. Small. 15 (50), 1903180 (2019).
  68. Lin, Y.-C. et al. Origins of elasticity in intermediate filament networks. Physical Review Letters. 104 (5), 058101 (2010).
  69. Pawelzyk, P., Mücke, N., Herrmann, H., Willenbacher, N. Attractive interactions among intermediate filaments determine network mechanics in vitro. PLOS ONE. 9 (4), e93194 (2014).
  70. Schepers, A. V. et al. Multiscale mechanics and temporal evolution of vimentin intermediate filament networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (27), e2102026118 (2021).
  71. Wu, H. et al. Effect of divalent cations on the structure and mechanics of vimentin intermediate filaments. Biophysical Journal. 119 (1), 55-64 (2020).
  72. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  73. Giavazzi, F., Malinverno, C., Scita, G., Cerbino, R. Tracking-free determination of single-cell displacements and division rates in confluent monolayers. Frontiers in Physics. 6, 120 (2018).
  74. Cho, J. H. Multiscale Probing of Colloidal Gelation Dynamics., Massachusetts Institute of Technology (2018).
  75. Krall, A. H., Weitz, D. A. Internal dynamics and elasticity of fractal colloidal gels. Physical Review Letters. 80 (4), 778-781 (1998).
  76. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Probe microrheology without particle tracking by differential dynamic microscopy. Rheologica Acta. 56 (11), 863-869 (2017).
  77. Edera, P., Bergamini, D., Trappe, V., Giavazzi, F., Cerbino, R. Differential dynamic microscopy microrheology of soft materials: a tracking-free determination of the frequency-dependent loss and storage moduli. Physical Review Materials. 1 (7), 073804 (2017).
  78. Wang, B., Kuo, J., Bae, S. C., Granick, S. When Brownian diffusion is not Gaussian. Nature Materials. 11 (6), 481-485 (2012).
  79. soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0. Zenodo (2021).
  80. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
  81. Nixon-Luke, R., Arlt, J., Poon, W. C. K., Bryant, G., Martinez, V. A. Probing the dynamics of turbid colloidal suspensions using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 18 (9), 1856-1867 (2022).

Tags

Bioingeniør utgave 184
Kvantifisere Cytoskeleton-dynamikken ved hjelp av differensial dynamisk mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G.,… More

Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G., Petitjean, I. I., Koenderink, G. H., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. J. Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63931, doi:10.3791/63931 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter