Summary
差分动态显微镜（DDM）结合了动态光散射和显微镜的特征。本文介绍了利用DDM通过量化维门汀网络中颗粒的亚扩散和笼中动力学以及活性肌球蛋白驱动的肌动蛋白-微管复合物的弹道运动来表征重构细胞骨架网络的过程。
Abstract
细胞可以爬行，自愈，并由于其显着的动态细胞骨架而调整其僵硬。因此，重构细胞骨架生物聚合物网络可能导致许多活性和适应性强的材料。然而，设计具有精确调谐特性的此类材料需要测量动力学如何依赖于网络组成和合成方法。量化这种动态受到复合网络在时间、空间和公式空间变化方面的挑战。此处的协议描述了傅里叶分析技术，即微分动态显微镜（DDM），如何量化生物聚合物网络的动力学，并且特别适合于细胞骨架网络的研究。DDM适用于使用一系列显微镜模式（包括激光扫描共聚焦，宽视场荧光和明场成像）获取的图像的时间序列。从这样的图像序列中，可以提取波矢量跨度内密度波动的特征去相关时间。还开发了一个用户友好的开源Python包来执行DDM分析。使用该软件包，可以测量标记的细胞骨架组分或嵌入的示踪颗粒的动力学，如中间丝（vimentin）网络和活性肌动蛋白 - 微管网络的数据所示。没有编程或图像处理经验的用户将能够使用此软件包和相关文档执行DDM。
Introduction
细胞骨架是一个蛋白质细丝网络，横跨真核细胞的细胞质，将细胞表面连接到细胞核。它具有独特的材料特性，可针对大而重复的机械负载提供机械保护，同时还能驱动动态单元形状变化1.重构的细胞骨架网络可以产生一系列有趣的动态行为，从嵌入粒子的笼子到分子马达驱动的弹道运动2，3，4，5，6，7，8，9，10，11.分析此类网络的动力学的方法包括跟踪嵌入的示踪微球6，7，12，13，14的运动，图像分析以跟踪蛋白质致密簇的大小随时间的变化8，动态光散射15，粒子图像测速4，16，17，18，19，计算图像在一段时间内的功率谱密度19，并分析KUKIR图20。随着对重构细胞骨架网络的更多研究的进行，无论是了解细胞力学还是活性物质，越来越需要稳健，无偏倚和可重复的动力学表征方法。差分动态显微镜（DDM）21，22是一种相对较新的技术，已被用于研究细胞骨架动力学，是一种用很少的用户定义参数有效量化动力学的技术。使用这里描述的软件包，在编程或图像分析方面经验很少的研究人员将能够利用DDM进行自己的工作。
DDM是一种图像分析技术，用于提取样品的动力学。与粒子跟踪或粒子图像测速一样，DDM需要图像的时间序列（通常为数千张图像），通常用显微镜记录。与粒子跟踪不同，单个特征或示踪剂磁珠不需要在图像中定位（甚至可定位）。与粒子跟踪和粒子图像测速不同，使用DDM恢复融合动力学，用户指定的参数相对较少。使用DDM，在傅里叶空间中分析图像，以确定密度波动在波数范围q（其中q = 2πu）和u是空间频率
的大小。一个获得类似散射的信息，但在显微镜21，22，23上获取真实空间图像。因此，可以利用显微镜的各种造影方法，例如宽视场荧光22，24，共聚焦荧光25，偏振26，暗场27或光片荧光28显微镜。此外，用于DDM分析的图像可用于粒子跟踪或粒子图像测速，以提供补充信息。
动态光散射和光学显微镜的这种功能组合使DDM成为一种功能强大且用途广泛的技术。自 Cerbino 和 Trappe 在 2008年首次描述以来，其中 DDM 被证明可以测量 73 nm 胶体颗粒的扩散，DDM 已被用于测量流动胶体29、胶体聚集30、31、向列状液晶26 的粘弹性、胶体凝胶32 的动力学、粗化泡沫33、受限环境中的纳米颗粒34、35、36、37、细菌运动38、39、40、41、弱散射蛋白簇的扩散42、流体界面处的毛细管波43、以及其他系统。那些寻找更完整的使用DDM的出版物列表的人可以参考有关主题22，23，44，45的全面审查论文。
DDM也被用于研究生物网络的动力学。德雷克斯勒等人使用DDM测量活 果蝇 卵母细胞中肌动蛋白的动力学46。Burla等人量化了透明质酸和透明质酸-胶原复合材料网络中示踪颗粒的动力学47。DDM的几个用途用于研究重组细胞骨架网络9，10中示踪粒子的动力学，此类网络48，49中DNA分子的运输以及活性重组网络的动力学11，50，51。DDM在测量此类系统中的动力学方面的一个优点是不需要定位和跟踪单个颗粒或分子。因此，例如，尽管难以追踪这种小分子和非球形分子，但可以使用DDM测量拥挤环境中DNA分子的动力学。此外，通过荧光显微镜，可以使用多色标记来选择性地测量复杂复合材料中单个成分的动力学。
要执行 DDM，需要随时间 I（x，y，t） 拍摄一系列图像。对于给定的滞后时间 Δt，可以找到由该滞后时间分隔的所有（或一部分）图像对。每对差的平方傅里叶变换，
一起计算和平均。这个量是 
径向平均的，前提是动力学是各向同性的。这将生成 DDM 矩阵（也称为图像结构函数） 
。此过程如图 1 所示。为了从此 DDM 矩阵中确定样本的动态，假定 DDM 矩阵采用以下形式：
其中 A 是振幅，取决于显微镜的细节和样品的结构， B 是背景，这取决于图像中的噪声， f（q，Δt）是中间散射函数（ISF），它包含有关动力学21，22的信息。在简单的情况下，
其中 τ 是特征衰减或去相关时间。这种ISF已被用于在热转系统上使用DDM的几项研究中，例如稀释胶体悬浮液21，24，27，37，40，52。但是，其他形式的 ISF 可用于对各种类型的动力学进行建模。例如，可以使用累积膨胀将多分散样品的 ISF 建模为
其中μ 是多分散度42，53的量度;如果密度波动衰减了两种不同的模式，则可以使用ISF，如
票价：26、 54、 55、 56、 57;
其它ISF可用于游动微生物或其它活性颗粒38、39、40、41、58、59。
图 1：DDM 分析概述。 根据图像的时间序列，计算图像差异的傅里叶变换以计算DDM矩阵。DDM 矩阵可以拟合到模型中，以确定 q 值范围内密度波动的时间尺度。 请点击此处查看此图的大图。
在这里，描述了使用在Python中开发的DDM分析软件包，PyDDM。该软件包建立在我们的研究实验室和其他已发表的研究在过去几年中所做的工作之上。创建此软件包的主要动机包括需要（1）跟踪和存储分析中使用的元数据和参数;（2）从头到尾进行详细的分析，并附上详细的分析实例;（3）一种使用不同（或创建新的）数学模型来拟合数据的简单方法（例如，添加ISF模型，例如最近为有源细丝60开发的模型，将很简单）。其他用于DDM分析的软件包也存在，尽管并非所有软件包都有很好的文档记录并以开源编程语言编写。例如，在 GPU 上计算的代码C++ （https://github.com/peterlu/ConDDM）25、C++使用傅里叶变换来加快计算速度的代码（https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro）61、MATLAB 和 Python 版本 （https://github.com/MathieuLeocmach/DDM）40、MATLAB 代码 （https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html）27 以及具有不确定性量化的 MATLAB 代码（https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ）62.由于这个PyDDM包有很好的文档记录，并且在如何计算和分析DDM矩阵方面提供了很大的灵活性，因此无论其编程或图像分析背景如何，它都有望对希望实现DDM的研究人员有用。
该协议显示了如何使用该软件包来量化 体外 重构细胞骨架网络的动力学。这是通过使用两组不同的成像数据来完成的：（1）用明场显微镜拍摄的嵌入在vimentin网络中的亚微米示踪颗粒的图像，以及（2）用激光扫描共聚焦显微镜拍摄的具有肌球蛋白驱动活性的纠缠复合网络中荧光标记的肌动蛋白和微管丝的图像。对这两个数据集的分析突出了DDM的显着优势，包括它能够分析使用各种成像方式（例如，明场或共聚焦荧光）拍摄的图像，从嵌入式示踪剂或标记的细丝中提取动力学，以及量化各种动力学（例如，下扩散和约束或弹道）。
Protocol
注意：可以在以下 GitHub 存储库中找到 Jupyter 笔记本文件，其中包含用于执行以下协议中每个步骤的代码，https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples。该文件的 PDF 包含在补充文件 1 中。此外，还可以在网站上找到每个函数和类的代码和文档的演练，https://rmcgorty.github.io/PyDDM/。
1. 软件安装
- 若要按照示例 DDM 分析文件进行操作，请安装 Jupyter 笔记本以运行代码。安装其他必需的常用Python软件包，包括NumPy和Matplotlib。这些软件包都与 Anaconda 发行版捆绑在一起（参见 https://www.anaconda.com/products/individual）。
- 安装蟒蛇包63.此包对于组织和存储元数据和分析参数是必需的。如果使用 Anaconda 发行版，请使用以下命令安装 xarray（及其推荐的依赖项）：
conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 Bottleneck - 使用以下命令安装 PyYAML 软件包：
conda install -c anaconda yaml
此软件包对于读取有关要分析的图像的元数据以及用户设置的用于分析和拟合的参数是必需的。 - 通过从 GitHub 存储库下载或使用 git 命令来安装 PyDDM 包：
git 克隆 https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git
2. 规划成像会话
- 选择最佳的可用成像方式和光学设置。如前所述，DDM可以与许多显微镜方法一起使用。
- 为了帮助规划要使用的适当物镜和图像尺寸，请根据像素尺寸和总图像尺寸确定将探测的波数 q的范围。根据这些计算，确认放大倍率和视场的选择对于实验是最佳的。对于这里分析的图像，将60x 1.4 NA物镜和256 x 256像素的图像尺寸（像素尺寸为0.83μm）用于活性肌动蛋白微管复合网络。对于嵌入在vimentin网络中的珠子的图像，使用100x 1.4 NA物镜和512 x 512像素的图像尺寸，像素尺寸为0.13μm。
注意：最小 q 由 2π/NΔx 设置，其中图像大小（假定为正方形）为 N × N 像素，像素大小为 Δx。最大 q 是π/ Δx 和2π NA / λ的最小值，其中NA是成像物镜的数值孔径， λ 是光的波长（对于明场成像，可以用（NA物镜 + NA聚光镜）代替NA）/2）。 - 接下来，考虑要调查的时间刻度范围。通常，DDM分析在至少1000帧的序列上进行。
- 要确定适当的帧速率，请考虑样本中的要素按最小可分辨长度刻度（对应于最大 q）的顺序移动距离的预期时间。
- 在考虑探测到的时间尺度范围的上限时，要认识到，通常，给定滞后时间Δt 的数百个图像差异的功率谱被平均在一起，以提供足够的统计数据来降低噪声。因此，采集比探测的最大时间尺度更长的图像序列。
注意：如果已知预期的扩散系数 D或速度 v，则可以使用τ = 1/ Dq2或τ = 1 / vq 以及 q的范围来估计预期的特征衰减时间，这是根据视场和像素大小确定的。在可访问的 q范围内，预期τ值的范围可以帮助指导帧速率的选择和要获取的帧数。
3. 样品制备和图像采集
注：有关用于代表性结果部分所述数据的样品制备和成像设置的详细信息，请参阅作者11，51，64和补充文件2的先前出版物。
- 基于对探测时间和长度尺度的考虑，理想情况下，采集超过1000帧的图像序列。
注意：代码将分析图像中的正方形图像或感兴趣的正方形区域，因此请相应地调整帧大小。 - 将图像序列另存为三维灰度 TIFF 堆栈。或者，尼康仪器系统使用的格式ND2格式可以由安装的软件包读取。如果图像以某种不同的格式保存，请使用 ImageJ 或其他成像处理程序将图像转换为 TIFF 堆栈。
注意：如果使用 ND2 文件，则必须安装 https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader 的包 nd2reader。
4. 参数设置
- 创建示例文件夹下的 PyDDM 代码存储库中提供的参数文件example_parameter_file.yml 的副本。使用文本编辑器（如记事本++）或JupyterLab中的文本编辑器打开此YAML文件。请参阅 补充文件 2 ，了解在代表性结果部分提供的数据分析中使用的示例 YAML 参数文件。
- 在复制的 YAML 文件中，提供与要分析的图像序列对应的数据目录和文件名。在元数据部分下，提供像素大小和帧速率。
- 在Analysis_parameters部分下，提供有关如何计算 DDM 矩阵的详细信息。此处的某些参数是可选的。
- 至少应为参数number_lag_times和last_lag_time提供值。它们分别对应于要计算 DDM 矩阵的不同滞后时间数和要使用的最长滞后时间（以帧为单位）。对于这里使用的活菌素网络中示踪剂微球的数据，number_lag_times和last_lag_time参数分别为60和1000。该代码将计算从 1 帧（如果指定了可选参数 first_lag_time，则为其他最小延迟时间）到具有对数间距的last_lag_time的延迟时间的 DDM 矩阵。
注意：如果采集 M 帧，则可以计算出与 M-1 一样大的滞后时间的 DDM 矩阵。但是，由于在如此大的滞后时间内统计数据较差，因此数据可能会很嘈杂。计算DDM矩阵的最长滞后时间将取决于数据的细节，但我们建议尝试大约三分之一的图像序列持续时间。
- 至少应为参数number_lag_times和last_lag_time提供值。它们分别对应于要计算 DDM 矩阵的不同滞后时间数和要使用的最长滞后时间（以帧为单位）。对于这里使用的活菌素网络中示踪剂微球的数据，number_lag_times和last_lag_time参数分别为60和1000。该代码将计算从 1 帧（如果指定了可选参数 first_lag_time，则为其他最小延迟时间）到具有对数间距的last_lag_time的延迟时间的 DDM 矩阵。
- 在Fitting_parameters部分中提供有关如何拟合 DDM 矩阵或中间散射函数 （ISF） 的详细信息。在 model 参数下提供模型的名称。为所选模型中的每个拟合参数提供初始猜测、下限和上限。
注： 要显示可能的管接头模型的列表，请运行函数print_fitting_models。这些模型也可以在PyDDM网站上的在线文档中找到。
5. 计算数字分方程矩阵
- 初始化DDM_Analysis类的实例。为此，请通过将 YAML 文件的文件名（包括完整文件路径）传递给DDM_Analysis来提供上面讨论的元数据和分析参数。或者，将元数据和参数作为 Python 字典数据结构传递。
- calculate_DDM_matrix运行函数以计算 DDM 矩阵。此计算可能需要几分钟或更长时间，具体取决于帧大小和滞后次数。有关典型运行时间，请参见 图 2 。
- 检查返回的数据，这些数据将位于 xarray 包（称为数据集）中的数据结构中。此数据结构存储在属性ddm_dataset下。
注意：不仅 DDM 矩阵，关联的变量和元数据也将存储在此数据结构中。它还将以网络通用数据形式 （netCDF） 格式保存到磁盘。 - 检查将生成和显示的绘图和图形。这些数字也作为 PDF 文件保存在数据目录中。
- 请参阅其中一个生成的图显示了傅里叶变换图像的融合平均平方模量，
作为 q的函数。默认情况下，代码使用它来估计背景参数 B。通过假设在 大 q 的限制下，它将接近 B/2（其中 B 是背景）来估计背景。 - 如果 q 没有 达到大范围的高原，则使用另一种方法来估计 B。为此，请将参数background_method在 YAML 文件中设置，或设置为函数calculate_DDM_matrix的可选关键字参数。有关估计 B 的方法的更多详细信息，请参见代表性结果部分。
- 请参阅其中一个生成的图显示了傅里叶变换图像的融合平均平方模量，
图 2：计算 DDM 矩阵的计算时间。在 （A） 和 （B） 中，显示了计算 DDM 矩阵的时间。所有情况下使用的数据都是一部 5000 帧的影片，图像大小为 512 x 512 像素。DDM矩阵计算了30个滞后时间，对数间隔在1帧（0.01 s）和1000帧（10 s）之间。该代码在具有 32 GB RAM 的英特尔 i7-10700 2.90 GHz 台式计算机上运行。在（A）中，显示了在计算每个滞后时间的DDM矩阵时使用多少图像差异的变化效果。为此，图像被合并以产生256 x 256的图像大小。对于每个滞后时间 Δt，减去由该 Δt 分隔的图像，得到的矩阵进行傅里叶变换。对于给定的Δt，可以使用由该Δt分隔的所有图像对（以蓝色显示），只能使用非重叠图像对（例如，帧1和10，10和19等;以棕色显示），或者每个Δt可以使用300个或更少的图像对。在（B）中，显示了更改图像大小对计算时间的影响。通过对 2 x 2、4 x 4 或 8 x 8 像素进行分组来合并图像，从而生成的图像大小分别为 256 x 256、128 x 128 或 64 x 64。对于每个图像对，大约使用300个图像对来计算每个Δt的DDM矩阵。（C） 从DDM矩阵中，可以提取中间散射函数（ISF）。对于 （A） 中的三种情况，显示了这一点。当每个Δt使用最大图像对数时，蓝色数据点（无偏移）对应于ISF;当每个Δt使用非重叠图像对时，棕色数据点（偏移量为0.1）对应于ISF;粉红色数据点（偏移量为0.2）对应于ISF，每个Δt最多使用300个图像对。使用非重叠图像对发现的ISF在长Δt处显示出噪声。在这种情况下，很少在长Δt下使用图像对（例如，对于1000帧的Δt，仅使用4个图像对）。（D） 通过将 ISF 拟合到指数函数，可以确定每个波数 q 的特征衰减时间 τ。粉红色表示，将原始图像合并 2 x 2 后显示结果，从而生成 256 x 256 的图像大小。在灰色中，结果在合并 8 x 8 后显示，图像大小为 64 x 64。通过对数据进行分箱，可以丢失有关较高波数下动力学的信息，但计算64 x 64图像的DDM矩阵比计算256 x 256图像快约16倍。请点击此处查看此图的大图。
6. 拟合 DDM 矩阵或 ISF
- 初始化DDM_Fit类的实例。为此，请传递给 DDM_Fit包含用于拟合的图像元数据和参数的 YAML 文件的文件名。
- 确定 DDM 矩阵或 ISF 用于拟合数据的模型。通过执行函数print_fitting_models列出可用模型。指定要在 YAML 参数文件中使用的模型，或使用函数 reload_fit_model_by_name。
- 在提供的 YAML 参数文件中为所选模型中的每个参数设置初始猜测和边界。若要更改任何参数的初始猜测，请使用函数 set_parameter_initial_guess。使用函数set_parameter_bounds设置参数的边界。例如，如 补充文件2所示，对于vimentin网络中示踪剂磁珠的数据，衰变时间的初始猜测为1 s，该参数的边界为0.01 s和2000 s。
- 使用函数拟合执行拟合。为此函数的输出分配一个变量，以便轻松访问结果。
注意：此函数可以采用许多可选参数。有关此类参数的列表以及何时考虑将它们设置为非默认值，请参阅代码文档和提供的示例。
7. 解释拟合结果
- 使用函数fit_report生成用于检查拟合参数的拟合和 q 依赖性的图。
注意：此功能将生成一系列绘图，这些绘图也将另存为PDF。此函数的可选参数可用于修改生成的绘图。 - 在生成的图中，将有一个包含 2 x 2 子图的图，显示 DDM 矩阵或 ISF（取决于所选的拟合模型）在四个 q 值（指定为fit_report的可选参数），以及使用模型和最佳拟合参数计算的 DDM 矩阵或 ISF。要以交互方式绘制 DDM 矩阵或 ISF 以及最佳拟合值，请使用类Browse_DDM_Fits，如使用 Jupyter 笔记本环境时提供的示例中所示。
- 根据特征衰减时间τ与波数 q的曲线，确定动力学是否遵循扩散，亚扩散，弹道或某种其他类型的运动。这可以通过寻找τ和 q之间的幂律关系来完成。
注意：在函数fit_report生成的 τ 与 q 的对数-对数图上，将显示三行，对应于指定 q 值范围内的幂律拟合。黑色实线对应于将τ与 q 拟合到幂律，τ = 1 / Kqβ，其中 K 和β 是自由参数。橙色虚线对应于拟合简单扩散，τ = 1 / Dq2，其中 D 是扩散系数。蓝色的虚线对应于拟合 τ = 1 / vq，其中 v 是速度。
8. 保存结果
- 拟合结果将保存在 xarray 数据集中。使用 xarray 函数to_netcdf或 Python 的内置泡菜模块将此数据结构保存到磁盘。使用open_dataset的 xarray 函数加载这些网络 CDF 文件。
- 使用函数save_fit_results_to_excel将拟合结果以及数据保存到工作表文件中。
Representative Results
在这里，我们展示了从两组不同的实验中使用PyDDM进行分析的示例。在一组实验中，将亚微米示踪剂微球嵌入由中间丝蛋白vimentin组成的网络中，并在100帧/秒的明场模式下使用100x物镜进行成像（图3A）。Vimentin在间充质细胞中表达，是细胞质65的机械性质和细胞核的机械稳定性的关键决定因素，细胞在进行密闭迁移66，67。到目前为止，重构的维门汀网络主要通过宏观流变学64，68，69进行研究，而动力学受到的关注相对较少13，70，71。这些实验的其他细节可以在补充文件2中找到。在另一组实验中，用肌动蛋白，微管和肌球蛋白制备活性细胞骨架网络。光谱不同的荧光标记允许使用双色激光扫描共聚焦显微镜以2.78帧/秒的速度使用60x物镜对肌动蛋白和微管细丝进行成像（图3B，C）。肌动蛋白和微管丝都是动态细胞形状变化的重要驱动因素，它们的作用由机械和生化相互作用协调72。这些实验的其他细节可以在11中找到。从这些实验中获取的图像序列中的各个帧如图3所示。
（A）活菌素网络中0.6μm微球的明场图像。（乙、丙）在激光扫描共聚焦显微镜上使用60x物镜拍摄的活性肌动蛋白 - 微管复合材料中的（B）微管和（C）肌动蛋白的图像，使用561nm激发光进行微管成像，使用488nm激发光进行肌动蛋白成像。请点击此处查看此图的大图。
对于vimentin网络中的示踪剂珠的图像，以100帧/秒的速度记录了5000帧，尺寸为512 x 512像素的电影。由此，DDM矩阵在1到1000帧之间或0.01 s和10 s之间的60个对数间隔滞后时间计算。为了估计背景，计算了B，即傅里叶变换图像的平方平均值，
并将其设置为
55，73。假设在 q 值的最大 10% 上，此量等于 B/2，并且 B 与 q 无关。这是包用于估计 B 的默认方法，但通过将 background_method 参数设置为其他值，也可以使用其他方法。
从 中确定参数 A（q） 和 B 后，可以从 DDM 矩阵中提取中间散射函数 （ISF）。示例 ISF 如图 4 所示。在图4A中，显示了嵌入在维门汀浓度为19μM的网络中的0.6μm直径珠子图像的ISF。在图4B中，显示了维门汀浓度为34μM的网络中相同类型磁珠的ISF。有趣的是，在这两种情况下，ISF都没有衰减到零。在较大的滞后时间，对于遍历系统，ISF 应接近于零。也就是说，在这样的系统中，密度波动应该在较大的滞后时间内完全去相关。这里的ISF没有衰减到零的事实可能是由于对A（q）和B的不准确估计造成的，这些估计用于从计算的DDM矩阵中查找ISF。值得注意的是，在某些情况下，此处采用的方法可能会高估B 62。然而，更有可能的是，示踪剂磁珠的动力学是真正非遍历的，因为磁珠的尺寸与网络网状尺寸相当，因此可能会被笼住。其他数据证实了非遗传性的发现。也就是说，微球尺寸0.6 μm大于19 μM浓度的0.4 μm和34 μM浓度的0.3 μm的网格尺寸的计算平均值。此外，这些示踪剂微球的单粒子跟踪结果（稍后显示）也显示了受限运动。
图 4：维门汀网络的几个波数处的中间散射函数。ISF绘制为q值从约1到9μm-1的滞后时间的函数。（A）来自vimentin网络中0.6μm珠子图像的ISF，其中vimentin浓度为19μM。ISF 在值远高于零时的长滞后时间平台表示非同步性。请点击此处查看此图的大图。
鉴于动力学可能是非遍历的，ISF适合于形式
，其中C是非遍历因子32。这种形式的ISF已经用于先前的非随机动力学研究，例如胶体凝胶32，74或肌动蛋白 - 微管网络10中的示踪颗粒。图4中的黑色虚线显示了与数据的拟合。从这些拟合中，现在可以查看衰减时间τ和非遍历参数C的q依赖性。
图 5：活体蛋白网络的衰减时间与波数的关系。从拟合到 ISF，衰减时间 τ 是针对 q 值范围确定的。为了清楚起见，我们不是显示每个 q 的 τ 值，而只是一个对数间隔的集合。蓝色（tan）是来自维门汀网络内0.6μm珠子的数据，其维生素素浓度为19μM（34μM）。误差线表示多个短片中以τ为单位的标准偏差（4个短片用于19 μM网络[蓝色]的数据，5个短片用于34 μM网络[tan]的数据）。红色虚线标记我们的时间和空间分辨率的估计边界，如结果中所述。黑色实线表示
缩放，这将指示扩散运动。这两个数据集都不遵循此缩放。相反，19 μM网络中的磁珠表现出次扩散运动（
β>2），34 μM网络中的磁珠显示出受限或笼中运动。请点击此处查看此图的大图。
衰减时间在低 q 和高 q 极值下都显示出大量的不确定性，如图 5 所示。此图上的误差线显示了针对较低维生素水平案例分析的四个视频或针对较高浓度分析的五个视频之间的标准偏差。要了解这些极端情况下较大不确定性的来源，请考虑时间和空间分辨率。分辨率的近似极限用三条红色虚线显示。两条水平线对应于探测到的最小和最大滞后时间。给定 100 帧/秒的帧速率和对应于 1000 帧的最大滞后时间（总视频持续时间的 20%），当测量快于 0.01 秒或慢于 10 秒的动态时，精度会丢失。在较低的 q 值下，τ 的拟合值大于 10 s。因此，在大于最大滞后时间的衰减时间内，预计会出现较大的不确定性。在q范围的较高端，衰减时间接近0.01 s的最小滞后时间，但保持在该值之上。在这些较高的 q 值下，空间分辨率可能不是时间分辨率的限制因素。给定0.13μm的像素大小，q的最大值约为24μm-1。然而，衍射极限分辨率并不一定允许在这些高空间频率下精确测量动力学。接近光学分辨率会导致波数上限约为
16μm-1，给定物镜的数值孔径NA为1.4和光
波长。这由图 5 中的垂直红色虚线虚线标记。事实上，在q的大值下，数据是嘈杂的。甚至在q的近似上限之前，就已经看到τ的不确定性增加，这可能是由于高估了qmax。光学分辨率比预测的差可能是因为使用油浸透镜将盖玻片以外的图像成像到水样中，或者因为聚光透镜未完全对齐。
对于嵌入在浓度较低的网络（19μM vimentin）中的0.6μm磁珠，可以从衰减时间与波数的对数对数图中观察到衰减时间随波数以与幂律一致的方式减小（图5）。然而，它似乎并没有遵循正常扩散运动的预期，其中.相反，τ 随着 q 的增加而急剧下降。这表明了次深陷运动，在诸如此类的拥挤环境中，珠子经常发生这种情况。在 1.4 μm-1 至 12.3 μm-1 的范围内拟合 τ（q） 到 τ = 1/Kq 形式的幂律β 得到传输参数 K = 0.0953 μmβ / s，β = 2.2。对于那些更习惯于将示踪粒子的均方位移（MSD）视为滞后时间的函数（即MSD = K' Δtα）来考虑正常扩散与次扩散的人来说，认识到MSD方程中的次扩散缩放指数α等价于α = 2 / β是有帮助的。换句话说，β = 2.2 的值与 MSD 方程中α = 0.9 的次扩散缩放指数一致。通过将参数Good_q_range在 YAML 文件中指定 q 数组的索引，或者通过将可选参数forced_qs传递给函数generate_fit_report，将 PyDDM 设置为在此 q 值范围内拟合 τ（q）。对于此处的数据，从1.4 μm-1到12.3 μm-1的q范围对应于q数组从15到130的指数。
对于更浓缩的网络（34 μM）中的0.6 μm磁珠，衰变时间对q的依赖性很小。这可能是由于网格尺寸较小的网络中珠子的非遗传性。为了探测此系统中的非遗传性，应将非遗传性参数 C 绘制为 q 的函数，如图 6 所示。对于19μM活菌素网络中的0.6μm磁珠，C≈0.2，对q的依赖性很小（未显示）。然而，对于含有34μM维门汀的网络和具有更高浓度49μM维生素素的网络，C的对数与q2成正比，如图6所示。C 和 q 之间的这种关系对于受限运动是预期的。对于被困在网络口袋中的磁珠，MSD预计在足够长的滞后时间内趋于稳定（即，
MSD在哪里
，δ2是最大MSD）。由于 ISF 可以用 MSD 表示为 
，并且由于非遍历 ISF 在很长的滞后时间（即）进入 C，
因此得到32，75 的关系
。因此，可以使用C（q）找到δ2，对于34和49μM活门汀网络，这分别产生了δ 2 = 0.017μm2和0.0032μm2（对应于δ = 0.13μm和0.057μm）。
图 6：非同步性参数与维门汀网络波数的关系。从拟合到 ISF，非符性参数 C 针对 q 值的范围确定。棕褐色（红色）是来自维门汀网络内0.6μm珠子的数据，其vimentin浓度为34μM（49μM）。误差线表示多个视频中以τ为单位的标准偏差（34 μM网络[tan]的数据为5个视频，49 μM网络数据为4个视频[红色]）。y 轴具有对数缩放。我们观察到 C 的 q 依赖性，它允许提取最大均方位移，δ2。拟合用实线显示。请点击此处查看此图的大图。
可以使用其他方法从数据中提取 δ 限制大小，以及通过检查19μM活门汀网络内珠子的τ（q）发现的次扩散指数。首先，可以使用贝勒斯等人76 和Edera等人77 描述的方法从DDM矩阵中提取MSD。值得注意的是，此方法不需要拟合 DDM 矩阵。人们只需要计算 DDM 矩阵 D（q， Δt） 和 
（从中可以确定 A（q） 和 B ）。然后，要找到MSD，请使用关系 
。请注意，这种查找MSD的方法假设粒子位移的分布是高斯的，尽管先前的工作已经表明，在某些情况下，从DDM导出的MSD确实与粒子跟踪的MSD一致，即使位移是非高斯73。对于这个系统，正如预期的那样78，大位移的分布中存在非高斯性，如图 S1所示。在 PyDDM 包中，应执行函数extract_MSD，该函数返回 。其次，可以使用单粒子跟踪来查找MSD。虽然DDM可用于分析高密度颗粒或有限的光学分辨率禁止精确颗粒定位的图像，但对于vimentin网络中0.6μm微球的图像，我们能够使用tracpy软件（https://github.com/soft-matter/trackpy）79定位和跟踪磁珠。该粒子跟踪软件包使用克罗克和格里尔80描述的算法。
图 7：维门汀网络的均方位移与滞后时间的关系。 使用两种方法测定MSD。首先，根据DDM矩阵（用实心符号显示）计算MSD。接下来，通过使用单粒子跟踪（SPT）来查找粒子轨迹（开放符号）来确定MSD。误差线的确定方式与前两个图例中所述的方式相同。（A）19 μM活体蛋白网络中0.6 μm微球的MSD表示亚扩散运动，两种查找MSD的方法之间具有良好的一致性。（B）49 μM活菌素网络中0.6 μm微球的MSD表示笼中运动，两种查找MSD的方法与从非能性参数中发现的最大MSD之间具有良好的一致性。 请点击此处查看此图的大图。
19 μM 活菌素网络和 49 μM 活菌素网络中 0.6 μm 微球的 MSD 与滞后时间的关系如图 7 所示。在这两种情况下，从DDM测定的MSD与通过单粒子跟踪（SPT）发现的MSD非常吻合。此外，对于不太集中的网络，次扩散缩放指数（α）
约为0.9。这与通过拟合 ISF 来确定 τ（q） （即 2/2.2 = 0.9） 找到的 
τ（q） 缩放一致。对于更集中的网络，MSD在较长的滞后时间内处于平台状态。通过分析非能性参数的 q 依赖性（如图 7B 所示，水平线为 δ2 = 0.0032 μm2）找到的最大 MSD 与 SPT 和 DDM 的 MSD 似乎趋于平稳的值大致相同。图7A中由DDM和SPT确定的最长滞后时间MSD之间存在差异。虽然这可能是由于有限数量的长滞后时间轨迹，但进一步优化使用DDM矩阵估计每个滞后时间的q值的范围（如Bayles等人76和Edera等人所做的那样）也可能改善我们的结果， 这种优化将是未来工作的重点。
这些实验记录了嵌入在维门汀中间细丝网络中的示踪剂珠的图像序列，允许进行独立分析：DDM（使用此处描述的包装）和SPT（使用tracpy）。这两种分析都可以揭示下扩散的程度和限制长度，允许使用两种独立的图像分析技术来提供互补的指标。可以从SPT和DDM中比较其他数量。例如，样本动力学中的非均质性可以在从SPT确定的粒子位移分布（即范霍夫分布）以及从DDM确定的适合于拉伸指数34，35的ISF中显示为非高斯性。图S1显示了Vimentin网络中0.6μm颗粒的范霍夫分布，并讨论了从拟合ISF中发现的拉伸指数 - 在先前的研究中串联使用的指标，以证明仿生系统中颗粒的非均质动力学9，10，47或其他拥挤环境中的异构动力学 34.作为另一个例子，ISF可以根据用SPT测量的粒子轨迹计算出来，并与DDM获得的ISF进行比较。虽然均方位移和位移分布是最常从SPT分析中提取的指标，但也可以使用从粒子轨迹 
中计算ISF（参见图S2）。该ISF可以与DDM生成的ISF进行比较，并用于揭示MSD59中不明显的动力学。
虽然在网络中获取示踪粒子的图像可能允许人们使用SPT和DDM的补充分析方法，但重要的是要注意DDM相对于SPT的一个优点是它不需要可以很容易地定位和跟踪的珠子（或其他特征）的图像。为了证明这一点，我们接下来重点介绍对肌动蛋白和微管丝活性网络的分析，其中肌动蛋白和微管蛋白的荧光标记允许使用多色激光扫描共聚焦显微镜对两种灯丝类型进行成像，通过不同的荧光团相互区分。
用激光扫描共聚焦显微镜获取肌动蛋白 - 微管网络的图像，其活性由肌球蛋白（兔骨骼肌肌球蛋白II;细胞骨架#MY02）。实验的细节和结果已经如前所述11，这里显示的代表性结果来自补充材料（电影S1和S4）中提供的两部电影的分析11。两个图像序列都以2.78帧/秒的速度记录了1000帧。
为了分析这些图像，DDM矩阵计算了50个滞后时间，范围从0.4 s到252 s（1帧到700帧）。然后DDM矩阵拟合到模型中 ，中间散射函数为 
。因此，有四个拟合参数： A、 τ、 s 和 B。这些拟合的结果如图 8 所示。观察到，特定 q值的DDM矩阵在低滞后时间具有平台，随着滞后时间的增加而增加，然后在大滞后时间趋于稳定（或显示出开始趋于稳定的迹象）。 q 值较低的 DDM 矩阵在较长的滞后时间内没有达到稳定状态。因此，人们应该期望在这些低 q （大长度尺度）动力学的衰减时间测量中精度较差。
从拟合到DDM矩阵的特征衰减时间 τ如图 9所示。给出了活性肌动蛋白 - 微管复合网络（类似于电影S111）和活性肌动蛋白网络（类似于电影S411）的结果。两个网络都是用相同浓度的肌动蛋白和肌球蛋白制备的，但是仅肌动蛋白网络是在没有微管蛋白的情况下创建的，如11中所述。对于这两种类型的活动网络，观察到的幂律关系为 
。这种缩放表示弹道运动，并且肌球蛋白驱动的收缩和流动在细丝的热运动中占主导地位。从 τ = （vq）-1开始，可以发现活性肌动蛋白微管网络的特征速度 v约为10 nm / s，活性肌动蛋白网络的特征速度v为75 nm / s。这些值与11所示相同视频的粒子图像测速分析一致。在活性肌动蛋白-微管复合网络的较低 q 值下，缩放不成立。这可能是因为这种肌动蛋白微管复合网络在较低 q 值下的真实衰变时间长于计算的DDM矩阵的最大滞后时间。最大滞后时间用 图9中的水平红线表示，衰减时间偏离了这些较长时间附近的预期缩放。
图 8：活性肌动蛋白-微管复合网络的 DDM 矩阵与滞后时间的关系。 几个 q 值的DDM矩阵绘制为滞后时间的函数，该图像由2.9μM肌动蛋白单体，2.9μM微管蛋白二聚体和0.24μM肌球蛋白组成的复合网络的薄膜组成。这些数据仅显示了对多色时间序列图像的微管通道的分析。 请点击此处查看此图的大图。
图9：活性肌动蛋白微管网络的衰减时间与波数的关系。 通过拟合DDM矩阵，可以找到衰减时间 τ，作为波数 q的函数。对于棕色的活性肌动蛋白微管网络（仅分析微管通道）的图像和绿色的活性肌动蛋白网络的图像，绘制为τ vs q 。两个网络具有相同浓度的肌动蛋白和肌球蛋白（分别为2.9μM和0.24μM）;肌动蛋白 - 微管复合物具有2.9μM的微管蛋白二聚体。活性肌动蛋白网络的衰减时间远小于活性肌动蛋白-微管网络的衰变时间，这表明活性肌动蛋白网络的运动速度更快。在这两种情况下，动态都是弹道的，因为数据遵循趋势。插图：ISF 与波数（Δt × q）缩放的滞后时间的图显示 ISF 在 q 值范围内的崩溃。这也表明了弹道运动。此插图中显示的 ISF 来自活动肌动蛋白网络。 请点击此处查看此图的大图。
对于有源网络的这些数据，我们选择拟合 DDM 矩阵 。这与对维门汀网络中的磁珠数据所做的工作形成鲜明对比，其中A（q）和B是估计的，没有任何拟合来分离ISF，f（q，Δt）。在这种情况下，对于活动网络数据，A 和 B 被保留为拟合参数，因为用于估计 B 的方法没有产生良好的拟合。估计 B 的默认方法是计算并假设，总的来说，这属于 B/2。然而，这种方法高估了B的数据，这体现在这样一个事实中：当计算以这种方式估计的B的ISF时（未显示），ISF在早期滞后时间大于1（而它们应该从最大值1变为零或一些非同步性参数，随着滞后时间的增加）。可以使用参数background_method选择其他方法来估计B。这些其他方法之一是估计B是早期滞后时间DDM矩阵的最小值（设置为background_method= 1）。Bayles等人使用了类似的方法，尽管他们没有假设B与q是常数。另一种选择是估计 B 是 DDM 矩阵在最大 q（设置为 background_method=2）时所有滞后时间的平均值。这些用于估计背景的不同方法，以及允许 B 成为自由拟合参数的结果，如图 10 所示。从这些图中可以看出，振幅A在探测的最大q值处没有达到零，因为在大q处没有达到稳定（图10B），并且由于D（qmax，Δt）从较低的滞后时间平台到某个较高的滞后时间平台（即，在qmax处，存在非零A;图 10D）。因此，对 B 
的估计既不合适，也不如 A 样
。在决定如何（或是否）估计B之前，应该检查q和D（q最大值，Δt）与Δ t。
图 10：主动肌动蛋白微管网络的背景与波数。 通过拟合DDM矩阵，可以找到背景 B，作为波数 q的函数。图中所示为 B 与 q ，表示由这些与紫色符号拟合的活性肌动蛋白微管网络（仅分析微管通道）的图像。（A） 中的三条实线显示了在没有任何拟合的情况下发现的背景的估计值。（A） 中最暗的顶部线显示使用 
的估计背景，如果 高原在大 q 下达到恒定值，则可能合适。从（B）中，注意 尚未达到探测的最大 q 处的常量值。因此，使用此方法会高估背景。（A） 中的底线显示了使用 
的估计背景。如果DDM矩阵显示低滞后时间平台，如（C）所示，带有红线，则此方法可能适用于估计背景。（A） 中中间最亮的线显示的 估计背景。如果在 q最大值处，振幅 A 已达到零，则此方法可能适用。从（D）可以看出振幅不为零，因此，这种方法高估了背景。 请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：粒子位移的概率分布。颗粒位移的概率分布显示，对于34 μM和49 μM的活体素浓度，在34 μM和49 μM的活体素浓度下，对直径为0.6 μm的珠子进行单颗粒跟踪。在这三个条件的位移分布中显示了不同的滞后时间。（A）19μM维门汀网络中粒子位移的分布与高斯函数拟合。高斯的宽度随着滞后时间的增加而增加。（B）与19μM的情况相比，34μM维门汀网络中粒子位移的分布显示出更多的非高斯性，特别是在大位移下。（C）49μM维门汀网络中粒子位移的分布也显示出非高斯性。此外，分布的宽度不会像在具有较低维门汀浓度的样品中那样显着增加滞后时间，表明受限运动。非高斯范霍夫分布（可见于所有活体素样品，但在较高浓度下最为明显）与非均相动力学相关，这在拥挤和受限环境中的颗粒运输中经常出现。从 DDM 分析确定的另一个异质传输指标是用于拟合中间散射函数的拉伸指数（此处使用的 ISF 方程中的参数 s： +
）。在0.4μm-1至9.4μm-1的q范围内，从最高维门汀浓度到最低，0.53±0.07，0.64±0.02和0.86±0.04（平均±标准差）的平均拉伸指数。请按此下载此档案。
补充图S2：来自DDM和SPT的中间散射函数。 图中显示了五个不同波数的中间散射函数 （ISF）。通过DDM找到的ISF与滞后时间是用圆形标记绘制的，ISF是从具有开放正方形的单粒子轨迹计算出来的。黑色虚线表示与 DDM 获取的 ISF 的拟合。ISF 是根据单粒子轨迹计算的， 使用 。在（A）中，显示了19μM活菌素网络中0.6μm颗粒的ISF。在（B）中，显示了34μM活菌素网络中0.6μm颗粒的ISF。从DDM和SPT中发现的ISF的差异可能是由于有限数量的长滞后时间轨迹。 请按此下载此档案。
补充文件 1：使用 DDM 的协议。 给出了协议中所示步骤的输入和输出。 请按此下载此档案。
补充文件2：样品制备的详细信息和活菌素网络的示例参数文件。 提供了在维门汀网络上进行样品制备和图像采集的详细步骤。此外，还提供了用于分析维门汀网络代表性结果部分中提供的数据的示例参数文件。 请按此下载此档案。
Discussion
这里描述的软件包使用DDM来分析使用光学显微镜获取的图像中观察到的密度波动。首先显示嵌入在维门汀网络中的示踪颗粒数据的代表性结果。对这些数据的分析可用于表征网络的网格大小和刚度，类似于过去许多细胞骨架网络6，12，13研究中使用单粒子跟踪的方式。与单粒子跟踪相比，使用DDM的一个优点是DDM不需要对粒子进行定位。因此，即使在粒子密度太高或粒子太小而无法定位和跟踪的图像中，DDM仍然可以确定动态。单粒子跟踪在检查粒子间变异性时是有利的。使用DDM，可以找到集合平均动力学，而使用单粒子跟踪，可以计算单个粒子的MSD和集合平均MSD。然而，DDM可用于通过分析大视野内的多个感兴趣区域来研究异构动力学。
接下来，显示了由两种不同标记的细胞骨架丝类型组成的活性网络中荧光标记的细丝数据的代表性结果11。有了这些数据，弹道运动就被表征了，而不需要图像中任何可定位的特征。由于DDM以很少的用户输入提取融合平均动力学，因此它使得比较在不同条件下获得的图像序列变得简单（例如，比较具有不同肌动蛋白与微管比率的样品或具有不同浓度肌球蛋白的样品，如50所示）。此外，使用荧光成像，我们可以使用多色标记来研究网络不同组分的动力学。这是在11，50中完成的，其中使用多色成像在活性肌动蛋白 - 微管复合网络中分别分析肌动蛋白和微管的动力学。在这里的代表性结果部分中，仅显示了微管通道的结果，但在以前的工作中，我们比较了微管和肌动蛋白丝11的动力学。
我们注意到，这些具有代表性的结果显示了被动俯冲或主动弹道运动。重要的是，DDM可用于分析在中间时间或长度尺度上动力学类型存在交叉的系统。例如，Kurzthaler等人使用DDM和活性Janus胶体系统来探索短时间尺度上的主动定向运动和较长时间尺度59处方向的随机化;Giavazzi等人将DDM与粗糙的泡沫一起使用，并在对应于气泡33的长度尺度的动力学中发现了交叉;Cho等人将DDM与胶体凝胶一起使用，并发现了从分形簇到整个网络32的不同长度尺度上的三种可区分的方案。
代表性结果部分包含的数据是用明场显微镜和激光扫描共聚焦显微镜获取的。然而，如前所述，DDM可以与许多成像方式一起使用。对于任何成像方式，用户都应考虑光学设置，例如光学切片程度或景深。高度的光学切片可能会减少来自失焦物体的信号，但人们将无法在大于物体移出景深25，28的时间尺度上精确测量动态。关于 q相关景深如何影响DDM分析的更全面讨论可以在22中找到。对于明场成像，用户可能还需要考虑样品厚度。而对于弱散射样品，较厚的样品可以提供更多的信号42，而浑浊的样品可能需要修改分析以考虑多重散射81。最后，对于非线性空间不变的成像方法（即，物体的相机记录的强度取决于该物体在 x-y 样品平面中的位置），可能需要考虑线性空间方差，如暗场DDM27所示。
对于那些开始使用DDM的人来说，我们希望强调考虑空间和时间分辨率的重要性。当将确定的衰减时间作为波数的函数进行检查时，重要的是要标记分辨率的极限（即最大和最小滞后时间以及最数，如图5所示）。在收集数据之前，应仔细考虑这些限制，以便选择最佳的物镜、图像尺寸、帧速率和短片持续时间。另一个重要的考虑因素是如何估计背景参数 B。文献中已经使用了多种估计背景的方法，并且在先前的出版物62，77中已经描述了过度或低估B的影响。如图 10 所示，PyDDM 允许用户实现不同的 B 估计方法，我们建议新用户尝试这些方法并评估哪些方法适合使用。
该软件包的优势在于其全面的文档和演练，其中包含示例数据，元数据的存储和组织以跟踪分析的执行方式，以及如何分析DDM矩阵的灵活性（各种拟合模型，用于估计背景参数 B的多种方法，查找MSD的能力）。但是，此代码有多个方面可以改进。目前，代码尚未针对快速计算速度进行优化。加速计算的方法已经报告了61，62，这些方法将在未来的版本中实施。此外，我们计划实施最近报告的方法，以更好地估计不确定性，并采用模拟来引导用户使用适当的ISF模型62。对于其他改进，我们希望用户能够与我们联系并提供建议。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究的部分内容由美国国立卫生研究院R15奖资助（国家普通医学科学研究所奖号）。R15GM123420，授予美国皇家海军陆战队和R.J.M.），来自科学促进研究公司的科特雷尔学者奖（第27459号，授予R.J.M.）和威廉M.凯克基金会研究补助金（授予R.M.R-A.）。GHK非常感谢荷兰研究理事会的财政支持（NWO，NWO人才计划项目编号VI.C.182.004）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CMOS camera, Orca-Flash 4.0 | Hamatsu | ||
| F-127 Pluronic | Sigma Aldrich | ||
| Jupyter Notebook | |||
| Nanodrop | Thermo Fisher | ||
| Nikon Ti-Eclipse microscope | Nikon | ||
| PLL-PEG-bio | SuSos AG, Dübendorf, Switzerland | ||
| Polystyrene beads | Sigma Aldrich | ||
| Protein dialysis mini-cassette | Thermo Fisher | ||
| PyDDM | University of San Diego | N/A | Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM |
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