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Bioengineering

विभेदक गतिशील माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके साइटोस्केलेटन गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करना

Published: June 15, 2022 doi: 10.3791/63931
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 2, 2
1Cell Biology, Neurobiology and Biophysics, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 2Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

Summary

विभेदक गतिशील माइक्रोस्कोपी (डीडीएम) गतिशील प्रकाश बिखरने और माइक्रोस्कोपी की विशेषताओं को जोड़ती है। यहां, विमेंटिन नेटवर्क में कणों की उप-आयामी और पिंजरे की गतिशीलता को मापकर पुनर्गठित साइटोस्केलेटन नेटवर्क को चिह्नित करने के लिए डीडीएम का उपयोग करने की प्रक्रिया और सक्रिय मायोसिन-चालित एक्टिन-सूक्ष्मनलिका कंपोजिट की बैलिस्टिक गति प्रस्तुत की जाती है।

Abstract

कोशिकाएं अपने उल्लेखनीय गतिशील साइटोस्केलेटन के कारण अपनी कठोरता को क्रॉल, आत्म-चंगा और ट्यून कर सकती हैं। इस प्रकार, साइटोस्केलेटल बायोपॉलिमर के नेटवर्क के पुनर्गठन से सक्रिय और अनुकूलनीय सामग्रियों का एक मेजबान हो सकता है। हालांकि, ठीक ट्यून किए गए गुणों के साथ ऐसी सामग्रियों को इंजीनियरिंग करने के लिए यह मापने की आवश्यकता होती है कि गतिशीलता नेटवर्क संरचना और संश्लेषण विधियों पर कैसे निर्भर करती है। इस तरह की गतिशीलता को समग्र नेटवर्क के समय, स्थान और सूत्रीकरण स्थान में भिन्नताओं द्वारा चुनौती दी जाती है। यहां प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि फूरियर विश्लेषण तकनीक, अंतर गतिशील माइक्रोस्कोपी (डीडीएम), बायोपॉलिमर नेटवर्क की गतिशीलता को कैसे माप सकती है और साइटोस्केलेटन नेटवर्क के अध्ययन के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है। डीडीएम लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल, वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस और ब्राइटफील्ड इमेजिंग सहित माइक्रोस्कोपी तौर-तरीकों की एक श्रृंखला का उपयोग करके अधिग्रहित छवियों के समय अनुक्रमों पर काम करता है। इस तरह के छवि अनुक्रमों से, कोई तरंग वैक्टर की अवधि में घनत्व में उतार-चढ़ाव के विशिष्ट सजावट समय निकाल सकता है। डीडीएम विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल, ओपन-सोर्स पायथन पैकेज भी विकसित किया गया है। इस पैकेज के साथ, कोई भी लेबल वाले साइटोस्केलेटन घटकों या एम्बेडेड ट्रेसर कणों की गतिशीलता को माप सकता है, जैसा कि मध्यवर्ती फिलामेंट (विमेंटिन) नेटवर्क और सक्रिय एक्टिन-सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के डेटा के साथ यहां प्रदर्शित किया गया है। बिना किसी पूर्व प्रोग्रामिंग या छवि प्रसंस्करण अनुभव वाले उपयोगकर्ता इस सॉफ़्टवेयर पैकेज और संबंधित प्रलेखन का उपयोग करके डीडीएम करने में सक्षम होंगे।

Introduction

साइटोस्केलेटन प्रोटीन फिलामेंट्स का एक नेटवर्क है जो यूकेरियोटिक कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में फैला होता है, जो कोशिका की सतह को नाभिक से जोड़ता है। इसमें अद्वितीय भौतिक गुण हैं, जो बड़े और दोहराए गए यांत्रिक भार के खिलाफ यांत्रिक सुरक्षा प्रदान करते हैं, फिर भी गतिशील सेल आकार परिवर्तन भी चलाते हैं1. पुनर्गठित साइटोस्केलेटन नेटवर्क आणविक मोटर्स 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 द्वारा संचालित बैलिस्टिक गति के लिए एम्बेडेड कणों के पिंजरे से लेकर दिलचस्प गतिशील व्यवहारों की एक श्रृंखला को जन्म दे सकते हैं . इस तरह के नेटवर्क की गतिशीलता का विश्लेषण करने के तरीकों में एम्बेडेड ट्रेसर माइक्रोस्फीयर 6,7,12,13,14 की गति को ट्रैक करना, समय के साथ प्रोटीन-घने समूहों के आकार को ट्रैक करने के लिए छवि विश्लेषण8, गतिशील प्रकाश बिखरने15, कण छवि वेलोसिमेट्री 4,16,17,18,19 शामिल हैं , समय19 के साथ छवियों की शक्ति वर्णक्रमीय घनत्व की गणना, और काइमोग्राफ विश्लेषण20. जैसा कि पुनर्गठित साइटोस्केलेटन नेटवर्क पर अधिक अध्ययन किए जाते हैं, चाहे सेलुलर यांत्रिकी या सक्रिय पदार्थ को समझना हो, गतिशीलता की विशेषता के लिए मजबूत, निष्पक्ष और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके तेजी से आवश्यक हैं। विभेदक गतिशील माइक्रोस्कोपी (डीडीएम) 21,22, एक अपेक्षाकृत नई तकनीक जिसका उपयोग साइटोस्केलेटन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया गया है, एक ऐसी तकनीक है जो कुछ उपयोगकर्ता-परिभाषित मापदंडों के साथ गतिशीलता को कुशलतापूर्वक मापती है। यहां वर्णित सॉफ़्टवेयर पैकेज के साथ, प्रोग्रामिंग या छवि विश्लेषण में कम अनुभव वाले शोधकर्ता अपने स्वयं के काम के लिए डीडीएम का लाभ उठाने में सक्षम होंगे।

डीडीएम एक नमूना की गतिशीलता निकालने के लिए एक छवि विश्लेषण तकनीक है। कण ट्रैकिंग या कण छवि वेलोसिमेट्री की तरह, डीडीएम को छवियों की एक समय श्रृंखला (अक्सर हजारों छवियों) की आवश्यकता होती है, जो आमतौर पर माइक्रोस्कोप के साथ दर्ज की जाती है। कण ट्रैकिंग के विपरीत, व्यक्तिगत विशेषताओं या अनुरेखक मोतियों को छवि में स्थानीयकृत (या यहां तक कि स्थानीयकरण योग्य) होने की आवश्यकता नहीं है। कण ट्रैकिंग और कण छवि वेलोसिमेट्री दोनों के विपरीत, एक अपेक्षाकृत कम उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट मापदंडों के साथ डीडीएम के साथ पहनावा गतिशीलता को पुनर्प्राप्त करता है। डीडीएम के साथ, तरंग संख्याओं की एक श्रृंखला पर घनत्व में उतार-चढ़ाव के क्षय समय को निर्धारित करने के लिए फूरियर स्पेस में छवियों का विश्लेषण किया जाता है, क्यू, जहां क्यू = 2πu, और यू स्थानिक आवृत्तियों का परिमाण है, Equation004। एक बिखरने जैसी जानकारी प्राप्त करता है लेकिन माइक्रोस्कोप21,22,23 पर प्राप्त वास्तविक अंतरिक्ष छवियों के साथ। इसलिए, कोई माइक्रोस्कोपी के विभिन्न विपरीत-उत्पादक तरीकों का लाभ उठा सकता है, जैसे वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति22,24, कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति25, ध्रुवीकृत26, डार्क-फील्ड27, या लाइट-शीट प्रतिदीप्ति28 माइक्रोस्कोपी। इसके अलावा, डीडीएम विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली छवियों का उपयोग पूरक जानकारी प्रदान करने के लिए कण ट्रैकिंग या कण छवि वेलोसिमेट्री के लिए किया जा सकता है।

गतिशील प्रकाश बिखरने और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी से सुविधाओं का यह संयोजन डीडीएम को एक शक्तिशाली और बहुमुखी तकनीक बनाता है। 200821 में सेर्बिनो और ट्रैप द्वारा अपने पहले विवरण के बाद से, जहां डीडीएम को 73 एनएम कोलाइडल कणों के प्रसार को मापने के लिए प्रदर्शित किया गया था, डीडीएम का उपयोग बहने वाले कोलाइड29, कोलाइडयन एकत्रीकरण30,31, नेमेटिक तरल क्रिस्टल26 की चिपचिपाहट, कोलाइडयन जैलकी गतिशीलता 32, कोरसेनिंग फोम33, नैनोकणों को मापने के लिएकिया गया है 35,36,37, बैक्टीरियल गतिशीलता 38,39,40,41, कमजोर बिखरने वाले प्रोटीन क्लस्टर42 का प्रसार, द्रव इंटरफेस 43 पर केशिका तरंगें, और अन्य प्रणालियां। डीडीएम को नियोजित करने वाले प्रकाशनों की अधिक पूर्ण सूची की तलाश करने वाले लोग 22,23,44,45 विषय पर गहन समीक्षा पत्रों का उल्लेख कर सकते हैं।

डीडीएम का उपयोग जैविक नेटवर्क की गतिशीलता की जांच के लिए भी किया गया है। ड्रेक्सलर एट अल ने जीवित ड्रोसोफिला ओओसाइट्स46 में एक्टिन की गतिशीलता को मापने के लिए डीडीएम का उपयोग किया। बर्ला एट अल हायलूरोनन और हाइलूरोनन-कोलेजन कंपोजिट47 के नेटवर्क में ट्रेसर कणों की गतिशीलता की मात्रा निर्धारित की। पुनर्गठित साइटोस्केलेटन नेटवर्क 9,10 में ट्रेसर कणों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए डीडीएम के कई उपयोग, ऐसे नेटवर्क में डीएनए अणुओं का परिवहन48,49, और सक्रिय पुनर्गठित नेटवर्क की गतिशीलता को भी11,50,51 प्रलेखित किया गया है। ऐसी प्रणालियों में गतिशीलता को मापने में डीडीएम का एक फायदा यह है कि व्यक्तिगत कणों या अणुओं को स्थानीयकृत और ट्रैक करने की आवश्यकता नहीं है। इसलिए, उदाहरण के लिए, भीड़ भरे वातावरण में डीएनए अणुओं की गतिशीलता को ऐसे छोटे और गैर-गोलाकार अणुओं को ट्रैक करने में कठिनाई के बावजूद डीडीएम के साथ मापा जा सकता है। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ, कोई भी एक जटिल समग्र में व्यक्तिगत घटकों की गतिशीलता को चुनिंदा रूप से मापने के लिए बहु-रंग लेबलिंग का उपयोग कर सकता है।

डीडीएम करने के लिए, छवियों का एक अनुक्रम समय के साथ लिया जाता है, मैं (एक्स, वाई, टी)। किसी दिए गए अंतराल समय के लिए, Δ t, उस अंतराल समय द्वारा अलग की गई छवियों के सभी (या सबसेट) जोड़े पाएजाते हैं। प्रत्येक जोड़ी के अंतर का चौकोर फूरियर रूपांतरण,

Equation007

गणना की जाती है और एक साथ औसत किया जाता है। यह मात्रा, Equation008, रेडियल रूप से औसत है, बशर्ते कि गतिशीलता आइसोट्रोपिक हो। यह डीडीएम मैट्रिक्स (छवि संरचना फ़ंक्शन के रूप में भी जाना जाता है) Equation009पैदा करता है। इस प्रक्रिया को चित्र 1 में ग्राफिक रूप से दिखाया गया है। इस डीडीएम मैट्रिक्स से नमूने की गतिशीलता निर्धारित करने के लिए, डीडीएम मैट्रिक्स को फॉर्म लेने के लिए माना जाता है

Equation010

जहां ए आयाम है, जो माइक्रोस्कोप के विवरण औरनमूने की संरचना पर निर्भर करता है, बी पृष्ठभूमि है, जो छवियों में शोर पर निर्भर करता है, और एफ (क्यू, Δ टी) मध्यवर्ती प्रकीर्णन फ़ंक्शन (आईएसएफ) है, जिसमें गतिशीलता21,22 के बारे में जानकारी है। साधारण मामलों में,

Equation014

जहां ω एक विशेषता क्षय या सजावट का समय है। इस तरह के आईएसएफ का उपयोग एर्गोडिक प्रणालियों पर डीडीएम को नियोजित करने वाले कई अध्ययनों में किया गया है जैसे पतला कोलाइडयन निलंबन 21,24,27,37,40,52। हालांकि, आईएसएफ के अन्य रूपों का उपयोग विभिन्न प्रकार की गतिशीलता को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कोई पॉलीडिस्पर्स नमूनों के लिए आईएसएफ को मॉडल करने के लिए एक क्यूमुलेंट विस्तार का उपयोग कर सकता है

Equation016

जहां μ पॉलीडिस्पर्सिटी42,53 का एक उपाय है; यदि घनत्व में उतार-चढ़ाव दो अलग-अलग मोड द्वारा क्षय होता है तो कोई आईएसएफ का उपयोग कर सकता है जैसे

Equation01826, 54, 55, 56, 57;

अन्य आईएसएफ का उपयोग सूक्ष्म जीवों या अन्य सक्रिय कणों 38,39,40,41,58,59 तैरने के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: डीडीएम विश्लेषण का अवलोकन। छवियों की समय श्रृंखला से, डीडीएम मैट्रिक्स की गणना करने के लिए छवि मतभेदों के फूरियर रूपांतरण की गणना की जाती है। डीडीएम मैट्रिक्स क्यू मूल्यों की एक श्रृंखला में घनत्व में उतार-चढ़ाव के समय पैमाने को निर्धारित करने के लिए एक मॉडल के लिए फिट किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यहां, पायथन, पीवाईडीडीएम में विकसित डीडीएम विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज के उपयोग का वर्णन किया गया है। यह सॉफ्टवेयर पैकेज पिछले कई वर्षों में हमारे शोध प्रयोगशालाओं और अन्य प्रकाशित अध्ययनों द्वारा किए गए काम पर बनाता है। इस सॉफ़्टवेयर पैकेज को बनाने के लिए प्राथमिक प्रेरकों में (1) विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले मेटाडेटा और मापदंडों पर नज़र रखने और संग्रहीत करने की आवश्यकता शामिल है; (2) शुरू से अंत तक विश्लेषण के विस्तृत उदाहरणों के साथ पूरी तरह से प्रलेखन; और (3) डेटा को फिट करने के लिए विभिन्न (या नए) गणितीय मॉडल को नियोजित करने का एक आसान तरीका (उदाहरण के लिए, आईएसएफ मॉडल जोड़ना, जैसे कि हाल ही में सक्रिय फिलामेंट्स60 के लिए विकसित किया गया है, सीधा होगा)। डीडीएम विश्लेषण के लिए अन्य सॉफ़्टवेयर पैकेज भी मौजूद हैं, हालांकि सभी ओपन-सोर्स प्रोग्रामिंग भाषा में अच्छी तरह से प्रलेखित और लिखे गए नहीं हैं। उदाहरण के लिए, जीपीयू (https://github.com/peterlu/ConDDM)25 पर कंप्यूटिंग के साथ सी ++ कोड है, सी ++ कोड जो गणना (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, मैटलैब और पायथन संस्करणों (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, मैटलैब कोड (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27, और अनिश्चितता परिमाणीकरण के साथ मैटलैब कोड को गति देने के लिए समय पर फूरियर रूपांतरण का उपयोग करता है । https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. चूंकि यह पीवाईडीडीएम पैकेज अच्छी तरह से प्रलेखित है और डीडीएम मैट्रिक्स की गणना और विश्लेषण कैसे किया जाता है, इसमें बहुत लचीलापन प्रदान करता है, यह उम्मीद है कि प्रोग्रामिंग या छवि विश्लेषण में उनकी पृष्ठभूमि की परवाह किए बिना डीडीएम को लागू करने के इच्छुक शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है।

प्रोटोकॉल से पता चलता है कि इन विट्रो पुनर्गठित साइटोस्केलेटन नेटवर्क की गतिशीलता को मापने के लिए इस सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग कैसे किया जा सकता है। यह इमेजिंग डेटा के दो अलग-अलग सेटों का उपयोग करके किया जाता है: (1) ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी के साथ लिए गए विमेंटिन नेटवर्क में एम्बेडेड सबमाइक्रोन ट्रेसर कणों की छवियां और (2) लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ मायोसिन संचालित गतिविधि के साथ उलझे हुए समग्र नेटवर्क में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एक्टिन और सूक्ष्मनलिका फिलामेंट्स की छवियां। इन दो डेटासेटों के विश्लेषण डीडीएम की उल्लेखनीय शक्तियों को उजागर करते हैं, जिसमें विभिन्न प्रकार के इमेजिंग तौर-तरीकों (जैसे, ब्राइटफील्ड या कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति) के साथ ली गई छवियों का विश्लेषण करने की क्षमता शामिल है, या तो एम्बेडेड ट्रेसर या लेबल फिलामेंट्स से गतिशीलता निकालने के लिए, और विभिन्न प्रकार की गतिशीलता (जैसे, सबडिफ्यूजिव और विवश या बैलिस्टिक) की मात्रा निर्धारित करने के लिए।

Protocol

नोट: निम्न प्रोटोकॉल में प्रत्येक चरण के साथ जाने के लिए कोड युक्त एक जुपिटर नोटबुक फ़ाइल निम्न GitHub भंडार पर पाया जा सकता है, https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples। उस फाइल का एक पीडीएफ पूरक फाइल 1 में शामिल है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक फ़ंक्शन और कक्षा के कोड और प्रलेखन का एक वॉकथ्रू वेबसाइट पर पाया जा सकता है, https://rmcgorty.github.io/PyDDM/।

1. सॉफ्टवेयर स्थापना

  1. उदाहरण DDM विश्लेषण फ़ाइलों के साथ पालन करने के लिए, कोड चलाने के लिए जुपिटर नोटबुक स्थापित करें। अन्य आवश्यक सामान्य पायथन पैकेज स्थापित करें, जिसमें न्यूम्पी और मैटप्लोटलिब भी शामिल हैं। ये पैकेज सभी एनाकोंडा वितरण के साथ बंडल आते हैं (https://www.anaconda.com/products/individual देखें)।
  2. पायथन पैकेज xarray63 स्थापित करें। मेटाडेटा और विश्लेषण मापदंडों को व्यवस्थित और संग्रहीत करने के लिए यह पैकेज आवश्यक है। यदि एनाकोंडा वितरण का उपयोग कर रहे हैं, तो कमांड का उपयोग करके ज़ेरे (इसकी अनुशंसित निर्भरताओं के साथ) स्थापित करें:
    कोंडा स्थापित करने के लिए -सी कोंडा-फोर्ज नेटसीडीएफ 4 अड़चन
  3. आदेश का उपयोग करके पाययामल पैकेज स्थापित करें:
    कोंडा स्थापित करें -सी एनाकोंडा यमल
    विश्लेषण करने के लिए छवियों और विश्लेषण और फिटिंग के लिए उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित मापदंडों के बारे में मेटाडेटा पढ़ने के लिए यह पैकेज आवश्यक है।
  4. गिटहब रिपॉजिटरी से डाउनलोड करके या गिट कमांड का उपयोग करके पीवाईडीडीएम पैकेज स्थापित करें:
    गिट क्लोन https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git

2. इमेजिंग सत्रों की योजना बनाना

  1. इष्टतम उपलब्ध इमेजिंग पद्धति और ऑप्टिकल सेटिंग्स चुनें। जैसा कि उल्लेख किया गया है, डीडीएम का उपयोग कई माइक्रोस्कोपी विधियों के साथ किया जा सकता है।
  2. उपयोग करने के लिए उपयुक्त उद्देश्य लेंस और छवि आकार की योजना बनाने में सहायता करने के लिए, तरंग संख्याओं की सीमा निर्धारित करें, क्यू, जिसे पिक्सेल आकार और कुल छवि आकार के आधार पर जांच की जाएगी। पुष्टि करें कि इन गणनाओं के आधार पर प्रयोग के लिए आवर्धन और दृश्य क्षेत्र की पसंद इष्टतम है। यहां विश्लेषण की गई छवियों के लिए, सक्रिय एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समग्र नेटवर्क के लिए 0.83 μm के पिक्सेल आकार के साथ 60x 1.4 एनए उद्देश्य और 256 x 256 पिक्सेल की छवि आकार का उपयोग किया गया था। विमेंटिन नेटवर्क में एम्बेडेड मोतियों की छवियों के लिए, 100x 1.4 एनए उद्देश्य और 0.13 μm के पिक्सेल आकार के साथ 512 x 512 पिक्सेल की छवि आकार का उपयोग किया गया था।
    नोट: न्यूनतम क्यू 2π/NΔx द्वारा निर्धारित किया गया है, जहां छवि आकार (वर्ग माना जाता है) N × N पिक्सेल है जिसमें Δx का पिक्सेल आकार है। अधिकतम क्यू न्यूनतम π/Δx और 2π NA/λ है, जहां NA इमेजिंग उद्देश्य का संख्यात्मक एपर्चर है, और λ प्रकाश की तरंग दैर्ध्य है (ब्राइटफील्ड इमेजिंग के लिए, कोई भी एनए को (NAउद्देश्य + NAकंडेनसर)/2 से प्रतिस्थापित कर सकता है)।
  3. अगला, जांच करने के लिए टाइमस्केल की सीमा पर विचार करें। आमतौर पर, डीडीएम विश्लेषण कम से कम 1000 फ्रेम के अनुक्रमों पर किया जाता है।
    1. उपयुक्त फ्रेम दर निर्धारित करने के लिए, न्यूनतम समाधान योग्य लंबाई पैमाने (अधिकतम क्यू के अनुरूप) के क्रम पर दूरी स्थानांतरित करने के लिए नमूने में सुविधाओं के लिए अपेक्षित समय पर विचार करें।
    2. जांच किए गए टाइमस्केल की सीमा की ऊपरी सीमा पर विचार करते हुए, पहचानें कि, आमतौर पर, किसी दिए गए अंतराल समय Δ t के सैकड़ों छवि मतभेदों के पावर स्पेक्ट्रम को शोर को कम करने के लिए पर्याप्त आंकड़े प्रदान करने के लिए एक साथ औसत किया जाताहै । इसलिए, जांच की गई अधिकतम टाइमस्केल से अधिक समय तक छवि अनुक्रम प्राप्त करें।
      नोट: यदि एक अपेक्षित प्रसार गुणांक, डी, या वेग, वी, ज्ञात है, तो कोई भी ω = 1/डीक्यू2 या ω = 1/वीक्यू का उपयोग करके अपेक्षित विशेषता क्षय समय का अनुमान लगा सकता है, साथ ही क्यू की सीमा के साथ, जिसे दृश्य क्षेत्र और पिक्सेल आकार के आधार पर निर्धारित किया गया था। सुलभ क्यू-रेंज पर अपेक्षित ω मानों की सीमा फ्रेम दर की पसंद और प्राप्त करने के लिए फ्रेम की संख्या का मार्गदर्शन करने में मदद कर सकती है।

3. नमूना तैयारी और छवि अधिग्रहण

नोट: प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत डेटा के लिए उपयोग की जाने वाली नमूना तैयारी और इमेजिंग सेटिंग्स के विवरण के लिए,लेखकों 11,51,64 और पूरक फ़ाइल 2 से पिछले प्रकाशन देखें।

  1. जांच करने के लिए समय और लंबाई के तराजू के विचार के आधार पर, आदर्श रूप से, 1000 फ्रेम से अधिक की छवि अनुक्रम प्राप्त करें।
    नोट: कोड छवि के भीतर वर्ग छवियों या ब्याज के वर्ग क्षेत्रों का विश्लेषण करेगा, इसलिए तदनुसार फ्रेम आकार समायोजित करें।
  2. छवि अनुक्रमों को त्रि-आयामी ग्रेस्केल टीआईएफएफ स्टैक के रूप में सहेजें। वैकल्पिक रूप से, निकॉन इंस्ट्रूमेंट्स सिस्टम, एनडी 2 प्रारूप द्वारा उपयोग किए जाने वाले प्रारूप को स्थापित पैकेज द्वारा पढ़ा जा सकता है। यदि छवियों को कुछ अलग प्रारूप में सहेजा जाता है, तो छवियों को टीआईएफएफ स्टैक में परिवर्तित करने के लिए इमेजजे या किसी अन्य इमेजिंग प्रोसेसिंग प्रोग्राम का उपयोग करें।
    नोट:: यदि ND2 फ़ाइलों का उपयोग कर रहा है, तो https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader से पैकेज nd2रीडर स्थापित किया जाना चाहिए।

4. पैरामीटर सेटअप

  1. उदाहरण फ़ोल्डर के तहत PyDDM कोड भंडार में प्रदान की गई पैरामीटर फ़ाइल example_parameter_file.yml की एक प्रतिलिपि बनाएँ। इस वाईएएमएल फ़ाइल को नोटपैड ++ जैसे टेक्स्ट एडिटर या जुपिटरलैब में टेक्स्ट एडिटर के साथ खोलें। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत डेटा के विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले उदाहरण के लिए पूरक फ़ाइल 2 देखें।
  2. कॉपी की गई YAML फ़ाइल में, विश्लेषण किए जाने वाले छवि अनुक्रम के अनुरूप डेटा निर्देशिका और फ़ाइल नाम प्रदान करें। मेटाडेटा अनुभाग के तहत, पिक्सेल आकार और फ्रेम दर प्रदान करें।
  3. Analysis_parameters अनुभाग के तहत, डीडीएम मैट्रिक्स की गणना कैसे की जानी चाहिए, इसके लिए विवरण प्रदान करें। यहां कुछ पैरामीटर वैकल्पिक हैं।
    1. कम से कम, number_lag_times मापदंडों और last_lag_time के लिए मान प्रदान करें। ये विभिन्न अंतराल समय की संख्या के अनुरूप हैं जिसके लिए डीडीएम मैट्रिक्स और उपयोग करने के लिए सबसे लंबे अंतराल समय (फ्रेम में) की गणना करने के लिए क्रमशः। यहां उपयोग किए जाने वाले विमेंटिन नेटवर्क में ट्रेसर मोतियों के डेटा के लिए, number_lag_times पैरामीटर और last_lag_time क्रमशः 60 और 1000 थे। कोड 1 फ्रेम (या कुछ अन्य न्यूनतम अंतराल समय यदि वैकल्पिक पैरामीटर first_lag_time निर्दिष्ट किया गया है) से अंतराल समय के लिए डीडीएम मैट्रिक्स की गणना लघुगणकीय रिक्ति के साथ last_lag_time में करेगा।
      नोट: यदि एम फ्रेम अधिग्रहित किए गए थे, तो कोई एम -1 जितना बड़ा अंतराल समय के लिए डीडीएम मैट्रिक्स की गणना कर सकता है। हालांकि, इतने बड़े अंतराल के समय खराब आंकड़ों के साथ, डेटा शोर होने की संभावना है। डीडीएम मैट्रिक्स की गणना करने के लिए सबसे लंबा अंतराल समय डेटा के विवरण पर निर्भर करेगा, लेकिन हम कुल छवि श्रृंखला अवधि के लगभग एक तिहाई की कोशिश करने का सुझाव देते हैं।
  4. डीडीएम मैट्रिक्स या मध्यवर्ती प्रकीर्णन फ़ंक्शन (आईएसएफ) को Fitting_parameters अनुभाग में कैसे फिट किया जाना चाहिए, इसके लिए विवरण प्रदान करें। मॉडल पैरामीटर के तहत मॉडल का नाम दें। चुने हुए मॉडल में फिटिंग मापदंडों में से प्रत्येक के लिए प्रारंभिक अनुमान, निचला बाउंड और ऊपरी बाउंड प्रदान करें।
    नोट:: संभव फिटिंग मॉडल की एक सूची प्रदर्शित करने के लिए, फ़ंक्शन print_fitting_models चलाएँ। मॉडल पीवाईडीडीएम वेबसाइट पर ऑनलाइन प्रलेखन में भी पाए जा सकते हैं।

5. डीडीएम मैट्रिक्स की गणना

  1. DDM_Analysis वर्ग की एक आवृत्ति प्रारंभ करें। ऐसा करने के लिए, फ़ाइल नाम को पास करके ऊपर चर्चा किए गए मेटाडेटा और विश्लेषण पैरामीटर प्रदान करें, जिसमें पूरा फ़ाइल पथ शामिल है, वाईएएमएल फ़ाइल का DDM_Analysis। वैकल्पिक रूप से, मेटाडेटा और मापदंडों को पायथन शब्दकोश डेटा संरचना के रूप में पास करें।
  2. DDM मैट्रिक्स की गणना करने के लिए फ़ंक्शन calculate_DDM_matrix चलाएँ। फ्रेम आकार और अंतराल समय की संख्या के आधार पर इस गणना में कई मिनट या उससे अधिक समय लग सकता है। ठेठ रन समय के लिए चित्रा 2 देखें।
  3. लौटाए गए डेटा का निरीक्षण करें, जो डेटासेट के रूप में जाना जाने वाला ज़ेरे पैकेज से डेटा संरचना में होगा। यह डेटा संरचना विशेषता ddm_dataset के तहत संग्रहीत की जाती है।
    नोट: न केवल डीडीएम मैट्रिक्स बल्कि संबंधित चर और मेटाडेटा भी इस डेटा संरचना में संग्रहीत किया जाएगा। इसे नेटवर्क कॉमन डेटा फॉर्म (नेटसीडीएफ) प्रारूप में डिस्क पर भी सहेजा जाएगा।
  4. भूखंडों और आंकड़ों का निरीक्षण करें, जो उत्पन्न और प्रदर्शित किए जाएंगे। इन आंकड़ों को डेटा निर्देशिका में पीडीएफ फाइल के रूप में भी सहेजा जाता है।
    1. देखें कि उत्पन्न भूखंडों में से एक क्यू के एक समारोह के रूप में फूरियर-रूपांतरित छवियों Equation031 के पहनावा-औसत वर्ग मापांक को दर्शाता है। डिफ़ॉल्ट रूप से, कोड पृष्ठभूमि पैरामीटर B का अनुमान लगाने के लिए इसका उपयोग करता है। यह मानकर पृष्ठभूमि का अनुमान लगाएं कि, बड़े क्यू की सीमा में, यह बी /2 तक Equation031 पहुंच जाएगा, जहां बी पृष्ठभूमि है।
    2. यदि Equation031 बड़े क्यू पर एक पठार तक नहीं पहुंच रहा है, तो बी का अनुमान लगाने के लिए एक और विधि का उपयोग करें। इसे पूरा करने के लिए, पैरामीटर background_method या तो YAML फ़ाइल में या फ़ंक्शन calculate_DDM_matrix के लिए वैकल्पिक कीवर्ड तर्क के रूप में सेट करें। बी का अनुमान लगाने के तरीकों के बारे में अधिक जानकारी प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत की गई है।

Figure 2
चित्रा 2: डीडीएम मैट्रिक्स की गणना के लिए गणना समय। (ए) और (बी) में डीडीएम मैट्रिक्स की गणना के लिए समय, Equation009दिखाया गया है। सभी मामलों में उपयोग किया जाने वाला डेटा 512 x 512 पिक्सेल की छवि आकार के साथ 5000 फ्रेम की एक फिल्म है। डीडीएम मैट्रिक्स की गणना 30 अंतराल समय के लिए की गई थी, लघुगणकीय रूप से 1 फ्रेम (0.01 एस) और 1000 फ्रेम (10 एस) के बीच स्थान दिया गया था। कोड इंटेल आई 7-10700 2.90 गीगाहर्ट्ज डेस्कटॉप कंप्यूटर पर 32 जीबी रैम के साथ चलाया गया था। (ए) में, प्रत्येक अंतराल समय के लिए डीडीएम मैट्रिक्स की गणना में कितने छवि अंतर का उपयोग किया जाता है, अलग-अलग का प्रभाव दिखाया गया है। इसके लिए, छवियों को 256 x 256 की छवि आकार में परिणाम करने के लिए बिन किया जाता है। प्रत्येक अंतराल समयΔ t के लिए, उस Δt द्वारा अलग किए गए चित्रों को घटाया जाता है और परिणामी मैट्रिक्स फूरियर रूपांतरित होता है। किसी दिए गए Δ t के लिए, उस Δt द्वारा अलग किए गए छवियों के सभी जोड़े का उपयोग किया जा सकता है (नीले रंग में दिखाया गया है), केवल गैर-अतिव्यापी छवि जोड़े का उपयोग किया जा सकताहै (उदाहरण के लिए, फ्रेम 1 और 10, 10 और 19, आदि; भूरे रंग में दिखाया गया है), या प्रत्येक Δ t के लिए 300 छवि जोड़े याउससे कम का उपयोग किया जा सकता है। (बी) में, गणना समय पर छवि आकार बदलने का प्रभाव दिखाया गया है। छवियों को या तो 2 x 2, 4 x 4, या 8 x 8 पिक्सेल को समूहीकृत करके बिन किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप क्रमशः 256 x 256, 128 x 128, या 64 x 64 के छवि आकार थे। प्रत्येक के लिए, प्रत्येक Δ t के लिए डीडीएम मैट्रिक्स की गणना में लगभग 300 छवि जोड़े का उपयोग किया जाताहै। (सी) डीडीएम मैट्रिक्स से, मध्यवर्ती प्रकीर्णन फ़ंक्शन (आईएसएफ) निकाला जा सकता है। यह (ए) में तीन मामलों के लिए दिखाया गया है। नीले डेटा बिंदु (बिना किसी ऑफसेट के) आईएसएफ के अनुरूप होते हैं जब प्रत्येक Δ t के लिए छवि जोड़े की अधिकतम संख्या का उपयोग किया जाताहै; भूरे रंग के डेटा बिंदु (0.1 के ऑफसेट के साथ) आईएसएफ के अनुरूप होते हैं जब प्रत्येक Δ t के लिए गैर-अतिव्यापी छवि जोड़े का उपयोग किया जाताहै; और गुलाबी डेटा बिंदु (0.2 के ऑफसेट के साथ) आईएसएफ के अनुरूप होते हैं जब प्रत्येक Δ t के लिए अधिकतम 300 छवि जोड़े का उपयोग किया जाताहै। गैर-अतिव्यापी छवि जोड़े का उपयोग करके पाया गया आईएसएफ लंबे Δ t पर शोरदिखाता है। उस स्थिति के लिए, कुछ छवि जोड़े का उपयोग लंबे Δ t पर किया जाताहै (उदाहरण के लिए, 1000 फ्रेम के Δt के लिए, केवल 4 छवि जोड़े का उपयोग किया जाता है)। (डी) आईएसएफ को एक घातीय फ़ंक्शन में फिट करके, प्रत्येक तरंग संख्या के लिए विशेषता क्षय समय, ω, क्यू, निर्धारित किया जाता है। गुलाबी रंग में, परिणाम मूल छवियों को 2 x 2 से बिन करने के बाद दिखाए जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप 256 x 256 का छवि आकार होता है। ग्रे में, परिणाम 8 x 8 द्वारा बिनिंग के बाद दिखाए जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप 64 x 64 का छवि आकार होता है। डेटा को बिन करके, उच्च तरंग संख्याओं पर गतिशीलता के बारे में जानकारी खो जाती है, लेकिन 64 x 64 छवियों के लिए डीडीएम मैट्रिक्स की गणना 256 x 256 छवियों की तुलना में लगभग 16x तेज़ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

6. डीडीएम मैट्रिक्स या आईएसएफ फिटिंग

  1. DDM_Fit वर्ग की एक आवृत्ति प्रारंभ करें। ऐसा करने के लिए, छवि मेटाडेटा और फिटिंग के लिए मापदंडों वाले वाईएएमएल फ़ाइल के फ़ाइल नाम को DDM_Fit के लिए पास करें।
  2. तय करें कि डेटा को फिट करने के लिए डीडीएम मैट्रिक्स या आईएसएफ के लिए किस मॉडल का उपयोग करना है। फ़ंक्शन print_fitting_models को निष्पादित करके उपलब्ध मॉडलों को सूचीबद्ध करें। YAML पैरामीटर फ़ाइल में या फ़ंक्शन reload_fit_model_by_name का उपयोग करके उपयोग किए जाने वाले मॉडल को निर्दिष्ट करें।
  3. प्रदान किए गए वाईएएमएल पैरामीटर फ़ाइल में चुने गए मॉडल में प्रत्येक पैरामीटर के लिए प्रारंभिक अनुमान और सीमा सेट करें। किसी भी पैरामीटर के लिए प्रारंभिक अनुमान बदलने के लिए, फ़ंक्शन set_parameter_initial_guess का उपयोग करें। फ़ंक्शन set_parameter_bounds के साथ मापदंडों के लिए सीमा सेट करें। उदाहरण के लिए, जैसा कि पूरक फ़ाइल 2 में देखा गया है, विमेंटिन नेटवर्क में अनुरेखक मोतियों के डेटा के लिए, क्षय समय के लिए प्रारंभिक अनुमान 1 एस था और उस पैरामीटर पर सीमा 0.01 एस और 2000 एस थी।
  4. फ़ंक्शन फिट के साथ फिट निष्पादित करें। परिणामों तक आसानी से पहुंचने के लिए इस फ़ंक्शन के आउटपुट के लिए एक चर असाइन करें।
    नोट: यह फ़ंक्शन कई वैकल्पिक तर्क ले सकता है। कोड प्रलेखन देखें और ऐसे तर्कों की सूची के लिए उदाहरण प्रदान किए गए हैं और उन्हें गैर-डिफ़ॉल्ट मानों पर सेट करने पर विचार कब करें।

7. फिट परिणामों की व्याख्या करना

  1. फ़ंक्शन fit_report के साथ फिट पैरामीटर के फिट और क्यू-निर्भरता का निरीक्षण करने के लिए भूखंड उत्पन्न करें।
    नोट: यह फ़ंक्शन भूखंडों की एक श्रृंखला उत्पन्न करेगा, जिसे पीडीएफ के रूप में भी सहेजा जाएगा। इस फ़ंक्शन के वैकल्पिक तर्कों का उपयोग उत्पादित भूखंडों को संशोधित करने के लिए किया जा सकता है।
  2. उत्पन्न भूखंडों में से 2 एक्स 2 सबप्लॉट के साथ एक आंकड़ा होगा जो डीडीएम मैट्रिक्स या आईएसएफ (चुने हुए फिटिंग मॉडल के आधार पर) को चार क्यू-मानों (fit_report के लिए वैकल्पिक तर्क के रूप में निर्दिष्ट) पर दिखाता है, साथ ही मॉडल और सर्वोत्तम फिट मापदंडों का उपयोग करके गणना की गई डीडीएम मैट्रिक्स या आईएसएफ के साथ। एक इंटरैक्टिव तरीके से सर्वोत्तम फिट के साथ डीडीएम मैट्रिक्स या आईएसएफ को प्लॉट करने के लिए, क्लास Browse_DDM_Fits का उपयोग करें जैसा कि जुपिटर नोटबुक वातावरण का उपयोग किया जाता है, जब प्रदान किए गए उदाहरणों में दिखाया गया है।
  3. विशेषता क्षय समय ω बनाम तरंग संख्या क्यू के कथानक से, यह निर्धारित करें कि क्या गतिशीलता विसारक, सबडिफ्यूजिव, बैलिस्टिक या किसी अन्य प्रकार की गति का पालन करती है। यह ω और q के बीच शक्ति कानून संबंध की तलाश करके किया जा सकता है।
    नोट: फ़ंक्शन fit_report द्वारा उत्पन्न τ बनाम क्यू के लॉग-लॉग प्लॉट पर, तीन लाइनें दिखाई जाएंगी, जो पावर लॉ के अनुरूप क्यू मानों की एक निर्दिष्ट सीमा पर फिट बैठती हैं। ठोस काली रेखा τ बनाम क्यू को एक शक्ति कानून में फिट करने से मेल खाती है, ω = 1 / केक्यूβ, जहां के और β मुक्त पैरामीटर हैं। नारंगी में धराशायी रेखा सरल प्रसार के लिए फिटिंग से मेल खाती है, ω = 1 / डीक्यू2, जहां डी एक प्रसार गुणांक है। नीले रंग में डॉट-धराशायी रेखा ω = 1 / vq के लिए फिटिंग से मेल खाती है, जहां v एक वेग है।

8. परिणामों को सहेजना

  1. फिट के परिणाम एक एक्सएरे डेटासेट में सहेजे जाएंगे। इस डेटा संरचना को डिस्क पर सहेजने के लिए to_netcdf या पायथन के अंतर्निहित अचार मॉड्यूल के लिए xarray फ़ंक्शन का उपयोग करें। इन नेटसीडीएफ फ़ाइलों को लोड करने के लिए open_dataset xarray फ़ंक्शन का उपयोग करें।
  2. डेटा के साथ, किसी कार्यपत्रक फ़ाइल में फ़िट परिणामों को सहेजने के लिए फ़ंक्शन save_fit_results_to_excel का उपयोग करें.

Representative Results

यहां, हम प्रयोगों के दो अलग-अलग सेटों से पीवाईडीडीएम के साथ किए गए विश्लेषण के उदाहरण दिखाते हैं। प्रयोगों के एक सेट में, उप माइक्रोन ट्रेसर मोती मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन विमेंटिन से मिलकर नेटवर्क में एम्बेडेड थे और 100 फ्रेम / विमेंटिन मेसेनकाइमल कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है और साइटोप्लाज्म 65 के यांत्रिक गुणों और सीमित माइग्रेशन66,67 करने वाली कोशिकाओं में नाभिक की यांत्रिक स्थिरता का एक प्रमुख निर्धारक है। अब तक, पुनर्गठित विमेंटिन नेटवर्क का अध्ययन मुख्य रूप से मैक्रोस्कोपिक रियोलॉजी 64,68,69 द्वारा किया गया है, जबकि गतिशीलता को तुलनात्मक रूप से कम ध्यान 13,70,71 प्राप्त हुआ है। इन प्रयोगों का अतिरिक्त विवरण अनुपूरक फ़ाइल 2 में पाया जा सकता है। प्रयोगों के अन्य सेट में, सक्रिय साइटोस्केलेटन नेटवर्क एक्टिन, सूक्ष्मनलिकाएं और मायोसिन के साथ तैयार किए गए थे। स्पेक्ट्रली अलग फ्लोरोसेंट लेबल ने एक्टिन और सूक्ष्मनलिका फिलामेंट्स को 2.78 फ्रेम / एस (चित्रा 3 बी, सी) पर 60 एक्स उद्देश्य लेंस का उपयोग करके दो-रंग लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित करने की अनुमति दी। एक्टिन और सूक्ष्मनलिका फिलामेंट्स दोनों गतिशील सेल आकार परिवर्तनों के महत्वपूर्ण चालक हैं, उनके कार्यों को यांत्रिक और जैव रासायनिक इंटरैक्शन72 द्वारा समन्वित किया जाता है। इन प्रयोगों का अतिरिक्त विवरण11 में पाया जा सकता है। इन प्रयोगों में ली गई छवि अनुक्रमों से अलग-अलग फ्रेम चित्रा 3 में दिखाए गए हैं।

Figure 3
चित्रा 3: विश्लेषण की गई समय श्रृंखला से छवियां( ए) एक विमेंटिन नेटवर्क में 0.6 μm मोतियों की ब्राइटफील्ड छवि। (बी, सी) सूक्ष्मनलिकाएं इमेजिंग के लिए 561 एनएम उत्तेजना प्रकाश और एक्टिन इमेजिंग के लिए 488 एनएम उत्तेजना प्रकाश का उपयोग करके लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर 60x उद्देश्य के साथ ली गई एक सक्रिय एक्टिन-सूक्ष्मनलिकाएं समग्र में (बी) सूक्ष्मनलिकाएं और (सी) एक्टिन की छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

विमेंटिन नेटवर्क में अनुरेखक मोतियों की छवियों के लिए, 100 फ्रेम / सेकंड पर 512 x 512 पिक्सेल के आकार के साथ 5000 फ्रेम की फिल्में दर्ज की गईं। इनमें से, डीडीएम मैट्रिक्स की गणना 1 और 1000 फ्रेम, या 0.01 एस और 10 एस के बीच 60 लघुगणकीय अंतराल समय पर की गई थी। पृष्ठभूमि का अनुमान लगाने के लिए, बी, चौकोर फूरियर-रूपांतरित छवियों का माध्य, Equation031गणना की गई थी और 55,73 के Equation037 बराबर सेट किया गया था। एक धारणा बनाई गई थी कि, क्यू-मानों के सबसे बड़े 10% पर, यह मात्रा बी/2 के बराबर है और बी क्यू से स्वतंत्र है। यह बी का अनुमान लगाने के लिए पैकेज की डिफ़ॉल्ट विधि है, लेकिन background_method पैरामीटर को एक अलग मान पर सेट करके अन्य विधियां संभव हैं।

से निर्धारित मापदंडों ए (क्यू) और बी के साथ, कोई डीडीएम मैट्रिक्स से Equation031मध्यवर्ती बिखरने वाले फ़ंक्शन (आईएसएफ) को निकाल सकता है। उदाहरण आईएसएफ चित्रा 4 में दिखाए गए हैं। चित्रा 4 ए में, 19 μM की विमेंटिन एकाग्रता के साथ एक नेटवर्क में एम्बेडेड 0.6 μm व्यास मोतियों की छवियों से आईएसएफ दिखाया गया है। चित्रा 4 बी में, 34 μM की विमेंटिन एकाग्रता के साथ एक नेटवर्क में एक ही प्रकार के मोतियों के लिए आईएसएफ दिखाया गया है। दिलचस्प बात यह है कि किसी भी मामले में आईएसएफ शून्य तक क्षय नहीं हुआ। बड़े अंतराल समय पर, आईएसएफ को एर्गोडिक सिस्टम के लिए शून्य तक पहुंचना चाहिए। यही है, ऐसी प्रणालियों में, घनत्व में उतार-चढ़ाव को बड़े अंतराल समय पर पूरी तरह से सजावट करनी चाहिए। तथ्य यह है कि यहां आईएसएफ शून्य तक क्षय नहीं हुआ था, ए (क्यू) और बी के गलत अनुमानों के परिणामस्वरूप हो सकता था, जिनका उपयोग गणना किए गए डीडीएम मैट्रिक्स से आईएसएफ को खोजने के लिए किया गया था। विशेष रूप से, यहां नियोजित विधि कुछ परिदृश्यों62 में बी को अधिक अनुमानित कर सकती है। हालांकि, यह अधिक संभावना है कि ट्रेसर मोतियों की गतिशीलता वास्तव में नॉनर्गोडिक है क्योंकि मोतियों का नेटवर्क जाल आकार के बराबर आकार होता है और इसलिए, पिंजरे में बंद हो सकता है। अन्य आंकड़ों ने नॉनर्गोडिसिटी की खोज की पुष्टि की। अर्थात्, मनका आकार, 0.6 μm, 19 μM एकाग्रता के लिए 0.4 μm और 34 μM एकाग्रता के लिए 0.3 μm के जाल आकार के लिए गणना औसत मान से बड़ा था। इसके अतिरिक्त, इन अनुरेखक मोतियों के एकल कण ट्रैकिंग के परिणाम, जो बाद में दिखाए जाते हैं, ने भी सीमित गति दिखाई।

Figure 4
चित्रा 4: विमेंटिन नेटवर्क के लिए कई तरंगसंख्याओं पर मध्यवर्ती बिखरने वाले कार्य। आईएसएफ को लगभग 1 से 9 μm-1 तक क्यू मानों के लिए अंतराल समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट किया गया है। (ए) 19 μM की विमेंटिन एकाग्रता के साथ एक विमेंटिन नेटवर्क में 0.6 μm मोतियों की छवियों से आईएसएफ( B) 34 μM की विमेंटिन एकाग्रता के साथ एक विमेंटिन नेटवर्क में 0.6 μm मोतियों की छवियों से आईएसएफ। शून्य से ऊपर के मूल्य पर आईएसएफ का लंबा अंतराल समय पठार गैर-घनत्व को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यह देखते हुए कि गतिशीलता संभवतः नॉनर्गोडिक है, आईएसएफ फॉर्म Equation039के लिए फिट हैं, जहां सी नॉनर्गोडिसिटी फैक्टर 32 है। आईएसएफ के इस रूप का उपयोग गैर-एर्गोडिक गतिशीलता के पिछले अध्ययनों में किया गया है, जैसे कि कोलाइडयन जैल32,74 या एक्टिन-माइक्रोट्यूब्यूल नेटवर्क 10 में ट्रेसर कण। चित्रा 4 में बिंदीदार काली रेखाएं डेटा के साथ फिट बैठती हैं। इन फिट से, कोई भी अब क्षय समय, ω, और गैर-घनत्व पैरामीटर, सी की क्यू-निर्भरता को देख सकता है।

Figure 5
चित्रा 5: विमेंटिन नेटवर्क के लिए क्षय समय बनाम तरंग संख्या। फिट से आईएसएफ तक, क्षय समय ω क्यू मानों की एक श्रृंखला के लिए निर्धारित किया जाता है। स्पष्टता के लिए, हम प्रत्येक क्यू के लिए ω का मान नहीं दिखा रहे हैं, लेकिन केवल एक लघुगणकीय रूप से दूरी वाला सेट दिखा रहे हैं। नीले रंग में (टैन) 19 μM (34 μM) की विमेंटिन एकाग्रता के साथ विमेंटिन नेटवर्क के भीतर 0.6 μm मोती की छवियों से डेटा है। त्रुटि पट्टियाँ कई फिल्मों में ω में मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं (19 μM नेटवर्क [नीले] के साथ डेटा के लिए चार फिल्में और 34 μM नेटवर्क [टैन]) के साथ डेटा के लिए पाँच फिल्में)। लाल डैश-बिंदीदार रेखाएं हमारे अस्थायी और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के लिए अनुमानित सीमाओं को चिह्नित करती हैं, जैसा कि परिणामों में वर्णित है। ठोस काली रेखा स्केलिंग दिखाती हैEquation044, जो विसारक गति का संकेत देगी। न तो डेटा सेट इस स्केलिंग का अनुसरण करता है। इसके बजाय, 19 μM नेटवर्क में मोती सबडिफ्यूसिव गति दिखाते हैं (Equation010β > 2 के साथ), और 34 μM नेटवर्क में मोती सीमित या पिंजरे की गति दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

क्षय समय अनिश्चितता की एक बड़ी राशि से पता चला, दोनों कम क्यू और उच्च क्यू चरम सीमाओं पर, के रूप में चित्रा 5 में देखा. इस भूखंड पर त्रुटि सलाखों कम विमेंटिन एकाग्रता मामले के लिए विश्लेषण किए गए चार वीडियो या उच्च एकाग्रता के लिए विश्लेषण किए गए पांच वीडियो के बीच मानक विचलन दिखाते हैं। इन चरम सीमाओं पर बड़ी अनिश्चितता के स्रोत को समझने के लिए, लौकिक और स्थानिक संकल्प दोनों पर विचार करें। रिज़ॉल्यूशन की अनुमानित सीमाएं तीन लाल डैश-डॉटेड लाइनों के साथ दिखाई जाती हैं। दो क्षैतिज रेखाएं जांच किए गए न्यूनतम और अधिकतम अंतराल समय के अनुरूप हैं। सेकंड की फ्रेम दर और 1000 फ्रेम (कुल वीडियो अवधि का 20%) के अनुरूप अधिकतम अंतराल समय को देखते हुए, 0.01 एस से तेज या 10 एस से धीमी गति से होने वाली गतिशीलता को मापने पर सटीकता खो गई थी। कम क्यू-मानों पर, ω के लिए फिट किए गए मान 10 एस से अधिक थे। इसलिए, क्षय समय में बड़ी अनिश्चितताओं की उम्मीद की जानी चाहिए जो अधिकतम अंतराल समय से बड़े हैं। क्यू-रेंज के उच्च अंत में, क्षय समय 0.01 एस के न्यूनतम अंतराल समय तक पहुंच गया लेकिन इसके ऊपर बना रहा। लौकिक रिज़ॉल्यूशन द्वारा सीमित होने के बजाय, इन उच्च क्यू मानों पर, स्थानिक रिज़ॉल्यूशन सीमित कारक हो सकता है। 0.13 μm के पिक्सेल आकार को देखते हुए, q के लिए सबसे बड़ा मान लगभग 24 μm-1 था। हालांकि, विवर्तन-सीमित रिज़ॉल्यूशन आवश्यक रूप से इन उच्च स्थानिक आवृत्तियों पर गतिशीलता के सटीक माप की अनुमति नहीं देता है। ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन Equation041 का अनुमान लगाना लगभग 16 μm-1 की ऊपरी तरंग संख्या सीमा की ओर जाता है, उद्देश्य लेंस के संख्यात्मक एपर्चर, एनए, 1.4 और प्रकाश की तरंग दैर्ध्य को देखते हुए, Equation042। यह चित्रा 5 में ऊर्ध्वाधर लाल डैश-बिंदीदार रेखा द्वारा चिह्नित किया गया है। दरअसल, डेटा क्यू के बड़े मूल्यों पर शोर कर रहे थे। क्यू की इस अनुमानित ऊपरी सीमा से पहले भी, ω में अनिश्चितता में वृद्धि देखी गई थी, और यह क्यूअधिकतम को अधिक अनुमानित करने से हो सकता है। भविष्यवाणी की तुलना में गरीब ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन हो सकता है क्योंकि एक तेल विसर्जन लेंस का उपयोग कवरस्लिप से परे एक जलीय नमूने में छवि बनाने के लिए किया गया था या क्योंकि कंडेनसर लेंस अपूर्ण रूप से संरेखित था।

कम केंद्रित नेटवर्क (19 μM vimentin) में एम्बेडेड 0.6 μm मोती के लिए, यह क्षय समय बनाम तरंग संख्या के लॉग-लॉग प्लॉट से देखा जा सकता है कि क्षय समय एक शक्ति कानून (चित्रा 5) के अनुरूप तरीके से तरंग संख्या के साथ कम हो गया। हालांकि, यह सामान्य विसारक गति के लिए क्या उम्मीद की जाएगी, जहां Equation044का पालन नहीं लगता है। इसके बजाय, q बढ़ने के साथ ω अधिक तेजी से कम हो गया। यह सबडिफ्यूजिव गति का संकेत है, जो अक्सर इस तरह के भीड़ भरे वातावरण में मोतियों के लिए होता है। ω (q) को 1.4 μm-1 से 12.3 μm-1 की सीमा पर τ = 1/Kqβरूप के शक्ति नियम में फिट करने से परिवहन पैरामीटर K = 0.0953 μmβ β / अंतराल समय के एक समारोह के रूप में अनुरेखक कणों के औसत वर्ग विस्थापन (एमएसडी) के संदर्भ में सामान्य प्रसार बनाम सबडिफ्यूजन के बारे में सोचने के अधिक आदी लोगों के लिए (यानी, एमएसडी = के ' Δटीα), यह पहचानने में सहायक है कि एमएसडी समीकरण में सबडिफ्यूजिव स्केलिंग एक्सपोनेंट, α, α = 2 / β के बराबर है। दूसरे शब्दों में, β = 2.2 का मान α = 0.9 के एमएसडी समीकरण में एक सबडिफ्यूजिव स्केलिंग घातांक के अनुरूप है। कोई भी वाईएएमएल फ़ाइल में पैरामीटर Good_q_range के साथ क्यू की सरणी के सूचकांकों को निर्दिष्ट करके या फ़ंक्शन generate_fit_report में वैकल्पिक तर्क forced_qs पास करके क्यू-मानों की इस श्रृंखला पर ω (क्यू) फिट करने के लिए पीवाईडीडीएम सेट करेगा। 1.4 μm-1 से 12.3 μm-1 तक q की सीमा, यहाँ डेटा के लिए, 15 से 130 तक q की सरणी के सूचकांकों के अनुरूप होगी।

अधिक केंद्रित नेटवर्क (34 μM) में 0.6 μm मोती के लिए, क्षय समय ने क्यू पर बहुत कम निर्भरता दिखाई। यह एक छोटे जाल आकार के साथ एक नेटवर्क में मोतियों की गैर-घनत्व के कारण होने की संभावना है। इस प्रणाली में गैर-घनत्व की जांच करने के लिए, गैर-ऑर्थोडिसिटी पैरामीटर, सी, को क्यू के एक समारोह के रूप में प्लॉट किया जाना चाहिए, जैसा कि चित्रा 6 में है। 19 μM vimentin नेटवर्क में 0.6 μm मोती के लिए, C ≈ 0.2 क्यू पर थोड़ी निर्भरता के साथ (नहीं दिखाया गया है)। हालांकि, 34 μM vimentin के साथ नेटवर्क के लिए और 49 μM vimentin की एक भी उच्च एकाग्रता के साथ एक नेटवर्क के लिए, सी का लॉग q2 के लिए आनुपातिक था जैसा कि चित्रा 6 में दिखाया गया है। सी और क्यू के बीच यह संबंध सीमित गति के लिए अपेक्षित है। नेटवर्क की जेब के भीतर फंसे मोतियों के लिए, एमएसडी को लंबे समय तक पर्याप्त अंतराल समय पर पठार करने की उम्मीद है (यानी, Equation055एमएसडी कहां Equation056 है और δ2 अधिकतम एमएसडी है)। चूंकि आईएसएफ को एमएसडी Equation058के संदर्भ में व्यक्त किया जा सकता है, और चूंकि नॉनर्गोडिक आईएसएफ लंबे अंतराल के समय (यानी, ) पर सी में जाता है, Equation059इसलिए संबंध Equation06032,75 प्राप्त होता है। इसलिए, कोई δ2 को खोजने के लिए सी (क्यू) का उपयोग कर सकता है, और इससे क्रमशः 34और 49 μM vimentin नेटवर्क के लिए δ 2 = 0.017 μm 2 और 0.0032 μm2 प्राप्त हुआ (δ = 0.13 μm और 0.057 μm के अनुरूप)।

Figure 6
चित्रा 6: विमेंटिन नेटवर्क के लिए नॉनर्गोडिसिटी पैरामीटर बनाम वेवनंबर। फिट से आईएसएफ तक, नॉनर्गोडिसिटी पैरामीटर सी क्यू मानों की एक श्रृंखला के लिए निर्धारित किया जाता है। टैन (लाल) में 34 μM (49 μM) की विमेंटिन एकाग्रता के साथ विमेंटिन नेटवर्क के भीतर 0.6 μm मोती की छवियों से डेटा है। त्रुटि पट्टियाँ कई फिल्मों में ω में मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं (34 μM नेटवर्क [टैन] के साथ डेटा के लिए पाँच फिल्में और 49 μM नेटवर्क [लाल] के साथ डेटा के लिए चार फिल्में)। वाई-अक्ष में लघुगणक स्केलिंग है। एक सी की क्यू-निर्भरता का अवलोकन करता है जो इस प्रकार हैEquation060, जो अधिकतम माध्य वर्ग विस्थापन को निकालने की अनुमति देता है, δ2। ठोस लाइनों के साथ दिखाए जाने के लिए Equation060 फिट बैठता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कोई भी डेटा से कारावास आकार δ निकालने के लिए अन्य तरीकों का उपयोग कर सकता है और साथ ही 19 μM विमेंटिन नेटवर्क के भीतर मोतियों के लिए ω (क्यू) की जांच करने से पाए जाने वाले सबडिफ्यूजिव एक्सपोनेंट का उपयोग कर सकता है। सबसे पहले, डीडीएम मैट्रिक्स से एमएसडी निकालने के लिए बेल्स एट अल .76 और एडेरा एट अल .77 द्वारा वर्णित विधि का उपयोग कर सकते हैं। विशेष रूप से, इस विधि को डीडीएम मैट्रिक्स की कोई फिटिंग की आवश्यकता नहीं है। एक को केवल डीडीएम मैट्रिक्स, डी (क्यू, Δ टी), और (जिसमें से ए (क्यू) और Equation070 बी निर्धारित किया जा सकता है) की गणना करनेकी आवश्यकता है। फिर, एमएसडी को खोजने के लिए, कोई संबंध Equation071का उपयोग करता है। ध्यान दें कि एमएसडी को खोजने के लिए यह विधि मानती है कि कण विस्थापन का वितरण गाऊसी है, हालांकि पिछले काम से पता चला है कि, कुछ मामलों में, डीडीएम से प्राप्त एमएसडी कण ट्रैकिंग से एमएसडी से सहमत हैं, भले ही विस्थापन गैर-गाऊसी73 हों। इस प्रणाली के लिए, जैसा कि अपेक्षित78 है, बड़े विस्थापन के वितरण में गैर-गॉसियनिटी है, जैसा कि चित्रा एस 1 में देखा गया है। पीवाईडीडीएम पैकेज में, फ़ंक्शन extract_MSD निष्पादित किया जाना चाहिए, जो लौटाता Equation056है। दूसरे, एमएसडी को खोजने के लिए एकल कण ट्रैकिंग का उपयोग किया जा सकता है। यद्यपि डीडीएम का उपयोग छवियों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है जहां या तो कणों का उच्च घनत्व या सीमित ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन सटीक कण स्थानीयकरण को प्रतिबंधित करता है, विमेंटिन नेटवर्क में 0.6 μm मोतियों की छवियों के लिए, हम ट्रैकपी सॉफ़्टवेयर (https://github.com/soft-matter/trackpy) 79 का उपयोग करके मोतियों को स्थानीयकृत और ट्रैक करने में सक्षम थे। यह कण ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर पैकेज क्रोकर और ग्रियर्स80 द्वारा वर्णित एल्गोरिदम का उपयोग करता है।

Figure 7
चित्रा 7: विमेंटिन नेटवर्क के लिए औसत चौकोर विस्थापन बनाम अंतराल समय। एमएसडी दो तरीकों का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। सबसे पहले, एमएसडी की गणना डीडीएम मैट्रिक्स (ठोस प्रतीकों के साथ दिखाया गया) से की गई थी। अगला, एमएसडी को कण प्रक्षेपवक्र (खुले प्रतीकों) को खोजने के लिए एकल-कण ट्रैकिंग (एसपीटी) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। त्रुटि सलाखों को उसी तरह से निर्धारित किया जाता है जैसा कि पिछले दो आंकड़ा किंवदंतियों में वर्णित है। (ए) 19 μM विमेंटिन नेटवर्क में 0.6 μm मोती के लिए एमएसडी एमएसडी खोजने के दो तरीकों के बीच अच्छे समझौते के साथ, सबडिफ्यूजिव गति का संकेत देते हैं। (बी) 49 μM vimentin नेटवर्क में 0.6 μm मोती के लिए एमएसडी एमएसडी खोजने के दो तरीकों के बीच अच्छे समझौते के साथ और गैर-आरजीओडीसिटी पैरामीटर से पाए जाने वाले अधिकतम एमएसडी के साथ पिंजरे की गति का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

19 μM vimentin नेटवर्क में और 49 μM vimentin नेटवर्क में 0.6 μm मोती के लिए एमएसडी बनाम अंतराल समय चित्रा 7 में दिखाया गया है। दोनों मामलों में, डीडीएम से निर्धारित एमएसडी एकल-कण ट्रैकिंग (एसपीटी) के माध्यम से पाए गए एमएसडी के साथ अच्छी तरह से सहमत था। इसके अलावा, कम केंद्रित नेटवर्क के लिए, सबडिफ्यूजिव स्केलिंग एक्सपोनेंट (α इनEquation010) लगभग 0.9 था। यह ω(q) (अर्थात्, 2/2.2 = 0.9) निर्धारित करने के लिए आईएसएफ को फिट करके पाए गए ω(q) स्केलिंग Equation010 के अनुरूप है। अधिक केंद्रित नेटवर्क के लिए, एमएसडी पठार लंबे अंतराल समय पर। नॉनर्गोडिसिटी पैरामीटर की क्यू-निर्भरता का विश्लेषण करके पाया गया अधिकतम एमएसडी (δ 2 = 0.0032 μm 2 पर क्षैतिज रेखा के साथ चित्रा 7 बी में दिखाया गया है) लगभग वही मूल्य था जो एसपीटी और डीडीएम दोनों से एमएसडी पठार लग रहा था। चित्रा 7 ए में डीडीएम और एसपीटी से निर्धारित सबसे लंबे अंतराल समय एमएसडी के बीच एक विसंगति है। हालांकि यह सीमित संख्या में लंबे अंतराल समय प्रक्षेपवक्र के कारण हो सकता है, यह भी मामला हो सकता है कि क्यू मानों की सीमा को और अनुकूलित करना जिसके लिए डीडीएम मैट्रिक्स का उपयोग प्रत्येक अंतराल समय के लिए अनुमान लगाने Equation056 के लिए किया जाता है (जैसा कि बेल्स एट अल .76 और एडेरा एट अल .77 द्वारा किया गया है) हमारे परिणामों में सुधार करेगा, और इस तरह के अनुकूलन भविष्य के काम का फोकस होगा।

ये प्रयोग जहां छवि अनुक्रम स्वतंत्र विश्लेषण के लिए अनुमति दी गई विमेंटिन मध्यवर्ती फिलामेंट्स के नेटवर्क में एम्बेडेड ट्रेसर मोतियों के रिकॉर्ड किए गए थे: डीडीएम (यहां वर्णित पैकेज का उपयोग करके) और एसपीटी (ट्रैकपी का उपयोग करके)। दोनों विश्लेषण सबडिफ्यूजन और कारावास की लंबाई की डिग्री को प्रकट कर सकते हैं, जिससे पूरक मैट्रिक्स प्रदान करने के लिए दो स्वतंत्र छवि विश्लेषण तकनीकों का उपयोग करने की अनुमति मिलती है। एसपीटी और डीडीएम से तुलना की जा सकने वाली अतिरिक्त मात्राएं हैं। उदाहरण के लिए, नमूने की गतिशीलता में विषमता एसपीटी से निर्धारित कण विस्थापन (यानी, वैन होव वितरण) के वितरण में गैर-गॉसियनिटी के रूप में प्रकट हो सकती है, साथ ही डीडीएम से निर्धारित एक आईएसएफ में जो एक विस्तारित घातीय34,35 पर फिट बैठता है। चित्रा एस 1 विमेंटिन नेटवर्क में 0.6 μm कणों के लिए वैन होव वितरण को दर्शाता है और बायोमिमेटिक सिस्टम 9,10,47 या अन्य भीड़ वाले वातावरण 34 के भीतर कणों की विषम गतिशीलता को प्रदर्शित करने के लिए पिछले अध्ययनों में अग्रानुक्रम में उपयोग किए गए आईएसएफ-मैट्रिक्स को फिट करने से पाए गए स्ट्रेचिंग एक्सपोनेंट पर चर्चा करता है। . एक अन्य उदाहरण के रूप में, आईएसएफ की गणना एसपीटी के साथ मापा गया कण प्रक्षेपवक्र से की जा सकती है और डीडीएम-अधिग्रहित आईएसएफ के साथ तुलना की जा सकती है। जबकि औसत वर्ग विस्थापन और विस्थापन वितरण सबसे अधिक बार एसपीटी विश्लेषण से खींचे गए मैट्रिक्स हैं, कोई भी कण प्रक्षेपवक्र से आईएसएफ की गणना कर सकता है, Equation075का उपयोग करके Equation076 (चित्रा एस 2 देखें)। इस आईएसएफ की तुलना डीडीएम-जनित आईएसएफ के साथ की जा सकती है और इसका उपयोग एमएसडी59 में स्पष्ट नहीं गतिशीलता को प्रकट करने के लिए किया जाता है।

नेटवर्क के भीतर ट्रेसर कणों की छवियों को प्राप्त करते समय एसपीटी और डीडीएम के पूरक विश्लेषण विधियों का उपयोग करने की अनुमति मिल सकती है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एसपीटी पर डीडीएम का एक फायदा यह है कि इसे मोतियों (या अन्य विशेषताओं) की छवियों की आवश्यकता नहीं होती है जिन्हें आसानी से स्थानीयकृत और ट्रैक किया जा सकता है। इस बिंदु को प्रदर्शित करने के लिए, हम आगे एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं फिलामेंट्स के सक्रिय नेटवर्क के विश्लेषण को उजागर करते हैं, जहां एक्टिन और ट्यूबुलिन की फ्लोरोसेंट लेबलिंग दोनों फिलामेंट प्रकारों की इमेजिंग की अनुमति देती है, जो विभिन्न फ्लोरोफोरस के माध्यम से एक दूसरे से अलग होती है, एक बहु-रंग लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ।

छवियों को मायोसिन (खरगोश कंकाल की मांसपेशी मायोसिन द्वितीय) द्वारा संचालित गतिविधि के साथ एक्टिन-सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहित किया गया था; साइटोस्केलेटन #MY02)। प्रयोगों और परिणामों का विवरण पहले11 वर्णित किया गया है, और यहां दिखाए गए प्रतिनिधि परिणाम11 के लिए पूरक सामग्री (फिल्में एस 1 और एस 4) में प्रदान की गई दो फिल्मों के विश्लेषण से हैं। दोनों छवि अनुक्रम 1000 फ्रेम के लिए 2.78 फ्रेम /

इन छवियों का विश्लेषण करने के लिए, डीडीएम मैट्रिक्स की गणना 0.4 एस से 252 एस (1 फ्रेम से 700 फ्रेम) तक 50 अंतराल समय के लिए की गई थी। डीडीएम मैट्रिक्स तब मॉडल Equation010के लिए फिट था, जिसमें मध्यवर्ती बिखरने वाला फ़ंक्शन था Equation077। इसलिए, चार फिटिंग पैरामीटर हैं: ए, ω, एस और बी। इन फिट के परिणाम चित्रा 8 में दिखाए गए हैं। यह देखा गया कि एक विशेष क्यू-वैल्यू के लिए डीडीएम मैट्रिक्स में कम अंतराल समय पर एक पठार था, अंतराल समय के साथ वृद्धि हुई, और फिर बड़े अंतराल समय पर पठार (या पठार शुरू होने के संकेत दिखाए गए)। क्यू के निचले मूल्यों के लिए डीडीएम मैट्रिक्स लंबे अंतराल समय पर एक पठार तक नहीं पहुंचा। इसलिए, इन कम क्यू (बड़े लंबाई पैमाने पर) गतिशीलता के लिए क्षय समय के माप में खराब सटीकता की उम्मीद करनी चाहिए।

विशेषता क्षय समय, ω, फिट से डीडीएम मैट्रिक्स के लिए चित्रा 9 में दिखाया गया है। परिणाम एक सक्रिय एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समग्र नेटवर्क (मूवीएस 1 11 के समान) और एक सक्रिय एक्टिन नेटवर्क (मूवी एस 411 के समान) के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं। दोनों नेटवर्क एक्टिन और मायोसिन की समान सांद्रता के साथ तैयार किए गए थे, लेकिन एक्टिन-ओनली नेटवर्क ट्यूबुलिन के बिना बनाया गया था, जैसा कि11 में वर्णित है। इन दो प्रकार के सक्रिय नेटवर्क के लिए, मनाया शक्ति कानून संबंध था Equation010। यह स्केलिंग बैलिस्टिक गति को इंगित करता है और मायोसिन संचालित संकुचन और प्रवाह फिलामेंट्स की थर्मल गति पर हावी है। ω = (vq)-1 से, सक्रिय एक्टिन-सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के लिए लगभग 10 एनएम/सेकंड और सक्रिय एक्टिन नेटवर्क के लिए 75 एनएम/सेकंड का एक विशिष्ट वेग, वी पाया जा सकता है। ये मान11 में दिखाए गए समान वीडियो के कण छवि वेलोसिमेट्री विश्लेषण के अनुरूप हैं। Equation010 स्केलिंग सक्रिय एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समग्र नेटवर्क के लिए कम क्यू मानों पर नहीं था। ऐसा इसलिए है क्योंकि कम क्यू मानों पर इस एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समग्र नेटवर्क के लिए सही क्षय समय गणना किए गए डीडीएम मैट्रिक्स के अधिकतम अंतराल समय से अधिक लंबा है। अधिकतम अंतराल समय चित्रा 9 में क्षैतिज लाल रेखा के साथ इंगित किया गया है, और क्षय समय इन लंबे समय के पास अपेक्षित Equation010 स्केलिंग से विचलित हो गया है।

Figure 8
चित्रा 8: एक सक्रिय एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समग्र नेटवर्क के लिए डीडीएम मैट्रिक्स बनाम अंतराल समय। क्यू के कई मूल्यों के लिए डीडीएम मैट्रिक्स को 2.9 μM एक्टिन मोनोमर्स, 2.9 μM ट्यूबुलिन डिमर्स और 0.24 μM मायोसिन से बने समग्र नेटवर्क की एक फिल्म से अंतराल समय के एक फ़ंक्शन के रूप में प्लॉट किया गया है। ये डेटा छवियों की एक बहुरंगी समय श्रृंखला के सूक्ष्मनलिका चैनल का विश्लेषण दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: सक्रिय एक्टिन-सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के लिए क्षय समय बनाम तरंग संख्या। डीडीएम मैट्रिक्स को फिट करने से, क्षय समय, ω, तरंग संख्या के एक समारोह के रूप में, क्यू, पाया जाता है। प्लॉटेड भूरे रंग में एक सक्रिय एक्टिन-सूक्ष्मनलिका नेटवर्क (केवल सूक्ष्मनलिका चैनल का विश्लेषण) की छवियों के लिए और हरे रंग में एक सक्रिय एक्टिन नेटवर्क की छवियों के लिए ω बनाम क्यू है। दोनों नेटवर्क में एक्टिन और मायोसिन की समान सांद्रता है (क्रमशः 2.9 μM और 0.24 μM); एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समग्र में ट्यूबुलिन डिमर के 2.9 μM होते हैं। सक्रिय एक्टिन नेटवर्क के लिए क्षय समय सक्रिय एक्टिन-सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के क्षय समय की तुलना में बहुत छोटा है, जो सक्रिय एक्टिन नेटवर्क की तेज गति को इंगित करता है। दोनों मामलों में, गतिशीलता बैलिस्टिक है क्योंकि डेटा एक प्रवृत्ति का अनुसरण करता हैEquation010। इनसेट: आईएसएफ की साजिश बनाम वेवनंबर (Δt × क्यू) द्वारा स्केल किए गए अंतराल समय क्यू मूल्यों की एक श्रृंखला पर आईएसएफ के पतन को दर्शाता है। यह बैलिस्टिक गति को भी इंगित करता है। इस इनसेट में दिखाए गए आईएसएफ सक्रिय एक्टिन नेटवर्क से हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सक्रिय नेटवर्क के इस डेटा के लिए, हमने डीडीएम मैट्रिक्स को फिट करना चुना, Equation010। यह विमेंटिन नेटवर्क में मोतियों के डेटा के लिए क्या किया गया था, जहां ए (क्यू) और बी को आईएसएफ, एफ (क्यू, Δ टी) को अलग करने के लिए किसी भी फिटिंग के बिना अनुमानलगाया गया था। इस मामले में, सक्रिय नेटवर्क डेटा के लिए, ए और बी को फिटिंग पैरामीटर के रूप में छोड़ दिया गया था क्योंकि बी का अनुमान लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों के परिणामस्वरूप अच्छा फिट नहीं हुआ था। बी का अनुमान लगाने के लिए डिफ़ॉल्ट विधि गणना Equation031 करना है और यह मानना है कि, बड़े क्यू में, यह बी / हालांकि, इस पद्धति ने इस डेटा के लिए बी को अधिक अनुमानित किया, जिसे इस तथ्य में देखा गया था कि, इस तरह से अनुमानित बी से आईएसएफ की गणना करते समय (नहीं दिखाया गया है), आईएसएफ शुरुआती अंतराल समय में 1 से अधिक थे (जबकि उन्हें अधिकतम 1 से शून्य या बढ़ते अंतराल समय के साथ कुछ नॉनर्गोडिसिटी पैरामीटर तक जाना चाहिए)। पैरामीटर background_method का उपयोग करके बी का अनुमान लगाने के लिए अन्य तरीकों का चयन कर सकते हैं। इन अन्य तरीकों में से एक बी को शुरुआती अंतराल समय (background_method = 1 के साथ सेट) पर डीडीएम मैट्रिक्स का न्यूनतम होने का अनुमान लगाना है। इसी तरह की विधि का उपयोग बेल्स एट अल .76 द्वारा किया गया था, हालांकि उन्होंने यह नहीं माना कि बी क्यू के साथ स्थिर था। एक अन्य विकल्प बी को अधिकतम क्यू (background_method = 2 के साथ सेट) पर डीडीएम मैट्रिक्स के सभी अंतराल समय पर औसत मूल्य होने का अनुमान लगाना है। पृष्ठभूमि का अनुमान लगाने के लिए ये अलग-अलग तरीके, साथ ही बी को एक मुफ्त फिटिंग पैरामीटर होने की अनुमति देने के परिणाम, चित्रा 10 में दिखाए गए हैं। उन भूखंडों से, कोई देख सकता है कि आयाम, ए, जांच किए गए सबसे बड़े क्यू मानों पर शून्य तक नहीं पहुंचा था, क्योंकि Equation031 बड़े क्यू (चित्रा 10 बी) पर पठार नहीं था, और चूंकि डी (क्यूअधिकतम, Δ टी) कम अंतराल समय पठार से कुछ उच्च अंतराल समय पठार (यानी, क्यूअधिकतम पर, एक गैर-शून्य ए था; चित्रा 10 डी)। इसलिए, न तो बी का अनुमान लगाना Equation082 और न ही जैसा Equation083 कि उचित होगा। बी का अनुमान लगाने के तरीके (यायदि) पर निर्णय लेने से पहले बनाम क्यू और डी (क्यूअधिकतम, Δटी) बनाम Δ टी का निरीक्षण Equation031 करना चाहिए।

Figure 10
चित्रा 10: सक्रिय एक्टिन-सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के लिए पृष्ठभूमि बनाम तरंग संख्या। डीडीएम मैट्रिक्स को फिट करने से, कोई पृष्ठभूमि, बी, तरंग संख्या, क्यू के एक समारोह के रूप में पा सकता है। दिखाया गया है बी बनाम क्यू एक सक्रिय एक्टिन-सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की छवियों के लिए (केवल सूक्ष्मनलिका चैनल का विश्लेषण करना) बैंगनी प्रतीकों के साथ इन फिट बैठता है। (ए) में तीन ठोस रेखाएं बिना किसी फिटिंग के पाई जाने वाली पृष्ठभूमि के अनुमान दिखाती हैं। (ए) में शीर्ष, सबसे गहरी रेखा अनुमानित पृष्ठभूमि का उपयोग करके Equation088दिखाती है, जो बड़े क्यू पर एक स्थिर मूल्य के लिए पठारों पर उपयुक्त Equation031 हो सकती है। (बी) से, ध्यान दें कि Equation031 अभी तक सबसे बड़े क्यू जांच पर एक स्थिर मूल्य तक पहुंचना बाकी है। इसलिए, इस पद्धति का उपयोग पृष्ठभूमि को अधिक महत्व देता है। (ए) में नीचे की रेखा का उपयोग करके Equation090अनुमानित पृष्ठभूमि दिखाती है। यदि डीडीएम मैट्रिक्स लाल रेखा के साथ (सी) में दिखाए गए अनुसार कम अंतराल समय पठार दिखाता है, तो यह विधि पृष्ठभूमि का अनुमान लगाने के लिए उपयुक्त हो सकती है। (ए) में मध्य, सबसे हल्की रेखा अनुमानित पृष्ठभूमि से Equation083पता चलता है। यह विधि उपयुक्त हो सकती है यदि , क्यूअधिकतम पर, आयाम, ए, शून्य तक पहुंच गया है। (डी) से, यह देखा जाता है कि आयाम गैर-शून्य है और इसलिए, यह विधि पृष्ठभूमि को अधिक महत्व देती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: कण विस्थापन की संभावना वितरण। कण विस्थापन की संभाव्यता वितरण 34 μM और 49 μM की विमेंटिन सांद्रता के लिए गैर-गॉसियनिटी दिखाते हैं। 0.6 μm व्यास मोतियों की एकल-कण ट्रैकिंग विभिन्न सांद्रता के विमेंटिन नेटवर्क में की गई थी। तीन स्थितियों के लिए विस्थापन वितरण में अलग-अलग अंतराल समय दिखाए जाते हैं। (ए) 19 μM विमेंटिन नेटवर्क में कण विस्थापन का वितरण एक गाऊसी फ़ंक्शन के साथ फिट है। बढ़ते अंतराल समय के साथ गाऊसी की चौड़ाई बढ़ जाती है। (बी) 34 μM विमेंटिन नेटवर्क में कण विस्थापन का वितरण 19 μM मामले की तुलना में विशेष रूप से बड़े विस्थापन पर अधिक गैर-गॉसियनिटी दिखाता है। (सी) 49 μM विमेंटिन नेटवर्क में कण विस्थापन का वितरण भी गैर-गॉसियनिटी को दर्शाता है। इसके अलावा, वितरण की चौड़ाई अंतराल समय के साथ उतनी नहीं बढ़ती है जितनी कि कम विमेंटिन सांद्रता वाले नमूनों में, सीमित गति का संकेत देती है। गैर-गाऊसी वैन होव वितरण (सभी विमेंटिन नमूनों के लिए देखा जाता है लेकिन उच्च सांद्रता में सबसे स्पष्ट) विषम गतिशीलता से जुड़ा होता है जैसा कि अक्सर भीड़ और सीमित वातावरण में कणों के परिवहन में देखा जाता है। डीडीएम विश्लेषण से निर्धारित विषम परिवहन का एक अन्य संकेतक मध्यवर्ती बिखरने वाले फ़ंक्शन को फिट करने के लिए उपयोग किया जाने वाला स्ट्रेचिंग एक्सपोनेंट है (यहां उपयोग किए जाने वाले आईएसएफ के समीकरण में पैरामीटर: Equation077 + Equation061)। 0.4 μm-1 से 9.4 μm-1 की q-सीमा पर औसत खींचने वाले घातांक उच्चतम विमेंटिन एकाग्रता से सबसे कम, 0.53 ± 0.07, 0.64 ± 0.02, और 0.86 ± 0.04 (मानक विचलन ± मतलब) हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: डीडीएम और एसपीटी से मध्यवर्ती बिखरने वाले कार्य। पांच अलग-अलग तरंगसंख्याओं के लिए मध्यवर्ती प्रकीर्णन फ़ंक्शन (आईएसएफ) दिखाए गए हैं। डीडीएम के माध्यम से पाए जाने वाले आईएसएफ बनाम अंतराल समय को परिपत्र मार्करों के साथ प्लॉट किया जाता है, और आईएसएफ की गणना खुले वर्गों के साथ एकल-कण प्रक्षेपवक्र से की जाती है। बिंदीदार काली रेखाएं डीडीएम-अधिग्रहित आईएसएफ के लिए फिट दिखाती हैं। आईएसएफ की गणना एकल-कण प्रक्षेपवक्र से की जाती है, Equation075का उपयोग करके Equation076। (ए) में, आईएसएफ को 19 μM vimentin नेटवर्क में 0.6 μm कणों के लिए दिखाया गया है। (बी) में, आईएसएफ को 34 μM विमेंटिन नेटवर्क में 0.6 μm कणों के लिए दिखाया गया है। डीडीएम और एसपीटी से पाए गए आईएसएफ में विसंगतियां सीमित संख्या में लंबे अंतराल प्रक्षेपवक्र के कारण होने की संभावना है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: डीडीएम का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल। प्रोटोकॉल में दिखाए गए चरणों के इनपुट और आउटपुट प्रस्तुत किए जाते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 2: विमेंटिन नेटवर्क के लिए नमूना तैयारी और उदाहरण पैरामीटर फ़ाइलों का विवरण। विमेंटिन नेटवर्क पर नमूना तैयार करने और छवि अधिग्रहण के लिए विस्तृत कदम प्रदान किए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, विमेंटिन नेटवर्क पर प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत डेटा के विश्लेषण के लिए एक उदाहरण पैरामीटर फ़ाइल भी प्रदान की जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां वर्णित सॉफ्टवेयर पैकेज ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त छवियों में देखे गए घनत्व में उतार-चढ़ाव का विश्लेषण करने के लिए डीडीएम का उपयोग करता है। विमेंटिन नेटवर्क में एम्बेडेड ट्रेसर कणों के डेटा से प्रतिनिधि परिणाम पहले दिखाए गए थे। इस तरह के डेटा के विश्लेषण का उपयोग नेटवर्क के जाल आकार और कठोरता को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है, इसी तरह साइटोस्केलेटन नेटवर्क 6,12,13 के कई पिछले अध्ययनों में एकल-कण ट्रैकिंग का उपयोग कैसे किया गया है। एकल-कण ट्रैकिंग पर डीडीएम का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि डीडीएम को कणों को स्थानीयकृत करने की आवश्यकता नहीं होती है। इसलिए, यहां तक कि उन छवियों में जहां कण घनत्व बहुत अधिक है या कण स्थानीयकरण और ट्रैक करने के लिए बहुत छोटे हैं, डीडीएम अभी भी गतिशीलता निर्धारित कर सकता है। जहां एकल-कण ट्रैकिंग फायदेमंद होगी, कण-से-कण परिवर्तनशीलता का निरीक्षण करते समय है। डीडीएम के साथ, एक पहनावा औसत गतिशीलता पाता है, जबकि एकल-कण ट्रैकिंग के साथ, कोई भी एक कण के एमएसडी और पहनावा-औसत एमएसडी दोनों की गणना कर सकता है। हालांकि, डीडीएम का उपयोग देखने के एक बड़े क्षेत्र के भीतर ब्याज के कई क्षेत्रों का विश्लेषण करके विषम गतिशीलता की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

अगला, दो अलग-अलग लेबल वाले साइटोस्केलेटल फिलामेंट प्रकारों से बने एक सक्रिय नेटवर्क में फ्लोरोसेंटली लेबल फिलामेंट्स के डेटा से प्रतिनिधि परिणाम11 दिखाए गए थे। इस डेटा के साथ, बैलिस्टिक गति को छवि के भीतर किसी भी स्थानीयकरण योग्य सुविधाओं की आवश्यकता के बिना विशेषता दी गई थी। चूंकि डीडीएम कुछ उपयोगकर्ता इनपुट के साथ पहनावा औसत गतिशीलता निकालता है, इसलिए यह विभिन्न स्थितियों के साथ अधिग्रहित छवि श्रृंखला की तुलना सरल बनाता है (उदाहरण के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं या मायोसिन की विभिन्न सांद्रता वाले नमूनों के लिए एक्टिन के विभिन्न अनुपातों के साथ नमूनों की तुलना करना, जैसा कि50 में किया गया है)। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग करके, हम बहुरंगी लेबलिंग का उपयोग करके नेटवर्क के विभिन्न घटकों की गतिशीलता की जांच कर सकते हैं। यह11,50 में किया गया था, जहां मल्टीकलर इमेजिंग का उपयोग करके एक सक्रिय एक्टिन-माइक्रोट्यूब्यूल समग्र नेटवर्क में एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता का अलग-अलग विश्लेषण किया गया था। यहां प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, सूक्ष्मनलिका चैनल से केवल परिणाम दिखाए गए थे, लेकिन पिछले काम में, हमने सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन फिलामेंट्स11 की गतिशीलता की तुलना की।

हम ध्यान दें कि ये प्रतिनिधि परिणाम या तो निष्क्रिय सबडिफ्यूजन या सक्रिय बैलिस्टिक गति दिखाते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, डीडीएम का उपयोग उन प्रणालियों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है जहां मध्यवर्ती समय या लंबाई के तराजू पर गतिशीलता के प्रकार में एक क्रॉसओवर होता है। उदाहरण के लिए, कुर्ज़थलर एट अल ने कम समय के तराजू पर सक्रिय निर्देशित गति का पता लगाने और लंबे समय तक तराजू59 पर अभिविन्यास के यादृच्छिकरण के लिए सक्रिय जानूस कोलाइड्स की एक प्रणाली के साथ डीडीएम का उपयोग किया; जियावाज़ी एट अल ने एक मोटे फोम के साथ डीडीएम का उपयोग किया और एक बुलबुला33 की लंबाई के पैमाने के अनुरूप गतिशीलता में एक क्रॉसओवर पाया; कोलाइडयन जैल के साथ डीडीएम का उपयोग किया और भग्न समूहों से पूरे नेटवर्क32 तक फैले विभिन्न लंबाई के तराजू पर तीन अलग-अलग शासन पाए।

प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में शामिल डेटा ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी और लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ अधिग्रहित किया गया था। हालांकि, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, डीडीएम का उपयोग कई इमेजिंग तौर-तरीकों के साथ किया जा सकता है। किसी भी इमेजिंग पद्धति के साथ, उपयोगकर्ताओं को ऑप्टिकल सेटिंग्स जैसे ऑप्टिकल सेक्शनिंग की डिग्री या क्षेत्र की गहराई पर विचार करना चाहिए। ऑप्टिकल सेक्शनिंग की एक उच्च डिग्री आउट-ऑफ-फोकस ऑब्जेक्ट्स से सिग्नल को कम कर सकती है, लेकिन कोई भी क्षेत्र25,28 की गहराई से बाहर निकलने के लिए ऑब्जेक्ट्स के लिए टाइमस्केल से अधिक टाइमस्केल पर गतिशीलता को सटीक रूप से मापने में सक्षम नहीं होगा। क्षेत्र की क्यू-निर्भर गहराई डीडीएम विश्लेषण को कैसे प्रभावित करती है, इसकी अधिक गहन चर्चा22 में पाई जा सकती है। ब्राइटफील्ड इमेजिंग के लिए, उपयोगकर्ताओं को नमूना मोटाई पर भी विचार करने की आवश्यकता हो सकती है। जबकि कमजोर बिखरने वाले नमूनों के लिए, मोटे नमूने अधिक संकेत42 प्रदान कर सकते हैं, टर्बिड नमूनों को कई बिखरनेवाले 81 के लिए विश्लेषण को संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है। अंत में, इमेजिंग विधियों के लिए जो रैखिक स्थान अपरिवर्तनीय नहीं हैं (अर्थात, जहां किसी ऑब्जेक्ट के कैमरे द्वारा रिकॉर्ड की गई तीव्रता इस बात पर निर्भर करती है कि वह ऑब्जेक्ट एक्स-वाई नमूना विमान में कहां है), किसी को रैखिक अंतरिक्ष विचरण के लिए खाते की आवश्यकता हो सकती है, जैसा कि डार्क-फील्ड डीडीएम27 के साथ प्रदर्शित किया गया है।

डीडीएम के साथ शुरुआत करने वालों के लिए, हम स्थानिक और लौकिक संकल्प पर विचार करने के महत्व पर जोर देना चाहते हैं। तरंग संख्या के एक समारोह के रूप में निर्धारित क्षय समय का निरीक्षण करते समय, किसी के रिज़ॉल्यूशन की सीमाओं को चिह्नित करना महत्वपूर्ण है (यानी, अधिकतम और न्यूनतम अंतराल समय और अधिकतम तरंग संख्या, जैसा कि चित्रा 5 में किया गया है)। डेटा एकत्र करने से पहले इन सीमाओं के बारे में ध्यान से सोचना चाहिए ताकि इष्टतम उद्देश्य लेंस, छवि आकार, फ्रेम दर और फिल्म अवधि का चयन किया जा सके। अन्य महत्वपूर्ण विचार यह है कि पृष्ठभूमि पैरामीटर बी का अनुमान कैसे लगाया जाए। साहित्य में पृष्ठभूमि का अनुमान लगाने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया गया है, और बी को अधिक या कम करके आंकने के प्रभावों को पूर्व प्रकाशनों62,77 में वर्णित किया गया है। जैसा कि चित्रा 10 में दिखाया गया है, पीवाईडीडीएम उपयोगकर्ताओं को बी का अनुमान लगाने के लिए विभिन्न तरीकों को लागू करने की अनुमति देता है, और हम सुझाव देते हैं कि नए उपयोगकर्ता इन विधियों का प्रयास करें और मूल्यांकन करें कि कौन सा उपयोग करने के लिए उपयुक्त हैं।

इस पैकेज की एक ताकत इसका संपूर्ण प्रलेखन और वॉकथ्रू है जिसमें उदाहरण डेटा, मेटाडेटा का भंडारण और संगठन है ताकि विश्लेषण कैसे किया गया, और डीडीएम मैट्रिक्स का विश्लेषण करने के तरीके में लचीलापन (विभिन्न फिटिंग मॉडल, पृष्ठभूमि पैरामीटर बी का अनुमान लगाने के लिए कई तरीके, एमएसडी खोजने की क्षमता)। हालाँकि, इस कोड के कई पहलू हैं जिन्हें सुधारा जा सकता है। वर्तमान में, कोड को तेज गणना गति के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है। गणना में तेजी लाने के तरीकों को61,62 की सूचना दी गई है, और इन्हें भविष्य के रिलीज में लागू किया जाएगा। इसके अतिरिक्त, हम अनिश्चितताओं का बेहतर अनुमान लगाने और उपयोगकर्ताओं को उपयुक्त आईएसएफ मॉडल62 के मार्गदर्शन के लिए सिमुलेशन को नियोजित करने के लिए हाल ही में रिपोर्ट किए गए तरीकों को लागू करने की योजना बना रहे हैं। अन्य सुधारों के लिए, हमें उम्मीद है कि उपयोगकर्ता सुझावों के साथ हमसे संपर्क करेंगे।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध के कुछ हिस्सों को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ आर 15 अवार्ड (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज अवार्ड नं। आर 15 जीएम 123420, आरएमआर-ए को सम्मानित किया गया। और आरजेएम), रिसर्च कॉर्पोरेशन फॉर साइंस एडवांसमेंट से कॉटरेल स्कॉलर अवार्ड (पुरस्कार संख्या 27459, आरजेएम को सम्मानित किया गया), और एक विलियम एम। जीएचके कृतज्ञतापूर्वक डच रिसर्च काउंसिल (एनडब्ल्यूओ; एनडब्ल्यूओ प्रतिभा कार्यक्रम की परियोजना संख्या VI.C.182.004) से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 Hamatsu
F-127 Pluronic Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop Thermo Fisher
Nikon Ti-Eclipse microscope Nikon
PLL-PEG-bio SuSos AG, Dübendorf, Switzerland
Polystyrene beads Sigma Aldrich
Protein dialysis mini-cassette Thermo Fisher
PyDDM University of San Diego N/A Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 184
विभेदक गतिशील माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके साइटोस्केलेटन गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करना
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Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G.,… More

Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G., Petitjean, I. I., Koenderink, G. H., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. J. Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63931, doi:10.3791/63931 (2022).

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