Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تحديد ديناميكيات الهيكل الخلوي باستخدام المجهر الديناميكي التفاضلي

Published: June 15, 2022 doi: 10.3791/63931
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 2, 2
1Cell Biology, Neurobiology and Biophysics, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 2Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

Summary

يجمع الفحص المجهري الديناميكي التفاضلي (DDM) بين ميزات تشتت الضوء الديناميكي والفحص المجهري. هنا ، يتم عرض عملية استخدام DDM لتوصيف شبكات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها عن طريق تحديد الديناميكيات تحت الانتشار والمحبوسة للجسيمات في شبكات vimentin والحركة الباليستية لمركبات الأكتين - microtubule النشطة التي يحركها الميوسين.

Abstract

يمكن للخلايا الزحف والشفاء الذاتي وضبط صلابتها بسبب هيكلها الخلوي الديناميكي بشكل ملحوظ. على هذا النحو ، قد تؤدي إعادة تشكيل شبكات البوليمرات الحيوية الهيكلية الخلوية إلى مجموعة من المواد النشطة والقابلة للتكيف. ومع ذلك ، فإن هندسة هذه المواد ذات الخصائص المضبوطة بدقة تتطلب قياس كيفية اعتماد الديناميكيات على تكوين الشبكة وطرق التوليف. ويواجه تحديد هذه الديناميكيات تحديا يتمثل في الاختلافات عبر الزمان والمكان ومساحة صياغة الشبكات المركبة. يصف البروتوكول هنا كيف يمكن لتقنية تحليل فورييه ، المجهر الديناميكي التفاضلي (DDM) ، تحديد ديناميكيات شبكات البوليمر الحيوي وهي مناسبة بشكل خاص لدراسات شبكات الهيكل الخلوي. يعمل DDM على تسلسلات زمنية للصور التي تم الحصول عليها باستخدام مجموعة من طرق الفحص المجهري ، بما في ذلك المسح الضوئي بالليزر ، والتألق واسع المجال ، والتصوير الساطع. من تسلسلات الصور هذه ، يمكن للمرء استخراج أوقات الديكور المميزة لتقلبات الكثافة عبر نطاق من متجهات الموجة. كما تم تطوير حزمة Python سهلة الاستخدام ومفتوحة المصدر لإجراء تحليل DDM. باستخدام هذه الحزمة ، يمكن للمرء قياس ديناميكيات مكونات الهيكل الخلوي الموسوم أو جزيئات التتبع المضمنة ، كما هو موضح هنا مع بيانات شبكات الخيوط الوسيطة (vimentin) وشبكات الأكتين والأنابيب الدقيقة النشطة. سيتمكن المستخدمون الذين ليس لديهم خبرة سابقة في البرمجة أو معالجة الصور من إجراء DDM باستخدام حزمة البرامج هذه والوثائق المرتبطة بها.

Introduction

الهيكل الخلوي هو شبكة من خيوط البروتين التي تمتد عبر سيتوبلازم الخلايا حقيقية النواة ، وتربط سطح الخلية بالنواة. لديها خصائص مواد فريدة من نوعها ، مما يوفر الحماية الميكانيكية ضد الأحمال الميكانيكية الكبيرة والمتكررة ، ولكن أيضا قيادة تغييرات شكل الخلية الديناميكية1. يمكن أن تؤدي شبكات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها إلى ظهور مجموعة من السلوكيات الديناميكية المثيرة للاهتمام ، من حبس الجسيمات المضمنة إلى الحركة الباليستية التي تحركها المحركات الجزيئية2،3،4،5،6،7،8،9،10،11 . تشمل طرق تحليل ديناميكيات هذه الشبكات تتبع حركة الميكروسفير المتتبع المدمج6،7،12،13،14 ، وتحليل الصور لتتبع حجم العناقيد كثيفة البروتين بمرور الوقت8 ، وتشتت الضوء الديناميكي 15 ، وقياس سرعة صورة الجسيمات4،16،17،18،19 ، وحساب الكثافة الطيفية للطاقة للصور بمرور الوقت19، وتحليل الكيموغراف20. مع إجراء المزيد من الدراسات حول شبكات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها ، سواء لفهم الميكانيكا الخلوية أو المادة النشطة ، أصبحت الطرق القوية وغير المتحيزة والقابلة للتكرار لتوصيف الديناميكيات ضرورية بشكل متزايد. يعد الفحص المجهري الديناميكي التفاضلي (DDM)21,22 ، وهو تقنية جديدة نسبيا تم استخدامها لدراسة ديناميكيات الهيكل الخلوي ، إحدى هذه التقنيات التي تحدد الديناميكيات بكفاءة مع عدد قليل من المعلمات المحددة من قبل المستخدم. مع حزمة البرامج الموضحة هنا ، سيتمكن الباحثون ذوو الخبرة القليلة في البرمجة أو تحليل الصور من الاستفادة من DDM لعملهم الخاص.

DDM هي تقنية تحليل الصور لاستخراج ديناميكيات العينة. مثل تتبع الجسيمات أو قياس سرعة صورة الجسيمات ، يتطلب DDM سلسلة زمنية من الصور (غالبا آلاف الصور) ، يتم تسجيلها عادة باستخدام المجهر. على عكس تتبع الجسيمات ، لا تحتاج الميزات الفردية أو حبات التتبع إلى أن تكون مترجمة (أو حتى قابلة للترجمة) في الصورة. على عكس كل من تتبع الجسيمات وقياس سرعة صورة الجسيمات ، يستعيد المرء ديناميكيات المجموعة باستخدام DDM مع عدد قليل نسبيا من المعلمات المحددة من قبل المستخدم. باستخدام DDM ، يتم تحليل الصور في فضاء فورييه لتحديد وقت اضمحلال تقلبات الكثافة عبر مجموعة من الأعداد الموجية ، q ، حيث q = 2πu ، و u هو مقدار الترددات المكانية ، Equation004. يحصل المرء على معلومات تشبه التشتت ولكن مع صور الفضاء الحقيقي التي تم الحصول عليها على المجهر 21،22،23. لذلك ، يمكن للمرء الاستفادة من الطرق المختلفة المولدة للتباين في الفحص المجهري ، مثل التألق واسع المجال22,24 ، أو التألق البؤري25 ، أو المستقطب 26 ، أو المجال المظلم 27 ، أو المجهر الفلوري ذو الورقة الضوئية28. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام الصور المستخدمة لتحليل DDM لتتبع الجسيمات أو قياس سرعة صورة الجسيمات لتوفير معلومات تكميلية.

هذا المزيج من الميزات من تشتت الضوء الديناميكي والمجهر الضوئي يجعل DDM تقنية قوية ومتعددة الاستخدامات. منذ أول وصف له من قبل Cerbino و Trappe في عام 2008 21 ، حيث تم إثبات DDM لقياس انتشار الجسيمات الغروية 73 نانومتر ، تم استخدام DDM لقياس الغرويات المتدفقة29 ، التجميع الغروي 30,31 ، المرونة اللزجة للبلورات السائلة الخيطية26 ، ديناميات المواد الهلامية الغروية 32 ، الرغاوي الخشنة 33 ، الجسيمات النانوية في البيئات المحصورة 34 ، 35,36,37 ، الحركة البكتيرية 38,39,40,41 ، انتشار مجموعات البروتين المبعثرة بشكل ضعيف 42 ، الموجات الشعرية في واجهات السوائل 43 ، وغيرها من الأنظمة. يمكن لأولئك الذين يبحثون عن قائمة أكثر اكتمالا للمنشورات التي تستخدم DDM الرجوع إلى أوراق مراجعة شاملة حول هذا الموضوع22،23،44،45.

كما تم استخدام DDM للتحقيق في ديناميكيات الشبكات البيولوجية. استخدم Drechsler et al. DDM لقياس ديناميكيات الأكتين في بويضات ذبابة الفاكهة الحية46. قام Burla et al. بقياس ديناميكيات الجسيمات التتبعية في شبكات مركبات الهيالورونان والهيالورونان والكولاجين47. كما تم توثيق العديد من استخدامات DDM لدراسة ديناميكيات جزيئات التتبع في شبكات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها9,10 ، ونقل جزيئات الحمض النووي في هذه الشبكات48,49 ، وديناميكيات الشبكات النشطة المعاد تشكيلها 11,50,51. ميزة DDM في قياس الديناميكيات في مثل هذه الأنظمة هي أن الجسيمات أو الجزيئات الفردية لا تحتاج إلى أن تكون محلية وتتبعها. لذلك ، على سبيل المثال ، يمكن قياس ديناميكيات جزيئات الحمض النووي في البيئات المزدحمة باستخدام DDM على الرغم من صعوبة تتبع هذه الجزيئات الصغيرة وغير الكروية. علاوة على ذلك ، باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، يمكن للمرء استخدام العلامات متعددة الألوان لقياس ديناميكيات المكونات الفردية بشكل انتقائي في مركب معقد.

لإجراء DDM ، يتم التقاط سلسلة من الصور بمرور الوقت ، I(x,y,t). بالنسبة لوقت تأخير معين ، Δt ، يتم العثور على جميع (أو مجموعة فرعية من) أزواج الصور مفصولة بوقت التأخر هذا. تحويل فورييه التربيعي لفرق كل زوج ،

Equation007

يتم حسابها ومتوسطها معا. هذه الكمية، هي في المتوسط شعاعيا، Equation008شريطة أن تكون الديناميكيات متساوي الخواص. ينتج عن ذلك مصفوفة DDM (يشار إليها أيضا باسم وظيفة بنية الصورة) ، Equation009. تظهر هذه العملية بيانيا في الشكل 1. لتحديد ديناميكيات العينة من مصفوفة DDM هذه ، يفترض أن تأخذ مصفوفة DDM الشكل

Equation010

حيث A هي السعة ، والتي تعتمد على تفاصيل المجهر وبنية العينة ، B هي الخلفية ، والتي تعتمد على الضوضاء في الصور ، و f (q ، Δt) هي دالة التشتت الوسيطة (ISF) ، والتي تحتوي على معلومات حول الديناميكيات21,22. في الحالات البسيطة،

Equation014

حيث τ هو اضمحلال مميز أو وقت الديكور. وقد استخدم مثل هذا ISF في العديد من الدراسات التي تستخدم DDM على الأنظمة الإرغودية مثل المعلقات الغروية المخففة21،24،27،37،40،52. ومع ذلك ، يمكن استخدام أشكال أخرى من ISF لنمذجة أنواع مختلفة من الديناميكيات. على سبيل المثال ، يمكن للمرء استخدام توسع تراكمي لنمذجة ISF لعينات متعددة التشتت على النحو التالي:

Equation016

حيث μ هو مقياس لتعدد التشتت42,53 ؛ إذا تفاضلت تقلبات الكثافة بواسطة وضعين منفصلين ، فقد يستخدم المرء ISF مثل

Equation01826, 54, 55, 56 , 57;

يمكن استخدام ISFs الأخرى للسباحة الكائنات الحية الدقيقة أو الجسيمات النشطة الأخرى 38،39،40،41،58،59.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على تحليل DDM. من السلسلة الزمنية للصور ، يتم حساب تحويل فورييه لاختلافات الصورة لحساب مصفوفة DDM. يمكن أن تكون مصفوفة DDM مناسبة لنموذج لتحديد النطاق الزمني لتقلبات الكثافة عبر مجموعة من قيم q . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هنا ، يتم وصف استخدام حزمة برامج تحليل DDM التي تم تطويرها في Python ، PyDDM. تعتمد حزمة البرامج هذه على العمل الذي قامت به مختبراتنا البحثية وغيرها من الدراسات المنشورة على مدى السنوات القليلة الماضية. وتشمل الدوافع الرئيسية لإنشاء حزمة البرامجيات هذه الحاجة إلى (1) تتبع وتخزين البيانات الوصفية والمعلمات المستخدمة في التحليل؛ و (2) الحاجة إلى (2) و (ج) و (ج (2) توثيق شامل مع أمثلة مفصلة للتحليل من البداية إلى النهاية ؛ و (3) طريقة سهلة لاستخدام نماذج رياضية مختلفة (أو إنشاء نماذج جديدة) لملاءمة البيانات (على سبيل المثال ، ستكون إضافة نماذج ISF ، مثل تلك التي تم تطويرها مؤخرا للخيوط النشطة60 ، أمرا سهلا). توجد أيضا حزم برامج أخرى لتحليل DDM ، على الرغم من أنها ليست جميعها موثقة جيدا ومكتوبة بلغة برمجة مفتوحة المصدر. على سبيل المثال ، هناك رمز C ++ مع الحوسبة على وحدات معالجة الرسومات (https://github.com/peterlu/ConDDM) 25 ، ورمز C ++ الذي يستخدم تحويلات فورييه في الوقت المناسب لتسريع العمليات الحسابية (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61 ، وإصدارات MATLAB و Python (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40 ، ورمز MATLAB (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 ، ورمز MATLAB مع تحديد كمي لعدم اليقين ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. نظرا لأن حزمة PyDDM هذه موثقة جيدا وتوفر الكثير من المرونة في كيفية حساب مصفوفة DDM وتحليلها ، فمن المأمول أن تكون مفيدة للباحثين الذين يتطلعون إلى تنفيذ DDM بغض النظر عن خلفيتهم في البرمجة أو تحليل الصور.

يوضح البروتوكول كيف يمكن استخدام حزمة البرامج هذه لتحديد ديناميكيات شبكات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها في المختبر . ويتم ذلك باستخدام مجموعتين متميزتين من بيانات التصوير: (1) صور لجسيمات تتبع تحت الميكرون مدمجة في شبكة فيمنتين تم التقاطها باستخدام الفحص المجهري الساطع و (2) صور لخيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة المسماة بالفلورسنت في شبكة مركبة متشابكة مع نشاط يحركه الميوسين تم التقاطه باستخدام المجهر البؤري الممسوح بالليزر. تسلط تحليلات هاتين المجموعتين من البيانات الضوء على نقاط القوة البارزة في DDM ، بما في ذلك قدرتها على تحليل الصور الملتقطة باستخدام مجموعة متنوعة من طرق التصوير (على سبيل المثال ، التألق الساطع أو البؤري البؤري) ، لاستخراج الديناميكيات من أجهزة التتبع المضمنة أو من الخيوط المصنفة ، وتحديد مجموعة متنوعة من الديناميكيات (على سبيل المثال ، تحت الانتشار والمقيد أو الباليستي).

Protocol

ملاحظة: يمكن العثور على ملف دفتر ملاحظات Jupyter يحتوي على التعليمات البرمجية اللازمة للتوافق مع كل خطوة في البروتوكول التالي على مستودع GitHub التالي https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. يتم تضمين ملف PDF من هذا الملف في الملف التكميلي 1. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن العثور على إرشادات حول التعليمات البرمجية والوثائق الخاصة بكل وظيفة وفئة على موقع الويب ، https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.

1. تثبيت البرامج

  1. لمتابعة ملفات تحليل DDM على سبيل المثال، قم بتثبيت Jupyter Notebook لتشغيل التعليمة البرمجية. قم بتثبيت حزم Python الشائعة الأخرى المطلوبة ، بما في ذلك NumPy و Matplotlib أيضا. تأتي جميع هذه الحزم مجمعة مع توزيع Anaconda (انظر https://www.anaconda.com/products/individual).
  2. قم بتثبيت حزمة Python xarray63. هذه الحزمة ضرورية لتنظيم وتخزين البيانات الوصفية ومعلمات التحليل. في حالة استخدام توزيع Anaconda ، قم بتثبيت xarray (إلى جانب تبعياته الموصى بها) باستخدام الأمر:
    كوندا تثبيت -ج كوندا-فورج xarray dask netCDF4 عنق الزجاجة
  3. قم بتثبيت حزمة PyYAML باستخدام الأمر:
    كوندا تثبيت -ج أناكوندا يامل
    هذه الحزمة ضرورية لقراءة البيانات الوصفية حول الصور المراد تحليلها والمعلمات التي حددها المستخدم للتحليل والتركيب.
  4. قم بتثبيت حزمة PyDDM ، عن طريق التنزيل من مستودع GitHub أو باستخدام الأمر git:
    جيت استنساخ https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git

2. التخطيط لجلسات التصوير

  1. اختر طريقة التصوير والإعدادات البصرية المثلى المتاحة. كما ذكرنا ، يمكن استخدام DDM مع عدد من طرق الفحص المجهري.
  2. للمساعدة في تخطيط العدسة الموضوعية المناسبة وحجم الصورة لاستخدامها، حدد نطاق الأرقام الموجية، q، التي سيتم فحصها بناء على حجم البكسل والحجم الإجمالي للصورة. تأكد من أن اختيار التكبير ومجال الرؤية هو الأمثل للتجربة، استنادا إلى هذه الحسابات. بالنسبة للصور التي تم تحليلها هنا ، تم استخدام هدف 60x 1.4 NA وحجم صورة 256 × 256 بكسل بحجم بكسل يبلغ 0.83 ميكرومتر للشبكة المركبة النشطة للأكتين والأنابيب الدقيقة. بالنسبة لصور الخرز المضمنة في شبكة vimentin ، تم استخدام هدف 100x 1.4 NA وحجم صورة 512 × 512 بكسل بحجم بكسل 0.13 ميكرومتر.
    ملاحظة: يتم تعيين الحد الأدنى q بواسطة 2π/NΔ x، حيث يكون حجم الصورة (المفترض أن يكون مربعا) N × N بكسل بحجم بكسل Δx. الحد الأقصى q هو الحد الأدنى π / Δx و 2π NA / λ ، حيث NA هو الفتحة العددية لهدف التصوير ، و λ هو الطول الموجي للضوء (بالنسبة للتصوير الساطع ، يمكن للمرء استبدال NA ب (NAobjective + NAcondenser) / 2).
  3. بعد ذلك ، ضع في اعتبارك نطاق الجداول الزمنية للتحقيق. عادة ، يتم إجراء تحليل DDM على تسلسلات لا تقل عن 1000 إطار.
    1. لتحديد معدل الإطارات المناسب، ضع في اعتبارك الوقت المتوقع الذي ستستغرقه المعالم في العينة لتحريك مسافة بترتيب الحد الأدنى لمقياس الطول القابل للحل (المقابل للحد الأقصى q).
    2. عند النظر في الحد الأعلى لنطاق الجداول الزمنية التي تم فحصها ، أدرك أنه ، عادة ، يتم حساب طيف الطاقة لمئات الاختلافات في الصور لوقت تأخير معين Δt معا لتوفير إحصاءات كافية لتقليل الضوضاء. وبالتالي ، احصل على تسلسلات الصور لفترة أطول من الحد الأقصى للمقياس الزمني الذي تم فحصه.
      ملاحظة: إذا كان معامل الانتشار المتوقع، D، أو السرعة، v، معروفا، فيمكن للمرء تقدير أوقات الاضمحلال المميزة المتوقعة باستخدام τ = 1/Dq2 أو τ = 1/vq جنبا إلى جنب مع نطاق q، والذي تم تحديده بناء على مجال الرؤية وحجم البكسل. يمكن أن يساعد نطاق قيم τ المتوقعة على نطاق q-range الذي يمكن الوصول إليه في توجيه اختيار معدل الإطارات وعدد الإطارات التي يجب الحصول عليها.

3. إعداد العينات والحصول على الصور

ملاحظة: للحصول على تفاصيل إعداد العينات وإعدادات التصوير المستخدمة للبيانات المقدمة في قسم النتائج التمثيلية، انظر المنشورات السابقة من المؤلفين11،51،64 والملف التكميلي 2.

  1. بناء على النظر في مقاييس الوقت والطول للتحقيق ، احصل على تسلسلات صور ، من الناحية المثالية ، أكثر من 1000 إطار.
    ملاحظة: سيقوم الرمز بتحليل الصور المربعة أو المناطق المربعة ذات الأهمية داخل الصورة، لذا اضبط حجم الإطار وفقا لذلك.
  2. احفظ تسلسلات الصور كمكدس TIFF رمادي ثلاثي الأبعاد. بدلا من ذلك ، يمكن قراءة التنسيق المستخدم من قبل أنظمة Nikon Instruments ، تنسيق ND2 ، بواسطة الحزمة المثبتة. إذا تم حفظ الصور بتنسيق مختلف، فاستخدم ImageJ أو برنامج معالجة تصوير آخر لتحويل الصور إلى مكدس TIFF.
    ملاحظة: في حالة استخدام ملفات ND2 يجب تثبيت حزمة nd2reader من https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader.

4. إعداد المعلمة

  1. قم بعمل نسخة من ملف المعلمة example_parameter_file.yml المتوفرة في مستودع التعليمات البرمجية PyDDM ضمن مجلد الأمثلة. افتح ملف YAML هذا باستخدام محرر نصوص مثل NotePad ++ أو محرر النصوص في JupyterLab. انظر الملف التكميلي 2 للحصول على مثال على ملف معلمات YAML المستخدم في تحليل البيانات المقدمة في قسم النتائج التمثيلية.
  2. في ملف YAML المنسوخ ، قم بتوفير دليل البيانات واسم الملف المقابل لتسلسل الصورة المراد تحليله. ضمن قسم البيانات الأولية، قم بتوفير حجم البكسل ومعدل الإطارات.
  3. تحت قسم Analysis_parameters، قدم تفاصيل حول كيفية حساب مصفوفة DDM. بعض المعلمات هنا اختيارية.
    1. كحد أدنى ، قم بتوفير قيم للمعلمات number_lag_times last_lag_time. تتوافق هذه مع عدد أوقات التأخير المختلفة التي يمكن من خلالها حساب مصفوفة DDM وأطول وقت تأخير (في إطارات) لاستخدامها ، على التوالي. بالنسبة لبيانات حبات التتبع في شبكات vimentin المستخدمة هنا ، كانت المعلمات number_lag_times و last_lag_time 60 و 1000 ، على التوالي. سيقوم الرمز بحساب مصفوفة DDM لأوقات التأخير من إطار 1 (أو بعض الحد الأدنى الآخر لوقت التأخير إذا تم تحديد المعلمة الاختيارية first_lag_time) إلى last_lag_time مع التباعد اللوغاريتمي.
      ملاحظة: إذا تم الحصول على إطارات M ، فيمكن للمرء حساب مصفوفة DDM لفترة تأخير كبيرة مثل M-1. ومع ذلك ، مع ضعف الإحصاءات في مثل هذا التأخر الكبير ، من المرجح أن تكون البيانات صاخبة. يعتمد أطول وقت تأخير لحساب مصفوفة DDM على تفاصيل البيانات ، لكننا نقترح تجربة حوالي ثلث إجمالي مدة سلسلة الصور.
  4. قدم تفاصيل حول كيفية ملاءمة مصفوفة DDM أو دالة التشتت الوسيطة (ISF) في قسم Fitting_parameters. أعط اسم النموذج تحت معلمة النموذج. قم بتوفير التخمين الأولي والحد الأدنى والحد الأعلى لكل معلمة من معلمات التركيب في النموذج المختار.
    ملاحظة: لعرض قائمة بنماذج التركيب المحتملة، قم بتشغيل الوظيفة print_fitting_models. يمكن أيضا العثور على النماذج في الوثائق عبر الإنترنت على موقع PyDDM.

5. حساب مصفوفة DDM

  1. تهيئة مثيل من الفئة DDM_Analysis. للقيام بذلك ، قم بتوفير البيانات الوصفية ومعلمات التحليل التي تمت مناقشتها أعلاه عن طريق تمرير اسم الملف ، مع تضمين مسار الملف الكامل ، لملف YAML إلى DDM_Analysis. بدلا من ذلك ، قم بتمرير البيانات الوصفية والمعلمات كبنية بيانات قاموس بايثون.
  2. قم بتشغيل الدالة calculate_DDM_matrix لحساب مصفوفة DDM. قد يستغرق هذا الحساب عدة دقائق أو أكثر اعتمادا على حجم الإطار وعدد مرات التأخير. راجع الشكل 2 للاطلاع على أوقات التشغيل النموذجية.
  3. افحص البيانات التي تم إرجاعها، والتي ستكون في بنية بيانات من حزمة xarray المعروفة باسم مجموعة البيانات. يتم تخزين بنية البيانات هذه ضمن السمة ddm_dataset.
    ملاحظة: لن يتم تخزين مصفوفة DDM فحسب ، بل أيضا المتغيرات والبيانات الوصفية المرتبطة بها في بنية البيانات هذه. سيتم حفظه أيضا على القرص بتنسيق نموذج البيانات المشتركة للشبكة (netCDF).
  4. افحص المؤامرات والأرقام التي سيتم إنشاؤها وعرضها. يتم حفظ هذه الأرقام أيضا كملف PDF في دليل البيانات.
    1. انظر إلى أن إحدى المخططات التي تم إنشاؤها تظهر معامل التربيع المتوسط الجماعي للصور المحولة من فورييه، Equation031 كدالة ل q. بشكل افتراضي، يستخدم التعليمة البرمجية هذا لتقدير معلمة الخلفية B. قم بتقدير الخلفية من خلال افتراض أنه ، في حدود q الكبير ، سيقترب من Equation031 B / 2 ، حيث B هو الخلفية.
    2. إذا Equation031 لم تصل إلى هضبة بشكل عام q ، فاستخدم طريقة أخرى لتقدير B. لتحقيق ذلك، قم بتعيين المعلمة background_method إما في ملف YAML أو كوسيطة كلمة رئيسية اختيارية إلى الدالة calculate_DDM_matrix. ويرد مزيد من التفاصيل عن أساليب تقدير باء في قسم النتائج التمثيلية.

Figure 2
الشكل 2: وقت الحساب لحساب مصفوفة DDM. في (A) و (B) يظهر Equation009وقت حساب مصفوفة DDM. البيانات المستخدمة في جميع الحالات هي فيلم من 5000 إطار بحجم صورة 512 × 512 بكسل. تم حساب مصفوفة DDM ل 30 مرة تأخير ، متباعدة لوغاريتميا بين إطار واحد (0.01 ثانية) و 1000 إطار (10 ثوان). تم تشغيل الرمز على كمبيوتر سطح مكتب Intel i7-10700 بسرعة 2.90 جيجاهرتز مع ذاكرة وصول عشوائي (RAM) سعة 32 جيجابايت. في (A) ، يظهر تأثير تغيير عدد اختلافات الصور المستخدمة في حساب مصفوفة DDM لكل وقت تأخير. لهذا ، يتم ربط الصور لينتج عنها حجم صورة 256 × 256. لكل وقت تأخير Δ t ، يتم طرح الصور المفصولة بواسطة Δt ويتم تحويل المصفوفة الناتجة فورييه. بالنسبة ل Δ t معين ، يمكن استخدام جميع أزواج الصور المفصولة بواسطة Δ t (تظهر باللون الأزرق) ، ويمكن استخدام أزواج الصور غير المتداخلة فقط (على سبيل المثال ، الإطارات 1 و 10 و 10 و 19 ، وما إلى ذلك ؛ المعروضة باللون البني) ، أو يمكن استخدام 300 زوج من الصور أو أقل لكل Δt. في (B) ، يتم عرض تأثير تغيير حجم الصورة على وقت الحساب. تم ربط الصور إما عن طريق تجميع 2 × 2 أو 4 × 4 أو 8 × 8 بكسل ، مما أدى إلى أحجام صور 256 × 256 أو 128 × 128 أو 64 × 64 ، على التوالي. لكل منها ، يتم استخدام حوالي 300 زوج من الصور في حساب مصفوفة DDM لكل Δt. (ج) من مصفوفة DDM ، يمكن استخراج دالة التشتت الوسيطة (ISF). ويظهر ذلك بالنسبة للحالات الثلاث الواردة في الفقرة (أ). تتوافق نقاط البيانات الزرقاء (بدون إزاحة) مع ISF عند استخدام الحد الأقصى لعدد أزواج الصور لكل Δt ؛ تتوافق نقاط البيانات البنية (مع إزاحة 0.1) مع ISF عند استخدام أزواج الصور غير المتداخلة لكل Δt ؛ وتتوافق نقاط البيانات الوردية (مع إزاحة 0.2) مع ISF عند استخدام 300 زوج صور على الأكثر لكل Δt. يظهر ISF الذي تم العثور عليه باستخدام أزواج صور غير متداخلة ضوضاء عند Δt الطويل. في هذه الحالة ، يتم استخدام عدد قليل من أزواج الصور في Δ t طويلة (على سبيل المثال ، بالنسبة ل Δt من إطارات 1000 ، يتم استخدام 4 أزواج صور فقط). (د) من خلال تركيب ISF مع دالة أسية ، يتم تحديد وقت الاضمحلال المميز ، τ ، لكل رقم موجي ، q. باللون الوردي، تظهر النتائج بعد ربط الصور الأصلية بمقدار 2 × 2، مما يؤدي إلى حجم صورة 256 × 256. باللون الرمادي ، تظهر النتائج بعد الربط بمقدار 8 × 8 ، مما يؤدي إلى حجم صورة 64 × 64. من خلال ربط البيانات ، يتم فقدان المعلومات حول الديناميكيات عند الأرقام الموجية الأعلى ، ولكن حساب مصفوفة DDM للصور 64 × 64 أسرع بنحو 16 مرة من الصور 256 × 256. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. تركيب مصفوفة DDM أو ISF

  1. تهيئة مثيل من الفئة DDM_Fit. للقيام بذلك، مرر إلى DDM_Fit اسم ملف YAML الذي يحتوي على البيانات الوصفية للصورة والمعلمات اللازمة للتركيب.
  2. حدد نموذج مصفوفة DDM أو ISF الذي تريد استخدامه لملاءمة البيانات. سرد النماذج المتوفرة عن طريق تنفيذ الدالة print_fitting_models. حدد النموذج المراد استخدامه في ملف معلمة YAML أو باستخدام الدالة reload_fit_model_by_name.
  3. قم بتعيين التخمينات الأولية والحدود لكل معلمة في النموذج المختار في ملف معلمة YAML المقدم. لتغيير التخمين الأولي لأي معلمة، استخدم الدالة set_parameter_initial_guess. قم بتعيين حدود للمعلمات باستخدام الدالة set_parameter_bounds. على سبيل المثال ، كما هو موضح في الملف التكميلي 2 ، بالنسبة لبيانات حبات التتبع في شبكة vimentin ، كان التخمين الأولي لوقت الاضمحلال هو 1 s وكانت الحدود على تلك المعلمة 0.01 s و 2000 s.
  4. تنفيذ الملاءمة مع ملاءمة الوظيفة. قم بتعيين متغير لإخراج هذه الوظيفة للوصول بسهولة إلى النتائج.
    ملاحظة: يمكن أن تأخذ هذه الدالة العديد من الوسيطات الاختيارية. راجع وثائق التعليمات البرمجية وقدمت أمثلة للحصول على قائمة بهذه الوسيطات ومتى يجب التفكير في تعيينها إلى قيم غير افتراضية.

7. تفسير النتائج المناسبة

  1. قم بإنشاء مؤامرات لفحص الملاءمة والاعتماد على q-من معلمات الملاءمة مع الوظيفة fit_report.
    ملاحظة: ستقوم هذه الوظيفة بإنشاء سلسلة من المؤامرات، والتي سيتم حفظها أيضا كملف PDF. يمكن استخدام الوسيطات الاختيارية لهذه الوظيفة لتعديل المؤامرات المنتجة.
  2. من بين المخططات التي تم إنشاؤها سيكون هناك رقم يحتوي على مخططات فرعية 2 × 2 تظهر مصفوفة DDM أو ISF (اعتمادا على نموذج التركيب المختار) عند أربع قيم q-values (محددة كوسيطة اختيارية fit_report) ، إلى جانب مصفوفة DDM المحسوبة أو ISF باستخدام النموذج والمعلمات الأكثر ملاءمة. لرسم مصفوفة DDM أو ISF جنبا إلى جنب مع الأنسب بطريقة تفاعلية، استخدم Browse_DDM_Fits الفصل كما هو موضح في الأمثلة المقدمة عند استخدام بيئة Jupyter Notebook.
  3. من مخطط وقت الاضمحلال المميز τ مقابل الرقم الموجي q ، حدد ما إذا كانت الديناميكيات تتبع الحركة المنتشرة أو الفرعية الانتشار أو الباليستية أو أي نوع آخر من الحركة. يمكن القيام بذلك من خلال البحث عن علاقة قانون القوة بين τ و q.
    ملاحظة: في مخطط سجل السجل τ مقابل q الذي تم إنشاؤه بواسطة الدالة fit_report، سيتم عرض ثلاثة أسطر، تتوافق مع قانون القدرة الذي يتناسب مع نطاق محدد من قيم q. يتوافق الخط الأسود الصلب مع ملاءمة τ مقابل q لقانون الطاقة ، τ = 1 / Kq β ، حيث K و β معلمات حرة. يتوافق الخط المتقطع باللون البرتقالي مع ملاءمة الانتشار البسيط ، τ = 1 / Dq2 ، حيث D هو معامل انتشار. الخط المتقطع النقطي باللون الأزرق يتوافق مع الملاءمة ل τ = 1 / vq ، حيث v هي سرعة.

8. حفظ النتائج

  1. سيتم حفظ نتائج الملاءمة في مجموعة بيانات xarray . استخدم وظيفة xarray to_netcdf أو وحدة المخلل المضمنة في Python لحفظ بنية البيانات هذه على القرص. استخدم الدالة xarray open_dataset لتحميل ملفات netCDF هذه.
  2. استخدم الدالة save_fit_results_to_excel لحفظ نتائج الملاءمة، إلى جانب البيانات، في ملف ورقة عمل.

Representative Results

هنا ، نعرض أمثلة على التحليل الذي تم إجراؤه باستخدام PyDDM من مجموعتين مختلفتين من التجارب. وفي مجموعة واحدة من التجارب، تم تضمين حبات التتبع دون الميكرون في شبكات تتكون من فيمنتين بروتين الخيوط الوسيطة وتم تصويرها باستخدام عدسة موضوعية 100x في وضع برايتفيلد عند 100 إطار/ثانية (الشكل 3A). يتم التعبير عن Vimentin في الخلايا الوسيطة وهو محدد رئيسي للخصائص الميكانيكية للسيتوبلازم65 والاستقرار الميكانيكي للنواة في الخلايا التي تؤدي هجرة محصورة66,67. حتى الآن ، تمت دراسة شبكات vimentin المعاد تشكيلها في المقام الأول بواسطة الريولوجيا العيانية64,68,69 ، في حين أن الديناميكيات لم تحظ باهتمام يذكر نسبيا 13,70,71. يمكن العثور على تفاصيل إضافية عن هذه التجارب في الملف التكميلي 2. في المجموعة الأخرى من التجارب ، تم إعداد شبكات الهيكل الخلوي النشطة باستخدام الأكتين والأنابيب الدقيقة والميوسين. سمحت الملصقات الفلورية المتميزة الطيفية بتصوير خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة باستخدام مجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر بلونين باستخدام عدسة موضوعية 60x عند 2.78 إطار / ثانية (الشكل 3B ، C). خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة كلاهما محركان مهمان لتغيرات شكل الخلية الديناميكية ، مع تنسيق إجراءاتهما من خلال التفاعلات الميكانيكية والكيميائية الحيوية72. يمكن العثور على تفاصيل إضافية عن هذه التجارب في11. يتم عرض الإطارات الفردية من تسلسلات الصور الملتقطة في هذه التجارب في الشكل 3.

Figure 3
الشكل 3: صور من السلسلة الزمنية التي تم تحليلها . (أ) صورة برايتفيلد لخرز 0.6 ميكرومتر في شبكة vimentin. (ب، ج) صورة للأنابيب الدقيقة (B) و (C) الأكتين في مركب نشط من الأكتين والأنابيب الدقيقة تم التقاطه بهدف 60x على مجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر ، باستخدام ضوء إثارة 561 نانومتر لتصوير microtubule وضوء إثارة 488 نانومتر لتصوير الأكتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالنسبة لصور خرز التتبع في شبكات vimentin ، تم تسجيل أفلام من 5000 إطار بحجم 512 × 512 بكسل في 100 إطار / ثانية. من هذه ، تم حساب مصفوفة DDM في 60 وقت تأخير متباعد لوغاريتميا بين 1 و 1000 إطار ، أو 0.01 ثانية و 10 ثانية. لتقدير الخلفية ، تم حساب B ، متوسط الصور المحولة إلى فورييه التربيعية ، Equation031وتعيينها مساوية ل Equation03755,73. تم افتراض أن هذه الكمية تساوي B/2 وأن B مستقلة عن q على أكبر 10٪ من قيم q. هذه هي الطريقة الافتراضية للحزمة لتقدير B، ولكن هناك طرق أخرى ممكنة عن طريق تعيين معلمة background_method إلى قيمة مختلفة.

مع تحديد المعلمتين A (q) و B من ، يمكن للمرء استخراج دالة التشتت الوسيطة (ISF) من Equation031مصفوفة DDM. ويرد في الشكل 4 أمثلة على أطر الدعم الدولية. في الشكل 4A ، يظهر ISF من صور خرزات قطرها 0.6 ميكرومتر مدمجة في شبكة بتركيز vimentin يبلغ 19 ميكرومتر. في الشكل 4B ، يظهر ISF لنفس النوع من الخرز في شبكة بتركيز vimentin يبلغ 34 ميكرومتر. ومن المثير للاهتمام أنه في كلتا الحالتين لم تتحلل قوى الأمن الداخلي إلى الصفر. في أوقات التأخر الكبيرة ، يجب أن تقترب ISF من الصفر للأنظمة الإرغودية. أي أنه في مثل هذه الأنظمة ، يجب أن ترتبط تقلبات الكثافة تماما خلال أوقات التأخير الكبيرة. حقيقة أن قوى الأمن الداخلي هنا لم تتحلل إلى الصفر يمكن أن تكون ناتجة عن تقديرات غير دقيقة ل A(q) و B ، والتي تم استخدامها للعثور على ISF من مصفوفة DDM المحسوبة. والجدير بالذكر أن الطريقة المستخدمة هنا يمكن أن تبالغ في تقدير B في بعض السيناريوهات62. ومع ذلك ، فمن المرجح أن تكون ديناميكيات حبات التتبع غير إرغودية حقا لأن الخرز له حجم مماثل لحجم شبكة الشبكة ، وبالتالي قد يصبح في قفص. وأكدت بيانات أخرى اكتشاف عدم الارتقاء. أي أن حجم الخرزة ، 0.6 ميكرومتر ، كان أكبر من متوسط القيمة المحسوبة لأحجام الشبكة البالغة 0.4 ميكرومتر لتركيز 19 ميكرومتر و 0.3 ميكرومتر لتركيز 34 ميكرومتر. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت نتائج تتبع الجسيمات المفردة لهذه الخرز المقتفي ، والتي تظهر لاحقا ، حركة محصورة.

Figure 4
الشكل 4: دوال التشتت الوسيطة عند عدة أرقام موجية لشبكات الفيمنتين. يتم رسم ISF كدالة لوقت التأخر لقيم q من حوالي 1 إلى 9 ميكرومتر-1. (أ) قوى الأمن الداخلي من صور خرز 0.6 ميكرومتر في شبكة فيمنتين بتركيز فيمنتين 19 ميكرومتر. (ب) قوى الأمن الداخلي من صور خرز 0.6 ميكرومتر في شبكة فيمنتين بتركيز فيمنتين 34 ميكرومتر. تشير الهضبة الزمنية الطويلة ل ISF بقيمة أعلى بكثير من الصفر إلى عدم الثبات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالنظر إلى أن الديناميكيات من المحتمل أن تكون غير إرغودية ، فإن ISFs مناسبة للشكل Equation039، حيث C هو عامل عدم الإرغودية 32. وقد استخدم هذا الشكل من ISF في دراسات سابقة للديناميكيات غير الإرغودية ، مثل تلك الخاصة بالمواد الهلامية الغروية32,74 أو جزيئات التتبع في شبكات الأكتين microtubule 10. الخطوط السوداء المنقطة في الشكل 4 تظهر التناسبات جنبا إلى جنب مع البيانات. من هذه النوبات ، يمكن للمرء الآن أن ينظر إلى الاعتماد على q لوقت الاضمحلال ، τ ، ومعلمة عدم الإرغودية ، C.

Figure 5
الشكل 5: زمن الاضمحلال مقابل الرقم الموجي لشبكات الفيمنتين. من النوبات إلى ISF ، يتم تحديد وقت الاضمحلال τ لمجموعة من قيم q . للتوضيح ، نحن لا نعرض قيمة τ لكل q ، ولكن مجرد مجموعة متباعدة لوغاريتميا. باللون الأزرق (tan) هي البيانات من صور خرز 0.6 ميكرومتر داخل شبكات vimentin بتركيز vimentin يبلغ 19 ميكرومتر (34 ميكرومتر). تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية في τ عبر أفلام متعددة (أربعة أفلام للبيانات مع شبكة 19 ميكرومتر [أزرق] وخمسة أفلام للبيانات مع شبكة 34 ميكرومتر [tan]). تشير الخطوط الحمراء المنقطة إلى الحدود المقدرة للدقة الزمنية والمكانية، كما هو موضح في النتائج. يظهر Equation044 الخط الأسود الصلب التحجيم ، مما يشير إلى حركة منتشرة. لا تتبع أي من مجموعتي البيانات هذا القياس. بدلا من ذلك ، تظهر الخرز في شبكة 19 ميكرومتر حركة شبه منتشرة (Equation010مع β > 2) ، وتظهر الخرز في شبكة 34 ميكرومتر حركة محصورة أو محبوسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أظهرت أوقات الاضمحلال قدرا كبيرا من عدم اليقين ، سواء عند الحد الأقصى المنخفض q أو المرتفع q ، كما هو موضح في الشكل 5. تظهر أشرطة الخطأ على هذه المؤامرة الانحراف المعياري بين أربعة مقاطع فيديو تم تحليلها لحالة تركيز vimentin الأقل أو خمسة مقاطع فيديو تم تحليلها للتركيز الأعلى. لفهم مصدر عدم اليقين الكبير في هذه الحدود القصوى ، فكر في كل من الدقة الزمنية والمكانية. يتم عرض الحدود التقريبية للدقة بثلاثة خطوط حمراء منقطة بشرطة. يتوافق الخطان الأفقيان مع الحد الأدنى والحد الأقصى لأوقات التأخير التي تم فحصها. بالنظر إلى معدل الإطارات البالغ 100 إطار / ثانية والحد الأقصى لوقت التأخر المقابل ل 1000 إطار (20٪ من إجمالي مدة الفيديو) ، فقد فقدت الدقة عند قياس الديناميكيات التي تحدث بشكل أسرع من 0.01 ثانية أو أبطأ من 10 ثوان. في قيم q السفلى ، كانت القيم المجهزة ل τ أكبر من 10 s. لذلك ، ينبغي توقع وجود شكوك كبيرة في أوقات الاضمحلال التي تكون أكبر من الحد الأقصى لوقت التأخير. في الطرف الأعلى من نطاق q، اقترب وقت الاضمحلال من الحد الأدنى لوقت التأخر البالغ 0.01 ثانية ولكنه ظل فوقه. بدلا من أن تكون محدودة بالدقة الزمنية ، عند هذه القيم q الأعلى ، قد تكون الدقة المكانية هي العامل المحدد. بالنظر إلى حجم البكسل البالغ 0.13 ميكرومتر ، كانت أكبر قيمة ل q حوالي 24 ميكرومتر-1. ومع ذلك، فإن الدقة المحدودة للحيود لا تسمح بالضرورة بقياسات دقيقة للديناميات عند هذه الترددات المكانية العالية. يؤدي تقريب الدقة Equation041 البصرية إلى حد أعلى للعدد الموجي يبلغ حوالي 16 ميكرومتر-1 ، بالنظر إلى الفتحة العددية للعدسة الموضوعية ، NA ، البالغة 1.4 والطول الموجي للضوء ، Equation042. يتم تمييز ذلك بالخط العمودي الأحمر المنقط في الشكل 5. في الواقع ، كانت البيانات صاخبة في قيم كبيرة من q. حتى قبل هذا الحد الأعلى التقريبي ل q ، شوهد عدم اليقين المتزايد في τ ، ويمكن أن يكون هذا من المبالغة في تقدير qmax. قد تكون الدقة البصرية الرديئة مما كان متوقعا بسبب استخدام عدسة غمر الزيت للتصوير خارج الغطاء في عينة مائية أو لأن عدسة المكثف كانت محاذاة بشكل غير كامل.

بالنسبة للحبات التي تبلغ سعتها 0.6 ميكرومتر المضمنة في الشبكة الأقل تركيزا (19 ميكرومتر فيمنتين)، يمكن ملاحظة من مخطط سجل سجل زمن الاضمحلال مقابل الرقم الموجي أن وقت الاضمحلال انخفض مع الرقم الموجي بطريقة تتفق مع قانون القدرة (الشكل 5). ومع ذلك ، لا يبدو أنه يتبع ما هو متوقع للحركة المنتشرة العادية ، حيث Equation044. بدلا من ذلك ، انخفض τ بشكل أكثر حدة مع زيادة q. هذا يدل على الحركة دون الانتشار ، والتي غالبا ما تحدث للحبات في بيئات مزدحمة مثل هذه. تركيب τ(q) على مدى 1.4 ميكرومتر-1 إلى 12.3 ميكرومتر-1 لقانون قوة من النموذج τ = 1/Kq β ينتج معلمات النقل K = 0.0953 μm β / s و β = 2.2. بالنسبة لأولئك الأكثر اعتيادا على التفكير في الانتشار الطبيعي مقابل الانتشار الفرعي من حيث متوسط الإزاحة التربيعية (MSD) لجسيمات التتبع كدالة لوقت التأخر (أي MSD = K' Δ t α) ، من المفيد أن ندرك أن أس القياس دون الانتشار في معادلة MSD ، α ، يعادل α = 2 / β. وبعبارة أخرى، فإن قيمة β = 2.2 تتفق مع أس القياس الفرعي المنتشر في معادلة MSD α = 0.9. يمكن للمرء تعيين PyDDM لتناسب τ(q) عبر هذا النطاق من قيم q عن طريق تحديد مؤشرات صفيف q إما مع المعلمة Good_q_range في ملف YAML أو عن طريق تمرير الوسيطة الاختيارية forced_qs إلى الدالة generate_fit_report. نطاق q من 1.4 μm-1 إلى 12.3 μm-1 ، بالنسبة للبيانات هنا ، يتوافق مع مؤشرات مصفوفة q من 15 إلى 130.

بالنسبة للحبات 0.6 ميكرومتر في الشبكة الأكثر تركيزا (34 ميكرومتر) ، أظهر وقت الاضمحلال اعتمادا ضئيلا على q. من المحتمل أن يكون هذا بسبب عدم وجود خرز في شبكة ذات حجم شبكة أصغر. للتحقيق في عدم الإرغودية في هذا النظام ، يجب رسم معلمة عدم الإرغودية ، C ، كدالة ل q ، كما في الشكل 6. بالنسبة للخرز 0.6 ميكرومتر في شبكة vimentin 19 ميكرومتر ، ≈ C 0.2 مع القليل من الاعتماد على q (غير معروض). ومع ذلك، بالنسبة للشبكة التي تحتوي على 34 ميكرومتر فيمنتين وللشبكة ذات التركيز الأعلى من 49 ميكرومتر فيمنتين، كان سجل C متناسبا مع q2 كما هو موضح في الشكل 6. هذه العلاقة بين C و q متوقعة للحركة المحدودة. بالنسبة للخرز المحاصر داخل جيوب الشبكة ، من المتوقع أن يستقر MSD في أوقات تأخير طويلة بما فيه الكفاية (أي ، Equation055أين Equation056 هو MSD و δ2 هو الحد الأقصى MSD). نظرا لأنه يمكن التعبير عن ISF من حيث MSD ك Equation058، وبما أن ISF غير الإرغودي يذهب إلى C في أوقات تأخير طويلة (أي ، ) ، Equation059يتم الحصول على العلاقة Equation06032,75. لذلك ، يمكن للمرء استخدام C (q) للعثور على δ 2 ، وهذا أسفر عن δ 2 = 0.017 ميكرومتر 2 و 0.0032 ميكرومتر 2 لشبكات vimentin 34 و 49 ميكرومتر ، على التوالي (المقابلة δ = 0.13 ميكرومتر و 0.057 ميكرومتر).

Figure 6
الشكل 6: معلمة عدم الإرغودية مقابل الرقم الموجي لشبكات الفيمنتين. من التناسبات إلى ISF ، يتم تحديد معلمة عدم الإرغودية C لمجموعة من قيم q . في تان (أحمر) هي البيانات من صور خرز 0.6 ميكرومتر داخل شبكات vimentin مع تركيز vimentin من 34 μM (49 μM). تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية في τ عبر أفلام متعددة (خمسة أفلام للبيانات مع شبكة 34 ميكرومتر [tan] وأربعة أفلام للبيانات مع شبكة 49 ميكرومتر [أحمر]). يحتوي المحور y على مقياس لوغاريتمي. يلاحظ المرء اعتماد q ل C الذي يلي Equation060، والذي يسمح باستخراج الحد الأقصى لمتوسط الإزاحة التربيعية ، δ2. تناسبها Equation060 تظهر مع الخطوط الصلبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يمكن للمرء استخدام طرق أخرى لاستخراج حجم الحبس δ من البيانات بالإضافة إلى الأس دون المنتشر الموجود من فحص τ(q) للخرز داخل شبكة vimentin 19 ميكرومتر. أولا ، يمكن للمرء استخدام الطريقة التي وصفها Bayles et al.76 و Edera et al.77 لاستخراج MSD من مصفوفة DDM. والجدير بالذكر أن هذه الطريقة لا تتطلب أي ملاءمة لمصفوفة DDM. يحتاج المرء فقط إلى حساب مصفوفة DDM ، D (q ، Δt) ، و (التي يمكن من خلالها تحديد A (q) وEquation070 B). ثم ، للعثور على MSD ، يستخدم المرء العلاقة Equation071. لاحظ أن هذه الطريقة للعثور على MSD تفترض أن توزيع إزاحات الجسيمات هو Gaussian ، على الرغم من أن العمل السابق أظهر أنه في بعض الحالات ، تتفق MSDs المشتقة من DDM مع MSDs من تتبع الجسيمات ، حتى عندما تكون الإزاحات غير Gaussian73. وبالنسبة لهذا النظام، وكما هو متوقع78، هناك عدم غاوسية في توزيع الإزاحات الكبيرة، كما هو مبين في الشكل S1. في حزمة PyDDM ، يجب تنفيذ الدالة extract_MSD ، والتي ترجع Equation056. ثانيا ، يمكن للمرء استخدام تتبع الجسيمات المفردة للعثور على MSD. على الرغم من أنه يمكن استخدام DDM لتحليل الصور حيث تحظر الكثافة العالية للجسيمات أو الدقة البصرية المحدودة توطين الجسيمات بدقة ، بالنسبة لصور حبات 0.6 ميكرومتر في شبكات vimentin ، تمكنا من توطين وتتبع الخرز باستخدام برنامج trackpy (https://github.com/soft-matter/trackpy)79. تستخدم حزمة برامج تتبع الجسيمات هذه الخوارزميات التي وصفها Crocker و Grier80.

Figure 7
الشكل 7: متوسط الإزاحة المربعة مقابل وقت التأخر لشبكات vimentin. تم تحديد MSD باستخدام طريقتين. أولا ، تم حساب MSD من مصفوفة DDM (الموضحة برموز صلبة). بعد ذلك ، تم تحديد MSD باستخدام تتبع الجسيمات المفردة (SPT) للعثور على مسارات الجسيمات (الرموز المفتوحة). يتم تحديد أشرطة الخطأ بنفس الطريقة الموضحة في أسطورتي الشكل السابقتين. (أ) تشير MSDs لخرز 0.6 ميكرومتر في شبكة vimentin 19 ميكرومتر إلى حركة دون الانتشار ، مع وجود اتفاق جيد بين طريقتي العثور على MSD. (ب) تشير MSDs لخرز 0.6 ميكرومتر في شبكة vimentin 49 ميكرومتر إلى حركة قفص ، مع اتفاق جيد بين طريقتي العثور على MSD ومع الحد الأقصى MSD الموجود من معلمة nonergodicity. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويبين الشكل 7 MSDs مقابل وقت التأخر لخرز 0.6 ميكرومتر في شبكة vimentin 19 ميكرومتر وفي شبكة vimentin 49 ميكرومتر. في كلتا الحالتين ، وافق MSD المحدد من DDM بشكل جيد مع MSD الموجود من خلال تتبع الجسيمات المفردة (SPT). علاوة على ذلك ، بالنسبة للشبكة الأقل تركيزا ، كان أس التحجيم الفرعي (α فيEquation010) حوالي 0.9. وهذا يتسق مع قياس τ(q) للكائن عن Equation010 طريق تركيب ISF لتحديد τ(q) (أي 2/2.2 = 0.9). بالنسبة للشبكة الأكثر تركيزا ، فإن هضاب MSD في أوقات تأخير أطول. كان الحد الأقصى ل MSD الذي تم العثور عليه من خلال تحليل اعتماد q-لمعلمة عدم الإرغودية (الموضحة في الشكل 7B مع الخط الأفقي عند δ 2 = 0.0032 μm 2) هو تقريبا نفس القيمة التي يبدو أن MSDs من كل من SPT و DDM تستقر نحوها. وهناك تباين بين أطول فترات التأخر التي حددتها MSDs من DDM وSPT في الشكل 7A. في حين أن هذا قد يكون بسبب عدد محدود من مسارات التأخر الزمني الطويل ، فقد يكون الحال أيضا أن زيادة تحسين نطاق قيم q التي تستخدم مصفوفة DDM لتقديرها Equation056 لكل وقت تأخير (كما فعل Bayles et al.76 و Edera et al.77) من شأنه أن يحسن نتائجنا ، وسيكون هذا التحسين محور العمل في المستقبل.

سمحت هذه التجارب التي تم فيها تسجيل تسلسلات الصور لخرز التتبع المضمن في شبكة من خيوط vimentin الوسيطة بإجراء تحليلات مستقلة: DDM (باستخدام الحزمة الموضحة هنا) و SPT (باستخدام trackpy). يمكن أن يكشف كلا التحليلين عن درجة الانتشار الفرعي وطول الحبس ، مما يسمح للمرء باستخدام تقنيتين مستقلتين لتحليل الصور لتوفير مقاييس تكميلية. هناك كميات إضافية يمكن للمرء مقارنتها من SPT و DDM. على سبيل المثال، يمكن أن يكشف عدم التجانس في ديناميكيات العينة عن نفسه على أنه غير غاوسي في توزيع إزاحات الجسيمات (أي توزيع فان هوف) المحددة من SPT، وكذلك في ISF المحدد من DDM الذي يتناسب مع الأس الممتد34,35. يوضح الشكل S1 توزيع فان هوف لجسيمات 0.6 ميكرومتر في شبكات vimentin ويناقش الأس الممتد الموجود من تركيب ISFs - المقاييس المستخدمة جنبا إلى جنب في الدراسات السابقة لإثبات الديناميكيات غير المتجانسة للجسيمات داخل أنظمة المحاكاة الحيوية 9,10,47 أو غيرها من البيئات المزدحمة 34 . وكمثال آخر، يمكن حساب قوى الأمن الداخلي من مسارات الجسيمات المقاسة باستخدام SPT ومقارنتها ب ISFs التي تم الحصول عليها من DDM. في حين أن متوسط الإزاحات التربيعية وتوزيعات الإزاحة هي المقاييس التي غالبا ما يتم سحبها من تحليل SPT ، يمكن للمرء أيضا حساب ISF من مسارات الجسيمات ، Equation075باستخدام Equation076 (انظر الشكل S2). يمكن مقارنة ISF هذا مع ISFs التي تم إنشاؤها بواسطة DDM واستخدامها للكشف عن الديناميكيات غير الواضحة في MSD59.

وفي حين أن الحصول على صور لجسيمات التتبع داخل الشبكة قد يسمح للمرء باستخدام أساليب التحليل التكميلية ل SPT و DDM، فمن المهم ملاحظة أن ميزة DDM على SPT هي أنها لا تتطلب صورا للخرز (أو ميزات أخرى) يمكن توطينها وتعقبها بسهولة. ولتوضيح هذه النقطة، نسلط الضوء بعد ذلك على تحليل الشبكات النشطة لخيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة، حيث يسمح وضع العلامات الفلورية للأكتين والتوبولين بتصوير كلا النوعين من الخيوط، المتميزين عن بعضهما البعض عبر الفلوروفورات المختلفة، باستخدام مجهر بؤري متعدد الألوان لمسح الليزر.

تم الحصول على الصور باستخدام مجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر لشبكات الأكتين - الأنابيب الدقيقة ذات النشاط المدفوع بالميوسين (الميوسين العضلي الهيكلي للأرانب II; الهيكل الخلوي #MY02). تم وصف تفاصيل التجارب والنتائج سابقا11 ، والنتائج التمثيلية المعروضة هنا هي من تحليل فيلمين مقدمين في المواد التكميلية (الفيلمان S1 و S4) ل11. تم تسجيل كلا تسلسلي الصور عند 2.78 إطار / ثانية ل 1000 إطار.

لتحليل هذه الصور ، تم حساب مصفوفة DDM ل 50 مرة تأخير تتراوح من 0.4 ثانية إلى 252 ثانية (1 إطار إلى 700 إطار). ثم كانت مصفوفة DDM مناسبة للنموذج Equation010، مع وظيفة التشتت الوسيطة هي Equation077. لذلك ، هناك أربعة معلمات مناسبة: A و τ و s و B. وتظهر نتائج هذه النوبات في الشكل 8. ولوحظ أن مصفوفة DDM لقيمة q معينة لها هضبة في أوقات تأخير منخفضة، وتزداد مع وقت التأخر، ثم تستقر (أو تظهر علامات البدء في الهبوط) في أوقات تأخر كبيرة. لم تصل مصفوفة DDM للقيم الدنيا من q إلى هضبة في أوقات التأخير الطويلة. لذلك ، ينبغي للمرء أن يتوقع دقة ضعيفة في قياس وقت الاضمحلال لهذه الديناميكيات المنخفضة q (مقياس الطول الكبير).

أوقات الاضمحلال المميزة ، τ ، من النوبات إلى مصفوفة DDM موضحة في الشكل 9. يتم تقديم النتائج لشبكة مركبة نشطة من الأكتين والأنابيب الدقيقة (على غرار الفيلم S111) ولشبكة أكتين نشطة (على غرار الفيلم S411). تم إعداد كلتا الشبكتين بنفس تركيزات الأكتين والميوسين ، ولكن تم إنشاء شبكة الأكتين فقط بدون توبولين ، كما هو موضح في11. بالنسبة لهذين النوعين من الشبكات النشطة ، كانت علاقة قانون الطاقة المرصودة هي Equation010. يشير هذا التحجيم إلى الحركة الباليستية وأن الانكماش والتدفق المدفوع بالميوسين يهيمن على الحركة الحرارية للخيوط. من τ = (vq)-1 ، يمكن العثور على سرعة مميزة ، v ، تبلغ حوالي 10 نانومتر / ثانية لشبكة الأكتين - الأنابيب الدقيقة النشطة و 75 نانومتر / ثانية لشبكة الأكتين النشطة. تتوافق هذه القيم مع تحليل قياس سرعة صورة الجسيمات لمقاطع الفيديو نفسها الموضحة في11. Equation010 لم يحافظ التحجيم على قيم q الدنيا للشبكة المركبة النشطة من الأكتين والأنابيب الدقيقة. ويرجع ذلك على الأرجح إلى أن أوقات الاضمحلال الحقيقية لهذه الشبكة المركبة من الأكتين والأنابيب الدقيقة عند قيم q الأدنى أطول من الحد الأقصى لوقت التأخر لمصفوفة DDM المحسوبة. يشار إلى الحد الأقصى لوقت التأخر بالخط الأحمر الأفقي في الشكل 9 ، وانحرفت أوقات الاضمحلال عن التحجيم المتوقع Equation010 بالقرب من هذه الأوقات الأطول.

Figure 8
الشكل 8: مصفوفة DDM مقابل وقت التأخر لشبكة مركبة نشطة من الأكتين والأنابيب الدقيقة. يتم رسم مصفوفة DDM لعدة قيم من q كدالة لوقت التأخر من فيلم لشبكة مركبة تتكون من مونومرات أكتين 2.9 ميكرومتر ، و 2.9 ميكرومتر توبولين دايمرات ، و 0.24 ميكرومتر ميوسين. تظهر هذه البيانات تحليل قناة الأنابيب الدقيقة فقط لسلسلة زمنية متعددة الألوان من الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: زمن الاضمحلال مقابل الرقم الموجي لشبكات الأكتين والأنابيب الدقيقة النشطة. من تركيب مصفوفة DDM ، تم العثور على وقت الاضمحلال ، τ ، كدالة للرقم الموجي ، q. Plotted هو τ vs q لصور شبكة أكتين-ميكروبوبول نشطة (تحلل قناة microtubule فقط) باللون البني ولصور شبكة أكتين نشطة باللون الأخضر. ولكل من الشبكتين نفس تركيزات الأكتين والميوسين (2.9 ميكرومتر و0.24 ميكرومتر على التوالي)؛ يحتوي مركب الأكتين-microtubule على 2.9 ميكرومتر من التوبولين دايمر. أوقات الاضمحلال لشبكة الأكتين النشطة أصغر بكثير من أوقات الاضمحلال لشبكة الأكتين - الأنابيب الدقيقة النشطة ، مما يشير إلى حركة أسرع لشبكة الأكتين النشطة. في كلتا الحالتين ، تكون الديناميكيات باليستية حيث تتبع البيانات اتجاهاEquation010. Inset: يظهر مخطط ISFs مقابل وقت التأخر الذي تم قياسه بواسطة الرقم الموجي (Δt × q) انهيار ISFs على نطاق من قيم q. هذا يشير أيضا إلى الحركة الباليستية. ISFs الموضحة في هذه المجموعة الداخلية هي من شبكة actin النشطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالنسبة لهذه البيانات الخاصة بالشبكات النشطة ، اخترنا أن تناسب مصفوفة DDM ، Equation010. وهذا يتناقض مع ما تم القيام به لبيانات الخرز في شبكة vimentin ، حيث تم تقدير A (q) و B دون أي ملاءمة لعزل ISF ، f (q ، Δt). في هذه الحالة ، بالنسبة لبيانات الشبكة النشطة ، تم ترك A و B كمعلمات مناسبة لأن الطرق المستخدمة لتقدير B لم تسفر عن ملاءمة جيدة. الطريقة الافتراضية لتقدير B هي حساب Equation031 وافتراض أن هذا ، بشكل عام q ، يذهب إلى B / 2. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة بالغت في تقدير B لهذه البيانات ، والتي شوهدت في حقيقة أنه عند حساب ISFs من B المقدرة بهذه الطريقة (غير معروضة) ، كانت ISFs أكبر من 1 في أوقات التأخر المبكرة (في حين أنها يجب أن تنتقل من الحد الأقصى من 1 إلى الصفر أو بعض معلمات عدم الإرغودية مع زيادة وقت التأخر). يمكن للمرء اختيار طرق أخرى لتقدير B باستخدام المعلمة background_method. واحدة من هذه الطرق الأخرى هي تقدير B ليكون الحد الأدنى من مصفوفة DDM في أوقات التأخر المبكرة (مضبوطة مع background_method = 1). تم استخدام طريقة مماثلة من قبل Bayles et al.76 ، على الرغم من أنهم لم يفترضوا أن B ثابت مع q. خيار آخر هو تقدير B ليكون متوسط القيمة على جميع أوقات التأخير لمصفوفة DDM عند الحد الأقصى q (المحدد مع background_method = 2). ويوضح الشكل 10 هذه الطرق المختلفة لتقدير الخلفية، فضلا عن نتائج السماح ل B بأن تكون معلمة ملائمة بحرية. ومن تلك المؤامرات، يمكن للمرء أن يرى أن السعة، A، لم تصل إلى الصفر عند أكبر قيم q التي تم فحصها، حيث Equation031 لم تكن الهضبة عند q بشكل عام (الشكل 10B)، وبما أن D(q max, Δt) انتقلت من هضبة زمنية أقل إلى هضبة زمنية أعلى للتأخر (أي عند qmax، كان هناك A غير صفري؛ الشكل 10 دال). ولذلك، لا يقدر باء على النحو Equation082 المناسب ولا كما Equation083 هو مناسب. يجب على المرء أن يتفحص Equation031 مقابل q و D (qmax ، Δ t) مقابل Δ t قبل اتخاذ قرار بشأن كيفية (أو إذا) تقدير B.

Figure 10
الشكل 10: الخلفية مقابل الرقم الموجي لشبكات الأكتين - الأنابيب الدقيقة النشطة. من خلال تركيب مصفوفة DDM ، يمكن للمرء العثور على الخلفية ، B ، كدالة للرقم الموجي ، q. يظهر B مقابل q لصور شبكة نشطة من الأكتين والأنابيب الدقيقة (تحليل قناة الأنابيب الدقيقة فقط) المحددة من هذه التناسبات مع الرموز الأرجوانية. تظهر الخطوط الصلبة الثلاثة في (أ) تقديرات للخلفية التي تم العثور عليها دون أي ملاءمة. يظهر الخط العلوي الأكثر قتامة في (A) الخلفية المقدرة باستخدام Equation088، والتي قد تكون مناسبة إذا Equation031 كانت الهضاب إلى قيمة ثابتة بشكل عام q. من (B) ، لاحظ أنه Equation031 لم يصل بعد إلى قيمة ثابتة عند أكبر q تم فحصه. لذلك ، باستخدام هذه الطريقة يبالغ في تقدير الخلفية. يوضح الخلاصة في (A) الخلفية المقدرة باستخدام Equation090. إذا أظهرت مصفوفة DDM هضبة زمنية منخفضة التأخر كما هو موضح في (C) مع الخط الأحمر ، فقد تكون هذه الطريقة مناسبة لتقدير الخلفية. يظهر الخط الأوسط والأخف وزنا في (A) الخلفية المقدرة من Equation083. قد تكون هذه الطريقة مناسبة إذا ، عند qmax ، وصلت السعة ، A ، إلى الصفر. من (D) ، يلاحظ أن السعة غير صفرية ، وبالتالي ، فإن هذه الطريقة تبالغ في تقدير الخلفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: التوزيعات الاحتمالية لإزاحة الجسيمات. تظهر التوزيعات الاحتمالية لإزاحة الجسيمات عدم الغاوسية لتركيزات الفيمنتين البالغة 34 ميكرومتر و 49 ميكرومتر. تظهر أوقات تأخير مختلفة في توزيعات الإزاحة للشروط الثلاثة. (أ) يتناسب توزيع إزاحات الجسيمات في شبكة فيمنتين 19 ميكرومتر مع دالة غاوسية. يزداد عرض Gaussian مع زيادة وقت التأخير. (ب) يظهر توزيع إزاحات الجسيمات في شبكة فيمنتين 34 ميكرومتر قدرا أكبر من عدم الغاوسية، ولا سيما في حالات الإزاحة الكبيرة، مقارنة بالحالة البالغة 19 ميكرومتر. (ج) توزيع إزاحات الجسيمات في شبكة فيمنتين 49 ميكرومتر يظهر أيضا عدم الغاوسية. وعلاوة على ذلك، فإن عرض التوزيعات لا يزداد مع وقت التأخر بقدر ما هو الحال في العينات ذات التركيزات المنخفضة من الفيمنتين، مما يشير إلى الحركة المحصورة. ترتبط توزيعات فان هوف غير الغاوسية (التي شوهدت لجميع عينات الفيمنتين ولكن الأكثر وضوحا في التركيزات الأعلى) بديناميكيات غير متجانسة كما هو الحال غالبا في نقل الجسيمات في البيئات المزدحمة والمحصورة. مؤشر آخر للانتقال غير المتجانس الذي يتم تحديده من تحليل DDM هو أس التمدد المستخدم لتناسب دالة التشتت الوسيطة (المعلمة s في معادلة ISF المستخدمة هنا: Equation077 + Equation061). متوسط الأسس الممتدة على مدى Q من 0.4 ميكرومتر-1 إلى 9.4 ميكرومتر-1 هي، من أعلى تركيز فيمنتين إلى أدنى ±، 0.53 ± 0.07، 0.64 ± 0.02، و 0.86 0.04 (متوسط ± الانحراف المعياري). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: وظائف التشتت الوسيطة من DDM و SPT. تظهر دوال التشتت الوسيطة (ISF) لخمسة أرقام موجية مختلفة. يتم رسم ISF مقابل وقت التأخر الموجود من خلال DDM بعلامات دائرية ، ويتم حساب ISF من مسارات الجسيمات المفردة ذات المربعات المفتوحة. تظهر الخطوط السوداء المنقطة الملاءمة مع ISFs التي تم الحصول عليها من DDM. يتم حساب ISF من مسارات الجسيمات المفردة ، Equation075باستخدام Equation076. في (A) ، يظهر ISF لجسيمات 0.6 ميكرومتر في شبكات vimentin 19 ميكرومتر. في (B) ، يظهر ISF لجسيمات 0.6 ميكرومتر في شبكات vimentin 34 ميكرومتر. ومن المرجح أن تكون التناقضات في قوى الأمن الداخلي التي عثر عليها من DDM وSPT راجعة إلى عدد محدود من مسارات التأخر الزمني الطويل. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: بروتوكول لاستخدام DDM. يتم عرض مدخلات ومخرجات الخطوات الموضحة في البروتوكول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: تفاصيل إعداد العينات وملفات المعلمات النموذجية لشبكات vimentin. يتم توفير خطوات مفصلة لإعداد العينات والحصول على الصور على شبكات vimentin. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا توفير مثال على ملف المعلمات لتحليل البيانات المقدمة في قسم النتائج التمثيلية حول شبكات vimentin. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تستخدم حزمة البرامج الموضحة هنا DDM لتحليل تقلبات الكثافة التي لوحظت في الصور التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر الضوئي. تم عرض النتائج التمثيلية من بيانات جزيئات التتبع المضمنة في شبكات vimentin لأول مرة. يمكن استخدام تحليل هذه البيانات لتوصيف حجم الشبكة وصلابتها بشكل مشابه لكيفية استخدام تتبع الجسيمات المفردة في العديد من الدراسات السابقة لشبكات الهيكل الخلوي6،12،13. ميزة استخدام DDM على تتبع الجسيمات المفردة هي أن DDM لا يتطلب توطين الجسيمات. لذلك ، حتى في الصور التي تكون فيها كثافة الجسيمات عالية جدا أو الجسيمات صغيرة جدا بحيث لا يمكن توطينها وتعقبها ، لا يزال بإمكان DDM تحديد الديناميكيات. حيث يكون تتبع الجسيمات المفردة مفيدا عند فحص تباين الجسيمات إلى الجسيمات. باستخدام DDM ، يجد المرء ديناميكيات متوسط المجموعة بينما ، مع تتبع الجسيمات المفردة ، يمكن للمرء حساب كل من MSD لجسيم واحد و MSD متوسط المجموعة. ومع ذلك ، يمكن استخدام DDM للتحقيق في الديناميكيات غير المتجانسة من خلال تحليل مناطق متعددة من الاهتمام داخل مجال رؤية كبير.

بعد ذلك ، تم عرض النتائج التمثيلية من بيانات الخيوط المصنفة بالفلورسنت في شبكة نشطة تتكون من نوعين من الخيوط الخلوية الهيكلية ذات العلامات المختلفة11. باستخدام هذه البيانات ، تم تمييز الحركة الباليستية دون الحاجة إلى أي ميزات قابلة للتوطين داخل الصورة. نظرا لأن DDM يستخرج ديناميكيات المجموعة المتوسطة مع عدد قليل من مدخلات المستخدم ، فإنه يجعل مقارنة سلسلة الصور المكتسبة بظروف مختلفة مباشرة (على سبيل المثال ، مقارنة العينات بنسب مختلفة من الأكتين إلى الأنابيب الدقيقة أو العينات ذات التركيزات المختلفة من الميوسين ، كما هو الحال في50). بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام التصوير الفلوري ، يمكننا التحقيق في ديناميكيات المكونات المختلفة للشبكة باستخدام وضع العلامات متعددة الألوان. تم ذلك في11,50 ، حيث تم تحليل ديناميكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة بشكل منفصل في شبكة مركبة نشطة من الأكتين والأنابيب الدقيقة باستخدام التصوير متعدد الألوان. في قسم النتائج التمثيلية هنا ، تم عرض النتائج فقط من قناة microtubule ، ولكن في العمل السابق ، قارنا ديناميكيات الأنابيب الدقيقة وخيوط الأكتين11.

نلاحظ أن هذه النتائج التمثيلية تعرض إما الانتشار الفرعي السلبي أو الحركة الباليستية النشطة. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام DDM لتحليل الأنظمة التي يوجد فيها تقاطع في نوع الديناميكيات في جداول زمنية أو طولية متوسطة. وكأمثلة على ذلك، استخدم كورزثالر وآخرون DDM مع نظام من غرويات جانوس النشطة لاستكشاف الحركة الموجهة النشطة على نطاقات زمنية قصيرة والتوزيع العشوائي للاتجاه على نطاقات زمنية أطول59؛ استخدم Giavazzi et al. DDM مع رغوة خشنة ووجدوا تقاطعا في الديناميكيات المقابلة لمقياس طول فقاعة33 ؛ واستخدم Cho et al. DDM مع المواد الهلامية الغروية ووجدوا ثلاثة أنظمة مميزة على مقاييس طول مختلفة تمتد من المجموعات الكسورية إلى الشبكة بأكملها32.

تم الحصول على البيانات المدرجة في قسم النتائج التمثيلية باستخدام المجهر الساطع والمجهر البؤري للمسح الضوئي بالليزر. ومع ذلك ، كما لوحظ سابقا ، يمكن استخدام DDM مع العديد من طرق التصوير. مع أي طريقة تصوير ، يجب على المستخدمين مراعاة الإعدادات البصرية مثل درجة التقسيم البصري أو عمق المجال. قد تقلل درجة عالية من التقسيم البصري من الإشارة من الأجسام خارج نطاق التركيز البؤري ، ولكن لن يتمكن المرء من قياس الديناميكيات بدقة عبر جداول زمنية أكبر من المقياس الزمني للأجسام للتحرك خارج عمق المجال25,28. يمكن العثور على مناقشة أكثر شمولا حول كيفية تأثير عمق المجال المعتمد على Q على تحليل DDM في22. بالنسبة للتصوير الساطع ، قد يحتاج المستخدمون أيضا إلى مراعاة سمك العينة. في حين أنه بالنسبة للعينات المبعثرة بشكل ضعيف ، قد توفر العينات الأكثر سمكا إشارة أكثر42 ، فقد تتطلب العينات العكرة تعديل التحليل لمراعاة التشتت المتعدد81. وأخيرا، بالنسبة لطرق التصوير التي ليست ثابتة في الفضاء الخطي (أي عندما تعتمد الكثافة التي تسجلها كاميرا جسم ما على مكان وجود هذا الجسم في مستوى العينة x-y)، قد يحتاج المرء إلى حساب تباين الفضاء الخطي، كما هو موضح في المجال المظلم DDM27.

بالنسبة لأولئك الذين يبدأون في DDM ، نود أن نؤكد على أهمية النظر في الدقة المكانية والزمانية. عند فحص أوقات الاضمحلال المحددة كدالة للعدد الموجي ، من المهم وضع علامة على حدود دقة المرء (أي الحد الأقصى والحد الأدنى لأوقات التأخير والحد الأقصى للعدد الموجي ، كما هو موضح في الشكل 5). يجب على المرء أن يفكر بعناية في هذه الحدود قبل جمع البيانات بحيث يمكن تحديد العدسة الموضوعية المثلى وحجم الصورة ومعدل الإطارات ومدة الفيلم. الاعتبار المهم الآخر هو كيفية تقدير معلمة الخلفية B. وقد استخدمت أساليب متعددة لتقدير الخلفية في الأدبيات، وتم وصف آثار الإفراط في تقدير B أو التقليل من شأنه في المنشورات السابقة62,77. كما هو موضح في الشكل 10 ، يسمح PyDDM للمستخدمين بتنفيذ طرق مختلفة لتقدير B ، ونقترح على المستخدمين الجدد تجربة هذه الأساليب وتقييم الطرق المناسبة للاستخدام.

تتمثل إحدى نقاط قوة هذه الحزمة في توثيقها الشامل والإرشادات التفصيلية التي تضم بيانات المثال ، وتخزين وتنظيم البيانات الوصفية لتتبع كيفية إجراء التحليلات ، والمرونة في كيفية تحليل مصفوفة DDM (نماذج مناسبة مختلفة ، وطرق متعددة لتقدير معلمة الخلفية B ، والقدرة على العثور على MSD). ومع ذلك ، هناك جوانب متعددة لهذا الرمز يمكن تحسينها. حاليا ، لم يتم تحسين التعليمات البرمجية لسرعة الحساب السريعة. تم الإبلاغ عن طرق لتسريع الحساب61,62 ، وسيتم تنفيذها في الإصدارات المستقبلية. بالإضافة إلى ذلك ، نخطط لتنفيذ الأساليب التي تم الإبلاغ عنها مؤخرا لتقدير أوجه عدم اليقين بشكل أفضل واستخدام عمليات المحاكاة لتوجيه المستخدمين إلى نموذج ISF62 المناسب. للحصول على تحسينات أخرى ، نأمل أن يتصل بنا المستخدمون لتقديم اقتراحات.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل أجزاء من هذا البحث من قبل جائزة R15 للمعاهد الوطنية للصحة (المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة جائزة رقم. R15GM123420، منحت إلى R.M.R.-A. و R.J.M.) ، وجائزة Cottrell Scholar من مؤسسة الأبحاث للتقدم العلمي (الجائزة رقم 27459 ، الممنوحة ل R.J.M.) ، ومنحة أبحاث مؤسسة William M. Keck (تمنح إلى R.M.R-A.). تقدر GHK بامتنان الدعم المالي المقدم من مجلس البحوث الهولندي (NWO ؛ رقم المشروع VI.C.182.004 لبرنامج المواهب NWO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 Hamatsu
F-127 Pluronic Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop Thermo Fisher
Nikon Ti-Eclipse microscope Nikon
PLL-PEG-bio SuSos AG, Dübendorf, Switzerland
Polystyrene beads Sigma Aldrich
Protein dialysis mini-cassette Thermo Fisher
PyDDM University of San Diego N/A Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).
  2. Amblard, F., Maggs, A. C., Yurke, B., Pargellis, A. N., Leibler, S. Subdiffusion and anomalous local viscoelasticity in actin networks. Physical Review Letters. 77 (21), 4470-4473 (1996).
  3. Mizuno, D., Tardin, C., Schmidt, C. F., MacKintosh, F. C. Nonequilibrium mechanics of active cytoskeletal networks. Science. 315 (5810), 370-373 (2007).
  4. Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).
  5. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Physical Review Letters. 102 (18), 188303 (2009).
  6. Stuhrmann, B., Soares e Silva, M., Depken, M., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Nonequilibrium fluctuations of a remodeling in vitro cytoskeleton. Physical Review E. 86 (2), 020901 (2012).
  7. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  8. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  9. Anderson, S. J. et al. Filament rigidity vies with mesh size in determining anomalous diffusion in cytoskeleton. Biomacromolecules. 20 (12),4380-4388 (2019).
  10. Anderson, S. J., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  11. Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).
  12. Wong, I. Y. et al. Anomalous diffusion probes microstructure dynamics of entangled F-actin networks. Physical Review Letters. 92 (17), 178101 (2004).
  13. Köster, S., Lin, Y.-C., Herrmann, H., Weitz, D. A. Nanomechanics of vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 6 (9), 1910-1914 (2010).
  14. Chandrakar, P. et al. Engineering stability, longevity, and miscibility of microtubule-based active fluids. Soft Matter. 18 (9), 1852-1835 (2022).
  15. Alvarado, J., Cipelletti, L., H. Koenderink, G. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).
  16. Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
  17. Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).
  18. Malik-Garbi, M. et al. Scaling behaviour in steady-state contracting actomyosin networks. Nature Physics. 15 (5), 509-516 (2019).
  19. Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (5), e2115895119 (2022).
  20. Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., Nédélec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e714 (2018).
  21. Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).
  22. Giavazzi, F., Brogioli, D., Trappe, V., Bellini, T., Cerbino, R. Scattering information obtained by optical microscopy: differential dynamic microscopy and beyond. Physical Review E. 80 (3), 031403 (2009).
  23. Giavazzi, F., Cerbino, R. Digital Fourier microscopy for soft matter dynamics. Journal of Optics. 16 (8), 083001 (2014).
  24. He, K., Spannuth, M., Conrad, J. C., Krishnamoorti, R. Diffusive dynamics of nanoparticles in aqueous dispersions. Soft Matter. 8 (47), 11933-11938 (2012).
  25. Lu, P. J. et al. Characterizing concentrated, multiply scattering, and actively driven fluorescent systems with confocal differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 108 (21), 218103 (2012).
  26. Giavazzi, F. et al. Viscoelasticity of nematic liquid crystals at a glance. Soft Matter. 10 (22), 3938-3949 (2014).
  27. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Dark-field differential dynamic microscopy. Soft Matter. 12 (8), 2440-2452 (2016).
  28. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. Light-sheet microscopy with digital Fourier analysis measures transport properties over large field-of-view. Optics Express. 24 (18), 20881-20894 (2016).
  29. Richards, J. A., Martinez, V. A., Arlt, J. Particle sizing for flowing colloidal suspensions using flow-differential dynamic microscopy. Soft Matter. 17 (14), 3945-3953 (2021).
  30. Ferri, F. et al. Kinetics of colloidal fractal aggregation by differential dynamic microscopy. The European Physical Journal Special Topics. 199 (1), 139-148 (2011).
  31. Lanfranco, R. et al. Adaptable DNA interactions regulate surface triggered self assembly. Nanoscale. 12 (36), 18616-18620 (2020).
  32. Cho, J. H., Cerbino, R., Bischofberger, I. Emergence of multiscale dynamics in colloidal gels. Physical Review Letters. 124 (8), 088005 (2020).
  33. Giavazzi, F., Trappe, V., Cerbino, R. Multiple dynamic regimes in a coarsening foam. Journal of Physics: Condensed Matter. 33 (2), 024002 (2020).
  34. He, K. et al. Diffusive dynamics of nanoparticles in arrays of nanoposts. ACS Nano. 7 (6), 5122-5130 (2013).
  35. Jacob, J. D. C., He, K., Retterer, S. T., Krishnamoorti, R., Conrad, J. C. Diffusive dynamics of nanoparticles in ultra-confined media. Soft Matter. 11 (38), 7515-7524 (2015).
  36. Sentjabrskaja, T. et al. Anomalous dynamics of intruders in a crowded environment of mobile obstacles. Nature Communications. 7, 11133 (2016).
  37. Hitimana, E., Roopnarine, B. K., Morozova, S. Diffusive dynamics of charged nanoparticles in convex lens-induced confinement. Soft Matter. 18 (4), 832-840 (2022).
  38. Wilson, L. G. et al. Differential dynamic microscopy of bacterial motility. Physical Review Letters. 106 (1), 018101 (2011).
  39. Martinez, V. A. et al. Differential dynamic microscopy: a high-throughput method for characterizing the motility of microorganisms. Biophysical Journal. 103 (8), 1637-1647 (2012).
  40. Germain, D., Leocmach, M., Gibaud, T. Differential dynamic microscopy to characterize Brownian motion and bacteria motility. American Journal of Physics. 84 (3), 202-210 (2016).
  41. Croze, O. A. et al. Helical and oscillatory microswimmer motility statistics from differential dynamic microscopy. New Journal of Physics. 21 (6), 063012 (2019).
  42. Safari, M. S., Vorontsova, M. A., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of weakly scattering and polydisperse protein-rich clusters. Physical Review E. 92 (4), 042712 (2015).
  43. Wang, J., McGorty, R. Measuring capillary wave dynamics using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 15 (37), 7412-7419 (2019).
  44. Cerbino, R., Giavazzi, F., Helgeson, M. E. Differential dynamic microscopy for the characterization of polymer systems. Journal of Polymer Science. 60 (7), 1079-1089 (2021).
  45. Cerbino, R., Cicuta, P. Perspective: differential dynamic microscopy extracts multi-scale activity in complex fluids and biological systems. The Journal of Chemical Physics. 147 (11), 110901 (2017).
  46. Drechsler, M., Giavazzi, F., Cerbino, R., Palacios, I. M. Active diffusion and advection in Drosophila oocytes result from the interplay of actin and microtubules. Nature Communications. 8 (1), 1-11 (2017).
  47. Burla, F., Sentjabrskaja, T., Pletikapic, G., Beugen, J. v., H. Koenderink, G. Particle diffusion in extracellular hydrogels. Soft Matter. 16 (5), 1366-1376 (2020).
  48. Regan, K., Wulstein, D., Rasmussen, H., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. M. Bridging the spatiotemporal scales of macromolecular transport in crowded biomimetic systems. Soft Matter. 15 (6), 1200-1209 (2019).
  49. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).
  50. Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).
  51. Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv:2112.11260 .(2021).
  52. Chen, X. et al. Coaxial differential dynamic microscopy for measurement of Brownian motion in weak optical field. Optics Express. 26 (24), 32083-32090 (2018).
  53. Reufer, M., Martinez, V. A., Schurtenberger, P., Poon, W. C. K. Differential dynamic microscopy for anisotropic colloidal dynamics. Langmuir. 28 (10), 4618-4624 (2012).
  54. Giavazzi, F., Haro-Pérez, C., Cerbino, R. Simultaneous characterization of rotational and translational diffusion of optically anisotropic particles by optical microscopy. Journal of Physics: Condensed Matter. 28 (19), 195201 (2016).
  55. Cerbino, R., Piotti, D., Buscaglia, M., Giavazzi, F. Dark field differential dynamic microscopy enables accurate characterization of the roto-translational dynamics of bacteria and colloidal clusters. Journal of Physics: Condensed Matter. 30 (2), 025901 (2017).
  56. Safari, M. S., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of bidisperse colloidal suspensions. npj Microgravity. 3 (1), 21 (2017).
  57. Giavazzi, F., Pal, A., Cerbino, R. Probing roto-translational diffusion of small anisotropic colloidal particles with a bright-field microscope. The European Physical Journal E. 44 (4), 61 (2021).
  58. Schwarz-Linek, J. et al. Escherichia coli as a model active colloid: a practical introduction. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 137, 2-16 (2016).
  59. Kurzthaler, C. et al. Probing the spatiotemporal dynamics of catalytic Janus particles with single-particle tracking and differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
  60. Mandal, S., Kurzthaler, C., Franosch, T., Löwen, H. Crowding-enhanced diffusion: an exact theory for highly entangled self-propelled stiff filaments. Physical Review Letters. 125 (13), 138002 (2020).
  61. Norouzisadeh, M., Chraga, M., Cerchiari, G., Croccolo, F. The modern structurator: increased performance for calculating the structure function. The European Physical Journal E. 44 (12), 146 (2021).
  62. Gu, M., Luo, Y., He, Y., Helgeson, M. E., Valentine, M. T. Uncertainty quantification and estimation in differential dynamic microscopy. Physical Review E. 104 (3), 034610 (2021).
  63. Hoyer, S., Hamman, J. xarray: N-D labeled arrays and datasets in Python. Journal of Open Research Software. 5 (1), 10 (2017).
  64. Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. Stiffening and inelastic fluidization in vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 15 (36), 7127-7136 (2019).
  65. Guo, M. et al. The role of vimentin intermediate filaments in cortical and cytoplasmic mechanics. Biophysical Journal. 105 (7), 1562-1568 (2013).
  66. Lavenus, S. B., Tudor, S. M., Ullo, M. F., Vosatka, K. W., Logue, J. S. A flexible network of vimentin intermediate filaments promotes migration of amoeboid cancer cells through confined environments. Journal of Biological Chemistry. 295 (19), 6700-6709 (2020).
  67. Patteson, A. E. et al. Loss of vimentin enhances cell motility through small confining spaces. Small. 15 (50), 1903180 (2019).
  68. Lin, Y.-C. et al. Origins of elasticity in intermediate filament networks. Physical Review Letters. 104 (5), 058101 (2010).
  69. Pawelzyk, P., Mücke, N., Herrmann, H., Willenbacher, N. Attractive interactions among intermediate filaments determine network mechanics in vitro. PLOS ONE. 9 (4), e93194 (2014).
  70. Schepers, A. V. et al. Multiscale mechanics and temporal evolution of vimentin intermediate filament networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (27), e2102026118 (2021).
  71. Wu, H. et al. Effect of divalent cations on the structure and mechanics of vimentin intermediate filaments. Biophysical Journal. 119 (1), 55-64 (2020).
  72. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  73. Giavazzi, F., Malinverno, C., Scita, G., Cerbino, R. Tracking-free determination of single-cell displacements and division rates in confluent monolayers. Frontiers in Physics. 6, 120 (2018).
  74. Cho, J. H. Multiscale Probing of Colloidal Gelation Dynamics., Massachusetts Institute of Technology (2018).
  75. Krall, A. H., Weitz, D. A. Internal dynamics and elasticity of fractal colloidal gels. Physical Review Letters. 80 (4), 778-781 (1998).
  76. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Probe microrheology without particle tracking by differential dynamic microscopy. Rheologica Acta. 56 (11), 863-869 (2017).
  77. Edera, P., Bergamini, D., Trappe, V., Giavazzi, F., Cerbino, R. Differential dynamic microscopy microrheology of soft materials: a tracking-free determination of the frequency-dependent loss and storage moduli. Physical Review Materials. 1 (7), 073804 (2017).
  78. Wang, B., Kuo, J., Bae, S. C., Granick, S. When Brownian diffusion is not Gaussian. Nature Materials. 11 (6), 481-485 (2012).
  79. soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0. Zenodo (2021).
  80. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
  81. Nixon-Luke, R., Arlt, J., Poon, W. C. K., Bryant, G., Martinez, V. A. Probing the dynamics of turbid colloidal suspensions using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 18 (9), 1856-1867 (2022).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 184 ،
تحديد ديناميكيات الهيكل الخلوي باستخدام المجهر الديناميكي التفاضلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G.,… More

Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G., Petitjean, I. I., Koenderink, G. H., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. J. Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63931, doi:10.3791/63931 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter