Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Diferansiyel Dinamik Mikroskopi Kullanarak Sitoiskelet Dinamiğinin Ölçülmesi

Published: June 15, 2022 doi: 10.3791/63931
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 2, 2
1Cell Biology, Neurobiology and Biophysics, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 2Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

Summary

Diferansiyel dinamik mikroskopi (DDM), dinamik ışık saçılması ve mikroskopi özelliklerini birleştirir. Burada, vimentin ağlarındaki parçacıkların subdifüzyon ve kafesli dinamiklerini ve aktif miyozin güdümlü aktin-mikrotübül kompozitlerinin balistik hareketini ölçerek yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarını karakterize etmek için DDM'yi kullanma süreci sunulmaktadır.

Abstract

Hücreler sürünebilir, kendi kendini iyileştirebilir ve dikkat çekici derecede dinamik sitoiskeletleri nedeniyle sertliklerini ayarlayabilir. Bu nedenle, sitoiskelet biyopolimerlerinin ağlarının yeniden oluşturulması, bir dizi aktif ve uyarlanabilir malzemeye yol açabilir. Bununla birlikte, hassas bir şekilde ayarlanmış özelliklere sahip bu tür malzemelerin mühendisliği, dinamiklerin ağ bileşimine ve sentez yöntemlerine nasıl bağlı olduğunu ölçmeyi gerektirir. Bu tür dinamiklerin nicelleştirilmesi, kompozit ağların zaman, mekan ve formülasyon uzayı boyunca farklılıklarla karşı karşıya kalmaktadır. Buradaki protokol, Fourier analiz tekniğinin, diferansiyel dinamik mikroskopinin (DDM), biyopolimer ağlarının dinamiklerini nasıl ölçebildiğini ve özellikle sitoiskelet ağlarının çalışmaları için çok uygun olduğunu açıklamaktadır. DDM, lazer taramalı konfokal, geniş alan floresan ve parlak alan görüntüleme dahil olmak üzere bir dizi mikroskopi modalitesi kullanılarak elde edilen görüntülerin zaman dizileri üzerinde çalışır. Bu tür görüntü dizilerinden, dalga vektörlerinin bir aralığı boyunca yoğunluk dalgalanmalarının karakteristik korelasyon süreleri çıkarılabilir. DDM analizi yapmak için kullanıcı dostu, açık kaynaklı bir Python paketi de geliştirilmiştir. Bu paketle, burada ara filament (vimentin) ağları ve aktif aktin-mikrotübül ağlarının verileriyle gösterildiği gibi, etiketli sitoiskelet bileşenlerinin veya gömülü izleyici parçacıklarının dinamikleri ölçülebilir. Önceden programlama veya görüntü işleme deneyimi olmayan kullanıcılar, bu yazılım paketini ve ilgili belgeleri kullanarak DDM gerçekleştirebileceklerdir.

Introduction

Hücre iskeleti, ökaryotik hücrelerin sitoplazması boyunca uzanan ve hücre yüzeyini çekirdeğe bağlayan bir protein filamentleri ağıdır. Büyük ve tekrarlanan mekanik yüklere karşı mekanik koruma sağlayan benzersiz malzeme özelliklerine sahiptir, ancak aynı zamanda dinamik hücre şekli değişikliklerini de yönlendirir1. Yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağları, gömülü parçacıkların kafeslenmesinden moleküler motorlar tarafından tahrik edilen balistik harekete kadar bir dizi ilginç dinamik davranışa yol açabilir 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Bu tür ağların dinamiklerini analiz etme yöntemleri arasında gömülü izleyici mikrosferlerinin hareketini izleme 6,7,12,13,14, zaman içinde protein yoğun kümelerin boyutunu izlemek için görüntü analizi8, dinamik ışık saçılması 15, parçacık görüntü velosimetrisi 4,16,17,18,19 , zaman içinde görüntülerin güç spektral yoğunluğunun hesaplanması19 ve kimograf analizi20. Yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağları üzerine daha fazla çalışma yapıldıkça, hücresel mekaniği veya aktif maddeyi anlamak için, dinamikleri karakterize etmek için sağlam, tarafsız ve tekrarlanabilir yöntemler giderek daha fazla gerekli hale gelmektedir. Diferansiyel dinamik mikroskopi (DDM) 21,22, sitoiskelet dinamiklerini incelemek için kullanılan nispeten yeni bir tekniktir, dinamikleri az sayıda kullanıcı tanımlı parametreyle verimli bir şekilde ölçen böyle bir tekniktir. Burada açıklanan yazılım paketiyle, programlama veya görüntü analizi konusunda çok az deneyime sahip araştırmacılar, DDM'yi kendi çalışmaları için kullanabileceklerdir.

DDM, bir numunenin dinamiklerini çıkarmak için kullanılan bir görüntü analiz tekniğidir. Parçacık izleme veya parçacık görüntü velosimetrisi gibi, DDM de tipik olarak mikroskopla kaydedilen bir dizi görüntü (genellikle binlerce görüntü) gerektirir. Parçacık izlemenin aksine, bireysel özelliklerin veya izleyici boncukların görüntüde yerelleştirilmesi (hatta yerelleştirilebilir) gerekmez. Hem partikül izleme hem de partikül görüntü velosimetrisinden farklı olarak, DDM ile topluluk dinamikleri nispeten az sayıda kullanıcı tarafından belirlenen parametrelerle kurtarılır. DDM ile görüntüler, bir dalga sayıları aralığı üzerindeki yoğunluk dalgalanmalarının bozunma süresini belirlemek için Fourier uzayında analiz edilir, q, burada q = 2πu ve u, uzamsal frekansların Equation004 büyüklüğüdür. Biri saçılma benzeri bilgiler elde eder, ancak mikroskopta elde edilen gerçek uzay görüntüleriile 21,22,23. Bu nedenle, geniş alan floresan 22,24, konfokal floresan 25, polarize26, karanlık alan 27 veya ışık tabakası floresan 28 mikroskopi gibi çeşitli kontrast üretenmikroskopi yöntemlerinden yararlanılabilir. Ayrıca, DDM analizi için kullanılan görüntüler, tamamlayıcı bilgi sağlamak için partikül izleme veya partikül görüntü velosimetrisi için kullanılabilir.

Dinamik ışık saçılması ve optik mikroskopiden gelen özelliklerin bu kombinasyonu, DDM'yi güçlü ve çok yönlü bir teknik haline getirir. DDM'nin 73 nm kolloidal parçacıkların difüzyonunu ölçtüğü 2008 21'de Cerbino ve Trappe tarafından ilk tanımından bu yana, DDM, akan kolloidleriölçmek için kullanılmıştır 29, kolloidal agregasyon30,31, nematik sıvı kristallerin viskoelastisitesi26, kolloidal jellerin dinamikleri 32, kabalaştırıcı köpükler 33, sınırlı ortamlarda nanopartiküller 34, 35,36,37, bakteriyel hareketlilik 38,39,40,41, zayıf saçılan protein kümelerinin difüzyonu 42, sıvı arayüzlerinde kılcal dalgalar 43 ve diğer sistemler. DDM'yi kullanan yayınların daha eksiksiz bir listesini arayanlar, konuyla ilgili kapsamlı inceleme makalelerine başvurabilirler 22,23,44,45.

DDM, biyolojik ağların dinamiklerini araştırmak için de kullanılmıştır. Drechsler ve ark. canlı Drosophila oositlerinde aktinin dinamiklerini ölçmek için DDM'yi kullandılar46. Burla ve ark. hyaluronan ve hyaluronan-kollajen kompozitleri ağlarındaki izleyici parçacıkların dinamiklerini ölçmüştür47. DDM'nin yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarındaki izleyici parçacıkların dinamiklerini incelemek için çeşitli kullanımları9,10, bu tür ağlardaki DNA moleküllerinin taşınması48,49 ve aktif yeniden yapılandırılmış ağların dinamikleri de belgelenmiştir 11,50,51. DDM'nin bu tür sistemlerdeki dinamikleri ölçmedeki bir avantajı, bireysel parçacıkların veya moleküllerin lokalize edilmesine ve izlenmesine gerek olmamasıdır. Bu nedenle, örneğin, kalabalık ortamlardaki DNA moleküllerinin dinamikleri, bu kadar küçük ve küresel olmayan moleküllerin izlenmesindeki zorluğa rağmen DDM ile ölçülebilir. Ayrıca, floresan mikroskobu ile, karmaşık bir kompozitteki bireysel bileşenlerin dinamiklerini seçici olarak ölçmek için çok renkli etiketleme kullanılabilir.

DDM'yi gerçekleştirmek için, zaman içinde bir dizi görüntü alınır, I(x,y,t). Belirli bir gecikme süresi için, Δt, bu gecikme süresiyle ayrılmış tüm (veya bir alt kümesi) görüntü çiftleri bulunur. Her çiftin farkının kareli Fourier dönüşümü,

Equation007

birlikte hesaplanır ve ortalaması alınır. Bu miktar, Equation008dinamiklerin izotropik olması koşuluyla radyal olarak ortalamadır. Bu, DDM matrisini (görüntü yapısı işlevi olarak da adlandırılır) verir Equation009. Bu işlem Şekil 1'de grafiksel olarak gösterilmiştir. Bu DDM matrisinden numunenin dinamiklerini belirlemek için, DDM matrisinin formu aldığı varsayılır.

Equation010

burada A, mikroskobun ayrıntılarına ve numunenin yapısına bağlı olan genliktir, B, görüntülerdeki gürültüye bağlı olan arka plandır ve f (q, Δt),dinamikler 21,22 hakkında bilgi içeren ara saçılma fonksiyonudur (ISF). Basit durumlarda,

Equation014

burada τ karakteristik bir bozunma veya korelasyon süresidir. Böyle bir ISF, seyreltik kolloidal süspansiyonlar21,24,27,37,40,52 gibi ergodik sistemler üzerinde DDM kullanan çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Bununla birlikte, ISF'nin diğer biçimleri çeşitli dinamik türlerini modellemek için kullanılabilir. Örneğin, polidispers numuneler için ISF'yi modellemek üzere kümülatif bir genişleme kullanılabilir.

Equation016

burada μ polidispersitenin bir ölçüsüdür42,53; yoğunluk dalgalanmaları iki ayrı mod tarafından bozunursa, aşağıdaki gibi bir ISF kullanılabilir.

Equation01826, 54, 55, 56 , 57;

Diğer ISF'ler mikroorganizmaları veya diğer aktif parçacıklarıyüzdürmek için kullanılabilir 38,39,40,41,58,59.

Figure 1
Şekil 1: DDM analizine genel bakış. Görüntülerin zaman serilerinden, DDM matrisini hesaplamak için görüntü farklılıklarının Fourier dönüşümü hesaplanır. DDM matrisi, bir q değerleri aralığındaki yoğunluk dalgalanmalarının zaman ölçeğini belirlemek için bir modele sığdırılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Burada Python'da geliştirilen bir DDM analiz yazılım paketinin kullanımı, PyDDM, anlatılmaktadır. Bu yazılım paketi, araştırma laboratuvarlarımız tarafından yapılan çalışmalara ve son birkaç yılda yayınlanan diğer çalışmalara dayanmaktadır. Bu yazılım paketini oluşturmak için birincil motivasyon kaynakları arasında (1) analizde kullanılan meta verileri ve parametreleri takip etme ve depolama; (2) baştan sona ayrıntılı analiz örnekleri içeren kapsamlı dokümantasyon; ve (3) verileri sığdırmak için farklı matematiksel modeller kullanmanın (veya yeni) matematiksel modeller oluşturmanın kolay bir yolu (örneğin, aktif filamentler60 için yakın zamanda geliştirilenler gibi ISF modellerinin eklenmesi basit olacaktır). DDM analizi için diğer yazılım paketleri de mevcuttur, ancak hepsi iyi belgelenmemiş ve açık kaynaklı bir programlama dilinde yazılmamıştır. Örneğin, GPU'larda hesaplama ile C++ kodu (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, hesaplamaları hızlandırmak için zaman içinde Fourier dönüşümlerini kullanan C++ kodu (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, MATLAB ve Python sürümleri (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, MATLAB kodu (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 ve belirsizlik ölçümüne sahip MATLAB kodu ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Bu PyDDM paketi iyi belgelendiğinden ve DDM matrisinin nasıl hesaplandığı ve analiz edildiği konusunda çok fazla esneklik sağladığından, programlama veya görüntü analizindeki geçmişlerine bakılmaksızın DDM'yi uygulamak isteyen araştırmacılar için yararlı olabilir.

Protokol, bu yazılım paketinin in vitro yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarının dinamiklerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu, iki farklı görüntüleme verisi seti kullanılarak yapılır: (1) parlak alan mikroskobu ile alınan bir vimentin ağına gömülü mikron altı izleyici parçacıklarının görüntüleri ve (2) lazer taramalı konfokal mikroskopi ile alınan miyozin tahrikli aktiviteye sahip dolaşık bir kompozit ağdaki floresan etiketli aktin ve mikrotübül filamentlerinin görüntüleri. Bu iki veri kümesinin analizleri, çeşitli görüntüleme yöntemleriyle (örneğin, parlak alan veya konfokal floresan) çekilen görüntüleri analiz etme, gömülü izleyicilerden veya etiketli filamentlerden dinamikleri çıkarma ve çeşitli dinamikleri (örneğin, alt difüzyon ve kısıtlı veya balistik) ölçme yeteneği de dahil olmak üzere DDM'nin dikkate değer güçlü yönlerini vurgulamaktadır.

Protocol

NOT: Aşağıdaki protokoldeki her adımla birlikte gidecek kodu içeren bir Jupyter Notebook dosyası, aşağıdaki GitHub deposunda bulunabilir https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. Bu dosyanın PDF'si Ek Dosya 1'de bulunur. Ek olarak, her işlevin ve sınıfın kodunun ve belgelerinin izlenecek yolu web sitesinde, https://rmcgorty.github.io/PyDDM/ bulunabilir.

1. Yazılım kurulumu

  1. Örnek DDM çözümleme dosyalarıyla birlikte gitmek için, kodu çalıştırmak üzere Jupyter Not Defteri'ni yükleyin. NumPy ve Matplotlib de dahil olmak üzere diğer gerekli ortak Python paketlerini yükleyin. Bu paketlerin hepsi Anaconda dağıtımı ile birlikte gelir (https://www.anaconda.com/products/individual bakınız).
  2. Python paketi xarray63'ü yükleyin. Bu paket, meta verileri ve analiz parametrelerini düzenlemek ve depolamak için gereklidir. Anaconda dağıtımını kullanıyorsanız, komutu kullanarak xarray'i (önerilen bağımlılıklarıyla birlikte) yükleyin:
    conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 darboğazı
  3. Şu komutu kullanarak PyYAML paketini yükleyin:
    conda install -c anaconda yaml
    Bu paket, analiz edilecek görüntüler ve kullanıcı tarafından analiz ve montaj için ayarlanan parametreler hakkındaki meta verileri okumak için gereklidir.
  4. GitHub deposundan indirerek veya git komutunu kullanarak PyDDM paketini yükleyin:
    git klon https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git

2. Görüntüleme oturumlarının planlanması

  1. Mevcut en uygun görüntüleme yöntemini ve optik ayarları seçin. Belirtildiği gibi, DDM bir dizi mikroskopi yöntemiyle kullanılabilir.
  2. Kullanılacak uygun objektif lens ve görüntü boyutunun planlanmasına yardımcı olmak için, piksel boyutuna ve toplam görüntü boyutuna göre incelenecek dalga sayılarının (q) aralığını belirleyin. Bu hesaplamalara dayanarak, büyütme ve görüş alanı seçiminin deney için en uygun olduğunu onaylayın. Burada analiz edilen görüntüler için, aktif aktin-mikrotübül kompozit ağı için 60x 1.4 NA objektif ve 0.83 μm piksel boyutuna sahip 256 x 256 piksel görüntü boyutu kullanılmıştır. Bir vimentin ağına gömülü boncukların görüntüleri için, 100x 1,4 NA objektif ve 0,13 μm piksel boyutuna sahip 512 x 512 piksel görüntü boyutu kullanılmıştır.
    NOT: Minimum q, 2π/NΔ x ileayarlanır, burada görüntü boyutu (kare olduğu varsayılır) piksel boyutu Δ x olan N × N pikseldir. Maksimum q, minimum π/Δx ve 2π NA/λ'dur, burada NA, görüntüleme hedefinin sayısal açıklığıdır ve λ, ışığın dalga boyudur (parlak alan görüntüleme için, NA'yı (NAobjektif + NAkondansatör)/2 ile değiştirebilirsiniz).
  3. Ardından, araştırılacak zaman ölçekleri aralığını göz önünde bulundurun. Tipik olarak, DDM analizi en az 1000 karelik diziler üzerinde yapılır.
    1. Uygun kare hızını belirlemek için, örneklemdeki özelliklerin minimum çözümlenebilir uzunluk ölçeği (maksimum q'ya karşılık gelen) sırasına göre bir mesafeyi hareket ettirmesi için gereken beklenen süreyi göz önünde bulundurun.
    2. İncelenen zaman ölçekleri aralığının üst sınırını göz önünde bulundurarak, tipik olarak, belirli bir gecikme süresi Δt'nin yüzlerce görüntü farkının güç spektrumunun, gürültüyü azaltmak için yeterli istatistik sağlamak için birlikte ortalamasının alındığını kabul edin. Bu nedenle, maksimum zaman ölçeği incelendiğinden daha uzun görüntü dizileri elde edin.
      NOT: Beklenen bir difüzyon katsayısı, D veya hız, v, biliniyorsa, beklenen karakteristik bozunma sürelerini, görüş alanına ve piksel boyutuna göre belirlenen q aralığıyla birlikte τ = 1/Dq2 veya τ = 1/vq kullanarak tahmin edebilirsiniz. Erişilebilir q-aralığı üzerinden beklenen τ değerlerinin aralığı, kare hızı seçimini ve elde edilecek kare sayısını yönlendirmeye yardımcı olabilir.

3. Numune hazırlama ve görüntü alma

NOT: Temsili sonuçlar bölümünde sunulan veriler için kullanılan örnek hazırlama ve görüntüleme ayarlarının ayrıntıları için, yazarların önceki yayınları11,51,64 ve Ek Dosya 2'ye bakınız.

  1. Prob için zaman ve uzunluk ölçeklerinin dikkate alınmasına dayanarak, ideal olarak 1000'den fazla karenin görüntü dizilerini elde edin.
    NOT: Kod, görüntü içindeki kare görüntüleri veya ilgi çekici kare bölgeleri analiz eder, bu nedenle çerçeve boyutunu buna göre ayarlayın.
  2. Görüntü dizilerini üç boyutlu gri tonlamalı TIFF yığını olarak kaydedin. Alternatif olarak, Nikon Instruments sistemleri tarafından kullanılan format, ND2 formatı, kurulu paket tarafından okunabilir. Görüntüler farklı bir biçimde kaydedilmişse, görüntüleri bir TIFF yığınına dönüştürmek için ImageJ veya başka bir görüntüleme işleme programı kullanın.
    Not: ND2 dosyaları kullanıyorsanız, https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader nd2reader paketi yüklü olmalıdır.

4. Parametre kurulumu

  1. Örnekler klasörünün altındaki PyDDM kod deposunda sağlanan example_parameter_file.yml parametre dosyasının bir kopyasını oluşturun. Bu YAML dosyasını NotePad++ gibi bir metin düzenleyicisiyle veya JupyterLab'daki metin düzenleyicisiyle açın. Temsili sonuçlar bölümünde sunulan verilerin analizinde kullanılan örnek bir YAML parametreleri dosyası için Ek Dosya 2'ye bakın.
  2. Kopyalanan YAML dosyasında, analiz edilecek görüntü dizisine karşılık gelen veri dizinini ve dosya adını sağlayın. Meta veriler bölümünün altında, piksel boyutunu ve kare hızını belirtin.
  3. Analysis_parameters bölümünün altında, DDM matrisinin nasıl hesaplanması gerektiğine ilişkin ayrıntıları sağlayın. Buradaki bazı parametreler isteğe bağlıdır.
    1. En azından, number_lag_times parametreler ve last_lag_time için değerler sağlayın. Bunlar, sırasıyla DDM matrisinin hesaplanacağı farklı gecikme sürelerinin sayısına ve kullanılacak en uzun gecikme süresine (çerçeveler halinde) karşılık gelir. Burada kullanılan vimentin ağlarındaki izleyici boncukların verileri için, number_lag_times ve last_lag_time parametreleri sırasıyla 60 ve 1000 idi. Kod, gecikme süreleri için DDM matrisini 1 kareden (veya isteğe bağlı parametre first_lag_time belirtilmişse başka bir minimum gecikme süresinden) logaritmik aralıklı last_lag_time kadar hesaplar.
      NOT: M çerçeveleri elde edilirse, DDM matrisi M-1 kadar büyük bir gecikme süresi için hesaplanabilir. Bununla birlikte, bu kadar büyük bir gecikme süresinde zayıf istatistiklerle, verilerin gürültülü olması muhtemeldir. DDM matrisinin hesaplanacağı en uzun gecikme süresi, verilerin ayrıntılarına bağlı olacaktır, ancak toplam görüntü serisi süresinin yaklaşık üçte birini denemenizi öneririz.
  4. DDM matrisinin veya ara saçılma fonksiyonunun (ISF) Fitting_parameters bölümüne nasıl sığması gerektiğine ilişkin ayrıntılar sağlayın. Model parametresinin altına modelin adını verin. Seçilen modeldeki uydurma parametrelerinin her biri için ilk tahmini, alt sınırı ve üst sınırı sağlayın.
    NOT: Olası montaj modellerinin bir listesini görüntülemek için, print_fitting_models işlevini çalıştırın. Modeller ayrıca PyDDM web sitesindeki çevrimiçi belgelerde de bulunabilir.

5. DDM matrisinin hesaplanması

  1. DDM_Analysis sınıfının bir örneğini başlatın. Bunu yapmak için, YAML dosyasının dosya adını tam dosya yolu dahil olmak üzere DDM_Analysis geçirerek yukarıda açıklanan meta verileri ve analiz parametrelerini sağlayın. Alternatif olarak, meta verileri ve parametreleri Python sözlük veri yapısı olarak geçirin.
  2. DDM matrisini hesaplamak için calculate_DDM_matrix işlevini çalıştırın. Bu hesaplama, çerçeve boyutuna ve gecikme sürelerinin sayısına bağlı olarak birkaç dakika veya daha uzun sürebilir. Tipik çalışma süreleri için Şekil 2'ye bakın.
  3. Veri Kümesi olarak bilinen xarray paketinden bir veri yapısında olacak döndürülen verileri inceleyin. Bu veri yapısı, ddm_dataset özniteliği altında depolanır.
    NOT: Yalnızca DDM matrisi değil, ilişkili değişkenler ve meta veriler de bu veri yapısında depolanır. Ayrıca Ağ Ortak Veri Formu (netCDF) biçiminde diske kaydedilir.
  4. Oluşturulacak ve görüntülenecek grafikleri ve şekilleri inceleyin. Bu rakamlar ayrıca veri dizinine PDF dosyası olarak kaydedilir.
    1. Oluşturulan grafiklerden birinin, Equation031 q'nun bir fonksiyonu olarak Fourier dönüştürülmüş görüntülerin topluluk ortalamalı kare modülünü gösterdiğini görün. Varsayılan olarak, kod arka plan parametresi B'yi tahmin etmek için bunu kullanır. Büyük q sınırında, B'nin arka plan olduğu B/2'ye Equation031 yaklaşacağını varsayarak arka planı tahmin edin.
    2. Equation031 Büyük q'da bir platoya ulaşmıyorsa, B'yi tahmin etmek için başka bir yöntem kullanın. Bunu gerçekleştirmek için, parametre background_method YAML dosyasında veya isteğe bağlı bir anahtar sözcük bağımsız değişkeni olarak işlev calculate_DDM_matrix ayarlayın. B'yi tahmin etme yöntemleri hakkında daha fazla ayrıntı temsili sonuçlar bölümünde sunulmaktadır.

Figure 2
Şekil 2: DDM matrisini hesaplamak için hesaplama süresi. (A) ve (B)'de DDM matrisinin Equation009hesaplanma zamanı gösterilir. Her durumda kullanılan veriler, görüntü boyutu 512 x 512 piksel olan 5000 karelik bir filmdir. DDM matrisi, logaritmik olarak 1 kare (0.01 s) ile 1000 kare (10 s) arasında aralıklı 30 gecikme süresi için hesaplandı. Kod, 32 GB RAM'e sahip bir Intel i7-10700 2.90 GHz masaüstü bilgisayarda çalıştırıldı. (A)'da, her gecikme süresi için DDM matrisinin hesaplanmasında kaç görüntü farklılığının kullanıldığının değişen etkisi gösterilmiştir. Bunun için, görüntüler 256 x 256 görüntü boyutuyla sonuçlanacak şekilde bağlanır. Her gecikme süresi Δ tiçin, bu Δt ile ayrılmış görüntüler çıkarılır ve elde edilen matris Fourier dönüştürülür. Belirli bir Δ t için, bu Δ t ile ayrılmış tüm görüntü çiftleri kullanılabilir (mavi renkle gösterilir), yalnızca örtüşmeyen görüntü çiftleri kullanılabilir (örneğin, çerçeve 1 ve 10, 10 ve 19, vb.; kahverengi renkle gösterilmiştir) veya her Δt için 300 görüntü çifti veya daha azıkullanılabilir. (B) bendinde, görüntü boyutunun değiştirilmesinin hesaplama süresi üzerindeki etkisi gösterilir. Görüntüler 2 x 2, 4 x 4 veya 8 x 8 piksel gruplandırılarak birleştirildi ve sırasıyla 256 x 256, 128 x 128 veya 64 x 64 görüntü boyutlarıyla sonuçlandı. Her biri için, her Δ t için DDM matrisinin hesaplanmasında yaklaşık 300 görüntüçifti kullanılır. (C) DDM matrisinden, ara saçılma fonksiyonu (ISF) çıkarılabilir. Bu, (A)'daki üç durum için gösterilmiştir. Mavi veri noktaları (ofset olmadan), her Δ t için maksimum görüntü çifti sayısı kullanıldığındaISF'ye karşılık gelir; kahverengi veri noktaları (0,1 ofseti ile), her Δ t için örtüşmeyen görüntü çiftleri kullanıldığındaISF'ye karşılık gelir; pembe veri noktaları (0,2 ofseti ile), her Δ t için en fazla 300 görüntü çifti kullanıldığındaISF'ye karşılık gelir. Örtüşmeyen görüntü çiftleri kullanılarak bulunan ISF, uzun Δt'de gürültülülük gösterir. Bu durumda, uzun Δ t'de birkaç görüntü çifti kullanılır (örneğin; 1000 karelik Δt için yalnızca 4 görüntü çifti kullanılır). (D) ISF'yi üstel bir fonksiyona uydurarak, her dalga sayısı için karakteristik bozunma süresi, τ, q, belirlenir. Pembe renkte, sonuçlar orijinal görüntüleri 2 x 2 ile ciltledikten sonra gösterilir ve görüntü boyutu 256 x 256 olur. Gri renkte, sonuçlar 8 x 8 ile ciltlendikten sonra gösterilir ve görüntü boyutu 64 x 64 olur. Verileri ciltleyerek, daha yüksek dalga sayılarındaki dinamikler hakkındaki bilgiler kaybolur, ancak 64 x 64 görüntüler için DDM matrisini hesaplamak, 256 x 256 görüntülerden yaklaşık 16 kat daha hızlıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. DDM matrisini veya ISF'yi takma

  1. DDM_Fit sınıfının bir örneğini başlatın. Bunu yapmak için, görüntü meta verilerini ve sığdırma parametrelerini içeren YAML dosyasının dosya adını DDM_Fit geçirin.
  2. Verileri sığdırmak için DDM matrisi veya ISF için hangi modelin kullanılacağına karar verin. İşlev print_fitting_models çalıştırarak kullanılabilir modelleri listeleyin. YAML parametre dosyasında veya işlev reload_fit_model_by_name kullanarak kullanılacak modeli belirtin.
  3. Sağlanan YAML parametre dosyasında seçilen modeldeki her parametre için ilk tahminleri ve sınırları ayarlayın. Herhangi bir parametrenin başlangıç tahminini değiştirmek için, set_parameter_initial_guess işlevini kullanın. İşlev set_parameter_bounds parametreler için sınırlar ayarlayın. Örneğin, Ek Dosya 2'de görüldüğü gibi, vimentin ağındaki izleyici boncukların verileri için, bozunma süresi için ilk tahmin 1 s ve bu parametredeki sınırlar 0.01 s ve 2000 s idi.
  4. İşlev uyumu ile uyumu gerçekleştirin. Sonuçlara kolayca erişmek için bu işlevin çıktısına bir değişken atayın.
    NOT: Bu işlev birçok isteğe bağlı bağımsız değişken alabilir. Bu tür bağımsız değişkenlerin listesi ve bunları varsayılan olmayan değerlere ayarlamanın ne zaman düşünülmesi gerektiği konusunda kod belgelerine ve sağlanan örneklere bakın.

7. Uyum sonuçlarının yorumlanması

  1. Uyum parametrelerinin fonksiyon fit_report ile uyumlarını ve q-bağımlılığını incelemek için grafikler oluşturun.
    NOT: Bu işlev, PDF olarak da kaydedilecek bir dizi çizim oluşturacaktır. Bu işlevin isteğe bağlı bağımsız değişkenleri, üretilen grafikleri değiştirmek için kullanılabilir.
  2. Oluşturulan grafikler arasında, DDM matrisini veya ISF'yi (seçilen uygun modele bağlı olarak) dört q-değerinde (fit_report isteğe bağlı bir argüman olarak belirtilen) gösteren 2 x 2 alt grafiklere sahip bir şekil ile birlikte hesaplanan DDM matrisi veya ISF, model ve en uygun parametreler kullanılarak hesaplanacaktır. DDM matrisini veya ISF'yi en uygun olanla birlikte etkileşimli bir şekilde çizmek için, Jupyter Notebook ortamı kullanıldığında sağlanan örneklerde gösterildiği gibi sınıf Browse_DDM_Fits kullanın.
  3. Karakteristik bozunma süresi τ ve dalga sayısı q'nun grafiğinden, dinamiklerin difüzif, subdifüzif, balistik veya başka bir hareket türünü takip edip etmediğini belirleyin. Bu, τ ve q arasındaki güç yasası ilişkisini arayarak yapılabilir.
    NOT: fit_report fonksiyonu tarafından oluşturulan τ ve q günlük grafiğinde, belirli bir q değerleri aralığındaki güç yasasına karşılık gelen üç satır gösterilecektir. Düz siyah çizgi, τ ve q'nun bir güç yasasına, τ = 1 / Kq β takılmasına karşılık gelir, burada K ve β serbest parametrelerdir. Turuncu renkli kesikli çizgi, basit difüzyona uymaya karşılık gelir, τ = 1 / Dq2, burada D bir difüzyon katsayısıdır. Mavi renkteki nokta kesikli çizgi, τ = 1 / vq'ya sığmaya karşılık gelir, burada v bir hızdır.

8. Sonuçların kaydedilmesi

  1. Sığdırmanın sonuçları bir xarray veri kümesine kaydedilir. Bu veri yapısını diske kaydetmek için xarray işlevini to_netcdf veya Python'un yerleşik turşu modülünü kullanın. Bu netCDF dosyalarını yüklemek için open_dataset xarray işlevini kullanın.
  2. Sığdırma sonuçlarını, verilerle birlikte bir çalışma sayfası dosyasına kaydetmek için save_fit_results_to_excel işlevini kullanın.

Representative Results

Burada, iki farklı deney setinden PyDDM ile yapılan analizlerin örneklerini gösteriyoruz. Bir dizi deneyde, mikron altı izleyici boncuklar, ara filament proteini vimentinden oluşan ağlara gömüldü ve 100 kare / s'de parlak alan modunda 100x objektif lens kullanılarak görüntülendi (Şekil 3A). Vimentin mezenkimal hücrelerde eksprese edilir ve sitoplazma 65'in mekanik özelliklerinin ve sınırlı migrasyon66,67 gerçekleştiren hücrelerde çekirdeğin mekanik stabilitesinin önemli bir belirleyicisidir. Şimdiye kadar, yeniden yapılandırılmış vimentin ağları öncelikle makroskopik reoloji64,68,69 ile incelenirken, dinamikler nispeten az dikkat çekmiştir 13,70,71. Bu deneylerin ek ayrıntıları Ek Dosya 2'de bulunabilir. Diğer deney setinde, aktif sitoiskelet ağları aktin, mikrotübüller ve miyozin ile hazırlandı. Spektral olarak farklı floresan etiketler, aktin ve mikrotübül filamentlerinin, 2.78 kare / s'de 60x objektif lens kullanılarak iki renkli lazer taramalı konfokal mikroskopla görüntülenmesini sağlamıştır (Şekil 3B, C). Aktin ve mikrotübül filamentleri, mekanik ve biyokimyasal etkileşimlerle koordine edilen eylemleri ile dinamik hücre şekli değişikliklerinin önemli itici güçleridir72. Bu deneylerin ek ayrıntıları11'de bulunabilir. Bu deneylerde alınan görüntü dizilerinden tek tek kareler Şekil 3'te gösterilmiştir.

Figure 3
Şekil 3: Analiz edilen zaman serilerinden görüntüler . (A) Bir vimentin ağındaki 0,6 μm boncukların parlak alan görüntüsü. (B,C) Mikrotübül görüntüleme için 561 nm uyarma ışığı ve aktin görüntüleme için 488 nm uyarma ışığı kullanılarak, lazer taramalı bir konfokal mikroskopta 60x objektif ile alınan aktif bir aktin-mikrotübül kompozitindeki (B) mikrotübüllerin ve (C) aktinin görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Vimentin ağlarındaki izleyici boncukların görüntüleri için, 100 kare/sn'de 512 x 512 piksel boyutunda 5000 karelik filmler kaydedildi. Bunlardan, DDM matrisi, 1 ila 1000 kare veya 0.01 s ve 10 s arasında 60 logaritmik aralıklı gecikme süresinde hesaplandı. Arka planı tahmin etmek için, kareli Fourier dönüştürülmüş görüntülerin Equation031ortalaması olan B hesaplandı ve 55,73'eEquation037 eşit olarak ayarlandı. Q-değerlerinin en büyük %10'u üzerinden, bu miktarın B/2'ye eşit olduğu ve B'nin q'dan bağımsız olduğu varsayımı yapılmıştır. Bu, paketin B'yi tahmin etmek için varsayılan yöntemidir, ancak background_method parametresini farklı bir değere ayarlayarak başka yöntemler de mümkündür.

A(q) ve B parametreleri belirlendiğinde, DDM matrisinden Equation031ara saçılma fonksiyonu (ISF) çıkarılabilir. Örnek ISF'ler Şekil 4'te gösterilmiştir. Şekil 4A'da, 19 μM vimentin konsantrasyonuna sahip bir ağa gömülü 0,6 μm çapında boncukların görüntülerinden ISF gösterilmiştir. Şekil 4B'de, vimentin konsantrasyonu 34 μM olan bir ağdaki aynı tip boncuklar için ISF gösterilmiştir. İlginçtir ki, her iki durumda da ISF sıfıra düşmedi. Büyük gecikme zamanlarında, ISF ergodik sistemler için sıfıra yaklaşmalıdır. Yani, bu tür sistemlerde, yoğunluk dalgalanmaları büyük gecikme süreleri boyunca tamamen dekore edilmelidir. Buradaki ISF'nin sıfıra düşmemesi, hesaplanan DDM matrisinden ISF'yi bulmak için kullanılan A (q) ve B'nin yanlış tahminlerinden kaynaklanmış olabilir. Özellikle, burada kullanılan yöntem, belirli senaryolarda B'yi abartabilir62. Bununla birlikte, izleyici boncukların dinamiklerinin gerçekten ergodik olmaması daha olasıdır, çünkü boncuklar ağ ağı boyutuyla karşılaştırılabilir bir boyuta sahiptir ve bu nedenle kafeslenebilir. Diğer veriler ergodisite bulgusunu doğruladı. Yani, boncuk boyutu, 0.6 μm, 19 μM konsantrasyonu için 0.4 μm ve 34 μM konsantrasyonu için 0.3 μm ağ boyutları için hesaplanan ortalama değerden daha büyüktü. Ek olarak, daha sonra gösterilen bu izleyici boncukların tek parçacık takibinden elde edilen sonuçlar da sınırlı hareket gösterdi.

Figure 4
Şekil 4: Vimentin ağları için çeşitli dalga sayılarında ara saçılma fonksiyonları. ISF, yaklaşık 1 ila 9 μm-1 arasındaki q değerleri için gecikme süresinin bir fonksiyonu olarak çizilir. (A) Vimentin konsantrasyonu 19 μM olan bir vimentin ağındaki 0,6 μm boncuk görüntülerinden elde edilen ISF. (B) 34 μM vimentin konsantrasyonuna sahip bir vimentin ağındaki 0,6 μm boncuk görüntülerinden elde edilen ISF. ISF'nin sıfırın çok üzerinde bir değerdeki uzun gecikme süresi platosu, ergodisiteyi gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Dinamiklerin muhtemelen ergodik olmadığı göz önüne alındığında, ISF'ler forma Equation039uygundur C, ergodiklik faktörü 32'dir. ISF'nin bu formu, kolloidal jeller32,74 veya aktin-mikrotübül ağlarındaki izleyici parçacıklar gibi ergodik olmayan dinamiklerin önceki çalışmalarında kullanılmıştır 10. Şekil 4'teki noktalı siyah çizgiler, verilerle birlikte uyumları gösterir. Bu uyumlardan, artık bozunma zamanının, τ'nin ve ergodisite olmayan parametre C'nin q-bağımlılığına bakılabilir.

Figure 5
Şekil 5: Vimentin ağları için bozunma süresi ve dalga sayısı. ISF'ye uyumdan, τ bozunma süresi bir dizi q değeri için belirlenir. Netlik için, her q için τ değerini değil, sadece logaritmik olarak aralıklı bir kümeyi gösteriyoruz. Mavi renkte (bronz), vimentin konsantrasyonu 19 μM (34 μM) olan vimentin ağları içindeki 0.6 μm boncuk görüntülerinden elde edilen verilerdir. Hata çubukları, birden fazla filmdeki τ cinsinden standart sapmaları temsil eder (19 μM ağa sahip veriler için dört film [mavi] ve 34 μM ağa [bronz] sahip veriler için beş film). Kırmızı çizgi noktalı çizgiler, sonuçlarda açıklandığı gibi, zamansal ve uzamsal çözünürlüğümüz için tahmini sınırları işaretler. Düz siyah çizgi, difüzyon hareketini gösteren ölçeklemeyi gösterirEquation044. Her iki veri kümesi de bu ölçeklendirmeyi izlemez. Daha ziyade, 19 μM ağındaki boncuklar subdifüzyonel hareket gösterir (Equation010β > 2 ile) ve 34 μM ağındaki boncuklar sınırlı veya kafesli hareket gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bozunma süreleri, Şekil 5'te görüldüğü gibi, hem düşük q hem de yüksek q uçlarında büyük miktarda belirsizlik gösterdi. Bu grafikteki hata çubukları, düşük vimentin konsantrasyonu vakası için analiz edilen dört video veya daha yüksek konsantrasyon için analiz edilen beş video arasındaki standart sapmayı göstermektedir. Bu uçlardaki büyük belirsizliğin kaynağını anlamak için, hem zamansal hem de mekansal çözünürlüğü göz önünde bulundurun. Çözünürlüğün yaklaşık sınırları üç kırmızı çizgi noktalı çizgiyle gösterilir. İki yatay çizgi, incelenen minimum ve maksimum gecikme sürelerine karşılık gelir. 100 kare/sn'lik kare hızı ve 1000 kareye karşılık gelen maksimum gecikme süresi (toplam video süresinin %20'si) göz önüne alındığında, 0,01 sn'den daha hızlı veya 10 sn'den daha yavaş gerçekleşen dinamikler ölçülürken doğruluk kaybedildi. Daha düşük q-değerlerinde, τ için takılan değerler 10 s'den büyüktü. Bu nedenle, maksimum gecikme süresinden daha büyük olan çürüme sürelerinde büyük belirsizlikler beklenmelidir. Q-aralığının üst ucunda, bozunma süresi 0.01 s'lik minimum gecikme süresine yaklaştı, ancak bunun üzerinde kaldı. Zamansal çözünürlükle sınırlı kalmak yerine, bu yüksek q değerlerinde, uzamsal çözünürlük sınırlayıcı faktör olabilir. 0.13 μm'lik piksel boyutu göz önüne alındığında, q için en büyük değer yaklaşık 24 μm-1 idi. Bununla birlikte, kırınım sınırlı çözünürlük, bu yüksek uzamsal frekanslardaki dinamiklerin doğru ölçümlerine izin vermez. Optik çözünürlüğe Equation041 yaklaşmak, objektif lensin sayısal açıklığı, NA, 1.4 ve ışığın Equation042dalga boyu göz önüne alındığında, yaklaşık 16 μm-1'lik bir üst dalga sayısı sınırına yol açar. Bu, Şekil 5'teki dikey kırmızı çizgi noktalı çizgi ile işaretlenmiştir. Gerçekten de, veriler q'nun büyük değerlerinde gürültülüydü. Q'nun bu yaklaşık üst sınırından önce bile, τ'de artan belirsizlik görüldü ve bu, qmaksimumunun abartılmasından kaynaklanabilir. Tahmin edilenden daha düşük optik çözünürlük, kapak kapağının ötesinde sulu bir numuneye görüntü almak için bir yağ daldırma lensinin kullanılması veya kondenser lensin kusurlu bir şekilde hizalanmış olması olabilir.

Daha az konsantre ağa (19 μM vimentin) gömülü 0,6 μm boncuklar için, bozunma süresinin dalga sayısına karşı günlük grafiğinden, bozunma süresinin bir güç yasasıyla tutarlı bir şekilde dalga sayısıyla azaldığı gözlemlenebilir (Şekil 5). Bununla birlikte, normal difüzyon hareketi Equation044için beklenenleri takip etmiyor gibi görünmektedir. Aksine, τ q arttıkça daha dik bir şekilde azaldı. Bu, genellikle bunlar gibi kalabalık ortamlarda boncuklar için meydana gelen subdifüzyonel hareketin göstergesidir. τ(q)'nun τ = 1/Kq biçimindeki bir güç yasasına 1,4 μm-1 ila 12,3 μm-1 aralığında β takılması, K = 0,0953 μm β / s ve β = 2,2 taşıma parametrelerini verir. Gecikme süresinin bir fonksiyonu olarak izleyici parçacıklarının ortalama kare yer değiştirmesi (MSD) açısından normal difüzyon ve alt difüzyon hakkında düşünmeye daha alışkın olanlar için (yani, MSD = K' Δ t α),MSD denklemindeki alt difüzyon üsünün α = 2 / α eşdeğer olduğunu kabul etmek β yararlıdır. Başka bir deyişle, β = 2.2 değeri, α = 0.9'un MSD denklemindeki bir alt difüzyon ölçekleme üssü ile tutarlıdır. PyDDM, q dizisinin endekslerini YAML dosyasında Good_q_range parametreyle belirterek veya isteğe bağlı bağımsız değişkeni forced_qs fonksiyon generate_fit_report ileterek bu q-değerleri aralığına τ(q) sığacak şekilde ayarlanır. 1,4 μm-1 ila 12,3 μm-1 arasındaki q aralığı, buradaki veriler için, 15 ila 130 arasındaki q dizisinin endekslerine karşılık gelecektir.

Daha konsantre ağdaki (34 μM) 0,6 μm boncuklar için, bozunma süresi q'ya çok az bağımlılık gösterdi. Bu muhtemelen daha küçük bir ağ boyutuna sahip bir ağdaki boncukların ergodisite olmamasından kaynaklanmaktadır. Bu sistemdeki ergodisiteyi araştırmak için, nonergodicity parametresi C, Şekil 6'da olduğu gibi q'nun bir fonksiyonu olarak çizilmelidir. 19 μM vimentin ağındaki 0,6 μm boncuklar için C, q'ya çok az bağımlı olarak 0,2'≈ (gösterilmemiştir). Bununla birlikte, 34 μM vimentin içeren ağ ve 49 μM vimentin konsantrasyonu daha yüksek olan bir ağ için, C günlüğü Şekil 6'da gösterildiği gibi q2 ile orantılıydı. C ve q arasındaki bu ilişki, sınırlı hareket için beklenir. Ağın ceplerinde sıkışmış boncuklar için, MSD'nin yeterince uzun gecikme sürelerinde plato yapması beklenir δ. Equation055Equation056 ISF, MSD cinsinden , olarak Equation058ifade edilebildiğinden ve ergodik olmayan ISF uzun gecikme zamanlarında (yani, ) C'ye gittiğinden, ilişki Equation06032,75Equation059 elde edilir. Bu nedenle, δ 2'yi bulmak için C(q) kullanılabilir ve bu, 34 ve 49 μM vimentin ağları için sırasıyla δ 2 = 0.017 μm 2 ve 0.0032 μm 2 verir (δ = 0.13 μm ve 0.057 μm'ye karşılık gelir).

Figure 6
Şekil 6: Vimentin ağları için Nonergodicity parametresi ve dalga sayısı. ISF'ye uyumdan, ergodicity olmayan parametre C, bir dizi q değeri için belirlenir. Ten rengi (kırmızı), vimentin konsantrasyonu 34 μM (49 μM) olan vimentin ağları içindeki 0.6 μm boncuk görüntülerinden elde edilen verilerdir. Hata çubukları, birden fazla filmde τ cinsinden standart sapmaları temsil eder (34 μM ağ [bronz] ile veriler için beş film ve 49 μM ağ [kırmızı] ile veriler için dört film). Y ekseni logaritmik ölçeklendirmeye sahiptir. Biri C'nin q-bağımlılığını gözlemler ve bunu takip ederEquation060, bu da maksimum ortalama karesel yer değiştirmenin çıkarılmasına izin verir, δ2. Uydurmalar Equation060 düz çizgilerle gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Verilerden δ hapsetme boyutunu ve 19 μM vimentin ağındaki boncuklar için τ (q) incelemesinden bulunan alt difüzyon üsünü çıkarmak için başka yöntemler de kullanılabilir. İlk olarak, MSD'yi DDM matrisinden çıkarmak için Bayles ve ark.76 ve Edera ve ark.77 tarafından açıklanan yöntem kullanılabilir. Özellikle, bu yöntem DDM matrisinin takılmasını gerektirmez. Birinin sadece DDM matrisini, D(q, Δt) ve (A(q) veEquation070 B'nin belirlenebileceği) hesaplanması gerekir. Ardından, MSD'yi bulmak için, biri ilişkiyi Equation071kullanır. MSD'yi bulmak için kullanılan bu yöntemin, parçacık yer değiştirmelerinin dağılımının Gaussian olduğunu varsaydığını unutmayın, ancak önceki çalışmalar, bazı durumlarda, DDM'den türetilen MSD'lerin, yer değiştirmeler Gauss73 olmasa bile, parçacık izlemeden MSD'lerle aynı fikirde olduğunu göstermiştir. Bu sistem için, beklendiği gibi78, Şekil S1'de görüldüğü gibi, büyük yer değiştirmelerin dağılımında Gaussianity yoktur. PyDDM paketinde, extract_MSD işlevi yürütülmelidir, bu da Equation056. İkincisi, MSD'yi bulmak için tek parçacık izleme kullanılabilir. DDM, yüksek parçacık yoğunluğunun veya sınırlı optik çözünürlüğün doğru parçacık lokalizasyonunu yasakladığı görüntüleri analiz etmek için kullanılabilse de, vimentin ağlarındaki 0,6 μm boncukların görüntüleri için, trackpy yazılımını (https://github.com/soft-matter/trackpy) kullanarak boncukları yerelleştirebildik ve izleyebildik79. Bu parçacık izleme yazılım paketi, Crocker ve Grier80 tarafından açıklanan algoritmaları kullanır.

Figure 7
Şekil 7: Vimentin ağları için ortalama kare yer değiştirme ve gecikme süresi. MSD iki yöntem kullanılarak belirlendi. İlk olarak, MSD DDM matrisinden hesaplandı (katı sembollerle gösterildi). Daha sonra, MSD, parçacık yörüngelerini (açık semboller) bulmak için tek parçacık izleme (SPT) kullanılarak belirlendi. Hata çubukları, önceki iki şekil göstergesinde açıklandığı gibi belirlenir. (A) 19 μM vimentin ağındaki 0,6 μm boncuklar için MSD'ler, MSD'yi bulmak için iki yöntem arasında iyi bir anlaşma ile subdifüzyonel hareketi gösterir. (B) 49 μM vimentin ağındaki 0,6 μm boncuklar için MSD'ler, MSD'yi bulmak için iki yöntem arasında iyi bir anlaşma ve ergodisite parametresinden bulunan maksimum MSD ile kafesli hareketi gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

19 μM vimentin ağında ve 49 μM vimentin ağında 0,6 μm boncuklar için MSD'ler ve gecikme süresi Şekil 7'de gösterilmiştir. Her iki durumda da, DDM'den belirlenen MSD, tek parçacık izleme (SPT) yoluyla bulunan MSD ile iyi bir şekilde uyuşmuştur. Ayrıca, daha az konsantre ağ için, subdifüzyon ölçekleme üssü (α içindeEquation010) yaklaşık 0.9 idi. Bu, τ(q)'yu belirlemek için ISF'ye Equation010 uyarak bulunan τ(q) ölçeklendirmesi ile tutarlıdır (yani, 2/2.2 = 0.9). Daha yoğun ağ için, MSD daha uzun gecikme sürelerinde platolar. Ergodisite olmayan parametrenin q-bağımlılığını analiz ederek bulunan maksimum MSD (Şekil 7B'de yatay çizgi δ 2 = 0.0032 μm 2 ile gösterilmiştir), hem SPT hem de DDM'den MSD'lerin platoya doğru ilerlediği yaklaşık olarak aynı değerdi. Şekil 7A'da DDM ve SPT'den belirlenen en uzun gecikme süresi MSD'leri arasında bir tutarsızlık vardır. Bu, sınırlı sayıda uzun gecikme süresi yörüngesinden kaynaklanıyor olsa da, DDM matrisinin her gecikme süresi için tahmin Equation056 etmek için kullanıldığı q değerleri aralığını daha da optimize etmenin (Bayles ve ark.76 ve Edera ve ark.77 tarafından yapıldığı gibi) sonuçlarımızı iyileştireceği de söz konusu olabilir. ve böyle bir optimizasyon gelecekteki çalışmaların odak noktası olacaktır.

Bir vimentin ara filamentler ağına gömülü izleyici boncukların görüntü dizilerinin kaydedildiği bu deneyler, bağımsız analizlere izin verdi: DDM (burada açıklanan paketi kullanarak) ve SPT (trackpy kullanarak). Her iki analiz de alt difüzyon derecesini ve hapsetme uzunluğunu ortaya çıkarabilir ve tamamlayıcı metrikler sağlamak için iki bağımsız görüntü analizi tekniğinin kullanılmasına izin verir. SPT ve DDM'den karşılaştırılabilecek ek miktarlar vardır. Örneğin, numunenin dinamiklerindeki heterojenlik, SPT'den belirlenen parçacık yer değiştirmelerinin dağılımında (yani van Hove dağılımında) ve DDM'den belirlenen ve gerilmiş üstel34,35'e uyan bir ISF'de Gaussianity olmayan olarak kendini gösterebilir. Şekil S1, vimentin ağlarındaki 0,6 μm parçacıklar için van Hove dağılımını göstermektedir ve ISF'lerin uymasından bulunan gerilme üsünü tartışmaktadır - biyomimetik sistemler içindeki parçacıkların heterojen dinamiklerini göstermek için önceki çalışmalarda birlikte kullanılan metrikler 9,10,47 veya diğer kalabalık ortamlar 34 . Başka bir örnek olarak, ISF, SPT ile ölçülen parçacık yörüngelerinden hesaplanabilir ve DDM tarafından edinilen ISF'lerle karşılaştırılabilir. Ortalama kareli yer değiştirmeler ve yer değiştirme dağılımları SPT analizinden en sık çekilen metrikler olsa da, ISF'yi parçacık yörüngelerinden Equation075Equation076 de hesaplayabiliriz (bkz. Şekil S2). Bu ISF, DDM tarafından oluşturulan ISF'lerle karşılaştırılabilir ve MSD59'da görünmeyen dinamikleri ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Bir ağ içindeki izleyici parçacıkların görüntülerini elde etmek, SPT ve DDM'nin tamamlayıcı analiz yöntemlerini kullanmasına izin verebilirken, DDM'nin SPT'ye göre bir avantajının, kolayca lokalize edilebilen ve izlenebilen boncukların (veya diğer özelliklerin) görüntülerini gerektirmemesi olduğunu belirtmek önemlidir. Bu noktayı göstermek için, aktin ve tübülinin floresan etiketlemesinin, farklı floroforlarla birbirinden ayırt edilen her iki filament tipinin çok renkli lazer taramalı konfokal mikroskopla görüntülenmesine izin verdiği aktif aktin ve mikrotübül filamentlerinin analizini vurguluyoruz.

Görüntüler, miyozin (tavşan iskelet kası miyozini II; Hücre iskeleti #MY02). Deneylerin ve sonuçların ayrıntıları daha önce11 olarak tanımlanmıştır ve burada gösterilen temsili sonuçlar,11 için ek materyallerde (S1 ve S4 filmleri) sağlanan iki filmin analizinden alınmıştır. Her iki görüntü dizisi de 1000 kare için 2,78 kare/sn'de kaydedildi.

Bu görüntüleri analiz etmek için, DDM matrisi 0,4 s ila 252 s (1 kare ila 700 kare) arasında değişen 50 gecikme süresi için hesaplanmıştır. DDM matrisi daha sonra modele Equation010uydu, ara saçılma fonksiyonu Equation077. Bu nedenle, dört bağlantı parametresi vardır: A, τ, s ve B. Bu uyumların sonuçları Şekil 8'de gösterilmiştir. Belirli bir q-değeri için DDM matrisinin düşük gecikme zamanlarında bir platoya sahip olduğu, gecikme süresiyle arttığı ve daha sonra büyük gecikme zamanlarında platolaştığı (veya platoya başlama belirtileri gösterdiği) gözlenmiştir. Q'nun düşük değerleri için DDM matrisi uzun gecikme zamanlarında bir platoya ulaşmadı. Bu nedenle, bu düşük q (büyük uzunluk ölçeği) dinamikleri için bozunma süresinin ölçümünde zayıf doğruluk beklenmelidir.

Uyumlardan DDM matrisine kadar karakteristik bozunma süreleri, τ, Şekil 9'da gösterilmiştir. Aktif aktin-mikrotübül kompozit ağı (S1 11 filminebenzer) ve aktif aktin ağı (S411 filmine benzer) için sonuçlar sunulmuştur. Her iki ağ da aynı aktin ve miyosin konsantrasyonlarıyla hazırlandı, ancak11'de açıklandığı gibi sadece aktin ağı tübülin olmadan oluşturuldu. Bu iki tür aktif ağ için, gözlemlenen güç yasası ilişkisi . Equation010 Bu ölçekleme, balistik hareketi ve miyozin güdümlü kasılma ve akışın filamentlerin termal hareketi üzerinde baskın olduğunu gösterir. τ = (vq)-1'den, aktif aktin-mikrotübül ağı için yaklaşık 10 nm / s ve aktif aktin ağı için 75 nm / s'lik karakteristik bir hız, v bulunabilir. Bu değerler,11'de gösterilen aynı videoların parçacık görüntü velosimetri analizi ile tutarlıdır. ÖlçeklemeEquation010, aktif aktin-mikrotübül kompozit ağı için daha düşük q değerlerinde tutmadı. Bunun nedeni, düşük q değerlerindeki bu aktin-mikrotübül kompozit ağı için gerçek bozunma sürelerinin, hesaplanan DDM matrisinin maksimum gecikme süresinden daha uzun olmasıdır. Maksimum gecikme süresi, Şekil 9'daki yatay kırmızı çizgi ile gösterilmiştir ve bozunma süreleri, bu uzun sürelerin yakınında beklenen Equation010 ölçeklemeden sapmıştır.

Figure 8
Şekil 8: Aktif bir aktin-mikrotübül kompozit ağı için DDM matrisi ve gecikme süresi. Birkaç q değeri için DDM matrisi, 2.9 μM aktin monomerleri, 2.9 μM tübülin dimerleri ve 0.24 μM miyozinden oluşan kompozit bir ağın filminden gecikme süresinin bir fonksiyonu olarak çizilir. Bu veriler, çok renkli bir görüntü zaman serisinin sadece mikrotübül kanalının analizini göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: Aktif aktin-mikrotübül ağları için dalga sayısına karşı bozunma süresi. DDM matrisinin uydurmasından, dalga numarasının bir fonksiyonu olarak τ bozunma süresi, q, bulunur. Çizilen, kahverengi bir aktif aktin-mikrotübül ağının görüntüleri (sadece mikrotübül kanalını analiz eder) ve yeşil renkte aktif bir aktin ağının görüntüleri için τ vs q'dur. Her iki ağ da aynı aktin ve miyozin konsantrasyonlarına sahiptir (sırasıyla 2.9 μM ve 0.24 μM); aktin-mikrotübül kompoziti 2.9 μM tübülin dimerine sahiptir. Aktif aktin ağı için bozunma süreleri, aktif aktin-mikrotübül ağının bozunma sürelerinden çok daha küçüktür, bu da aktif aktin ağının daha hızlı hareketini gösterir. Her iki durumda da, veriler bir Equation010 eğilimi takip ettiği için dinamikler balistiktir. Giriş: ISF'lerin grafiği ile dalga sayısı (Δt × q) tarafından ölçeklendirilen gecikme süresi arasındaki grafik, ISF'lerin bir q değerleri aralığı üzerindeki çöküşünü gösterir. Bu aynı zamanda balistik hareketi de gösterir. Bu girişte gösterilen ISF'ler etkin aktin ağındandır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Aktif ağların bu verileri için, DDM matrisine Equation010uymayı seçtik, . Bu, A (q) ve B'nin ISF, f (q, Δt) 'yi izole etmek için herhangi bir uydurma olmadan tahmin edildiği vimentin ağındaki boncukların verileri için yapılanlarla çelişmektedir. Bu durumda, aktif ağ verileri için, A ve B, uygun parametreler olarak bırakıldı, çünkü B'yi tahmin etmek için kullanılan yöntemler iyi uyumlarla sonuçlanmadı. B'yi tahmin etmenin varsayılan yöntemi hesaplama Equation031 yapmak ve büyük q'da bunun B/2'ye gittiğini varsaymaktır. Bununla birlikte, bu yöntem, bu şekilde tahmin edilen B'den ISF'leri hesaplarken (gösterilmemiş), ISF'lerin erken gecikme zamanlarında 1'den büyük olduğu gerçeğinde görülen bu veriler için B'yi abartmıştır (oysa maksimum 1'den sıfıra veya artan gecikme süresine sahip bazı ergodicity olmayan parametrelere gitmeleri gerekir). background_method parametresini kullanarak B'yi tahmin etmek için başka yöntemler de seçilebilir. Bu diğer yöntemlerden biri, B'nin erken gecikme zamanlarında DDM matrisinin minimumu olduğunu tahmin etmektir (background_method = 1 ile ayarlanır). Benzer bir yöntem Bayles ve ark.76 tarafından da kullanılmıştır, ancak B'nin q ile sabit olduğunu varsaymamışlardır. Başka bir seçenek de B'yi DDM matrisinin tüm gecikme süreleri boyunca maksimum q'daki ortalama değer olarak tahmin etmektir (background_method=2 ile ayarlanır). Arka planı tahmin etmek için kullanılan bu farklı yöntemler ve B'nin serbest bir uygulama parametresi olmasına izin verme sonuçları Şekil 10'da gösterilmiştir. Bu grafiklerden, genliğin, A'nın, incelenen en büyük q değerlerinde sıfıra ulaşmadığı , çünkü Equation031 büyük q'da plato olmadığı (Şekil 10B) ve D (q max, Δt) daha düşük bir gecikme süresi platosundan daha yüksek bir gecikme süresi platosuna gittiği görülebilir (yani, q max'ta, sıfır olmayan bir A vardı; Şekil 10D). Bu nedenle, ne B'yi ne de uygun olduğu gibi Equation082 Equation083 tahmin etmek. B'nin nasıl tahmin edileceğine (veya tahmin edilip edilmeyeceğine) karar vermeden önce q ve D (qmax, Δ t) ve Δt incelenmelidir. Equation031

Figure 10
Şekil 10: Aktif aktin-mikrotübül ağları için arka plan ve dalga sayısı. DDM matrisine uyduğundan, dalga numarasının bir fonksiyonu olarak arka plan B, q bulunabilir. Gösterilen aktif bir aktin-mikrotübül ağının görüntüleri içinB ve q'dur  (sadece mikrotübül kanalını analiz eder) mor sembollerle bu uyumlardan belirlenir. (A) içindeki üç düz çizgi, herhangi bir uyum olmadan bulunan arka planın tahminlerini gösterir. (A) içindeki en üst, en koyu çizgi, , kullanılarak Equation088tahmini arka planı gösterir; bu, büyük q'da sabit bir değere platolar varsa Equation031 uygun olabilir. (B)'den, en büyük q sondasında henüz sabit bir değere ulaşmadığını unutmayınEquation031. Bu nedenle, bu yöntemi kullanmak arka planı abartır. (A) içindeki alt satır, Equation090. DDM matrisi kırmızı çizgili (C)'de gösterildiği gibi düşük gecikme süresi platosu gösteriyorsa, bu yöntem arka planı tahmin etmek için uygun olabilir. (A) içindeki orta, en hafif çizgi, .Equation083 Bu yöntem, qmaksimumda, genlik olan A'nın sıfıra ulaşması durumunda uygun olabilir. (D)'den genliğin sıfır olmadığı ve bu nedenle bu yöntemin arka planı abarttığı görülmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Parçacık yer değiştirmelerinin olasılık dağılımları. Parçacık yer değiştirmelerinin olasılık dağılımları, 34 μM ve 49 μM'lik vimentin konsantrasyonları için Gaussiyanite olmadığını göstermektedir. 0.6 μm çapında boncukların tek parçacık izlemesi, farklı konsantrasyonlardaki vimentin ağlarında gerçekleştirilmiştir. Üç koşul için yer değiştirme dağılımlarında farklı gecikme süreleri gösterilir. (A) 19 μM vimentin ağındaki parçacık yer değiştirmelerinin dağılımı bir Gauss fonksiyonuna uygundur. Gaussian'ın genişliği, gecikme süresinin artmasıyla birlikte artar. (B) 34 μM vimentin ağındaki parçacık yer değiştirmelerinin dağılımı, özellikle büyük yer değiştirmelerde, 19 μM durumundan daha fazla Gaussianite göstermezlik gösterir. (C) 49 μM vimentin ağındaki parçacık yer değiştirmelerinin dağılımı da Gaussianite olmadığını gösterir. Ayrıca, dağılımların genişlikleri, gecikme süresi ile daha düşük vimentin konsantrasyonlarına sahip numunelerde olduğu kadar önemli ölçüde artmaz, bu da sınırlı hareketi gösterir. Gauss olmayan van Hove dağılımları (tüm vimentin örnekleri için görülür, ancak en yüksek konsantrasyonlarda görülür), parçacıkların kalabalık ve sınırlı ortamlarda taşınmasında sıklıkla görüldüğü gibi heterojen dinamiklerle ilişkilidir. DDM analizinden belirlenen heterojen taşımanın bir başka göstergesi, ara saçılma fonksiyonuna uymak için kullanılan germe üssüdür (burada kullanılan ISF denklemindeki s parametresi: Equation077 +Equation061). 0,4 μm-1 ila 9,4 μm-1 q-aralığı boyunca ortalama gerilme üsleri, en yüksek vimentin konsantrasyonundan en düşük seviyeye kadar, 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 ve 0,86 ± 0,04'tür (ortalama ± standart sapma). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S2: DDM ve SPT'den ara saçılma fonksiyonları. Beş farklı dalga numarası için ara saçılma fonksiyonları (ISF) gösterilir. DDM aracılığıyla bulunan ISF'ye karşı gecikme süresi dairesel belirteçlerle çizilir ve ISF, açık karelere sahip tek parçacıklı yörüngelerden hesaplanır. Noktalı siyah çizgiler, DDM tarafından edinilen ISF'lere uyumu gösterir. ISF, . Equation075Equation076 (A)'da, ISF, 19 μM vimentin ağlarındaki 0,6 μm parçacıklar için gösterilir. (B)'de, ISF, 34 μM vimentin ağlarındaki 0,6 μm parçacıklar için gösterilmiştir. DDM ve SPT'den bulunan ISF'deki tutarsızlıklar muhtemelen sınırlı sayıda uzun gecikme süresi yörüngesinden kaynaklanmaktadır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1: DDM kullanma protokolü. Protokolde gösterilen adımların giriş ve çıkışları sunulur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 2: Vimentin ağları için örnek hazırlama ve örnek parametre dosyalarının ayrıntıları. Vimentin ağlarında numune hazırlama ve görüntü yakalama için ayrıntılı adımlar sağlanmaktadır. Ek olarak, vimentin ağları ile ilgili temsili sonuçlar bölümünde sunulan verilerin analizi için örnek bir parametre dosyası da sağlanmaktadır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Burada açıklanan yazılım paketi, optik mikroskop kullanılarak elde edilen görüntülerde gözlenen yoğunluk dalgalanmalarını analiz etmek için DDM'yi kullanır. İlk olarak vimentin ağlarına gömülü izleyici parçacıkların verilerinden elde edilen temsili sonuçlar gösterilmiştir. Bu tür verilerin analizi, ağın ağ boyutunu ve sertliğini, tek parçacık izlemenin sitoiskelet ağlarının geçmiş birçok çalışmasında nasıl kullanıldığına benzer şekilde karakterize etmek için kullanılabilir 6,12,13. DDM'yi tek parçacık izlemeye göre kullanmanın bir avantajı, DDM'nin parçacıkların lokalize edilmesini gerektirmemesidir. Bu nedenle, parçacık yoğunluğunun çok yüksek olduğu veya parçacıkların lokalize edilemeyecek ve izlenemeyecek kadar küçük olduğu görüntülerde bile, DDM dinamikleri belirleyebilir. Tek parçacık izlemenin avantajlı olacağı yer, parçacık-parçacık değişkenliğini incelerken. DDM ile, topluluk ortalama dinamikleri bulunurken, tek parçacık izleme ile hem tek bir parçacığın MSD'sini hem de topluluk ortalaması MSD'sini hesaplayabilir. Bununla birlikte, DDM, geniş bir görüş alanındaki birden fazla ilgi alanını analiz ederek heterojen dinamikleri araştırmak için kullanılabilir.

Daha sonra, iki farklı etiketli sitoiskelet filament tipinden oluşan aktif bir ağdaki floresan olarak etiketlenmiş filamentlerin verilerinden elde edilen temsili sonuçlar11 gösterilmiştir. Bu verilerle, balistik hareket, görüntü içinde herhangi bir yerelleştirilebilir özelliğe ihtiyaç duymadan karakterize edildi. DDM, topluluğun ortalama dinamiklerini az sayıda kullanıcı girdisiyle çıkardığından, farklı koşullarla elde edilen görüntü serilerinin karşılaştırılmasını kolaylaştırır (örneğin; farklı aktin oranlarına sahip numunelerin mikrotübüllere veya50'de yapıldığı gibi farklı miyozin konsantrasyonlarına sahip numunelerin karşılaştırılması). Ek olarak, floresan görüntülemeyi kullanarak, çok renkli etiketleme kullanarak bir ağın farklı bileşenlerinin dinamiklerini araştırabiliriz. Bu, aktin ve mikrotübüllerin dinamiklerinin, çok renkli görüntüleme kullanılarak aktif bir aktin-mikrotübül kompozit ağında ayrı ayrı analiz edildiği 11,50'de yapıldı. Buradaki temsili sonuçlar bölümünde, sadece mikrotübül kanalından elde edilen sonuçlar gösterildi, ancak önceki çalışmalarda mikrotübül ve aktin filamentlerinin dinamiklerini karşılaştırdık11.

Bu temsili sonuçların ya pasif subdifüzyonu ya da aktif balistik hareketi sergilediğini not ediyoruz. Daha da önemlisi, DDM, ara zaman veya uzunluk ölçeklerinde dinamik tipinde bir geçişin olduğu sistemleri analiz etmek için kullanılabilir. Örnek olarak, Kurzthaler ve ark. DDM'yi kısa zaman ölçeklerinde aktif yönlendirilmiş hareketi ve daha uzun zaman ölçeklerinde oryantasyonun randomizasyonunu keşfetmek için aktif Janus kolloidleri sistemi ile birlikte kullanmışlardır59; Giavazzi ve ark. DDM'yi kaba bir köpükle kullandılar ve bir kabarcık33'ün uzunluk ölçeğine karşılık gelen dinamiklerde bir çapraz geçiş buldular; ve Cho ve ark. DDM'yi kolloidal jellerle kullandılar ve fraktal kümelerden tüm ağa kadar uzanan farklı uzunluk ölçeklerinde üç ayırt edilebilir rejim buldular32.

Temsili sonuçlar bölümünde yer alan veriler parlak alan mikroskobu ve lazer taramalı konfokal mikroskopi ile elde edilmiştir. Bununla birlikte, daha önce de belirtildiği gibi, DDM birçok görüntüleme yöntemiyle kullanılabilir. Herhangi bir görüntüleme yönteminde, kullanıcılar optik kesitleme derecesi veya alan derinliği gibi optik ayarları göz önünde bulundurmalıdır. Yüksek derecede optik bölümleme, odak dışı nesnelerden gelen sinyali azaltabilir, ancak nesnelerin alan derinliğinden25,28 dışına çıkması için zaman ölçeğinden daha büyük zaman ölçekleri üzerindeki dinamikleri doğru bir şekilde ölçemeyecektir. Q-bağımlı alan derinliğinin DDM analizini nasıl etkilediğine dair daha kapsamlı bir tartışma22'de bulunabilir. Parlak alan görüntüleme için, kullanıcıların numune kalınlığını da göz önünde bulundurmaları gerekebilir. Zayıf saçılan numuneler için, daha kalın numuneler daha fazla sinyalsağlayabilir 42, bulanık numuneler ise analizin birden fazla saçılma81'i hesaba katacak şekilde değiştirilmesini gerektirebilir. Son olarak, doğrusal uzay değişmezi olmayan görüntüleme yöntemleri için (yani, bir nesnenin kamerası tarafından kaydedilen yoğunluğun, o nesnenin x-y örnek düzleminde nerede olduğuna bağlı olduğu yerlerde), karanlık alan DDM27'de gösterildiği gibi doğrusal alan varyansının hesaba katılması gerekebilir.

DDM'ye başlayanlar için, mekansal ve zamansal çözünürlüğü göz önünde bulundurmanın önemini vurgulamak istiyoruz. Belirlenen bozunma sürelerini dalga sayısının bir fonksiyonu olarak incelerken, kişinin çözünürlüğünün sınırlarını işaretlemek önemlidir (yani, Şekil 5'te yapıldığı gibi, maksimum ve minimum gecikme süreleri ve maksimum dalga sayısı). Veri toplamadan önce bu sınırlar hakkında dikkatlice düşünülmelidir, böylece en uygun objektif lens, görüntü boyutu, kare hızı ve film süresi seçilebilir. Diğer önemli husus, arka plan parametresi B'nin nasıl tahmin edileceğidir. Literatürde arka planı tahmin etmek için birçok yöntem kullanılmış ve B'yi fazla veya küçümsemenin etkileri önceki yayınlarda 62,77'de tanımlanmıştır. Şekil 10'da gösterildiği gibi, PyDDM, kullanıcıların B'yi tahmin etmek için farklı yöntemler uygulamalarına izin verir ve yeni kullanıcıların bu yöntemleri denemelerini ve hangilerinin kullanımına uygun olduğunu değerlendirmelerini öneririz.

Bu paketin güçlü bir gücü, örnek verileri içeren kapsamlı dokümantasyonu ve izlenecek yolları, analizlerin nasıl gerçekleştirildiğini takip etmek için meta verilerin depolanması ve düzenlenmesi ve DDM matrisinin nasıl analiz edileceği esnekliğidir (çeşitli montaj modelleri, arka plan parametresi B'yi tahmin etmek için birden fazla yöntem, MSD'yi bulma yeteneği). Ancak, bu kodun geliştirilebilecek birçok yönü vardır. Şu anda, kod hızlı hesaplama hızı için optimize edilmemiştir. Hesaplamayı hızlandırma yöntemleri61,62 olarak bildirilmiştir ve bunlar gelecekteki sürümlerde uygulanacaktır. Ek olarak, belirsizlikleri daha iyi tahmin etmek ve kullanıcıları uygun ISF modeli62'ye yönlendirmek için simülasyonlar kullanmak için yakın zamanda bildirilen yöntemleri uygulamayı planlıyoruz. Diğer iyileştirmeler için, kullanıcıların önerileriyle bizimle iletişime geçeceğini umuyoruz.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Bu araştırmanın bazı bölümleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri R15 Ödülü (Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü ödül no. R15GM123420, R.M.R.-A.'ya verildi. ve R.J.M.), Research Corporation for Science Advancement'tan bir Cottrell Scholar Ödülü (ödül no. 27459, R.J.M.'ye verilir) ve William M. Keck Vakfı Araştırma Bursu (R.M.R-A.'ya verilir). GHK, Hollanda Araştırma Konseyi'nin (NWO; NWO Yetenek Programı'nın VI.C.182.004 proje numarası) mali desteğini minnetle kabul eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 Hamatsu
F-127 Pluronic Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop Thermo Fisher
Nikon Ti-Eclipse microscope Nikon
PLL-PEG-bio SuSos AG, Dübendorf, Switzerland
Polystyrene beads Sigma Aldrich
Protein dialysis mini-cassette Thermo Fisher
PyDDM University of San Diego N/A Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).
  2. Amblard, F., Maggs, A. C., Yurke, B., Pargellis, A. N., Leibler, S. Subdiffusion and anomalous local viscoelasticity in actin networks. Physical Review Letters. 77 (21), 4470-4473 (1996).
  3. Mizuno, D., Tardin, C., Schmidt, C. F., MacKintosh, F. C. Nonequilibrium mechanics of active cytoskeletal networks. Science. 315 (5810), 370-373 (2007).
  4. Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).
  5. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Physical Review Letters. 102 (18), 188303 (2009).
  6. Stuhrmann, B., Soares e Silva, M., Depken, M., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Nonequilibrium fluctuations of a remodeling in vitro cytoskeleton. Physical Review E. 86 (2), 020901 (2012).
  7. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  8. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  9. Anderson, S. J. et al. Filament rigidity vies with mesh size in determining anomalous diffusion in cytoskeleton. Biomacromolecules. 20 (12),4380-4388 (2019).
  10. Anderson, S. J., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  11. Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).
  12. Wong, I. Y. et al. Anomalous diffusion probes microstructure dynamics of entangled F-actin networks. Physical Review Letters. 92 (17), 178101 (2004).
  13. Köster, S., Lin, Y.-C., Herrmann, H., Weitz, D. A. Nanomechanics of vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 6 (9), 1910-1914 (2010).
  14. Chandrakar, P. et al. Engineering stability, longevity, and miscibility of microtubule-based active fluids. Soft Matter. 18 (9), 1852-1835 (2022).
  15. Alvarado, J., Cipelletti, L., H. Koenderink, G. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).
  16. Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
  17. Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).
  18. Malik-Garbi, M. et al. Scaling behaviour in steady-state contracting actomyosin networks. Nature Physics. 15 (5), 509-516 (2019).
  19. Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (5), e2115895119 (2022).
  20. Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., Nédélec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e714 (2018).
  21. Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).
  22. Giavazzi, F., Brogioli, D., Trappe, V., Bellini, T., Cerbino, R. Scattering information obtained by optical microscopy: differential dynamic microscopy and beyond. Physical Review E. 80 (3), 031403 (2009).
  23. Giavazzi, F., Cerbino, R. Digital Fourier microscopy for soft matter dynamics. Journal of Optics. 16 (8), 083001 (2014).
  24. He, K., Spannuth, M., Conrad, J. C., Krishnamoorti, R. Diffusive dynamics of nanoparticles in aqueous dispersions. Soft Matter. 8 (47), 11933-11938 (2012).
  25. Lu, P. J. et al. Characterizing concentrated, multiply scattering, and actively driven fluorescent systems with confocal differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 108 (21), 218103 (2012).
  26. Giavazzi, F. et al. Viscoelasticity of nematic liquid crystals at a glance. Soft Matter. 10 (22), 3938-3949 (2014).
  27. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Dark-field differential dynamic microscopy. Soft Matter. 12 (8), 2440-2452 (2016).
  28. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. Light-sheet microscopy with digital Fourier analysis measures transport properties over large field-of-view. Optics Express. 24 (18), 20881-20894 (2016).
  29. Richards, J. A., Martinez, V. A., Arlt, J. Particle sizing for flowing colloidal suspensions using flow-differential dynamic microscopy. Soft Matter. 17 (14), 3945-3953 (2021).
  30. Ferri, F. et al. Kinetics of colloidal fractal aggregation by differential dynamic microscopy. The European Physical Journal Special Topics. 199 (1), 139-148 (2011).
  31. Lanfranco, R. et al. Adaptable DNA interactions regulate surface triggered self assembly. Nanoscale. 12 (36), 18616-18620 (2020).
  32. Cho, J. H., Cerbino, R., Bischofberger, I. Emergence of multiscale dynamics in colloidal gels. Physical Review Letters. 124 (8), 088005 (2020).
  33. Giavazzi, F., Trappe, V., Cerbino, R. Multiple dynamic regimes in a coarsening foam. Journal of Physics: Condensed Matter. 33 (2), 024002 (2020).
  34. He, K. et al. Diffusive dynamics of nanoparticles in arrays of nanoposts. ACS Nano. 7 (6), 5122-5130 (2013).
  35. Jacob, J. D. C., He, K., Retterer, S. T., Krishnamoorti, R., Conrad, J. C. Diffusive dynamics of nanoparticles in ultra-confined media. Soft Matter. 11 (38), 7515-7524 (2015).
  36. Sentjabrskaja, T. et al. Anomalous dynamics of intruders in a crowded environment of mobile obstacles. Nature Communications. 7, 11133 (2016).
  37. Hitimana, E., Roopnarine, B. K., Morozova, S. Diffusive dynamics of charged nanoparticles in convex lens-induced confinement. Soft Matter. 18 (4), 832-840 (2022).
  38. Wilson, L. G. et al. Differential dynamic microscopy of bacterial motility. Physical Review Letters. 106 (1), 018101 (2011).
  39. Martinez, V. A. et al. Differential dynamic microscopy: a high-throughput method for characterizing the motility of microorganisms. Biophysical Journal. 103 (8), 1637-1647 (2012).
  40. Germain, D., Leocmach, M., Gibaud, T. Differential dynamic microscopy to characterize Brownian motion and bacteria motility. American Journal of Physics. 84 (3), 202-210 (2016).
  41. Croze, O. A. et al. Helical and oscillatory microswimmer motility statistics from differential dynamic microscopy. New Journal of Physics. 21 (6), 063012 (2019).
  42. Safari, M. S., Vorontsova, M. A., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of weakly scattering and polydisperse protein-rich clusters. Physical Review E. 92 (4), 042712 (2015).
  43. Wang, J., McGorty, R. Measuring capillary wave dynamics using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 15 (37), 7412-7419 (2019).
  44. Cerbino, R., Giavazzi, F., Helgeson, M. E. Differential dynamic microscopy for the characterization of polymer systems. Journal of Polymer Science. 60 (7), 1079-1089 (2021).
  45. Cerbino, R., Cicuta, P. Perspective: differential dynamic microscopy extracts multi-scale activity in complex fluids and biological systems. The Journal of Chemical Physics. 147 (11), 110901 (2017).
  46. Drechsler, M., Giavazzi, F., Cerbino, R., Palacios, I. M. Active diffusion and advection in Drosophila oocytes result from the interplay of actin and microtubules. Nature Communications. 8 (1), 1-11 (2017).
  47. Burla, F., Sentjabrskaja, T., Pletikapic, G., Beugen, J. v., H. Koenderink, G. Particle diffusion in extracellular hydrogels. Soft Matter. 16 (5), 1366-1376 (2020).
  48. Regan, K., Wulstein, D., Rasmussen, H., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. M. Bridging the spatiotemporal scales of macromolecular transport in crowded biomimetic systems. Soft Matter. 15 (6), 1200-1209 (2019).
  49. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).
  50. Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).
  51. Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv:2112.11260 .(2021).
  52. Chen, X. et al. Coaxial differential dynamic microscopy for measurement of Brownian motion in weak optical field. Optics Express. 26 (24), 32083-32090 (2018).
  53. Reufer, M., Martinez, V. A., Schurtenberger, P., Poon, W. C. K. Differential dynamic microscopy for anisotropic colloidal dynamics. Langmuir. 28 (10), 4618-4624 (2012).
  54. Giavazzi, F., Haro-Pérez, C., Cerbino, R. Simultaneous characterization of rotational and translational diffusion of optically anisotropic particles by optical microscopy. Journal of Physics: Condensed Matter. 28 (19), 195201 (2016).
  55. Cerbino, R., Piotti, D., Buscaglia, M., Giavazzi, F. Dark field differential dynamic microscopy enables accurate characterization of the roto-translational dynamics of bacteria and colloidal clusters. Journal of Physics: Condensed Matter. 30 (2), 025901 (2017).
  56. Safari, M. S., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of bidisperse colloidal suspensions. npj Microgravity. 3 (1), 21 (2017).
  57. Giavazzi, F., Pal, A., Cerbino, R. Probing roto-translational diffusion of small anisotropic colloidal particles with a bright-field microscope. The European Physical Journal E. 44 (4), 61 (2021).
  58. Schwarz-Linek, J. et al. Escherichia coli as a model active colloid: a practical introduction. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 137, 2-16 (2016).
  59. Kurzthaler, C. et al. Probing the spatiotemporal dynamics of catalytic Janus particles with single-particle tracking and differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
  60. Mandal, S., Kurzthaler, C., Franosch, T., Löwen, H. Crowding-enhanced diffusion: an exact theory for highly entangled self-propelled stiff filaments. Physical Review Letters. 125 (13), 138002 (2020).
  61. Norouzisadeh, M., Chraga, M., Cerchiari, G., Croccolo, F. The modern structurator: increased performance for calculating the structure function. The European Physical Journal E. 44 (12), 146 (2021).
  62. Gu, M., Luo, Y., He, Y., Helgeson, M. E., Valentine, M. T. Uncertainty quantification and estimation in differential dynamic microscopy. Physical Review E. 104 (3), 034610 (2021).
  63. Hoyer, S., Hamman, J. xarray: N-D labeled arrays and datasets in Python. Journal of Open Research Software. 5 (1), 10 (2017).
  64. Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. Stiffening and inelastic fluidization in vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 15 (36), 7127-7136 (2019).
  65. Guo, M. et al. The role of vimentin intermediate filaments in cortical and cytoplasmic mechanics. Biophysical Journal. 105 (7), 1562-1568 (2013).
  66. Lavenus, S. B., Tudor, S. M., Ullo, M. F., Vosatka, K. W., Logue, J. S. A flexible network of vimentin intermediate filaments promotes migration of amoeboid cancer cells through confined environments. Journal of Biological Chemistry. 295 (19), 6700-6709 (2020).
  67. Patteson, A. E. et al. Loss of vimentin enhances cell motility through small confining spaces. Small. 15 (50), 1903180 (2019).
  68. Lin, Y.-C. et al. Origins of elasticity in intermediate filament networks. Physical Review Letters. 104 (5), 058101 (2010).
  69. Pawelzyk, P., Mücke, N., Herrmann, H., Willenbacher, N. Attractive interactions among intermediate filaments determine network mechanics in vitro. PLOS ONE. 9 (4), e93194 (2014).
  70. Schepers, A. V. et al. Multiscale mechanics and temporal evolution of vimentin intermediate filament networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (27), e2102026118 (2021).
  71. Wu, H. et al. Effect of divalent cations on the structure and mechanics of vimentin intermediate filaments. Biophysical Journal. 119 (1), 55-64 (2020).
  72. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  73. Giavazzi, F., Malinverno, C., Scita, G., Cerbino, R. Tracking-free determination of single-cell displacements and division rates in confluent monolayers. Frontiers in Physics. 6, 120 (2018).
  74. Cho, J. H. Multiscale Probing of Colloidal Gelation Dynamics., Massachusetts Institute of Technology (2018).
  75. Krall, A. H., Weitz, D. A. Internal dynamics and elasticity of fractal colloidal gels. Physical Review Letters. 80 (4), 778-781 (1998).
  76. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Probe microrheology without particle tracking by differential dynamic microscopy. Rheologica Acta. 56 (11), 863-869 (2017).
  77. Edera, P., Bergamini, D., Trappe, V., Giavazzi, F., Cerbino, R. Differential dynamic microscopy microrheology of soft materials: a tracking-free determination of the frequency-dependent loss and storage moduli. Physical Review Materials. 1 (7), 073804 (2017).
  78. Wang, B., Kuo, J., Bae, S. C., Granick, S. When Brownian diffusion is not Gaussian. Nature Materials. 11 (6), 481-485 (2012).
  79. soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0. Zenodo (2021).
  80. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
  81. Nixon-Luke, R., Arlt, J., Poon, W. C. K., Bryant, G., Martinez, V. A. Probing the dynamics of turbid colloidal suspensions using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 18 (9), 1856-1867 (2022).

Tags

Biyomühendislik Sayı 184
Diferansiyel Dinamik Mikroskopi Kullanarak Sitoiskelet Dinamiğinin Ölçülmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G.,… More

Verwei, H. N., Lee, G., Leech, G., Petitjean, I. I., Koenderink, G. H., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. J. Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63931, doi:10.3791/63931 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter