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Bioengineering

Quantification de la dynamique du cytosquelette à l’aide de la microscopie dynamique différentielle

Published: June 15, 2022 doi: 10.3791/63931
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 2, 2
1Cell Biology, Neurobiology and Biophysics, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 2Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

Summary

La microscopie dynamique différentielle (DDM) combine les caractéristiques de la diffusion dynamique de la lumière et de la microscopie. Ici, le processus d’utilisation du DDM pour caractériser les réseaux de cytosquelettes reconstitués en quantifiant la dynamique sous-diffusive et en cage des particules dans les réseaux de vimentine et le mouvement balistique des composites actifs actine-microtubules entraînés par la myosine est présenté.

Abstract

Les cellules peuvent ramper, s’auto-guérir et régler leur raideur en raison de leur cytosquelette remarquablement dynamique. En tant que tel, la reconstitution de réseaux de biopolymères cytosquelettiques peut conduire à une foule de matériaux actifs et adaptables. Cependant, l’ingénierie de tels matériaux avec des propriétés précisément réglées nécessite de mesurer comment la dynamique dépend de la composition du réseau et des méthodes de synthèse. La quantification de cette dynamique est remise en question par les variations dans le temps, l’espace et l’espace de formulation des réseaux composites. Le protocole décrit ici comment la technique d’analyse de Fourier, la microscopie dynamique différentielle (DDM), peut quantifier la dynamique des réseaux de biopolymères et est particulièrement bien adaptée aux études des réseaux de cytosquelettes. DDM travaille sur des séquences temporelles d’images acquises à l’aide d’une gamme de modalités de microscopie, y compris l’imagerie confocale à balayage laser, la fluorescence à grand champ et l’imagerie en champ clair. À partir de telles séquences d’images, on peut extraire des temps de décorrélation caractéristiques des fluctuations de densité sur une gamme de vecteurs d’onde. Un package Python open source convivial pour effectuer une analyse DDM est également développé. Avec ce paquet, on peut mesurer la dynamique des composants marqués du cytosquelette ou des particules traceuses incorporées, comme démontré ici avec les données des réseaux de filaments intermédiaires (vimentine) et des réseaux actifs actine-microtubules. Les utilisateurs n’ayant aucune expérience préalable de la programmation ou du traitement d’images seront en mesure d’effectuer DDM à l’aide de ce progiciel et de la documentation associée.

Introduction

Le cytosquelette est un réseau de filaments protéiques qui s’étend à travers le cytoplasme des cellules eucaryotes, reliant la surface cellulaire au noyau. Il possède des propriétés matérielles uniques, offrant une protection mécanique contre les charges mécaniques importantes et répétées, tout en entraînant des changements dynamiques de forme de cellule1. Les réseaux de cytosquelettes reconstitués peuvent donner lieu à une gamme de comportements dynamiques intéressants, allant de la mise en cage de particules incorporées au mouvement balistique entraîné par des moteurs moléculaires 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Les méthodes d’analyse de la dynamique de ces réseaux comprennent le suivi du mouvement des microsphères traceuses intégrées 6,7,12,13,14, l’analyse d’images pour suivre la taille des amas denses en protéines au fil du temps 8, la diffusion dynamique de la lumière15, la vélocimétrie d’image de particules 4,16,17,18,19 , calcul de la densité spectrale de puissance des images au fil du temps19 et analyse kymographique20. Au fur et à mesure que de plus en plus d’études sur les réseaux de cytosquelettes reconstitués sont menées, que ce soit pour comprendre la mécanique cellulaire ou la matière active, des méthodes robustes, impartiales et reproductibles pour caractériser la dynamique sont de plus en plus nécessaires. La microscopie dynamique différentielle (DDM)21,22, une technique relativement nouvelle qui a été utilisée pour étudier la dynamique du cytosquelette, est l’une de ces techniques qui quantifie efficacement la dynamique avec peu de paramètres définis par l’utilisateur. Avec le progiciel décrit ici, les chercheurs ayant peu d’expérience en programmation ou en analyse d’images pourront tirer parti de DDM pour leur propre travail.

DDM est une technique d’analyse d’image permettant d’extraire la dynamique d’un échantillon. Comme le suivi des particules ou la vélocimétrie d’images de particules, DDM nécessite une série chronologique d’images (souvent des milliers d’images), généralement enregistrées au microscope. Contrairement au suivi des particules, les caractéristiques individuelles ou les billes traceuses n’ont pas besoin d’être localisées (ni même localisables) dans l’image. Contrairement au suivi des particules et à la vélocimétrie d’image des particules, on récupère la dynamique d’ensemble avec DDM avec relativement peu de paramètres spécifiés par l’utilisateur. Avec DDM, les images sont analysées dans l’espace de Fourier pour déterminer le temps de désintégration des fluctuations de densité sur une gamme de nombres d’ondes, q, où q = 2πu, et u est la magnitude des fréquences spatiales, Equation004. On obtient des informations de type diffusion mais avec des images de l’espace réel acquises au microscope 21,22,23. Par conséquent, on peut tirer parti des différentes méthodes de microscopie génératrices de contraste, telles que la fluorescence à grand champ22,24, la fluorescence confocale25, la polarisation26, le champ sombre27 ou la fluorescence à feuille de lumière28. En outre, les images utilisées pour l’analyse DDM peuvent être utilisées pour le suivi des particules ou la vélocimétrie d’images de particules afin de fournir des informations complémentaires.

Cette combinaison de caractéristiques de diffusion dynamique de la lumière et de microscopie optique fait du DDM une technique puissante et polyvalente. Depuis sa première description par Cerbino et Trappe en 200821, où il a été démontré que le DDM mesure la diffusion de particules colloïdales de 73 nm, le DDM a été utilisé pour mesurer les colloïdesen écoulement 29, l’agrégation colloïdale 30,31, la viscoélasticité des cristaux liquides nématiques26, la dynamique des gels colloïdaux32, les mousses grossissantes33, les nanoparticules dans des environnements confinés 34, 35,36,37, la motilité bactérienne 38,39,40,41, la diffusion d’amas de protéines faiblement diffusants 42, les ondes capillaires aux interfaces fluides43 et d’autres systèmes. Ceux qui recherchent une liste plus complète des publications utilisant DDM peuvent se référer à des articles de synthèse approfondis sur le sujet 22,23,44,45.

Le DDM a également été utilisé pour étudier la dynamique des réseaux biologiques. Drechsler et al. ont utilisé le DDM pour mesurer la dynamique de l’actine dans les ovocytes vivants de la drosophile 46. Burla et al. ont quantifié la dynamique des particules traceuses dans les réseaux de composites hyaluronane et hyaluronane-collagène47. Plusieurs utilisations du DDM pour étudier la dynamique des particules traceuses dans les réseaux de cytosquelettes reconstitués 9,10, le transport des molécules d’ADN dans de tels réseaux 48,49 et la dynamique des réseaux actifs reconstitués ont également été documentées 11,50,51. Un avantage du DDM dans la mesure de la dynamique dans de tels systèmes est que les particules ou molécules individuelles n’ont pas besoin d’être localisées et suivies. Ainsi, par exemple, la dynamique des molécules d’ADN dans des environnements surpeuplés peut être mesurée avec DDM malgré la difficulté de suivre ces molécules petites et non sphériques. De plus, avec la microscopie à fluorescence, on peut utiliser l’étiquetage multicolore pour mesurer sélectivement la dynamique des constituants individuels dans un composite complexe.

Pour effectuer DDM, une séquence d’images est prise au fil du temps, I(x,y,t). Pour un temps de latence donné, Δt, toutes les paires d’images séparées par ce temps de décalage (ou un sous-ensemble de) sont trouvées. La transformée de Fourier au carré de la différence de chaque paire,

Equation007

est calculé et moyenné ensemble. Cette quantité, Equation008, est moyenne radiale, à condition que la dynamique soit isotrope. Cela donne la matrice DDM (également appelée fonction de structure d’image), Equation009. Ce processus est illustré graphiquement à la figure 1. Pour déterminer la dynamique de l’échantillon à partir de cette matrice DDM, la matrice DDM est supposée prendre la forme

Equation010

où A est l’amplitude, qui dépend des détails du microscope et de la structure de l’échantillon, B est l’arrière-plan, qui dépend du bruit dans les images, et f (q, Δt) est la fonction de diffusion intermédiaire (ISF), qui contient des informations sur la dynamique21,22. Dans des cas simples,

Equation014

où τ est un temps de désintégration ou de décorrélation caractéristique. Un tel FSI a été utilisé dans plusieurs études utilisant le DDM sur des systèmes ergodiques tels que les suspensions colloïdales diluées 21,24,27,37,40,52. Cependant, d’autres formes de l’ISF peuvent être utilisées pour modéliser divers types de dynamique. Par exemple, on peut utiliser une expansion de cumulant pour modéliser l’ISF pour les échantillons polydispersés comme suit :

Equation016

où μ est une mesure de la polydispersité42,53; si les fluctuations de densité se désintègrent par deux modes distincts, on peut utiliser un ISF comme

Equation01826, 54, 55, 56, 57;

d’autres FSI peuvent être utilisés pour nager des micro-organismes ou d’autres particules actives 38,39,40,41,58,59.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble de l’analyse DDM. À partir de la série chronologique d’images, la transformée de Fourier des différences d’image est calculée pour calculer la matrice DDM. La matrice DDM peut être adaptée à un modèle pour déterminer l’échelle de temps des fluctuations de densité sur une plage de valeurs q. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ici, l’utilisation d’un progiciel d’analyse DDM développé en Python, PyDDM, est décrite. Ce progiciel s’appuie sur le travail effectué par nos laboratoires de recherche et d’autres études publiées au cours des dernières années. Les principales motivations pour la création de ce progiciel comprennent la nécessité de (1) garder une trace et de stocker les métadonnées et les paramètres utilisés dans l’analyse; (2) une documentation complète avec des exemples détaillés d’analyse du début à la fin; et (3) un moyen facile d’utiliser différents modèles mathématiques (ou d’en créer de nouveaux) pour ajuster les données (par exemple, l’ajout de modèles ISF, tels que ceux récemment développés pour les filaments actifs60, serait simple). D’autres progiciels pour l’analyse DDM existent également, bien que tous ne soient pas bien documentés et écrits dans un langage de programmation open source. Par exemple, il existe du code C++ avec calcul sur GPU (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, du code C++ qui utilise des transformations de Fourier dans le temps pour accélérer les calculs (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, des versions MATLAB et Python (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, du code MATLAB (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 et du code MATLAB avec quantification de l’incertitude ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Comme ce package PyDDM est bien documenté et offre beaucoup de flexibilité dans la façon dont la matrice DDM est calculée et analysée, il peut, espérons-le, être utile aux chercheurs qui cherchent à mettre en œuvre DDM indépendamment de leur expérience en programmation ou en analyse d’images.

Le protocole montre comment ce progiciel peut être utilisé pour quantifier la dynamique des réseaux de cytosquelettes reconstitués in vitro . Cela se fait en utilisant deux ensembles distincts de données d’imagerie: (1) des images de particules traceuses submicroniques intégrées dans un réseau de vimentine prises avec la microscopie à fond clair et (2) des images de filaments d’actine et de microtubules marqués par fluorescence dans un réseau composite intriqué avec une activité induite par la myosine prises avec la microscopie confocale à balayage laser. Les analyses de ces deux ensembles de données mettent en évidence les points forts notables du DDM, y compris sa capacité à analyser des images prises avec une variété de modalités d’imagerie (p. ex., fluorescence en champ clair ou confocale), à extraire la dynamique des traceurs intégrés ou des filaments marqués, et à quantifier une variété de dynamiques (p. ex., subdiffusives et contraintes ou balistiques).

Protocol

REMARQUE : Un fichier Jupyter Notebook contenant le code correspondant à chaque étape du protocole suivant se trouve sur le référentiel GitHub suivant, https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. Un fichier PDF de ce fichier est inclus dans le fichier supplémentaire 1. En outre, une procédure pas à pas du code et de la documentation de chaque fonction et classe peut être trouvée sur le site Web, https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.

1. Installation du logiciel

  1. Pour suivre l’exemple des fichiers d’analyse DDM, installez Jupyter Notebook pour exécuter le code. Installez d’autres paquets Python courants requis, y compris NumPy et Matplotlib. Ces paquets sont tous livrés avec la distribution Anaconda (voir https://www.anaconda.com/products/individual).
  2. Installez le paquet Python xarray63. Ce package est nécessaire pour organiser et stocker les métadonnées et les paramètres d’analyse. Si vous utilisez la distribution Anaconda, installez xarray (avec ses dépendances recommandées) à l’aide de la commande :
    conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 goulot d’étranglement
  3. Installez le package PyYAML à l’aide de la commande :
    conda install -c anaconda yaml
    Ce package est nécessaire pour lire les métadonnées sur les images à analyser et les paramètres définis par l’utilisateur pour l’analyse et l’ajustement.
  4. Installez le package PyDDM, en le téléchargeant depuis le référentiel GitHub ou en utilisant la commande git :
    https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git de clone git

2. Planification des séances d’imagerie

  1. Choisissez la modalité d’imagerie et les paramètres optiques optimaux disponibles. Comme mentionné, DDM peut être utilisé avec un certain nombre de méthodes de microscopie.
  2. Pour vous aider à planifier l’objectif approprié et la taille de l’image à utiliser, déterminez la plage de numéros d’onde, q, qui sera sondée en fonction de la taille en pixels et de la taille totale de l’image. Confirmez que le choix du grossissement et du champ de vision sont optimaux pour l’expérience, sur la base de ces calculs. Pour les images analysées ici, un objectif 60x 1,4 NA et une taille d’image de 256 x 256 pixels avec une taille de pixel de 0,83 μm ont été utilisés pour le réseau composite actif actine-microtubule. Pour les images de perles intégrées dans un réseau vimentin, un objectif 100x 1,4 NA et une taille d’image de 512 x 512 pixels avec une taille de pixel de 0,13 μm ont été utilisés.
    REMARQUE: Le minimum q est défini par 2π/NΔx, où la taille de l’image (supposée carrée) est N × N pixels avec une taille de pixel de Δx. Le maximum q est le minimum de π/Δx et 2π NA/λ, où NA est l’ouverture numérique de l’objectif d’imagerie, et λ est la longueur d’onde de la lumière (pour l’imagerie en fond clair, on peut remplacer NA par (objectif NA +condensateur NA)/2).
  3. Ensuite, considérez la gamme de délais à étudier. En règle générale, l’analyse DDM est effectuée sur des séquences d’au moins 1000 images.
    1. Pour déterminer la fréquence d’images appropriée, tenez compte du temps prévu pour que les entités de l’échantillon se déplacent d’une distance de l’ordre de l’échelle de longueur minimale résolvable (correspondant au q maximum).
    2. En considérant la limite supérieure de la plage d’échelles de temps sondées, reconnaissez que, typiquement, le spectre de puissance de centaines de différences d’image d’un temps de latence donné Δt est moyenné ensemble pour fournir des statistiques suffisantes pour réduire le bruit. Par conséquent, acquérir des séquences d’images plus longues que l’échelle de temps maximale sondée.
      REMARQUE: Si un coefficient de diffusion attendu, D, ou une vitesse, v, est connu, alors on peut estimer les temps de désintégration caractéristiques attendus en utilisant τ = 1/Dq2 ou τ = 1/vq avec la plage de q, qui a été déterminée en fonction du champ de vision et de la taille des pixels. La plage de valeurs τ attendues sur la plage q accessible peut aider à guider le choix de la fréquence d’images et le nombre d’images à acquérir.

3. Préparation des échantillons et acquisition d’images

REMARQUE : Pour plus de détails sur les paramètres de préparation des échantillons et d’imagerie utilisés pour les données présentées dans la section des résultats représentatifs, voir les publications précédentes des auteurs 11,51,64 et le dossier supplémentaire 2.

  1. Sur la base de la prise en compte des échelles de temps et de longueur à sonder, acquérir des séquences d’images de, idéalement, plus de 1000 images.
    REMARQUE: Le code analysera les images carrées ou les régions carrées d’intérêt dans l’image, alors ajustez la taille du cadre en conséquence.
  2. Enregistrez les séquences d’images sous la forme d’une pile TIFF tridimensionnelle en niveaux de gris. Alternativement, le format utilisé par les systèmes Nikon Instruments, le format ND2, peut être lu par le package installé. Si les images sont enregistrées dans un format différent, utilisez ImageJ ou un autre programme de traitement d’imagerie pour convertir les images en une pile TIFF.
    Remarque : Si vous utilisez des fichiers ND2, le package nd2reader de https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader doit être installé.

4. Configuration des paramètres

  1. Effectuez une copie du fichier de paramètres example_parameter_file.yml fourni dans le référentiel de code PyDDM sous le dossier examples. Ouvrez ce fichier YAML avec un éditeur de texte comme NotePad ++ ou l’éditeur de texte dans JupyterLab. Voir le fichier supplémentaire 2 pour un exemple de fichier de paramètres YAML utilisé dans l’analyse des données présentées dans la section des résultats représentatifs.
  2. Dans le fichier YAML copié, indiquez le répertoire de données et le nom de fichier correspondant à la séquence d’images à analyser. Sous la section des métadonnées, indiquez la taille en pixels et la fréquence d’images.
  3. Dans la section Analysis_parameters, fournissez des détails sur la façon dont la matrice DDM doit être calculée. Certains paramètres ici sont facultatifs.
    1. Au minimum, fournissez des valeurs pour les paramètres number_lag_times et last_lag_time. Ceux-ci correspondent au nombre de temps de latence différents pour lesquels calculer la matrice DDM et au temps de décalage le plus long (en images) à utiliser, respectivement. Pour les données des billes traceuses dans les réseaux de vimentine utilisées ici, les paramètres number_lag_times et last_lag_time étaient respectivement de 60 et 1000. Le code calculera la matrice DDM pour les temps de décalage de 1 image (ou d’un autre temps de décalage minimum si le paramètre facultatif first_lag_time est spécifié) à la last_lag_time avec espacement logarithmique.
      REMARQUE: Si M images étaient acquises, on pourrait calculer la matrice DDM pour un temps de latence aussi grand que M-1. Cependant, avec de mauvaises statistiques à un temps de latence aussi important, les données sont susceptibles d’être bruyantes. Le temps de latence le plus long pour calculer la matrice DDM dépendra des détails des données, mais nous vous suggérons d’essayer environ un tiers de la durée totale de la série d’images.
  4. Fournissez des détails sur la façon dont la matrice DDM ou la fonction de diffusion intermédiaire (ISF) doit être insérée dans la section Fitting_parameters. Donnez le nom du modèle sous le paramètre model. Indiquez la supposition initiale, la limite inférieure et la limite supérieure pour chacun des paramètres d’ajustement dans le modèle choisi.
    REMARQUE: Pour afficher une liste des modèles de raccord possibles, exécutez la fonction print_fitting_models. Les modèles peuvent également être trouvés dans la documentation en ligne sur le site Web de PyDDM.

5. Calcul de la matrice DDM

  1. Initialisez une instance de la classe DDM_Analysis. Pour ce faire, fournissez les métadonnées et les paramètres d’analyse décrits ci-dessus en transmettant le nom de fichier, avec le chemin d’accès complet inclus, du fichier YAML à DDM_Analysis. Vous pouvez également transmettre les métadonnées et les paramètres en tant que structure de données de dictionnaire Python.
  2. Exécutez la fonction calculate_DDM_matrix pour calculer la matrice DDM. Ce calcul peut prendre plusieurs minutes ou plus en fonction de la taille de l’image et du nombre de temps de latence. Reportez-vous à la figure 2 pour connaître les durées d’exécution typiques.
  3. Inspectez les données renvoyées, qui se trouveront dans une structure de données du package xarray appelé dataset. Cette structure de données est stockée sous l’attribut ddm_dataset.
    REMARQUE : Non seulement la matrice DDM, mais aussi les variables et métadonnées associées seront stockées dans cette structure de données. Il sera également enregistré sur le disque dans un format NetCDF (Network Common Data Form).
  4. Inspectez les tracés et les figures, qui seront générés et affichés. Ces chiffres sont également enregistrés sous forme de fichier PDF dans le répertoire de données.
    1. Voyez que l’un des tracés générés montre le module carré moyenné d’ensemble des images transformées de Fourier, Equation031 en fonction de q. Par défaut, le code l’utilise pour estimer le paramètre d’arrière-plan B. Estimez le contexte Equation031 en supposant que, dans la limite du grand q, il se rapprochera de B/2, où B est l’arrière-plan.
    2. Si Equation031 n’atteint pas un plateau à l’échelle q, utilisez une autre méthode pour estimer B. Pour ce faire, définissez le paramètre background_method dans le fichier YAML ou en tant qu’argument de mot-clé facultatif sur la fonction calculate_DDM_matrix. Plus de détails sur les méthodes d’estimation de B sont présentés dans la section des résultats représentatifs.

Figure 2
Figure 2 : Temps de calcul pour le calcul de la matrice DDM. Dans (A) et (B) le temps de calcul de la matrice DDM, Equation009, est indiqué. Les données utilisées dans tous les cas sont un film de 5000 images avec une taille d’image de 512 x 512 pixels. La matrice DDM a été calculée pour 30 temps de décalage, espacés logarithmiquement entre 1 image (0,01 s) et 1000 images (10 s). Le code a été exécuté sur un ordinateur de bureau Intel i7-10700 2,90 GHz avec 32 Go de RAM. Dans (A), l’effet de la variation du nombre de différences d’image utilisées dans le calcul de la matrice DDM pour chaque temps de latence est montré. Pour cela, les images sont regroupées pour obtenir une taille d’image de 256 x 256. Pour chaque temps de décalage Δt, les images séparées par ce Δt sont soustraites et la matrice résultante est transformée de Fourier. Pour un Δt donné, toutes les paires d’images séparées par ce Δt peuvent être utilisées (en bleu), seules les paires d’images qui ne se chevauchent pas peuvent être utilisées (par exemple, les images 1 et 10, 10 et 19, etc.; en brun), ou 300 paires d’images ou moins peuvent être utilisées pour chaque Δt. Dans (B), l’effet de la modification de la taille de l’image sur le temps de calcul est affiché. Les images ont été regroupées en regroupant 2 x 2, 4 x 4 ou 8 x 8 pixels, ce qui a donné des tailles d’image de 256 x 256, 128 x 128 ou 64 x 64, respectivement. Pour chacun, environ 300 paires d’images sont utilisées dans le calcul de la matrice DDM pour chaque Δt. (C) À partir de la matrice DDM, la fonction de diffusion intermédiaire (ISF) peut être extraite. Ceci est indiqué pour les trois cas en (A). Les points de données bleus (sans décalage) correspondent à l’ISF lorsque le nombre maximal de paires d’images est utilisé pour chaque Δt ; les points de données bruns (avec un décalage de 0,1) correspondent à l’ISF lorsque des paires d’images qui ne se chevauchent pas sont utilisées pour chaque Δt; et les points de données roses (avec un décalage de 0,2) correspondent à l’ISF lorsqu’au plus 300 paires d’images sont utilisées pour chaque Δt. L’ISF trouvé en utilisant des paires d’images qui ne se chevauchent pas montre le bruit à long Δt. Dans ce cas, peu de paires d’images sont utilisées à Δt long (par exemple, pour Δt de 1000 images, seules 4 paires d’images sont utilisées). (D) En ajustant l’ISF à une fonction exponentielle, le temps de désintégration caractéristique, τ, pour chaque nombre d’onde, q, est déterminé. En rose, les résultats sont affichés après avoir binning les images originales par 2 x 2, ce qui donne une taille d’image de 256 x 256. En gris, les résultats sont affichés après avoir binning par 8 x 8, ce qui donne une taille d’image de 64 x 64. En binning les données, les informations sur la dynamique à des nombres d’onde plus élevés sont perdues, mais le calcul de la matrice DDM pour les images 64 x 64 est environ 16 fois plus rapide que pour les images 256 x 256. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Montage de la matrice DDM ou de l’ISF

  1. Initialisez une instance de la classe DDM_Fit. Pour ce faire, transmettez à DDM_Fit le nom de fichier du fichier YAML contenant les métadonnées de l’image et les paramètres d’ajustement.
  2. Décidez quel modèle pour la matrice DDM ou l’ISF utiliser pour ajuster les données. Répertoriez les modèles disponibles en exécutant la fonction print_fitting_models. Spécifiez le modèle à utiliser dans le fichier de paramètres YAML ou à l’aide de la fonction reload_fit_model_by_name.
  3. Définissez les estimations et les limites initiales pour chaque paramètre du modèle choisi dans le fichier de paramètres YAML fourni. Pour modifier la supposition initiale d’un paramètre, utilisez la fonction set_parameter_initial_guess. Définissez les limites des paramètres avec la fonction set_parameter_bounds. Par exemple, comme on le voit dans le fichier supplémentaire 2, pour les données des billes traceuses dans le réseau vimentin, la supposition initiale pour le temps de désintégration était de 1 s et les limites de ce paramètre étaient de 0,01 s et 2000 s.
  4. Exécutez l’ajustement avec l’ajustement de fonction. Attribuez une variable à la sortie de cette fonction pour accéder facilement aux résultats.
    Remarque : Cette fonction peut prendre de nombreux arguments facultatifs. Consultez la documentation du code et les exemples fournis pour obtenir une liste de ces arguments et quand envisager de les définir sur des valeurs autres que celles par défaut.

7. Interprétation des résultats d’ajustement

  1. Générez des tracés pour inspecter les ajustements et la q-dépendance des paramètres d’ajustement avec la fonction fit_report.
    REMARQUE: Cette fonction générera une série de tracés, qui seront également enregistrés au format PDF. Les arguments facultatifs de cette fonction peuvent être utilisés pour modifier les tracés produits.
  2. Parmi les graphiques générés, il y aura une figure avec 2 x 2 sous-tracés montrant la matrice DDM ou ISF (selon le modèle d’ajustement choisi) à quatre valeurs q (spécifiées comme argument facultatif pour fit_report), ainsi que la matrice DDM calculée ou ISF en utilisant le modèle et les paramètres les mieux ajustés. Pour tracer la matrice DDM ou ISF avec le meilleur ajustement de manière interactive, utilisez la classe Browse_DDM_Fits comme indiqué dans les exemples fournis lorsque l’environnement Jupyter Notebook est utilisé.
  3. À partir du tracé du temps de désintégration caractéristique τ par rapport au nombre d’onde q, déterminez si la dynamique suit un mouvement diffusif, subdiffusif, balistique ou un autre type de mouvement. Cela peut être fait en recherchant la relation de loi de puissance entre τ et q.
    REMARQUE: Sur le diagramme log-log de τ vs q généré par la fonction fit_report, trois lignes seront affichées, correspondant à la loi de puissance s’adapte sur une plage spécifiée de valeurs q . La ligne noire continue correspond à l’ajustement τ vs. q à une loi de puissance, τ = 1 / Kqβ, où K et β sont des paramètres libres. La ligne pointillée en orange correspond à l’ajustement à la diffusion simple, τ = 1 / Dq2, où D est un coefficient de diffusion. La ligne pointillée en bleu correspond à l’ajustement à τ = 1 / vq, où v est une vitesse.

8. Enregistrement des résultats

  1. Les résultats de l’ajustement seront enregistrés dans un jeu de données xarray. Utilisez la fonction xarray to_netcdf ou le module de cornichon intégré de Python pour enregistrer cette structure de données sur le disque. Utilisez la fonction xarray open_dataset pour charger ces fichiers netCDF.
  2. Utilisez la fonction save_fit_results_to_excel pour enregistrer les résultats d’ajustement, ainsi que les données, dans un fichier de feuille de calcul.

Representative Results

Ici, nous montrons des exemples de l’analyse effectuée avec PyDDM à partir de deux ensembles d’expériences différents. Dans une série d’expériences, des billes traceuses submicroniques ont été intégrées dans des réseaux constitués de la protéine de filament intermédiaire vimentine et imagées à l’aide d’une lentille d’objectif 100x en mode champ clair à 100 images / s (Figure 3A). La vimentine est exprimée dans les cellules mésenchymateuses et est un déterminant clé des propriétés mécaniques du cytoplasme65 et de la stabilité mécanique du noyau dans les cellules effectuant une migration confinée 66,67. Jusqu’à présent, les réseaux de vimentine reconstitués ont été étudiés principalement par la rhéologie macroscopique 64,68,69, alors que la dynamique a reçu relativement peu d’attention 13,70,71. Des détails supplémentaires sur ces expériences se trouvent dans le dossier supplémentaire 2. Dans l’autre série d’expériences, des réseaux actifs de cytosquelettes ont été préparés avec de l’actine, des microtubules et de la myosine. Des étiquettes fluorescentes spectralement distinctes ont permis d’imager les filaments d’actine et de microtubules à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser bicolore à l’aide d’une lentille d’objectif 60x à 2,78 images/s (Figure 3B,C). Les filaments d’actine et de microtubules sont tous deux des moteurs importants des changements dynamiques de la forme cellulaire, leurs actions étant coordonnées par des interactions mécaniques et biochimiques72. Des détails supplémentaires sur ces expériences peuvent être trouvés dans11. Les images individuelles des séquences d’images prises dans ces expériences sont illustrées à la figure 3.

Figure 3
Figure 3 : Images de la série chronologique analysées. (A) Image en champ lumineux de perles de 0,6 μm dans un réseau de vimentine. (B,C) Image des microtubules (B) et de l’actine (C) dans un composite actif actine-microtubule prise avec un objectif 60x sur un microscope confocal à balayage laser, en utilisant une lumière d’excitation de 561 nm pour l’imagerie des microtubules et une lumière d’excitation de 488 nm pour l’imagerie de l’actine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour les images de perles traceuses dans les réseaux vimentin, des films de 5000 images d’une taille de 512 x 512 pixels à 100 images / s ont été enregistrés. À partir de ceux-ci, la matrice DDM a été calculée à 60 temps de décalage espacés logarithmiquement entre 1 et 1000 images, soit 0,01 s et 10 s. Pour estimer l’arrière-plan, B, la moyenne des images transformées de Fourier au carré, Equation031, a été calculée et définie sur Equation03755,73. On a supposé que, sur les 10 % les plus grands des valeurs q, cette quantité est égale à B/2 et que B est indépendante de q. Il s’agit de la méthode par défaut du package pour estimer B, mais d’autres méthodes sont possibles en définissant le paramètre background_method sur une valeur différente.

Avec les paramètres A(q) et B déterminés à partir de Equation031, on peut extraire la fonction de diffusion intermédiaire (ISF) de la matrice DDM. Des exemples de FIA sont illustrés à la figure 4. La figure 4A montre l’ISF à partir d’images de billes de 0,6 μm de diamètre encastrées dans un réseau avec une concentration de vimentine de 19 μM. La figure 4B montre l’ISF pour le même type de billes dans un réseau avec une concentration de vimentine de 34 μM. Fait intéressant, dans aucun des deux cas, l’ISF ne s’est désintégré à zéro. Dans les temps de latence, l’ISF devrait approcher de zéro pour les systèmes ergodiques. C’est-à-dire que dans de tels systèmes, les fluctuations de densité doivent être complètement décorrélées sur de grands temps de latence. Le fait que l’ISF ici ne se soit pas désintégré à zéro pourrait avoir résulté d’estimations inexactes de A (q) et B, qui ont été utilisées pour trouver l’ISF à partir de la matrice DDM calculée. Notamment, la méthode employée ici peut surestimer B dans certains scénarios62. Cependant, il est plus probable que la dynamique des perles traceuses soit vraiment non erratique car les perles ont une taille comparable à la taille du maillage du réseau et peuvent, par conséquent, devenir en cage. D’autres données ont corroboré la conclusion de non-urgence. À savoir, la taille des billes, 0,6 μm, était supérieure à la valeur moyenne calculée pour les maillages de 0,4 μm pour la concentration de 19 μM et de 0,3 μm pour la concentration de 34 μM. De plus, les résultats du suivi d’une seule particule de ces billes traceuses, qui sont montrés plus tard, ont également montré un mouvement confiné.

Figure 4
Figure 4 : Fonctions de diffusion intermédiaire à plusieurs nombres d’onde pour les réseaux vimentin. L’ISF est tracé en fonction du temps de latence pour q valeurs d’environ 1 à 9 μm-1. (A) L’ISF à partir d’images de billes de 0,6 μm dans un réseau de vimentine avec une concentration de vimentine de 19 μM. (B) L’ISF à partir d’images de billes de 0,6 μm dans un réseau de vimentine avec une concentration de vimentine de 34 μM. Le long plateau de temps de latence de l’ISF à une valeur bien supérieure à zéro indique une non-énergie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Étant donné que la dynamique est probablement non erratique, les FSI sont adaptés à la forme Equation039, où C est le facteur de non-énergie 32. Cette forme de l’ISF a été utilisée dans des études antérieures sur la dynamique non ergodique, comme celle des gels colloïdaux32,74 ou des particules traceuses dans les réseaux actine-microtubules 10. Les lignes noires pointillées de la figure 4 montrent les ajustements ainsi que les données. À partir de ces ajustements, on peut maintenant examiner la q-dépendance du temps de désintégration, τ, et du paramètre de non-énergie, C.

Figure 5
Figure 5 : Temps de désintégration par rapport au nombre d’onde pour les réseaux vimentin. De l’ajustement à l’ISF, le temps de désintégration τ est déterminé pour une plage de valeurs q. Pour plus de clarté, nous n’affichons pas la valeur de τ pour chaque q, mais juste un ensemble espacé logarithmiquement. En bleu (bronzage) se trouvent les données provenant d’images de billes de 0,6 μm dans les réseaux de vimentine avec une concentration de vimentine de 19 μM (34 μM). Les barres d’erreur représentent les écarts-types en τ sur plusieurs films (quatre films pour les données avec le réseau 19 μM [bleu] et cinq films pour les données avec le réseau 34 μM [tan]). Des lignes pointillées rouges marquent les limites estimées de notre résolution temporelle et spatiale, comme décrit dans les résultats. La ligne noire continue montre Equation044 la mise à l’échelle, ce qui indiquerait un mouvement diffusif. Aucun des deux ensembles de données ne suit cette mise à l’échelle. Au contraire, les perles du réseau de 19 μM montrent un mouvement subdiffusif (Equation010avec β > 2), et les perles du réseau de 34 μM montrent un mouvement confiné ou en cage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les temps de désintégration ont montré une grande quantité d’incertitude, à la fois aux extrêmes q faible et q élevé, comme le montre la figure 5. Les barres d’erreur sur ce graphique montrent l’écart-type entre quatre vidéos analysées pour le cas de concentration de vimentine inférieure ou cinq vidéos analysées pour la concentration plus élevée. Pour comprendre la source de la grande incertitude à ces extrêmes, considérez à la fois la résolution temporelle et spatiale. Les limites approximatives de la résolution sont indiquées par trois lignes pointillées rouges. Les deux lignes horizontales correspondent aux temps de latence minimaux et maximaux sondés. Compte tenu de la fréquence d’images de 100 images/s et du temps de latence maximal correspondant à 1000 images (20 % de la durée totale de la vidéo), la précision a été perdue lors de la mesure de la dynamique se produisant plus rapidement que 0,01 s ou plus lentement que 10 s. Aux valeurs q inférieures, les valeurs ajustées pour τ étaient supérieures à 10 s. Par conséquent, il faut s’attendre à de grandes incertitudes dans les temps de désintégration qui sont plus importants que le temps de latence maximal. À l’extrémité supérieure de la plage q, le temps de désintégration approchait le temps de latence minimum de 0,01 s, mais restait au-dessus. Plutôt que d’être limitée par la résolution temporelle, à ces valeurs q plus élevées, la résolution spatiale peut être le facteur limitant. Compte tenu de la taille des pixels de 0,13 μm, la plus grande valeur pour q était d’environ 24 μm-1. Cependant, la résolution limitée par diffraction ne permet pas nécessairement des mesures précises de la dynamique à ces hautes fréquences spatiales. L’approximation de la résolution Equation041 optique conduit à une limite de nombre d’onde supérieure d’environ 16 μm-1, compte tenu de l’ouverture numérique de l’objectif, NA, de 1,4 et de la longueur d’onde de la lumière, Equation042. Ceci est marqué par la ligne pointillée rouge verticale de la figure 5. En effet, les données étaient bruyantes à de grandes valeurs de q. Même avant cette limite supérieure approximative de q, une incertitude accrue dans τ a été observée, et cela pourrait être dû à une surestimation de qmax. Une résolution optique plus faible que prévu peut être due au fait qu’une lentille d’immersion dans l’huile a été utilisée pour imager au-delà du couvercle dans un échantillon aqueux ou parce que la lentille du condensateur était imparfaitement alignée.

Pour les billes de 0,6 μm incorporées dans le réseau moins concentré (vimentine de 19 μM), on peut observer à partir du diagramme logarithmique du temps de désintégration par rapport au nombre d’onde que le temps de désintégration diminuait avec le nombre d’onde d’une manière compatible avec une loi de puissance (Figure 5). Cependant, il ne semble pas suivre ce à quoi on pourrait s’attendre pour un mouvement diffusif normal, où Equation044. Au contraire, τ a diminué plus fortement avec l’augmentation de q. Ceci est révélateur d’un mouvement subdiffusif, qui se produit souvent pour les perles dans des environnements surpeuplés tels que ceux-ci. L’ajustement de τ(q) sur la plage de 1,4 μm-1 à 12,3 μm-1 à une loi de puissance de la forme τ = 1/Kqβ donne les paramètres de transport K = 0,0953 μmβ /s et β = 2,2. Pour ceux qui sont plus habitués à penser à la diffusion normale par rapport à la sous-diffusion en termes de déplacement moyen au carré (MSD) des particules traceuses en fonction du temps de latence (c’est-à-dire MSD = K' Δtα), il est utile de reconnaître que l’exposant d’échelle sous-diffusif dans l’équation MSD, α, équivaut à α = 2 / β. En d’autres termes, la valeur de β = 2,2 est cohérente avec un exposant d’échelle sous-diffusif dans l’équation MSD de α = 0,9. On définirait PyDDM pour qu’il s’adapte à τ(q) sur cette plage de valeurs q en spécifiant les indices du tableau de q avec le paramètre Good_q_range dans le fichier YAML ou en passant l’argument facultatif forced_qs à la fonction generate_fit_report. La plage de q de 1,4 μm-1 à 12,3 μm-1 correspondrait, pour les données ici, aux indices du tableau de q de 15 à 130.

Pour les billes de 0,6 μm dans le réseau plus concentré (34 μM), le temps de désintégration a montré peu de dépendance à q. Cela est probablement dû à la non-énergie des perles dans un réseau avec un maillage plus petit. Pour sonder la non-énergie dans ce système, le paramètre de non-énergie, C, doit être tracé en fonction de q, comme dans la figure 6. Pour les billes de 0,6 μm dans le réseau de vimentine de 19 μM, C ≈ 0,2 avec peu de dépendance à q (non montré). Cependant, pour le réseau avec une vimentine de 34 μM et pour un réseau avec une concentration encore plus élevée de 49 μM de vimentine, le log de C était proportionnel à q2 comme le montre la figure 6. Cette relation entre C et q est attendue pour le mouvement confiné. Pour les billes piégées dans les poches du réseau, on s’attend à ce que le TMS plafonne à des temps de latence suffisamment longs (c.-à-d. Equation055, où Equation056 est le TMS et δ2 est le TMS maximal). Étant donné que le FSI peut être exprimé en termes de MSD comme , et puisque Equation058le FSI non erratique va à C à des temps de latence longs (c’est-à-dire Equation059), la relation Equation060 est obtenue32,75. Par conséquent, on peut utiliser C(q) pour trouver δ2, ce qui a donné δ2 = 0,017 μm2 et 0,0032 μm2 pour les réseaux de vimentine de 34 et 49 μM, respectivement (correspondant à δ = 0,13 μm et 0,057 μm).

Figure 6
Figure 6 : Paramètre de non-énergie par rapport au nombre d’onde pour les réseaux vimentin. De l’ajustement à l’ISF, le paramètre de non-énergie C est déterminé pour une plage de valeurs q. Dans le bronzage (rouge) sont les données provenant d’images de billes de 0,6 μm dans les réseaux de vimentine avec une concentration de vimentine de 34 μM (49 μM). Les barres d’erreur représentent les écarts-types en τ sur plusieurs films (cinq films pour les données avec le réseau 34 μM [tan] et quatre films pour les données avec le réseau 49 μM [rouge]). L’axe des y a une mise à l’échelle logarithmique. On observe une q-dépendance de C qui suit Equation060, ce qui permet d’extraire le déplacement au carré moyen maximal, δ2. Les ajustements sont Equation060 affichés avec les lignes pleines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

On peut utiliser d’autres méthodes pour extraire la taille de confinement δ des données ainsi que l’exposant sous-diffusif trouvé lors de l’examen de τ(q) pour les billes dans le réseau de vimentine de 19 μM. Tout d’abord, on peut utiliser la méthode décrite par Bayles et al.76 et Edera et al.77 pour extraire le MSD de la matrice DDM. Notamment, cette méthode ne nécessite aucun ajustement de la matrice DDM. Il suffit de calculer la matrice DDM, D(q, Δt), et Equation070 (à partir de laquelle A(q) et B peuvent être déterminés). Ensuite, pour trouver le MSD, on utilise la relation Equation071. Notez que cette méthode pour trouver le MSD suppose que la distribution des déplacements de particules est gaussienne, bien que des travaux antérieurs aient montré que, dans certains cas, les TMS dérivés de DDM sont en accord avec les TMS du suivi des particules, même lorsque les déplacements ne sont pas gaussiens73. Pour ce système, comme prévu78, il y a une non-gaussianité dans la distribution des grands déplacements, comme le montre la figure S1. Dans le package PyDDM, la fonction extract_MSD doit être exécutée, ce qui renvoie Equation056. Deuxièmement, on peut utiliser le suivi des particules uniques pour trouver le MSD. Bien que DDM puisse être utilisé pour analyser des images où la densité élevée de particules ou la résolution optique limitée interdisent une localisation précise des particules, pour les images de billes de 0,6 μm dans les réseaux de vimentine, nous avons pu localiser et suivre les perles à l’aide du logiciel trackpy (https://github.com/soft-matter/trackpy)79. Ce progiciel de suivi des particules utilise les algorithmes décrits par Crocker et Grier80.

Figure 7
Figure 7 : Déplacement moyen au carré par rapport au temps de latence pour les réseaux vimentin. Le TMS a été déterminé à l’aide de deux méthodes. Tout d’abord, le MSD a été calculé à partir de la matrice DDM (illustrée par des symboles solides). Ensuite, le MSD a été déterminé en utilisant le suivi des particules uniques (SPT) pour trouver des trajectoires de particules (symboles ouverts). Les barres d’erreur sont déterminées de la même manière que celle décrite dans les deux légendes de figures précédentes. (A) Les TMS pour les billes de 0,6 μm dans le réseau de vimentine de 19 μM indiquent un mouvement subdiffusif, avec un bon accord entre les deux méthodes de recherche du TMS. (B) Les TMS pour les billes de 0,6 μm dans le réseau de vimentine de 49 μM indiquent un mouvement en cage, en bon accord entre les deux méthodes de recherche du TMS et avec le TMS maximal trouvé à partir du paramètre de non-urgence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les TMS par rapport au temps de latence pour les billes de 0,6 μm dans le réseau de vimentine de 19 μM et dans le réseau de vimentine de 49 μM sont illustrés à la figure 7. Dans les deux cas, le DSM déterminé à partir du DDM concordait bien avec le TMS trouvé grâce au suivi d’une seule particule (SPT). De plus, pour le réseau moins concentré, l’exposant de mise à l’échelle sous-diffusive (α en Equation010) était d’environ 0,9. Ceci est cohérent avec la mise à l’échelle τ(q) de Equation010 found en ajustant l’ISF pour déterminer τ(q) (c’est-à-dire 2/2.2 = 0.9). Pour le réseau plus concentré, le MSD plafonne à des temps de latence plus longs. La DSM maximale trouvée en analysant la dépendance q du paramètre de non-énergie (illustrée à la figure 7B avec la ligne horizontale à δ2 = 0,0032 μm2) était à peu près la même valeur que les TMS du SPT et du DDM semblaient plafonner. Il existe un écart entre les TMS à plus long délai déterminés à partir du DDM et du SPT à la figure 7A. Bien que cela puisse être dû à un nombre limité de trajectoires de temps de décalage long, il se peut également que l’optimisation de la plage de valeurs q pour laquelle la matrice DDM est utilisée pour estimer Equation056 pour chaque temps de décalage (comme le font Bayles et al.76 et Edera et al.77) améliorerait nos résultats, et cette optimisation sera au centre des travaux futurs.

Ces expériences où des séquences d’images ont été enregistrées de billes traceuses intégrées dans un réseau de filaments intermédiaires de vimentine ont permis des analyses indépendantes: DDM (en utilisant le paquet décrit ici) et SPT (en utilisant trackpy). Les deux analyses peuvent révéler le degré de sous-diffusion et la longueur de confinement, ce qui permet d’utiliser deux techniques d’analyse d’image indépendantes pour fournir des mesures complémentaires. Il existe des quantités supplémentaires que l’on peut comparer à partir de SPT et DDM. Par exemple, l’hétérogénéité dans la dynamique de l’échantillon peut se révéler comme une non-gaussianité dans la distribution des déplacements de particules (c’est-à-dire la distribution de van Hove) déterminée à partir de SPT, ainsi que dans un ISF déterminé à partir de DDM qui correspond à une exponentielle étirée34,35. La figure S1 montre la distribution de van Hove pour les particules de 0,6 μm dans les réseaux de vimentine et discute de l’exposant d’étirement trouvé lors de l’ajustement des FSI – mesures utilisées en tandem dans des études antérieures pour démontrer la dynamique hétérogène des particules dans les systèmes biomimétiques 9,10,47 ou d’autres environnements surpeuplés 34 . Autre exemple, l’ISF peut être calculé à partir des trajectoires de particules mesurées avec spT et comparé aux ISF acquis par DDM. Alors que les déplacements au carré moyens et les distributions de déplacement sont les mesures les plus souvent tirées de l’analyse SPT, on peut également calculer l’ISF à partir des trajectoires des particules, Equation075en utilisant Equation076 (voir la figure S2). Ce FSI peut être comparé aux FAI générés par DDM et utilisé pour révéler une dynamique non apparente dans la DSM59.

Bien que l’acquisition d’images de particules traceuses au sein d’un réseau puisse permettre d’utiliser les méthodes d’analyse complémentaires de SPT et DDM, il est important de noter que l’un des avantages de DDM par rapport à SPT est qu’il ne nécessite pas d’images de perles (ou d’autres caractéristiques) qui peuvent être facilement localisées et suivies. Pour démontrer ce point, nous soulignons ensuite l’analyse des réseaux actifs de filaments d’actine et de microtubules, où le marquage fluorescent de l’actine et de la tubuline permet l’imagerie des deux types de filaments, distingués l’un de l’autre via différents fluorophores, avec un microscope confocal multicolore à balayage laser.

Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser de réseaux actine-microtubules dont l’activité était entraînée par la myosine (myosine II du muscle squelettique du lapin; Cytosquelette #MY02). Les détails des expériences et des résultats ont déjà été décrits11, et les résultats représentatifs présentés ici proviennent de l’analyse de deux films fournis dans les documents supplémentaires (films S1 et S4) pour11. Les deux séquences d’images ont été enregistrées à 2,78 images/s pour 1000 images.

Pour analyser ces images, la matrice DDM a été calculée pour 50 temps de latence allant de 0,4 s à 252 s (1 image à 700 images). La matrice DDM a ensuite été adaptée au modèle Equation010, la fonction de diffusion intermédiaire étant Equation077. Il existe donc quatre paramètres d’ajustement : A, τ, s et B. Les résultats de ces ajustements sont présentés à la figure 8. Il a été observé que la matrice DDM pour une valeur q particulière avait un plateau à des temps de décalage faibles, augmentait avec le temps de décalage, puis plafonnait (ou montrait des signes de début à plateau) à des temps de décalage importants. La matrice DDM pour les valeurs inférieures de q n’a pas atteint un plateau à long terme. Il faut donc s’attendre à une faible précision dans la mesure du temps de désintégration pour ces dynamiques de faible q (grande échelle de longueur).

Les temps de désintégration caractéristiques, τ, des ajustements à la matrice DDM sont illustrés à la figure 9. Les résultats sont présentés pour un réseau composite actine-microtubule actif (similaire au film S111) et pour un réseau actif d’actine (similaire au film S411). Les deux réseaux ont été préparés avec les mêmes concentrations d’actine et de myosine, mais le réseau d’actine seule a été créé sans tubuline, comme décrit aupoint 11. Pour ces deux types de réseaux actifs, la relation de loi de puissance observée était Equation010. Cette mise à l’échelle indique un mouvement balistique et que la contraction et l’écoulement entraînés par la myosine dominent le mouvement thermique des filaments. À partir de τ = (vq)-1, on a pu trouver une vitesse caractéristique, v, d’environ 10 nm/s pour le réseau actif actine-microtubule et de 75 nm/s pour le réseau actif d’actine. Ces valeurs sont cohérentes avec l’analyse de vélocimétrie d’image de particules des mêmes vidéos montrées dans11. La Equation010 mise à l’échelle n’a pas tenu aux valeurs q inférieures pour le réseau composite actif actine-microtubule. Cela est probablement dû au fait que les temps de désintégration réels de ce réseau composite actine-microtubule aux valeurs q inférieures sont plus longs que le temps de latence maximal de la matrice DDM calculée. Le temps de latence maximal est indiqué par la ligne rouge horizontale de la figure 9, et les temps de désintégration s’écartent de la mise à l’échelle prévue Equation010 près de ces temps plus longs.

Figure 8
Figure 8 : Matrice DDM par rapport au temps de latence pour un réseau composite actine-microtubule actif. La matrice DDM pour plusieurs valeurs de q est tracée en fonction du temps de latence à partir d’un film d’un réseau composite composé de monomères d’actine de 2,9 μM, de dimères de tubuline de 2,9 μM et de myosine de 0,24 μM. Ces données montrent l’analyse du canal microtubule d’une série chronologique multicolore d’images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Temps de désintégration par rapport au nombre d’onde pour les réseaux actifs actine-microtubules. En ajustant la matrice DDM, on trouve le temps de désintégration, τ, en fonction du nombre d’onde, q. Tracé est τ vs q pour les images d’un réseau actif actine-microtubule (analysant uniquement le canal microtubule) en brun et pour les images d’un réseau actif d’actine en vert. Les deux réseaux ont les mêmes concentrations d’actine et de myosine (2,9 μM et 0,24 μM, respectivement); le composite actine-microtubule a 2,9 μM de dimères de tubuline. Les temps de désintégration du réseau actif d’actine sont beaucoup plus petits que les temps de désintégration du réseau actif actine-microtubule, ce qui indique un mouvement plus rapide du réseau d’actine actif. Dans les deux cas, la dynamique est balistique car les données suivent une Equation010 tendance. Encadré : le tracé des FAI par rapport au temps de décalage mis à l’échelle par le nombre d’onde (Δt × q) montre un effondrement des FAI sur une plage de valeurs q. Cela indique également un mouvement balistique. Les FAI indiqués dans cet encadré proviennent du réseau actif d’actine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour ces données de réseaux actifs, nous avons choisi d’adapter la matrice DDM, Equation010. Cela contraste avec ce qui a été fait pour les données des billes dans le réseau vimentin, où A (q) et B ont été estimés sans aucun ajustement pour isoler l’ISF, f (q, Δt). Dans ce cas, pour les données de réseau actif, A et B ont été laissés comme paramètres d’ajustement parce que les méthodes utilisées pour estimer B n’ont pas abouti à de bons ajustements. La méthode par défaut pour estimer B est de calculer Equation031 et de supposer que, dans l’ensemble q, cela va à B/2. Cependant, cette méthode a surestimé B pour ces données, ce qui a été vu dans le fait que, lors du calcul des FAI à partir de B estimés de cette manière (non montrés), les FAI étaient supérieurs à 1 aux premiers temps de décalage (alors qu’ils devraient passer d’un maximum de 1 à zéro ou à un paramètre de non-urgence avec un temps de latence croissant). On peut sélectionner d’autres méthodes pour estimer B en utilisant le paramètre background_method. L’une de ces autres méthodes consiste à estimer B comme étant le minimum de la matrice DDM aux premiers temps de latence (défini avec background_method = 1). Une méthode similaire a été utilisée par Bayles et al.76, bien qu’ils n’aient pas supposé que B était constant avec q. Une autre option consiste à estimer B comme étant la valeur moyenne sur tous les temps de latence de la matrice DDM au maximum q (défini avec background_method = 2). Ces différentes méthodes d’estimation de l’arrière-plan, ainsi que les résultats permettant à B d’être un paramètre d’ajustement libre, sont illustrés à la figure 10. À partir de ces graphiques, on peut voir que l’amplitude, A, n’a pas atteint zéro aux plus grandes valeurs q sondées, puisqu’elle Equation031 n’a pas plafonné à l’ensemble q (figure 10B), et puisque D(qmax, Δt) est passée d’un plateau de temps de décalage inférieur à un plateau de temps de décalage plus élevé (c’est-à-dire qu’à qmax, il y avait un A non nul; Figure 10D). Par conséquent, ni estimer B ni Equation082 ce qui Equation083 serait approprié. Il faut inspecter Equation031 vs. q et D(qmax, Δt) vs. Δt avant de décider comment (ou si) estimer B.

Figure 10
Figure 10 : Arrière-plan par rapport au nombre d’onde pour les réseaux actifs actine-microtubules. En ajustant la matrice DDM, on peut trouver l’arrière-plan, B, en fonction du nombre d’onde, q. B vsq  est  montré pour les images d’un réseau actif actine-microtubule (en analysant uniquement le canal microtubule) déterminé à partir de ces correspondances avec les symboles violets. Les trois lignes pleines en (A) montrent des estimations de l’arrière-plan trouvé sans aucun ajustement. La ligne la plus sombre du haut en (A) montre l’arrière-plan estimé en utilisant Equation088, ce qui peut être approprié si Equation031 les plateaux à une valeur constante à q large. À partir de (B), notez qu’il Equation031 n’a pas encore atteint une valeur constante au plus grand q sondé. Par conséquent, l’utilisation de cette méthode surestime l’arrière-plan. La ligne de fond dans (A) montre l’arrière-plan estimé à l’aide de Equation090. Si la matrice DDM montre un plateau de temps de décalage faible comme indiqué en (C) avec la ligne rouge, cette méthode peut être appropriée pour estimer l’arrière-plan. La ligne médiane la plus claire en (A) montre l’arrière-plan estimé à partir de Equation083. Cette méthode peut être appropriée si, à qmax, l’amplitude, A, a atteint zéro. À partir de (D), on voit que l’amplitude est non nulle et, par conséquent, cette méthode surestime l’arrière-plan. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Distributions de probabilité des déplacements de particules. Les distributions de probabilité des déplacements de particules montrent une non-gaussianité pour des concentrations de vimentine de 34 μM et 49 μM. Un suivi monoparticulaire de billes de 0,6 μm de diamètre a été effectué dans des réseaux de vimentine de concentrations différentes. Différents temps de latence sont indiqués dans les distributions de déplacement pour les trois conditions. (A) La distribution des déplacements de particules dans un réseau de vimentine de 19 μM est adaptée à une fonction gaussienne. La largeur du gaussien augmente avec l’augmentation du temps de latence. (B) La distribution des déplacements de particules dans un réseau de vimentine de 34 μM montre plus de non-gaussianité, en particulier pour les grands déplacements, que pour le cas de 19 μM. (C) La distribution des déplacements de particules dans un réseau de vimentine de 49 μM montre également une non-gaussianité. De plus, les largeurs des distributions n’augmentent pas avec le temps de latence de manière aussi significative que dans les échantillons avec des concentrations de vimentine plus faibles, ce qui indique un mouvement confiné. Les distributions de van Hove non gaussiennes (observées pour tous les échantillons de vimentine mais plus apparentes dans les concentrations plus élevées) sont associées à une dynamique hétérogène comme on le voit souvent dans le transport de particules dans des environnements surpeuplés et confinés. Un autre indicateur de transport hétérogène qui est déterminé à partir de l’analyse DDM est l’exposant d’étirement utilisé pour s’adapter à la fonction de diffusion intermédiaire (le paramètre s dans l’équation de l’ISF utilisé ici: Equation077 + Equation061). Les exposants d’étirement moyens sur la plage q de 0,4 μm-1 à 9,4 μm-1 sont, de la concentration de vimentine la plus élevée à la plus faible, de 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 et 0,86 ± 0,04 (écart type moyen ±). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Les fonctions de diffusion intermédiaires de DDM et SPT. Les fonctions de diffusion intermédiaire (ISF) pour cinq nombres d’onde différents sont affichées. L’ISF par rapport au temps de latence trouvé par DDM est tracé avec des marqueurs circulaires, et l’ISF calculé à partir de trajectoires à particule unique avec des carrés ouverts. Des lignes noires pointillées indiquent les ajustements aux FAI acquis par DDM. L’ISF est calculé à partir de trajectoires monoparticulaires, Equation075, en utilisant Equation076. En (A), l’ISF est représenté pour des particules de 0,6 μm dans les réseaux de vimentine de 19 μM. En (B), l’ISF est représenté pour les particules de 0,6 μm dans les réseaux de vimentine de 34 μM. Les écarts dans le FSI constatés à partir du DDM et du SPT sont probablement dus à un nombre limité de trajectoires de temps de long décalage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Protocole d’utilisation de DDM. L’entrée et la sortie des étapes indiquées dans le protocole sont présentées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Détails de la préparation des échantillons et exemples de fichiers de paramètres pour les réseaux vimentin. Des étapes détaillées pour la préparation des échantillons et l’acquisition d’images sur les réseaux vimentin sont fournies. En outre, un exemple de fichier de paramètres pour l’analyse des données présentées dans la section des résultats représentatifs sur les réseaux vimentin est également fourni. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le progiciel décrit ici utilise DDM pour analyser les fluctuations de densité observées dans les images acquises à l’aide d’un microscope optique. Des résultats représentatifs des données des particules traceuses incorporées dans les réseaux de vimentine ont d’abord été montrés. L’analyse de ces données peut être utilisée pour caractériser la taille du maillage et la rigidité du réseau de la même manière que le suivi des particules uniques a été utilisé dans de nombreuses études antérieures sur les réseaux de cytosquelettes 6,12,13. Un avantage de l’utilisation de DDM par rapport au suivi d’une seule particule est que DDM ne nécessite pas que les particules soient localisées. Par conséquent, même dans les images où la densité de particules est trop élevée ou les particules trop petites pour être localisées et suivies, DDM peut toujours déterminer la dynamique. Là où le suivi d’une seule particule serait avantageux, c’est lors de l’inspection de la variabilité d’une particule à l’autre. Avec DDM, on trouve la dynamique moyenne de l’ensemble alors que, avec le suivi d’une seule particule, on peut calculer à la fois le MSD d’une seule particule et le MSD moyenné de l’ensemble. Cependant, DDM peut être utilisé pour étudier la dynamique hétérogène en analysant plusieurs régions d’intérêt dans un large champ de vision.

Ensuite, des résultats représentatifs des données de filaments marqués par fluorescence dans un réseau actif composé de deux types de filaments cytosquelettiques marqués différemment ont été montrés11. Avec ces données, le mouvement balistique a été caractérisé sans avoir besoin de caractéristiques localisables dans l’image. Étant donné que DDM extrait la dynamique moyenne de l’ensemble avec peu d’entrées de l’utilisateur, il facilite la comparaison des séries d’images acquises avec différentes conditions (par exemple, en comparant des échantillons avec différents rapports d’actine à microtubules ou des échantillons avec différentes concentrations de myosine, comme cela a été fait dans50). De plus, en utilisant l’imagerie fluorescente, nous pouvons étudier la dynamique de différents composants d’un réseau en utilisant l’étiquetage multicolore. Cela a été fait dans11,50, où la dynamique de l’actine et des microtubules a été analysée séparément dans un réseau composite actif actine-microtubule à l’aide d’une imagerie multicolore. Dans la section des résultats représentatifs ici, seuls les résultats du canal microtubule ont été montrés, mais dans des travaux précédents, nous avons comparé la dynamique des filaments de microtubule et d’actine11.

Nous notons que ces résultats représentatifs présentent soit une sous-diffusion passive, soit un mouvement balistique actif. Il est important de noter que DDM peut être utilisé pour analyser les systèmes où il existe un croisement dans le type de dynamique à des échelles de temps ou de longueur intermédiaires. À titre d’exemples, Kurzthaler et coll. ont utilisé le DDM avec un système de colloïdes Janus actifs pour explorer le mouvement dirigé actif à de courtes échelles de temps et la randomisation de l’orientation à des échelles de temps plus longues59; Giavazzi et al. ont utilisé DDM avec une mousse grossissante et ont trouvé un croisement dans la dynamique correspondant à l’échelle de longueur d’une bulle33; et Cho et coll. ont utilisé le DDM avec des gels colloïdaux et ont trouvé trois régimes distincts à différentes échelles de longueur allant des amas fractaux à l’ensemble du réseau32.

Les données incluses dans la section des résultats représentatifs ont été acquises avec la microscopie à fond clair et la microscopie confocale à balayage laser. Cependant, comme indiqué précédemment, DDM peut être utilisé avec de nombreuses modalités d’imagerie. Avec n’importe quelle modalité d’imagerie, les utilisateurs doivent tenir compte des paramètres optiques tels que le degré de section optique ou la profondeur de champ. Un degré élevé de sectionnement optique peut réduire le signal provenant d’objets flous, mais on ne sera pas en mesure de mesurer avec précision la dynamique sur des échelles de temps supérieures à l’échelle de temps pour que les objets sortent de la profondeur de champ25,28. Une discussion plus approfondie sur la façon dont la profondeur de champ dépendante de q affecte l’analyse DDM peut être trouvée dans22. Pour l’imagerie en champ clair, les utilisateurs peuvent également avoir besoin de prendre en compte l’épaisseur de l’échantillon. Alors que pour les échantillons à faible diffusion, les échantillons plus épais peuvent fournir plus de signal42, les échantillons troubles peuvent nécessiter une modification de l’analyse pour tenir compte de la diffusion multiple81. Enfin, pour les méthodes d’imagerie qui ne sont pas invariantes linéaires de l’espace (c’est-à-dire où l’intensité enregistrée par la caméra d’un objet dépend de l’endroit où cet objet se trouve dans le plan d’échantillonnage x-y), il peut être nécessaire de tenir compte de la variance linéaire de l’espace, comme démontré avec le DDM27 en champ sombre.

Pour ceux qui commencent avec DDM, nous souhaitons souligner l’importance de prendre en compte la résolution spatiale et temporelle. Lors de l’inspection des temps de désintégration déterminés en fonction du nombre d’onde, il est important de marquer les limites de la résolution (c.-à-d. les temps de latence maximum et minimum et le nombre d’onde maximal, comme le fait la figure 5). Il faut bien réfléchir à ces limites avant de collecter des données afin de sélectionner l’objectif optimal, la taille de l’image, la fréquence d’images et la durée du film. L’autre considération importante est de savoir comment estimer le paramètre d’arrière-plan B. De multiples méthodes d’estimation du contexte ont été utilisées dans la littérature, et les effets de la surestimation ou de la sous-estimation de B ont été décrits dans des publications antérieures62,77. Comme le montre la figure 10, PyDDM permet aux utilisateurs d’implémenter différentes méthodes pour estimer B, et nous suggérons aux nouveaux utilisateurs d’essayer ces méthodes et d’évaluer celles qui sont appropriées à utiliser.

L’une des forces de ce package est sa documentation complète et ses procédures pas à pas comprenant des exemples de données, le stockage et l’organisation des métadonnées pour suivre la façon dont les analyses ont été effectuées, et la flexibilité dans la façon d’analyser la matrice DDM (divers modèles d’ajustement, plusieurs méthodes pour estimer le paramètre d’arrière-plan B, la possibilité de trouver le MSD). Cependant, il y a plusieurs aspects de ce code qui pourraient être améliorés. Actuellement, le code n’a pas été optimisé pour une vitesse de calcul rapide. Les méthodes d’accélération du calcul ont été signalées61,62, et celles-ci seront mises en œuvre dans les versions futures. De plus, nous prévoyons de mettre en œuvre des méthodes récemment signalées pour mieux estimer les incertitudes et d’utiliser des simulations pour guider les utilisateurs vers le modèle62 approprié du FSI. Pour d’autres améliorations, nous espérons que les utilisateurs nous contacteront avec des suggestions.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Certaines parties de cette recherche ont été financées par un prix R15 des National Institutes of Health (prix no. R15GM123420, attribué à R.M.R.-A. et R.J.M.), un Cottrell Scholar Award de la Research Corporation for Science Advancement (prix no 27459, décerné à R.J.M.), et une william M. Keck Foundation Research Grant (décernée à R.M.R-A.). GHK remercie le Conseil néerlandais de la recherche (NWO; numéro de projet VI.C.182.004 du programme NWO Talent).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 Hamatsu
F-127 Pluronic Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop Thermo Fisher
Nikon Ti-Eclipse microscope Nikon
PLL-PEG-bio SuSos AG, Dübendorf, Switzerland
Polystyrene beads Sigma Aldrich
Protein dialysis mini-cassette Thermo Fisher
PyDDM University of San Diego N/A Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM

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Bioingénierie numéro 184
Quantification de la dynamique du cytosquelette à l’aide de la microscopie dynamique différentielle
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