Summary
Представлен протокол культивирования ex vivo желудочковой ткани миокарда человека. Это позволяет проводить детальный анализ силы сжатия и кинетики, а также применять пред- и послегрузку для более точной имитации физиологической среды in vivo .
Abstract
Культивирование кардиомиоцитов видело огромное количество разработок, начиная от двумерного (2D) культивирования клеток до органоидов, полученных из iPSC. В 2019 году был продемонстрирован способ ex vivo культивирования срезов миокарда, полученных из образцов сердца человека, при приближении in vivo к состоянию сокращения миокарда. Эти образцы происходят в основном из трансплантации сердца или размещения вспомогательных устройств левого желудочка. Используя вибратом и специально разработанную систему культивирования, ломтики толщиной 300 мкм помещают между фиксированной и пружинной проволокой, что позволяет стабильно и воспроизводимо культивировать в течение нескольких недель. Во время выращивания ломтики непрерывно стимулируются в соответствии с индивидуальными настройками. Схватки могут отображаться и регистрироваться в режиме реального времени, а фармакологические средства могут быть легко применены. Пользовательские протоколы стимуляции могут быть запланированы и выполнены для оценки жизненно важных параметров сокращения, таких как пост-пауза-потенцирование, порог стимуляции, соотношение силы и частоты и рефрактерный период. Кроме того, система позволяет изменять настройку предварительной и последующей нагрузки для более физиологичного культивирования.
Здесь мы представляем пошаговое руководство о том, как создать успешное долгосрочное культивирование срезов миокарда левого желудочка человека, используя коммерческий раствор для биомиметического культивирования.
Introduction
За последнее десятилетие культивирование клеток миокарда in vitro достигло больших успехов, начиная от 2D и трехмерных (3D) методов до использования органоидов и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, дифференцированных в сердечные миоциты 1,2,3. Культивирование ex vivo и первичных клеток показало большую ценность, особенно для генетических исследований и разработки лекарств 4,5,6. Использование тканей человека улучшает трансляционную ценность результатов. Однако длительное 3D-культивирование тканей миокарда с интактной геометрией не является устоявшимся. Неповрежденная геометрия является ключевой особенностью для имитации условий in vivo, поскольку правильная сердечная функция, связь между различными клетками, а также взаимодействия между клетками и матрицами являются предпосылками. Культивирование тканей миокарда проходило через различные фазы развития. Успешность и стабильность культивирования ткани миокарда ex vivo изначально были довольно низкими, но последние подходы дали многообещающие результаты 7,8,9,10,11.
Среди них Фишер и др. были первыми, кто продемонстрировал, что жизнеспособность и сократительная производительность ткани миокарда человека могут поддерживаться при культивировании клеток ex vivo в течение многих недель7. Их метод был основан на тонких срезах тканей, вырезанных из эксплантированного миокарда человека, которые были установлены в недавно разработанных культивационных камерах, которые обеспечивали определенные биомеханические условия и непрерывную электрическую стимуляцию. Этот метод культивирования очень похож на функцию in vivo ткани миокарда и был воспроизведен несколькими независимыми исследовательскими группами 2,12,13,14,15. Важно отметить, что камеры, используемые Fischer et al., также позволяли непрерывно регистрировать развитые силы в течение 4 месяцев и, таким образом, открывали беспрецедентные возможности для физиологических и фармакологических исследований интактного миокардачеловека 7.
Подобные методики были независимо разработаны другими группами и применены к миокарду человека, крыс, свиней и кроликов 7,10,11. Pitoulis et al. впоследствии разработали более физиологический метод, который воспроизводит нормальное соотношение сила-длина во время цикла сжатия, но менее подходит для высокопроизводительного анализа16. Таким образом, общий подход биомиметического культивирования можно рассматривать как дальнейший шаг к сокращению, уточнению и замене (3R) экспериментов на животных.
Однако использование этого потенциала требует стандартизированных процедур, анализа высокого содержания и высокого уровня пропускной способности. Представлена методика, сочетающая автоматизированную нарезку живого миокарда человека с поддержанием in vitro в биомиметической системе культивирования, которая стала коммерчески доступной (см. Таблицу материалов). При предложенном подходе количество отдельных срезов, которые могут быть получены из одного трансмурального образца миокарда, ограничено только временем обработки. Образец достаточного размера и качества (3 см х 3 см) часто дает 20-40 срезов ткани, которые удобно разрезаются с помощью автоматизированного вибратома. Эти срезы могут быть помещены в камеры культивирования, принадлежащие системе. Камеры позволяют проводить электрическую стимуляцию, параметры которой могут модулироваться (т.е. длительность импульса, полярность, скорость и ток), а также регулировку предварительной и послегрузки с помощью пружинных проводов внутри камер. Сжатие каждого среза регистрируется от движения небольшого магнита, прикрепленного к пружинному проводу, и отображается в виде интерпретируемого графика. Данные могут быть записаны в любое время и проанализированы с помощью свободно доступного программного обеспечения. Помимо постоянного базового темпа, могут быть выполнены запланированные протоколы для функциональной оценки их рефрактерного периода, порога стимуляции, потенцирования после паузы и соотношения силы и частоты.
Это долгосрочное биомиметическое культивирование нескольких срезов миокарда из отдельного сердца прокладывает путь для будущих исследований ex vivo как в тканях человека, так и в тканях животных и облегчает скрининг на терапевтические и кардиотоксические эффекты лекарств в сердечно-сосудистой медицине. Он уже применялся к различным экспериментальным подходам 2,12,13,15. Здесь мы дадим подробное пошаговое описание подготовки тканей человека и предложим решения часто встречающихся проблем культивирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Коллекция тканей для описанных здесь экспериментов была одобрена Институциональными наблюдательными советами Мюнхенского университета и Рурского университета в Бохуме. Исследования проводились в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации. Пациенты давали свое письменное информированное согласие до сбора тканей.
1. Приобретение тканей
- Получить ткани человека от пациентов, перенесших трансплантацию сердца или кардиохирургию.
- Перед получением ткани готовят 2 л кардиоплегического раствора (далее именуемого буфером нарезки (таблица 1)).
- После получения трансмуральной биопсии левого желудочка (LV) размером 4 см х 4 см поместите ткань немедленно (в течение 5 мин после иссечения) в закрывающийся пластиковый одноразовый стерильный стакан, содержащий примерно 70 мл холодного (4 °C) буфера нарезки. Хранить при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер нарезки, используемый в этом протоколе, позволяет хранить ткань в холодном состоянии (4 °C) в течение 36 ч. Это позволяет холодно транспортировать ткань из клиник, которые не находятся близко к лаборатории. Тем не менее, время транспортировки ≤ 24 часов оказалось оптимальным.
2. Приготовление агарозы и вибратома
- Убедитесь, что подготовлено и стерилизовано достаточное количество камер для выращивания (рисунок 1А).
- Погружают камеры и графитовые электроды в 1 л 10% раствора изопропанола и перемешивают в течение ночи. На следующий день переведите камеры в 100% раствор изопропанола в течение 3 мин и автоклавируйте графитовые электроды при 120 °C в течение 10 мин.
- Дайте камерам и графитовым электродам высохнуть на воздухе под ламинарной проточной вытяжкой.
- Прикрепите печатную плату к каждой из камер в соответствии с доступными положениями на коромысле. Поместите два графитовых электрода на печатную плату в соответствии с инструкциями производителя.
- Поместите 35-миллиметровую крышку чашки Петри поверх камеры, чтобы предотвратить загрязнение.
- Настройте систему выращивания миодиша (см. Таблицу материалов) в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 путем подключения системы к компьютеру (рисунок 1B).
- Готовят 4% низкоплавковую агарозу в буфере нарезки (без глюкозы; Таблица 2). Агарозу можно хранить при 4 °C в течение 6 месяцев.
- В день эксперимента растопить запасной объем раствора агарозы с помощью водяной бани, установленной при 80 °C. В зависимости от количества, плавление занимает около 30 минут.
- Когда агароза становится жидкой, втягивайте 8 мл жидкой агарозы в шприц объемом 10 мл с дополнительными 2 мл воздуха. Закройте шприц стерильным колпачком и поместите его вверх дном на водяную баню с температурой 37 °C в течение 20 минут, чтобы предотвратить затвердевание агарозы и уравновесить ее температуру, чтобы предотвратить повреждение образца гипертермией.
- При наличии включите устройство водяного охлаждения вибратома по меньшей мере за 30 минут до нарезки ткани, чтобы обеспечить достаточную охлаждающую способность. Установите температуру циркуляции воды на уровне 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Режущий лоток и охлаждающая пластина, используемые здесь, содержали встроенную циркуляцию воды. Это настоятельно рекомендуется для охлаждения и снижения риска загрязнения. Однако также можно использовать лед в качестве метода охлаждения. Кроме того, устройство водяного охлаждения не нужно подключать к режущему лотку и/или охлаждающей пластине вибратома на этом этапе протокола. - Очистите лоток для нарезки вибратома и пластину для образцов, промыв все поверхности 100% изопропанолом в течение не менее 3 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от используемой системы вибратома настройка вибратома может отличаться. Обратитесь к руководству по вибратому, присутствующему в лаборатории, для получения информации о методах настройки и калибровки лезвия. - Наполните лоток для резки до 90%-95% буфером нарезки. В используемой в настоящее время установке это соответствует примерно 400 мл. Подключите трубку устройства водяного охлаждения к клапанам на режущем лотке вибратома и охлаждающей пластине.
- Продезинфицируйте все инструменты, необходимые для приготовления, погрузив их в 100% раствор изопропанола на 5 с. Извлеките инструмент из раствора изопропанола и высушите на воздухе под ламинарной вытяжкой.
3. Обрезка и встраивание образцов
- Перенесите образец ткани в 100-миллиметровую чашку Петри, заполненную буфером холодной нарезки. Держите блюдо на охлаждающей пластине при 4 °C (подключено к охладителю или помещено на лед).
- Удалите трабекулы эндокарда, удерживая эндокард пинцетом и используя ножницы, чтобы отрезать примерно 3 мм ткани эндокарда. Таким же образом удалите излишки жировой ткани под эпикардом, если они присутствуют.
- Зафиксируйте образец разрезанной ткани, эндокардиальной стороной вверх, на резиновом пластыре 2 см х 2 см с помощью четырех игл 0,9 мм х 70 мм 20 G, которые фиксируются в квадратном положении (0,9 см х 0,9 см; Рисунок 1С, Г). Убедитесь, что диагональный край каждого кончика иглы направлен внутрь. Это усиливает фиксацию и предотвращает повреждение миокарда.
ВНИМАНИЕ: Ориентация вышеупомянутого квадрата должна быть ортогональна ожидаемому преобладающему направлению миофибры. - Отрежьте всю лишнюю ткань за пределами квадрата четырех игл с помощью скальпеля. Если размер исходного образца позволяет, используйте два образца тканей миокарда во время этой подготовки из одного и того же сырого образца.
- Используя пинцет, поместите обрезанный образец на стерильный кусок ткани, чтобы удалить любой избыточный буфер нарезки, оставшийся на образце. Чтобы предотвратить высыхание образца, не держите образец на ткани дольше 10 с.
- Поместите образец (образцы) в чашку Петри толщиной 35 мм таким образом, чтобы лезвие разрезалось перпендикулярно выравниванию кардиомиоцитов, а эпикард был обращен вниз. Если препарат включает в себя два образца, убедитесь, что образцы центрированы и не касаются друг друга.
- Возьмите шприц агарозы с водяной бани и погрузите образец (образцы) в агарозу. (Рисунок 2А). Дайте агарозе затвердеть в течение 5 мин на охлаждающей пластине. Образец (образцы) должен (должны) оставаться в контакте с чашкой Петри, что гарантирует, что плоскость резки будет параллельна преобладающему направлению волокна миокарда.
ВНИМАНИЕ: Не опорожняйте шприц полностью, чтобы предотвратить пузырьки воздуха. Обратите внимание на количество агарозы, которое остается в шприце во время погружения образцов. В случае пузырьков воздуха в посуде с образцами осторожно вытяните пузырьки воздуха обратно в шприц.
4. Размещение образцов на режущем лотке
- Извлеките затвердевшую агарозу, содержащую образец (образцы), из 35-миллиметровой чашки Петри с помощью шпателя или аналогичного инструмента, вклинивая ее между образцом и боковой стороной чашки Петри. Отрежьте часть агарозы с помощью скальпеля, сохраняя при этом образцы покрытыми.
ВНИМАНИЕ: Не удаляйте слишком много агарозы. На длинной и короткой сторонах в плоскости X/Z должно оставаться не менее 5 мм агарозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 4.2-4.4 должны выполняться в быстрой последовательности (т.е. максимум 5 с). Имейте все необходимые инструменты в пределах досягаемости до начала. Репозиционирование образца после размещения невозможно. Постарайтесь ограничить воздействие на клей воздуха и влаги. Контакт с воздухом или жидкостями затвердеет клей, сделав его непригодным для использования. - С помощью пипетки поместите и распределите 60 мкл клея в центр режущей платформы и вокруг него.
- Поместите эпикардиальную сторону образца, содержащегося в агарозе, поверх клееного участка с помощью пинцета. Не изменяйте положение. Эндокардиальная сторона образца должна быть видна в агарозе. Дайте клею затвердеть в течение 1 мин. Осторожно надавите на агарозу, содержащую образец сверху, тупым инструментом (например, пинцетом), предотвращая разрезание или повреждение агарозы.
- Поместите платформу для образцов в назначенное ей положение в режущий лоток вибратома, заполненный буфером нарезки.
5. Запуск вибратома
- Установите амплитуду вибрации на 1 мм и начальную скорость резания на 0,07 мм/с. Установите толщину среза на 300 мкм для резки ломтиков.
- Пока лезвие только режет агарозу, увеличьте скорость резания до максимальной, которая в данном случае составляет 1,50 мм/с. Как только вибратом начнет разрезать ткань, немедленно уменьшите скорость до 0,07 мм/с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань не нарезана гладко, например, если в образце есть большие фиброзные участки, это может помочь увеличить амплитуду резания до 1,5 мм и снизить скорость резания до 0,04 мм/с.
6. Подготовка среды и инкубатора во время процедуры нарезки
- Наполните каждую культивационную камеру 2,4 мл полной питательной среды (таблица 3).
- Поместите камеры выращивания, заполненные средой, на систему культивирования в инкубатор, установленный при 37 °C, 5% CO2, 21% O2 и влажности 80%. Уравновешивайте среду не менее 20 мин.
- Подключите систему выращивания к компьютеру и запустите соответствующее программное обеспечение.
- Установите скорость рокера на 60 об/мин и предварительно задайте параметры стимуляции (импульсы стимуляции и частоту). Для сердечных срезов человека установите стандартную стимуляцию двухфазных импульсов с током 50 мА, каждый из которых состоит из положительного тока 3 мс, паузы 1 мс и импульса инвертированного тока 3 мс со скоростью 30 ударов в минуту (BPM).
ПРИМЕЧАНИЕ: В хорошо сохранившихся тканях типичный порог стимуляции составляет около 15 мА. Для обеспечения надежной стимуляции и учета возможного повышения порога стимуляции рекомендуется установить ток на величину, превышающую порог стимуляции в два-три раза. - Проверьте электродные индикаторы программного обеспечения, чтобы убедиться, что электроды камер культивирования работают правильно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Действие необходимо всякий раз, когда индикатор канала в программном обеспечении для выращивания становится красным. При этом биполярные импульсные заряды не уравновешиваются.
7. Подготовка ломтиков
ПРИМЕЧАНИЕ: Начальные субэндокардиальные срезы обычно не подходят для культивирования тканей и должны быть отброшены из-за неравномерной морфологии. После первых пяти-10 срезов текстура и морфология срезов улучшаются. Идеальный срез составляет не менее 1 см х 1 см, не имеет или имеет только ограниченные фиброзные пятна, не фрагментирован и имеет однородное выравнивание волокон (рисунок 2B, D). Интерстициальный фиброз, расположенный между волокнами миоцитов, часто присутствует в неисправном миокарде человека. Удивительно, но это не является негативным предиктором успеха культивирования.
- Налейте достаточное количество буфера холодной нарезки в крышку чашки Петри 5 см, чтобы ломтики не высохли. Поместите ломтики в крышку чашки Петри, содержащую буфер холодной нарезки.
- Отделите агарозу от ткани с помощью пинцета. Не допускайте прикосновения к тканям. Обращайтесь с тканью осторожно, так как любое повреждение ткани снизит вероятность успеха культивирования.
- Определите направление волокон миокарда путем тщательного осмотра источника света. Это важно при прикреплении пластиковых треугольников к ткани на шаге 7.6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 7.4 и 7.5 должны выполняться в быстрой последовательности, в течение 5 с. - Прикрепите два пластиковых треугольника к образцу с помощью клея, чтобы закрепить ткань внутри камер культивирования.
- Поместите 1 мкл клея на стерильную крышку чашки Петри. Используйте крючковатый пинцет, чтобы подобрать один из автоклавных пластиковых треугольников. Быстро опустите передний край треугольника в клей и наклейте треугольник на образец, перпендикулярный выравниванию кардиомиоцитов. Повторите для другого треугольника.
- Обрежьте скальпелем ткань, превышающую ширину треугольника (рисунок 2С). Поместите срез с двумя установленными треугольниками обратно в буфер нарезки режущего лотка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяйте шаги с 7.2 по 7.5 до тех пор, пока не будет подготовлено достаточное количество ломтиков для заполнения камер выращивания. Мы рекомендуем приготовить несколько дополнительных ломтиков, чтобы обеспечить замену ломтиков при плохом сокращении.
8. Монтаж срезов
ПРИМЕЧАНИЕ: Нагрузка определяется жесткостью пружинной проволоки в культивационных камерах. Доступны три различных типа, в зависимости от толщины пружинной проволоки.
- Возьмите из инкубатора заполненную средней камерой культивации. Выберите один из подготовленных ломтиков и вставьте его в камеру, соединив по одному треугольнику с каждым штифтом.
- Отрегулируйте расстояние между крепежными штифтами в соответствии с размером образца. Убедитесь, что образец погружен в среду. Поместите камеру обратно в назначенную гнездо системы выращивания в инкубаторе.
ВНИМАНИЕ: Не перерастягивайте ткань и не перегибайте пружинную проволоку! - Установите натяжение преднатяга после размещения тарелки на коромысле.
- Уменьшите преднагрузку, повернув регулировочный винт против часовой стрелки. Делайте это до тех пор, пока базовая линия соответствующего графика на экране компьютера больше не изменится.
- Осторожно увеличьте преднатяг (т.е. увеличьте натяжение), повернув регулировочный винт по часовой стрелке. Для камер с наибольшей жесткостью продолжайте до тех пор, пока соответствующая базовая линия на графике не увеличится на 1000-1200 единиц, что соответствует 1 мН преднатяга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точная регулировка будет зависеть от индивидуальной пружинной константы культивационной камеры, которая может быть определена путем калибровки перед экспериментом в соответствии с инструкциями производителя. Регистрирующее программное обеспечение позволяет учитывать калибровку отдельной камеры, так что силы будут равномерно отображаться в мкН. Рекомендуется применять электрическую стимуляцию с самого начала культивирования. Таким образом, вполне возможно, что срез начинает сжиматься во время регулировки предварительной нагрузки. В этом случае сосредоточьтесь на диастолической исходной линии для оценки преднагрузки.
9. Смена среды
- Приготовить среду для выращивания по рецепту в таблице 3. Незадолго до использования среды добавьте 50 мкл β-меркаптоэтанола (50 мМ) в пробирку объемом 50 мл. Хранить при температуре 4 °C.
- Раз в 2 дня частично обменивайте питательную среду. Обновляйте среду каждые 2 дня, если требуется длительное культивирование срезов миокарда.
- Предварительно разогрейте свежую среду на водяной бане или в инкубаторе горячего воздуха при 37 °C в течение 30-45 мин. Выньте из инкубатора камеру для выращивания и поместите ее под ламинарный вытяжной кожух.
ВНИМАНИЕ: Важно держать камеру, а также среду в тепле при 37 ° C (> 35 ° C), чтобы предотвратить гиперсербезды из-за низкой температуры. Менее отчетливое повреждение может присутствовать в виде увеличения диастолического напряжения в течение нескольких часов после среднего обмена. Может показаться, что это восстанавливается, но повторный стресс может привести к накоплению ухудшения. - Удалите среду из камеры культивации, оставив в камере примерно 0,8 мл. Добавьте 1,6 мл свежей среды в ту же камеру. Общий объем среды должен составлять около 2,4 мл на камеру.
- Поместите крышку камеры обратно и поместите камеру культивации обратно в соответствующее положение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сокращение срезов миокарда отображалось на экране компьютера после введения культивационной камеры в соответствующий разъем (рисунок 3). Сокращение срезов миокарда человека началось сразу после стимуляции. Ломтики гиперсжимают в течение 5-10 мин. Это проявлялось как увеличение диастолических сил, вызванное тонической контрактурой поврежденных тканевых фракций. Этот процесс возвращался в разной степени в течение 1-1,5 ч. После стабилизации срезы ткани ЛЖ человека показали силы подергивания, варьирующиеся от 1 мН до 3 мН при стимуляции. Систола проявляется как сильное увеличение силы сокращения, за которым следует диастола с не менее резким уменьшением силы сокращения.
Сокращение срезов миокарда регистрировалось программным обеспечением для культивирования и сохранялось в назначенном файле. Каждый из сгенерированных файлов необработанных данных был преобразован в читаемый двоичный формат файла Axon (.abf) для легкого анализа и количественной оценки данных. Для первичного анализа файл .abf был открыт в соответствующей программе. Приблизительно 5 минут данных о сокращении было выбрано для установления средней амплитуды сжатия в течение этого периода. Это было сделано для нескольких временных точек в записанном файле данных. Построение этих значений сжатия с течением времени дало полезный график для сравнения развития сокращения в контрольной и экспериментальной обстановке. Чтобы получить более глубокое представление о производительности сгенерированных срезов, были запущены протоколы стимуляции. Во время этих протоколов, которые занимают около 45 минут, параметры стимуляции были изменены для оценки параметров связи сокращения.
Текущий протокол стимуляции состоял из четырех отдельных разделов: пост-пауза-потенцирование, порог стимуляции, соотношение сила-частота и рефрактерный период (рисунок 4, таблица 4). Во время пост-паузы-потенцирования стимуляция возобновляется после кратковременной остановки в 3, 12, 50 или 120 с. Для определения порога стимуляции ток стимуляции увеличивают с шагом 3 мА каждые 10 с, начиная с 8 мА и увеличивая до 90 мА. С помощью этого теста можно определить минимальный ток стимуляции для каждого среза. Это не изменяет общие настройки стимуляции за пределами протокола стимуляции. Соотношение сила-частота оценивается по поэтапному увеличению частоты стимуляции (20, 30, 45, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 210 и 240 УДМ), при этом соответствующая продолжительность каждого шага сокращается параллельно. За исключением первых двух настроек частоты, этот режим дает от 20 до 40 сокращений на каждом этапе. Рефрактерный период каждого среза оценивается путем отправки преждевременного стимула (S2) после нормального стимула (S1; 30 BPM). Интервал S1-S2 сокращается каждые 10 с.
Чтобы продемонстрировать потенциал представленной системы культивирования в качестве инструмента для тестирования фармакологических вмешательств, срезы ткани ЛЖ человека ex vivo были приготовлены у того же пациента и подвергнуты фармакологическим агентам, которые влияют на внутриклеточные уровни ионов кальция (Ca2+) (n = 1) после 2 недель культивирования. Антагонист L-типа Ca2+-канала нифедипин ингибирует приток Ca2+ в клетки миокарда и, следовательно, снижает внутриклеточную доступность Ca2+ и снижает сократимость17. Из-за своего сосудорасширяющего действия нифедипин используется в качестве антигипертензивного препарата. Чтобы продемонстрировать фармакологические различия антагонистов Ca2+-каналов, кальцисептин исследовали для сравнения. Кальцисептин также являетсяL-типом Ca 2+-канального антагониста, извлеченным из яда Dendroaspis p. polylepis 18. Поэтому он разделяет отрицательное инотропное действие нифедипина. Однако кальцисептин имеет различные характеристики связывания и является более мощным по сравнению с нифедипином19. Чтобы изучить положительные и отрицательные модуляции доступности Ca2+ , мы также протестировали агонист кальциевого канала Bay-K8644 (1,4-дигидро-2,6-диметил-5-нитро-4-(2-[трифторметил]фенил)пиридин-3-карбоновая кислота метиловый эфир)20.
Три ломтика обрабатывали нифедипином (125 нМ), кальцисептином (70,8 нМ) и Bay-K8644 (417 нМ) соответственно, в то время как четвертый срез не получал лекарственного средства (контроль). Силы сокращения при общих параметрах стимуляции (ток 50 мА, двухфазные импульсы длительностью 3 мс, интервал 1 мс и скорость темпа 30 УДМ) сравнивали до и после лечения. Кроме того, перед лечением был запущен протокол стимуляции для оценки исходных значений пост-паузы-потенциации, порога стимуляции, соотношения силы и частоты и рефрактерного периода. После 30 мин лечения был запущен второй протокол стимуляции. Для устранения межиндивидуальных различий амплитуду сокращения каждого среза нормализовали до его исходного уровня до начала лечения. Исходный уровень (т.е. 100%) определяли путем анализа последних пяти циклов сокращения до начала протокола стимуляции перед лечением.
При анализе сокращения срезов при общей стимуляции было замечено, что сила сокращения срезов, обработанных антагонистами Ca2+ (нифедипин и кальцисептин), уменьшалась в течение 10 мин после обработки (рисунок 5) и эффект присутствовал до 20 мин после обработки. Напротив, напряжение затвора Ca2+ канал агониста Bay-K8644 увеличивало силу сжатия обрабатываемого среза. Контрольный фрагмент не показал заметного изменения. Аналогичным образом анализировались данные о сокращении, полученные во время протоколов стимуляции. Здесь данные, полученные протоколом стимуляции, выполненным до лечения (до лечения), сравнивались с данными после лечения того же протокола стимуляции.
Как обсуждалось ранее, протокол стимуляции начинался с оценки пост-паузы-потенцирования. Во время паузы дополнительный Ca2+ поглощается саркоплазматическим ретикулумом (SR), который высвобождается при первой стимуляции после паузы. Следовательно, пост-пауза-потенцирование отражает внутриклеточное высвобождение Ca2+ из SR. Таким образом, этот параметр может быть использован для оценки относительного вклада Ca2+, высвобождаемого из SR рецептором рианодина. Чтобы оценить потенцирование срезов после стимулирующей паузы, силу первого сокращения после паузы разделили на среднее сокращение до соответствующей паузы. Контрольный срез не показал каких-либо заметных изменений (рисунок 6A). Было отмечено, что ингибирование каналов Ca2+ L-типа приводило к потенцированию первого сокращения после паузы не менее 50 с (рисунок 6B,D), что отражает более высокий относительный вклад внутриклеточного высвобождения Ca2+ в общую сократимость. Противоположный эффект наблюдался в срезе, обработанном Bay-K8644, который стимулирует поступление внеклеточного Ca2+ через каналы L-типа Ca2+ (рисунок 6C).
Соотношение сила-частота оценивалось путем последовательного увеличения скорости темпа до 180 BPM. Для лучшей визуализации сила сжатия на разных частотах стимуляции была нормализована до исходного сокращения при 30 BPM в рамках одного протокола (= 100%). Анализ данных показал, что лечение кальцисептином не изменяло способность среза следовать стимулам при увеличении частоты стимуляции при сравнении данных до и после лечения (рисунок 7B). Никаких изменений в контрольном срезе не наблюдалось (рисунок 7А). В отличие от кальцисептина, нифедипин предотвращал увеличение сократимости при более высоких темпах и снижал максимальную скорость захвата до 80 уд/мин (рисунок 7D). Срез, обработанный агонистом канала Ca2+ Bay-K8644, показал повышенную силу сжатия при очень низких частотах стимуляции (рисунок 7C). Однако на частотах выше 50 уд/мин сила сжатия оказалась ниже, чем во время предварительного лечения состояния. Порог стимуляции и рефрактерный период также определялись до и после лечения. Однако никаких различий не наблюдалось, и поэтому данные не показаны.
Рисунок 1: Обзор необходимых материалов и системы культивирования. (A) Пустая камера культивирования, подключенная к зеленой печатной плате. Печатная плата (1) измеряет сжатие с помощью датчика и передает данные контроллеру. (B) Восемь заполненных камер, размещенных на качающейся основной плите. Крышки чашки Петри (35 мм) используются для покрытия камер. (C) (Хирургические) инструменты, необходимые для обрезки трансмурального образца миокарда. Изображены различные пинцеты, лезвия, необходимые для вибратома, и резиновая пластырь, помогающая в обрезке. (D) Четыре иглы размером 0,9 мм x 70 мм 20 G, которые закреплены в квадратном положении (0,9 см x 0,9 см) сплошным пластиковым блоком. Использование этой конструкции предотвращает повреждение и движение образца при обрезке и дает тканевый блок с требуемыми размерами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обработка двух образцов РН. (A) Два блока тканей миокарда (приблизительно 1 см х 1 см х 1 см), встроенные в затвердевшую агарозу с низким расплавом в чашке Петри толщиной 35 мм. В демонстрационных целях использовалась свиная ткань LV. (B) Блок агарозы со встроенными образцами был извлечен из чашки Петри, обрезан и приклеен на режущую платформу вибратома. Здесь в демонстрационных целях использовалась свиная ткань LV. Обратите внимание на однородный цвет ткани и отсутствие белой фиброзной ткани, обозначенной красной стрелкой. (C) После нарезки агарозу осторожно удаляют, а пластиковые треугольники (1) соединяют перпендикулярно направлению волокон миокарда. Красные линии указывают направление волокон миокарда. (D) Была подготовлена ткань ЛЖ человека, которая показала белую фиброзную ткань внутри срезов. Это не обязательно снижает уровень успешности выращивания; однако рекомендуется использовать срезы, которые не проявляют фиброза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Программное обеспечение для выращивания. В зависимости от количества используемых каналов (максимум восемь) регистрация сокращения будет визуализироваться в трех обозначенных окнах (два видны на рисунке). Каждая камера культивирования отображается в виде одного графика сокращения. В окне настроек параметры стимуляции могут быть изменены и адаптированы к желаемой экспериментальной ситуации. Это окно также позволяет запустить или остановить выбранный протокол/график стимуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Считывание сокращения пяти срезов миокарда во время типичного протокола стимуляции. На всех панелях каждый отдельный фрагмент отображается одним и тем же цветом. (A) Пост-пауза-потенцирование оценивает первое сокращение после короткой стимулирующей паузы в 3, 12, 50 и 120 секунд соответственно. (B) Определение порога стимуляции путем увеличения тока стимуляции с шагом 3 мА каждые 10 с с 8 мА до 80 мА. (C) Соотношение силы и частоты каждого среза оценивается путем поэтапного увеличения частоты стимуляции с 12 уд/мин до 240 уд/мин. Продолжительность периодов стимуляции становится короче на более высоких частотах, чтобы поддерживать количество ударов постоянным на каждой частоте. (D) Для оценки рефрактерного периода срезы подвергаются преждевременным стимуляциям (S2) с уменьшающимися интервалами к предыдущему стимулу (S1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализ силы сокращения до и после лечения агентами, влияющими на канал L-типа Ca2+ . Все данные (n = 1) были нормализованы до исходной сократимости (среднее значение пяти отдельных ударов до лечения (0)). К сжимающимся срезам миокарда ЛЖ были добавлены антагонисты каналов Ca2+ L-типа (125 нМ), кальцисептин (70,8 нМ) и агонист канала L-типа Ca2+ Bay-K8644 (417 нМ). Контрольный срез не получил никакой обработки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Пост-пауза-потенцирование обработанных и контрольных срезов. Наблюдались различия в потенцировании после паузы (исходный уровень и пост-лечение; n = 1). Здесь амплитуда первого сокращения после паузы нормализовалась до средней амплитуды сокращения до соответствующей паузы. Базовая линия была установлена как 100% и напоминает среднюю силу сжатия последних пяти циклов до начала первой паузы. Ось Y отображает нормализованное первое сокращение после паузы различной длительности. Ось X показывает длину базовой линии и паузы. (A) Контрольный срез без обработки. (B) Лечение кальцисептином. (C) Лечение Bay-K8644. (D) Лечение нифедипином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Анализ соотношения частот силы. Данные сжатия (n = 1) были нормализованы до силы сжатия при 30 BPM в рамках соответствующего протокола (= 100%). А) контрольный срез не был обработан каким-либо веществом; однако все остальные аспекты выращивания были такими же, как и у обработанных ломтиков. (B) Лечение кальцисептином одного среза миокарда LV. (C) Лечение Bay-K8644. (D) Лечение нифедипином. Данные о силе сжатия этого среза при частотах стимуляции выше 80 уд/мин были опущены, так как сокращение не следовало частоте стимуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Состав буфера нарезки, используемого для транспортировки и во время процедуры нарезки. Для приготовления агарозы глюкоза опущена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Состав 4% агарозного геля. Этот безглюсодержащий низкоплавкий агарозный гель используется для встраивания образцов тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Подготовка среды к выращиванию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 4: Подробная информация о протоколе стимуляции. Протокол стимуляции состоит из четырех частей, которые могут быть изменены в соответствии с потребностями проекта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В прошлом сердечно-сосудистые исследования добились больших успехов в культивировании кардиомиоцитов. Однако 3D-культивирование кардиомиоцитов с интактной геометрией еще не устоялось. По сравнению с предыдущими протоколами, применяемыми для культивирования ex vivo ткани миокарда, протокол, который мы описали здесь, более близко напоминает среду in vivo ткани. Кроме того, применение предварительной и последующей нагрузки обеспечивает более биомиметическую среду. Мы способны полностью проанализировать и понять непрерывную запись данных о сокращении и параметрах сокращения ткани.
Количество методов культивирования сердечно-сосудистой ткани ex vivo с использованием аналогичных установок ограничено 11,21,22. Аналогичная методика культивирования срезов миокарда, которая была опубликована, использует 6-луночную пластину для культивирования срезов миокарда10. Однако важным ограничением этой конкретной установки является то, что срезы не подвергаются предварительной и последующей нагрузке, а также не могут дать подробное представление о сокращении с течением времени без необходимости обработки ткани. Метод, который мы описали здесь, снижает риск повреждения тканей или инфекции. Кроме того, он дает всестороннее представление о возможных изменениях в сократительной силе всякий раз, когда к культивации добавляется вещество, представляющее интерес. В дополнение к анализу нормальной силы сжатия каждого среза, текущая настройка позволяет регулярно запускать заранее определенные протоколы. Это позволяет собирать данные о различных соответствующих параметрах культивируемой ткани.
Критические шаги в рамках протокола
Необходимо избегать повреждения тканей, и это уже может произойти во время операции эксплантата. Если ткань не переносится сразу в раствор холодного хранения после иссечения, это может привести к повреждению образцов ткани. Описанный протокол содержит несколько шагов, которые имеют решающее значение для получения надежных и воспроизводимых результатов. Соединение для встраивания агарозной ткани должно быть приготовлено с использованием буфера нарезки без глюкозы, чтобы предотвратить возможную карамелизацию глюкозы во время процесса плавления до начала протокола. Важно избегать повреждений из-за гипертермии, вызванной использованием агарозы непосредственно с водяной бани 80 °C, вместо того, чтобы инкубировать агарозу в шприце при 37 °C. Температура должна быть 4 °C во время хранения и резки для снижения метаболизма и минимизации ишемии. Кроме того, с тканью следует обращаться осторожно, захватывая агарозу, а не саму ткань, при перемещении ее между режущим лотком и чашкой Петри для прикрепления пластиковых треугольников. Крайне важно, чтобы эти треугольники крепились в правильном направлении относительно направления волокон миокарда. Смещение треугольников приведет к повреждению тканей.
В целом, порог стимуляции вновь нарезанных ломтиков составляет 10-20 мА, и ток следует осторожно увеличивать. Чрезмерная стимуляция ткани слишком высоким током также может привести к необратимому повреждению образца. Как только стимуляция началась, необходимо перемешивание тканей путем раскачивания камер культивации, и его никогда не следует останавливать более чем на 5 минут, чтобы обеспечить адекватную доступность кислорода и питательных веществ для ткани.
Устранение неполадок и внесение изменений
Гипер контрактура
Гипер контрактура образца ткани миокарда является одним из основных критериев исключения для обсуждаемого протокола. Это может произойти до и после приготовления срезов миокарда. В тех случаях, когда до препарата ткань ощущалась жесткой при пальпации, гиперконтракция наблюдалась не менее чем у 70% препаратов. Гиперконтрактура образца ткани может также возникать при введении на коромысло, что, вероятно, зависит от качества ткани или болезненного состояния пациента. Гиперконтрамуру можно рассматривать как повышение диастолического тонуса при стимуляции тканей, соответствующее тоническому укорочению поврежденных кардиомиоцитов при ишемии сердца. Гиперсдерменура во время стимуляции может быть прогрессирующей, в результате чего сокращение превышает предел обнаружения в 12 мН. Тем не менее, гипер контрактура может также спонтанно измениться в течение 30-60 минут, предполагая, что ткань может восстановиться. Для улучшения восстановления тканей настройки преднагрузки следует перенастроить (т.е. повторить этап 8.3) после 1 ч инкубации, а также на 2, 4 и 6 день после приготовления. Гиперконтрактура может присутствовать как с стимулированным сокращением образцов, так и без него. Тем не менее, если в течение 1 ч не наблюдается сокращения, образец использовать не следует. В этом случае ткань гиперсжимается до такой степени, что она не может восстановиться или была повреждена иным образом. В целом, культивирование срезов миокарда человека по представленному протоколу, показало успешность 90%.
Ожидаемые изменения силы сжатия
В зависимости от множества факторов (например, пациент, препарат, повреждение тканей), возможно, что миослики, которые показали приемлемое сокращение изначально, будут подвергаться прогрессирующему снижению сократительных амплитуд в течение первых 24 ч. На самом деле, такое поведение можно даже считать нормальным для кусочков, полученных из человеческих сердец на конечной стадии. Было обнаружено, что корректировка предварительной загрузки срезов каждый день в течение следующих 3 дней облегчает эту проблему и улучшает сокращение. Однако через 24-48 ч сократимость должна снова начать увеличиваться. Обратите внимание, что сокращение не вернется к своему первоначально наблюдаемому уровню в течение первых дней культивирования.
Вскоре после обмена средой, когда образцы возвращаются в инкубатор, сокращение обычно показывает заметно увеличенные амплитуды. Открытие и закрытие инкубатора способствует этому увеличению, так как вызывает падение уровня CO2 . Это увеличивает рН внутри бикарбонатно-буферной культивируемой среды, что вызывает положительный инотропный ответ срезов. После среднего обмена сократительная сила срезов часто уменьшается в течение нескольких часов, пока не достигнет или не превысит свое первоначальное значение. Чтобы предотвратить воздействие среднего обмена на протоколы стимуляции, протоколы стимуляции не должны выполняться по крайней мере через 1 ч после среднего обмена.
Ограничения метода
Преимуществом данной методики по сравнению с более ранними методами культивирования ткани миокарда человека, является возможность нанесения (и модуляции) предварительной и постнагрузки на сокращающуюся ткань. Однако трудно количественно оценить приложенную нагрузку с точки зрения натяжения стенок, хотя эту нагрузку можно оценить по константе пружины и размерам среза. Предполагается, что существует положительная связь между жизнеспособностью ткани миокарда и амплитудой сокращения образца ткани. Тем не менее, в настоящее время нет метода, который позволяет проверить жизнеспособность каждого отдельного среза перед его установкой в камеры. Колориметрическое окрашивание МТТ может быть выполнено на разрезанных срезах, которые не используются для культивирования, для определения жизнеспособности клеток миокарда. В клетках, которые являются жизнеспособными, NADPH уменьшит желтую соль MTT в фиолетовых кристаллах формазана. Другим ограничением является то, что в настоящее время питательные вещества в среде для выращивания ограничены основными ингредиентами. Следовательно, питательные вещества и циркулирующие факторы отличаются от среды in vivo , из которой была получена ткань. Тем не менее, среда может быть дополнена или модифицирована по мере необходимости.
Потенциальные применения метода
Существует несколько потенциальных применений метода как с точки зрения кардиотоксичности и тестирования лекарств, так и в понимании патофизиологии сердечных заболеваний. Во-первых, система, используемая в обсуждаемом протоколе, может быть использована для скрининга лекарств и кардиотоксичности. С помощью программируемых протоколов стимуляции можно анализировать физиологические изменения в ответ на введение препарата. Что касается интерпретации рефрактерного периода, то нужно учитывать, что это функциональный параметр, который не отражает строго влияние препаратов на продолжительность потенциала действия. Во-вторых, культивационные камеры могут быть использованы для различных экспериментов совместного культивирования миокарда в сочетании с иммунными клетками. Используя это совместное культивирование, можно оценить прямое влияние факторов, секретируемых иммунными клетками, на сокращение миокарда. Наконец, образцы нетрансплантационной кардиомиопатии также могут быть культивированы, хотя эти образцы нетрансплантационной ткани, как правило, меньше и, следовательно, труднее обрабатывать. Тем не менее, это может открыть возможности для идентификации новых терапевтических целей и разработки целевых лекарств. Также возможно использовать технику для характеристики тканей пациента, что приближает нас на один шаг к персонализированной медицине. Кроме того, представленный способ может быть использован для нечеловеческой ткани миокарда, примерами которой являются свинья и кролик. Следует учитывать, что высокая физиологическая частота сердечных сокращений мелких млекопитающих (мышей/крыс) не может быть получена, поскольку последующее более высокое требованиеО2 не может быть удовлетворено в условиях культивирования миокарда с использованием обсуждаемой установки. Таким образом, почти физиологическую среду трудно имитировать в этих случаях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JH, PS, DM и KL нечего раскрывать. AD и TS являются акционерами Компании InVitroSys GmbH, которая обеспечивает систему выращивания миодиша.
Acknowledgments
Исследования финансировались грантами DZHK 81Z0600207 (JH, PS и DM) и 81X2600253 (AD и TS).
Авторы хотели бы поблагодарить Клаудию Фани, Мэй-Пин Ву и Маттиаса Семиша за их поддержку в подготовке установок, а также за регулярное поддержание культивирования тканей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
