Summary
我々は、ヒト心室心筋組織の エクスビボ 培養のためのプロトコールを提示する。これは、収縮力および動態の詳細な分析、ならびに インビボ 生理学的環境をより密接に模倣するための前負荷および後負荷の適用を可能にする。
Abstract
心筋細胞培養は、2次元(2D)細胞培養からiPSC由来オルガノイドまで、膨大な数の開発を見てきました。2019年には、心筋収縮のインビボ状態に近づきながら、ヒト心臓サンプルから得られた心筋スライスを培養するエクスビボ方法が実証されました。これらのサンプルは、主に心臓移植または左心室補助装置の配置に由来する。ビブラトームと特別に開発された栽培システムを使用して、固定ワイヤとスプリングワイヤの間に厚さ300μmのスライスを配置し、数週間安定して再現可能な栽培を可能にします。栽培中、スライスは個々の設定に従って連続的に刺激される。収縮はリアルタイムで表示および記録することができ、薬理学的薬剤を容易に適用することができる。ユーザー定義の刺激プロトコルをスケジュールして実行し、一時停止後増強、刺激閾値、力と周波数の関係、耐火期間などの重要な収縮パラメータを評価することができます。さらに、このシステムは、より生理学的な培養のための可変のプリロードおよびアフターロード設定を可能にする。
ここでは、市販の生体模倣培養溶液を用いて、ヒト左心室心筋スライスの長期培養を成功させる方法に関するステップバイステップガイドを提示する。
Introduction
過去10年間で、心筋細胞のインビトロ培養は、2Dおよび三次元(3D)技術から、オルガノイドおよび心筋細胞に分化した誘導多能性幹細胞の使用に至るまで、大きな進歩を遂げた1,2,3。エクスビボおよび初代細胞培養は、特に遺伝学的研究および創薬のために、大きな価値があることが示されている4,5,6。ヒト組織を使用すると、結果の翻訳価値が向上します。しかし、無傷の形状を有する心筋組織の長期3D培養は十分に確立されていない。インタクトな幾何学的形状は、適切な心機能、異なる細胞間のコミュニケーション、ならびに細胞 - マトリックス相互作用が前提条件であるため、in vivo状態を模倣するための重要な特徴である。心筋組織培養は、発達の様々な段階を経た。エクスビボ心筋組織培養の成功率および安定性は、当初はかなり低かったが、最近のアプローチは有望な結果7、8、9、10、11をもたらしている。
その中で、Fischerらは、ヒト心筋組織の生存率および収縮性能が、エキソビボ細胞培養において何週間も維持され得ることを最初に実証した7。彼らの技術は、外植されたヒト心筋から切断された薄い組織スライスに基づいており、それらは、定義された生体力学的条件および連続的な電気刺激を提供する新しく開発された培養チャンバーに取り付けられた。この培養方法は、心筋組織のin vivo機能によく似ており、いくつかの独立した研究グループ2、12、13、14、15によって再現されている。重要なことに、Fischerらが使用したチャンバーは、最大4ヶ月間、発達した力の継続的な登録を可能にし、したがって、無傷のヒト心筋に関する生理学的および薬理学的研究のための前例のない機会を開いた7。
同様の技術を他のグループによって独立して開発し、ヒト、ラット、ブタ、およびウサギ心筋に適用した7、10、11。Pitoulisらはその後、収縮サイクル中の法線力-長さ関係を再現するより生理学的方法を開発したが、ハイスループット解析には適していない16。このように、生物模倣体培養の一般的なアプローチは、動物実験の還元、改良、および置換(3R)へのさらなるステップと見なすことができる。
ただし、この可能性を活用するには、標準化された手順、高コンテンツ分析、および高スループットレベルが必要です。我々は、市販されている生体模倣体培養システムにおいて、生きたヒト心筋の自動スライスと in vitro 維持を組み合わせた技術を提示する( 材料表参照)。提案されたアプローチでは、単一の経壁心筋標本から生成することができる個々のスライスの数は、処理時間によってのみ制限される。十分なサイズと品質(3 cm x 3 cm)の標本は、多くの場合、自動ビブラトームで便利に切断される20〜40の組織スライスを生成します。これらのスライスは、システムに属する培養チャンバに入れることができる。チャンバは、チャンバ内のスプリングワイヤを使用して、変調可能なパラメータ(すなわち、パルス持続時間、極性、レート、および電流)ならびに前負荷および後負荷の調整が可能な電気刺激を可能にする。各スライスの収縮は、ばね線に取り付けられた小さな磁石の動きから登録され、解釈可能なグラフとして表示されます。データはいつでも記録でき、自由に利用できるソフトウェアを使用して分析することができます。一定のベースラインペーシングとは別に、スケジュールされたプロトコルを実行して、それらの耐火性期間、刺激閾値、一時停止後増強、および力 - 周波数の関係を機能的に評価することができる。
個々の心臓から複数の心筋スライスを培養するこの長期の生体模倣体は、ヒトおよび動物組織の両方における将来のエクスビボ研究への道を開き、心血管内科における治療的および心毒性薬物効果のスクリーニングを容易にする。既に様々な実験的アプローチ2、12、13、15に適用されている。ここでは、ヒト組織の調製について詳細に段階的に説明し、頻繁に遭遇する培養上の問題に対する解決策を提供する。
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Protocol
ここに記載されている実験のための組織コレクションは、ミュンヘン大学およびルール大学ボーフムの治験審査委員会によって承認されました。研究はヘルシンキ宣言ガイドラインに従って実施された。患者は、組織採取前に書面によるインフォームドコンセントを与えた。
1. 組織取得
- 心臓移植または心臓手術を受けている患者からヒト組織を得る。
- 組織を調達する前に、2Lの心筋麻痺溶液(さらにスライスバッファー(表1)と呼ばれる)を調製する。
- 4cm×4cmサイズの経壁左心室(LV)生検を得た後、直ちに(切除後5分以内に)約70mLの冷(4°C)スライスバッファーを含む閉鎖可能なプラスチック製の使い捨て滅菌ビーカーに組織を置く。4°Cに保ちます。
メモ:このプロトコルで使用されるスライスバッファーは、組織の冷蔵保存(4°C)を最大36時間可能にします。これにより、実験室の近くにない診療所からの組織の冷たい輸送が可能になります。しかし、24時間≤輸送時間が最適であることが証明されています。
2.アガロースとビブラトームの準備
- 十分な栽培室が準備され、滅菌されていることを確認してください(図1A)。
- チャンバーとグラファイト電極を10%イソプロパノール溶液1Lに沈め、一晩攪拌する。翌日、チャンバーを100%イソプロパノール溶液に3分間移し、グラファイト電極を120°Cで10分間オートクレーブした。
- チャンバーとグラファイト電極を層流フードの下で風乾させます。
- ロッカーの使用可能な位置に従って、回路基板を各チャンバーに取り付けます。メーカーの説明書に従って、2つのグラファイト電極を回路基板に配置します。
- 汚染を防ぐために、チャンバーの上に35 mmのペトリ皿の蓋を置きます。
- システムをコンピュータに接続して、37°Cおよび5%CO2のインキュベーター内にMyodish培養システム(材料表を参照)をセットアップします(図1B)。
- スライスバッファー中で4%低融点アガロースを調製する(グルコースなし; 表2)。アガロースは4°Cで6ヶ月間保存することができる。
- 実験当日、80°Cに設定したウォーターバスを用いて原液量のアガロース溶液を融解した。 量にもよりますが、融解には約30分かかります。
- アガロースが液体の場合は、8 mLの液体アガロースを10 mLのシリンジに吸い込み、さらに2 mLの空気を入れます。シリンジを滅菌キャップで閉じ、37°Cの水浴中に20分間逆さまに置き、アガロースが固化するのを防ぎ、サンプルの温熱損傷を防ぐためにその温度を平衡化します。
- 存在する場合は、組織スライスの少なくとも30分前にビブラトームの水冷装置をオンにして、十分な冷却能力を可能にする。水循環の温度を4°Cに設定した。
メモ:ここで使用した切断トレイと冷却プレートには、どちらも水循環が組み込まれていました。これは、冷却し、汚染リスクを低減するために強く推奨されます。しかし、冷却技術として氷を使用することも可能である。また、プロトコルのこの時点で、水冷装置をビブラトームの切断トレイおよび/または冷却プレートに接続する必要はありません。 - ビブラトームのスライストレイとサンプルプレートを洗浄するには、すべての表面を100%イソプロパノールで少なくとも3分間洗い流します。
メモ:使用するビブラトームシステムによっては、ビブラトームのセットアップが異なる場合があります。セットアップおよびブレード校正方法の詳細については、実験室に存在するビブラトームのマニュアルを参照してください。 - 切断トレイをスライスバッファで最大90%〜95%満たします。現在使用されているセットアップでは、これは約400mLに相当します。水冷装置のチューブをビブラトームの切断トレイと冷却プレートのバルブに接続します。
- 100%イソプロパノール溶液に5秒間浸して、調製に必要なすべてのツールを消毒します。イソプロパノール溶液から工具を取り外し、層流フードの下で風乾します。
3. サンプルのトリミングと埋め込み
- 組織サンプルをコールドスライスバッファーで満たされた100 mmペトリ皿に移します。皿を冷却プレートの上で4°Cに保ちます(クーラーに接続するか、氷の上に置きます)。
- ピンセットで心内膜を保持し、はさみを使用して心内膜組織を約3mm切り取ることによって心内膜線維柱帯を除去する。同様に、心外膜の下にある過剰な脂肪組織がある場合は取り除きます。
- 切断した組織サンプルを、心内膜側を上にして、正方形の位置に固定された4本の0.9 mm x 70 mm 20 G針(0.9 cm x 0.9 cm; 図1C、D)。各針先の対角線の端が内側を向いていることを確認します。これは固定を強化し、心筋の損傷を防ぎます。
警告: 上記の正方形の向きは、予想される優勢なミオファイバー方向と直交している必要があります。 - メスを使用して4本の針の正方形の外側にある余分な組織をすべて切り取ります。元のサンプルのサイズが許す場合は、同じ生サンプルからのこの調製中に2つの心筋組織サンプルを使用します。
- ピンセットを使用して、トリミングしたサンプルを滅菌組織の上に置き、サンプルに残っている余分なスライスバッファーを除去します。サンプルの乾燥を防ぐため、サンプルを組織上に 10 秒以上保持しないでください。
- サンプルを35 mmのシャーレに入れ、ブレードが心筋細胞の位置合わせに垂直に切り込み、心外膜が下を向くようにします。試料作製に2つのサンプルが含まれている場合は、サンプルが中央に配置され、互いに接触していないことを確認してください。
- ウォーターバスからアガロースシリンジを取り出し、サンプルをアガロースに浸します。(図2A)。アガロースを冷却プレート上で5分間固化させます。サンプルはペトリ皿と接触したままでなければならず、切断面が優勢な心筋線維方向に平行になるようにします。
警告: 気泡を防ぐため、シリンジを完全に空にしないでください。サンプルの浸漬中にシリンジに残るアガロースの量に注意してください。サンプルを含む皿に気泡がある場合は、気泡を慎重にシリンジに戻します。
4. サンプルを切断トレイに置く
- サンプルを含む固化したアガロースをヘラまたは同様のツールを使用して35 mmのシャーレから取り出し、サンプルとシャーレの側面の間に挟み込みます。サンプルを覆ったままメスを使ってアガロースの一部を切り取ります。
警告:アガロースをあまり取り除かないでください。X / Z平面の長辺と短辺に少なくとも5mmのアガロースが残っているはずです。
メモ: 手順 4.2 ~ 4.4 は、すばやく連続して実行する必要があります (つまり、最大 5 秒)。開始する前に、必要なすべてのツールを手の届くところに保管してください。配置後にサンプルを再配置することはできません。空気や湿気への接着剤の暴露を制限するようにしてください。空気や液体と接触すると接着剤が固まり、使用できなくなります。 - ピペットを使用して、切断プラットフォームの中央とその周囲に60μLの接着剤を配置して分配します。
- ピンセットを用いて、アガロースに含まれる試料の心外膜側を接着領域の上に置きます。位置を変更しないでください。サンプルの心内膜側はアガロースで見えなければなりません。接着剤を1分間固めます。サンプルを含むアガロースを鈍い工具(ピンセットなど)で上から静かに押しながら、アガロースへの切断や損傷を防ぎます。
- サンプルプラットフォームを、スライスバッファーで満たされたビブラトームの切断トレイ内の指定された位置に置きます。
5. ビブラトームの開始
- 振動振幅を 1 mm、初期切削速度を 0.07 mm/s に設定します。スライスの厚さを300μmに設定してスライスを切断します。
- ブレードがアガロースのみを切断する限り、切断速度を最大(この場合は1.50mm/s)まで上げます。ビブラトームが組織を切断し始めたらすぐに、速度を直ちに0.07mm/sに下げてください。
メモ:サンプル中に大きな線維性領域がある場合など、組織がスムーズにスライスされない場合は、切断振幅を最大1.5mmまで増やし、切断速度を0.04mm/sに下げると役立ちます。
6.スライス手順中の培地およびインキュベーターの準備
- 各培養チャンバを2.4 mLの完全な培養培地で満たします(表3)。
- 培地を充填した培養チャンバーを培養系上に置き、37°C、5%CO2、21%O2、湿度80%に設定したインキュベーター内に置いた。培地を少なくとも20分間平衡化する。
- 栽培システムをコンピュータに接続し、対応するソフトウェアプログラムを起動します。
- ロッカー速度を60rpmに設定し、刺激パラメータ(刺激パルスと周波数)をプリセットします。ヒト心臓スライスの場合、標準刺激を、3 msの正電流、1 msの一時停止、および3 msの反転電流パルスからなる50 mA電流の二相性インパルスに設定し、ペーシングレートは30 mb/min(BPM)です。
注:よく保存された組織では、標準的な刺激閾値は約15mAです。信頼性の高い刺激を確保し、刺激閾値の可能な増加を考慮するために、電流を刺激閾値を2〜3倍超える値に設定することが推奨される。 - ソフトウェアの電極インジケータをチェックして、栽培チャンバの電極が正しく機能していることを確認します。
注:栽培ソフトウェアのチャンネルインジケータが赤に変わるたびにアクションが必要です。この場合、バイポーラパルス電荷はバランスが取れていません。
7. スライスの準備
注:初期の心内膜下スライスは、一般に組織培養には適しておらず、不均一な形態のために廃棄する必要がある。最初の5〜10スライスの後、スライスの質感と形態が改善されます。理想的なスライスは、少なくとも1 cm x 1 cmであり、線維性パッチがないか、または制限されているだけで、断片化されておらず、均質な繊維配向を有する(図2B、D)。間質性線維症は、筋細胞線維の間に位置し、しばしば障害のあるヒト心筋に存在する。驚くべきことに、これは栽培の成功の否定的な予測因子ではありません。
- スライスが乾燥しないように、5cmのペトリ皿の蓋に十分な量のコールドスライスバッファーを注ぎます。コールドスライスバッファーを入れたシャーレの蓋にスライスを置きます。
- ピンセットを使用して組織からアガロースを分離します。組織に触れないようにしてください。組織に損傷を与えると培養の成功率が低下するため、組織を慎重に取り扱います。
- 光源に対する綿密な検査によって心筋線維の方向を決定する。これは、ステップ7.6でプラスチック三角形を組織に取り付けるときに重要です。
メモ: 手順 7.4 および 7.5 は、5 秒以内にすばやく連続して実行する必要があります。 - 栽培チャンバ内の組織を固定するために、接着剤を使用してサンプルに2つのプラスチック三角形を取り付けます。
- 滅菌ペトリ皿の蓋に1μLの接着剤を置きます。フックピンセットを使用して、オートクレーブ処理されたプラスチック製の三角形の1つを拾います。三角形の前端を接着剤に素早く浸し、三角形を心筋細胞の位置合わせに垂直にサンプルに貼り付けます。もう一方の三角形についても同じ手順を繰り返します。
- 三角形の幅を超える組織をメスで切り取ります(図2C)。2つの三角形が取り付けられたスライスを切断トレイのスライスバッファに戻します。
注: 栽培チャンバーを満たすのに十分なスライスが準備されるまで、手順 7.2 ~ 7.5 を繰り返します。収縮の悪いスライスを置き換えることができるように、いくつかの追加のスライスを準備することをお勧めします。
8. スライスのマウント
注:後荷重は、栽培チャンバ内のスプリングワイヤーの剛性によって決定されます。スプリングワイヤーの太さに基づいて、3つの異なるタイプが利用可能です。
- インキュベーターから培地充填培養室を取り出す。準備したスライスの1つを選択し、各ピンに1つの三角形を接続してチャンバに挿入します。
- サンプルサイズに応じて取り付けピン間の距離を調整します。サンプルが培地に浸されていることを確認してください。チャンバーをインキュベーター内の栽培システムの指定されたソケットに戻します。
警告: ティッシュを伸ばしすぎたり、スプリングワイヤーを曲げすぎたりしないでください。 - 皿をロッカーに置いた後のプリロード張力を設定します。
- 調整ネジを反時計回りに回して予荷重を下げます。コンピュータ画面上の対応するグラフのベースラインがもう変更されなくなるまで、これを行います。
- 調整ネジを時計回りに回して、予荷重を慎重に増やします(つまり、張力を上げます)。剛性が最も高いチャンバの場合、グラフ内の対応するベースラインが 1000 ~ 1200 単位増加し、1 mN の予荷重に相当します。
注:正確な調整は、栽培チャンバの個々のばね定数に依存し、製造元の指示に従って実験前の較正によって決定することができます。記録ソフトウェアにより、個々のチャンバ校正を考慮することができ、力がμNで均一に表示されるようになります。栽培開始時から電気刺激を加えることをお勧めします。そのため、プリロード調整中にスライスが収縮し始める可能性は十分にあります。この場合、拡張期ベースラインに着目して予負荷を評価します。
9. メディアの変更
- 表3の処方に従って栽培培地を調製した。培地を使用する直前に、50 μLのβ-メルカプトエタノール(50 mM)を50 mLチューブに加えます。4°Cで保存する。
- 2日に1回、栽培培地を一部交換する。心筋スライスの長期培養が望まれる場合は、2日ごとに培地をリフレッシュする。
- 新鮮な培地を37°Cのウォーターバスまたは熱風インキュベーターで30〜45分間予備温める。培養槽から培養室を取り出し、層流フードの下に置きます。
警告: 低温による過度な拘縮を防ぐために、チャンバーと培地を 37 °C (> 35 °C) で暖かく保つことが不可欠です。あまり明確な損傷は、培地交換後数時間以内に拡張期緊張の増加として存在し得る。これは回復しているように見えるかもしれませんが、ストレスが繰り返されると劣化が蓄積する可能性があります。 - 培養チャンバから培地を取り出し、チャンバ内に約0.8 mLを残す。同じチャンバーに1.6 mLの新鮮な培地を加える。培地の総容量は、チャンバーあたり約2.4mLでなければならない。
- チャンバーのカバーを背面に置き、栽培チャンバーをそれぞれの位置に戻します。
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Representative Results
心筋スライスの収縮は、培養チャンバを対応するコネクタに挿入した後、コンピュータ画面に表示された(図3)。ヒト心筋切片の収縮は、刺激直後に開始された。スライスは5〜10分間過収縮した。これは、損傷組織画分の強直拘縮によって引き起こされる拡張期力の増加として見られた。このプロセスは、1〜1.5時間以内に様々な程度に戻された。安定化後、ヒトLV組織スライスは、刺激時に1mN〜3mNの間で変化する痙攣力を示した。収縮期は収縮力の強い増加として示され、続いて収縮力の同様に急激な減少を伴う拡張期が続く。
心筋切片の収縮は、培養ソフトウェアによって記録され、指定されたファイルに保存された。生成された各生データファイルは、データの分析と定量化を容易にするために、読み取り可能なAxonバイナリファイル形式(.abf)に変換されました。最初の分析では、.abf ファイルが適切なプログラムで開かれました。この期間中の平均収縮振幅を確立するために、約5分間の収縮データが選択されました。これは、記録されたデータファイル内の複数の時点に対して行われました。これらの収縮値を経時的にプロットすると、対照および実験環境での収縮発達を比較するのに有用なグラフが得られました。生成されたスライスの性能に関するより高度な洞察を得るために、刺激プロトコルが実行されました。約45分かかるこれらのプロトコールの間、収縮カップリングのパラメータを評価するために刺激パラメータを変更した。
現在の刺激プロトコルは、一時停止後増強、刺激閾値、力-周波数関係、および不応期間の4つの異なるセクションで構成されていました(図4、 表4)。一時停止後増強の間、刺激は、3、12、50、または120秒のいずれかの短い停止後に再開される。刺激閾値を決定するために、刺激電流は10秒ごとに3mAのステップで増加し、8mAから始まり90mAまで増加する。この試験では、スライスごとに最小の刺激電流を求めることができます。これは、刺激プロトコル外の一般的な刺激設定を変更しない。力-周波数関係は、刺激周波数(20、30、45、60、80、100、120、150、180、210、および240BPM)の段階的な増加によって評価され、各ステップのそれぞれの持続時間は並行して短縮される。最初の2つの周波数設定を除いて、このレジメンは各ステップ中に20〜40回の収縮をもたらします。各スライスの耐火期間は、正常な刺激(S1;30BPM)の後に早期刺激(S2)を送ることによって評価される。S1 ~ S2 間隔は 10 秒ごとに短縮されます。
薬理学的介入を試験するためのツールとして提示された培養系の可能性を実証するために、同じ患者からエキソビボヒトLV組織切片を調製し、培養の2週間後に細胞内カルシウムイオン(Ca2+)レベル(n = 1)に影響を与える薬理学的薬剤に供した。L型Ca2+チャネルアンタゴニストニフェジピンは、心筋細胞へのCa2+流入を阻害し、したがってCa2+の細胞内可用性を低下させ、収縮性を低下させる17。その血管拡張作用のために, ニフェジピンは、抗高血圧薬として使用されています.Ca2+チャネルアンタゴニストの薬理学的差異を実証するために、カルシセプチンを比較のために調査した。カルシセプチンはまた、L型Ca2+チャネルアンタゴニストであり、デンドロアスピスp.ポリレピス毒18から抽出される。したがって、ニフェジピンの負の変力作用を共有する。しかしながら, カルシセプチンは、異なる結合特性を有し、ニフェジピンと比較してより強力です19.Ca2+の利用可能性の正および負の変調を研究するために、我々はまた、カルシウムチャネルアゴニストBay−K8644(1,4−ジヒドロ−2,6−ジメチル−5−ニトロ−4−(2−[トリフルオロメチル]フェニル)ピリジン−3−カルボン酸メチルエステル)20を試験した。
3つのスライスをそれぞれニフェジピン(125 nM)、カルシセプチン(70.8 nM)、およびBay-K8644(417 nM)で処理し、4番目のスライスは薬物を受け取らなかった(対照)。一般的な刺激パラメータ(50mA電流、3ms持続時間の二相性パルス、1ms間隔、および30BPMペーシングレート)の下での収縮力を、治療前後に比較した。さらに、治療前に、刺激プロトコルを実行して、一時停止後増強、刺激閾値、力-周波数関係、および不応期間のベースライン値を評価した。治療の30分後、第2の刺激プロトコールを実行した。個人間差を排除するために、各スライスの収縮振幅を治療前にそのベースラインレベルに正規化した。ベースライン(すなわち、100%)は、治療前刺激プロトコールの開始前の最後の5つの収縮サイクルを分析することによって決定された。
一般的な刺激によるスライスの収縮を分析すると、Ca2+ アンタゴニスト(ニフェジピンおよびカルシセプチン)で処理したスライスの収縮力は、治療後10分以内に減少し(図5)、治療後20分まで効果が認められた。対照的に、電圧ゲートCa2+ チャネルアゴニストBay−K8644は、処理されたスライスの収縮力を増加させた。コントロール スライスに注目すべき変更が示されませんでした。刺激プロトコル中に生成された収縮データを同様の方法で分析した。ここで、治療前に行われた刺激プロトコール(前処理)によって生成されたデータを、同じ刺激プロトコールの治療後データと比較した。
前に論じたように、刺激プロトコルは、一時停止後の増強の評価から始まった。休止中、追加のCa2+は筋小胞体(SR)によって取り込まれ、これは休止後の最初の刺激で放出される。したがって、休止後増強は、SRからの細胞内Ca2+放出を反映する。したがって、このパラメータは、リアノジン受容体によってSRから放出されるCa2+の相対的寄与を評価するために使用することができる。刺激休止後のスライスの増強を評価するために、休止後の最初の収縮の強度を、それぞれの休止前の平均収縮で割った。コントロールスライスには目立った変化は見られなかった(図6A)。L型Ca2+チャネルの阻害は、少なくとも50秒の休止後に最初の収縮の増強をもたらし(図6B,D)、細胞内Ca2+放出の全収縮性に対するより高い相対的寄与を反映していることが観察された。反対の効果は、Bay-K8644で処理したスライスで見られ、これはL型Ca2+チャネルを介した細胞外Ca2+の侵入を刺激する(図6C)。
力-周波数関係は、ペーシングレートを180BPMまで連続的に増加させることによって評価された。よりよく視覚化するために、異なる刺激周波数での収縮力を、同じプロトコル内の30BPMでのベースライン収縮(=100%)に正規化した。データ分析は、カルシセプチンによる治療は、治療前および治療後のデータを比較した場合、刺激頻度の増加時に刺激に従うスライスの能力を変化させないことを示した(図7B)。コントロールスライスに変化は認められなかった(図7A)。カルシセプチンとは対照的に、ニフェジピンはより高いペーシングレートでの収縮性の増加を防ぎ、最大捕捉率を80BPMに低下させた(図7D)。Ca2+ チャネルアゴニストBay-K8644で処理したスライスは、非常に低い刺激周波数で増加した収縮力を示した(図7C)。しかし、50BPMより高い周波数では、収縮力は前処理条件の間よりも低いように見えた。刺激閾値および不応期間も、治療前および治療後に決定した。しかし、差は観察されず、したがってデータは示されていない。
図1:必要な材料と栽培システムの概要(A)緑色の回路基板に接続された空の栽培室。回路基板(1)は、センサで収縮を測定し、コントローラにデータを送信する。(B)揺れるメインプレートの上に置かれた8つの充填されたチャンバー。シャーレ蓋(35mm)は、チャンバーを覆うために使用されます。(C)経壁心筋サンプルをトリミングするために必要な(外科的)ツール。さまざまなピンセット、ビブラトームに必要なブレード、トリミングに役立つゴムパッチが描かれています。(D) 4本の0.9 mm x 70 mm 20 G針をプラスチックの固いブロックで正方形の位置(0.9 cm x 0.9 cm)に固定します。このコンストラクトを使用すると、トリミング時のサンプルの損傷や動きを防ぎ、必要な寸法の組織ブロックが得られます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)35mmのシャーレ内の固化した低融解アガロースに埋め込まれた2つの心筋組織ブロック(約1 cm x 1 cm x 1 cm)。デモンストレーションの目的で、ブタLV組織を使用した。(B)サンプルを埋め込んだアガロースブロックをペトリ皿から取り出し、トリミングし、ビブラトームの切断プラットフォームに接着した。ここで、ブタLV組織は、実証目的で使用した。均一な組織色と、赤い矢印で示された白い線維性組織の欠如に注目してください。(c)スライス後、アガロースを慎重に除去し、プラスチック三角形(1)を心筋線維の方向に垂直に接続する。赤い線は心筋線維の方向を示す。(d)ヒトLV組織を調製し、スライス内に白色の線維性組織を示した。これは必ずしも栽培の成功率を低下させるものではありません。ただし、線維症を表示しないスライスを使用することをお勧めします。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:栽培ソフトウェア 使用されるチャンネル数(最大8つ)に応じて、収縮登録は最大3つの指定されたウィンドウ(図に2つ見える)で視覚化されます。各栽培室は、1つの収縮グラフとして表示される。設定ウィンドウでは、刺激パラメータを変更し、所望の実験状況に合わせて調整することができます。このウィンドウでは、選択した刺激プロトコル/スケジュールを開始または停止することもできます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:典型的な刺激プロトコル中の5つの心筋スライスの収縮の読み出し。 すべてのパネルで、個々のスライスは同じ色で表示されます。(A)一時停止後増強は、それぞれ3、12、50、および120秒の短い刺激休止後の最初の収縮を評価する。(b)10秒毎に3mAのステップで刺激電流を8mAから80mAに増加させて刺激閾値を決定する。(C)各スライスの力-周波数関係は、刺激周波数を12BPMから240BPMに段階的に増加させることによって評価される。刺激期間の持続時間は、各周波数で一定の拍数を維持するために、より高い周波数で短くなる。(d)不応期を評価するために、スライスは、先行刺激に対する減少間隔で時期尚早刺激(S2)に曝される(S1)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:L型Ca2+チャネル影響剤による治療前後の収縮力の解析。全てのデータ(n=1)をベースライン収縮性(処置前の5つの別々の拍動の平均(0))に正規化した。L型Ca2+チャネルアンタゴニストニフェジピン(125nM)、カルシセプチン(70.8nM)、およびL型Ca2+チャネルアゴニストBay-K8644(417nM)を収縮ヒトLV心筋切片に添加した。コントロールスライスは処理を受けなかった。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:処理スライスおよび対照スライスの一時停止後増強。 休止後-増強の差は観察されなかった(ベースライン対治療後;n = 1)。ここで、一時停止後の最初の収縮の振幅は、それぞれの一時停止前の平均収縮振幅に正規化した。ベースラインは100%に設定され、最初の一時停止が開始される前の最後の5サイクルの平均収縮強度に似ています。Y 軸には、さまざまな期間の一時停止後の正規化された最初の収縮が表示されます。X 軸は、ベースラインと一時停止の長さを示します。(A)処理せずにスライスをコントロールする。(b)カルシセプチン処理。(C)ベイ-K8644治療。(d)ニフェジピン処理。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:力周波数関係の解析 収縮データ(n=1)は、それぞれのプロトコル内の30BPMにおける収縮力(=100%)に正規化した。(A)対照スライスをいかなる物質でも処理しなかった;しかし、栽培の他のすべての側面は、処理されたスライスのものと同じであった。(b)1つのLV心筋切片のカルシセプチン治療。(C)ベイ-K8644治療。(d)ニフェジピン処理。80BPMを超える刺激周波数におけるこのスライスの収縮力に関するデータは、収縮が刺激周波数に従わなかったため、省略した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:輸送およびスライス手順中に使用されるスライスバッファーの構成。 アガロースの調製のために、グルコースは省略される。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:4%アガロースゲルの組成。 このグルコースフリーの低融点アガロースゲルは、組織サンプルの包埋に使用されます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:培養用培地の調製。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4:刺激プロトコルの詳細。 刺激プロトコルは4つの部分で構成されており、プロジェクトのニーズに合わせてすべて変更できます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
過去には、心臓血管研究は心筋細胞の培養において大きな進歩を遂げました。しかし、無傷の幾何学的形状を有する心筋細胞の3D培養はまだ十分に確立されていない。心筋組織の エクス ビボ培養に適用された以前のプロトコルと比較して、ここで説明したプロトコルは、組織の インビボ 環境により密接に似ている。さらに、前負荷および後負荷の適用は、より生体模倣的な環境を可能にする。組織の収縮データと収縮パラメータの連続記録を完全に分析し、理解することができます。
同様のセットアップを用いたエクスビボ心血管組織培養技術の数は、11、21、22に制限されている。公開されている心筋スライス培養のための同様の技術は、心筋スライス10の培養のために6ウェルプレートを使用する。しかし、この特定のセットアップの重要な制限は、スライスが前後の負荷にさらされず、組織を取り扱う必要なしに経時的な収縮の詳細なビューをもたらさないことです。ここで説明した方法は、組織の損傷や感染のリスクを軽減します。さらに、関心のある物質が栽培に添加されるたびに起こりうる収縮力の変化を包括的に把握できます。各スライスの通常の収縮力の分析に加えて、現在のセットアップでは、事前に定義されたプロトコルを定期的に実行することができます。これにより、培養組織の異なる関連パラメータのデータ収集が可能になる。
プロトコル内の重要なステップ
組織の損傷は避けなければならず、これはすでに外植手術中に起こり得る。組織が切除後に直ちに冷蔵溶液に移されない場合、これは損傷した組織サンプルをもたらし得る。ここで説明するプロトコルには、信頼性が高く再現性のある結果を得るために不可欠ないくつかの手順が含まれています。アガロース組織包埋化合物は、プロトコールの開始前の融解プロセス中にグルコースの可能なカラメル化を防ぐために、グルコースを含まないスライス緩衝液を使用して調製されなければならない。アガロースを37°Cのシリンジでインキュベートするのではなく、80°Cの水浴から直接アガロースを使用することによって引き起こされる温熱療法による損傷を避けることが重要です。 温度は、代謝を低下させ、虚血を最小限に抑えるために、保存および切断中に4°Cでなければなりません。また、組織は、プラスチックの三角形を取り付けるために切断トレイとペトリ皿の間を移動するときに、組織自体ではなくアガロースをつかむことによって、慎重に取り扱う必要があります。これらの三角形が心筋線維の方向に対して適切な方向に付着していることが最も重要である。三角形のミスアライメントは、組織の損傷をもたらす。
一般に、新しく切断されたスライスの刺激閾値は10〜20mAであり、電流は慎重に増加させるべきである。高すぎる電流による組織の過剰刺激は、不可逆的なサンプル損傷にもつながります。刺激が開始されると、培養チャンバを揺らすことによる組織攪拌が必要であり、組織への酸素および栄養素の適切な利用可能性を確保するために、5分以上停止してはならない。
トラブルシューティングと変更
ハイパー拘縮
心筋組織サンプルの過度拘縮は、議論されたプロトコールの主要な排除基準の1つである。これは、心筋スライスの調製の前後に起こり得る。調製前に、触診時に組織が硬く感じられた場合、調製物の少なくとも70%において過収縮が観察された。組織試料の過拘縮は、ロッカーへの挿入時にも起こり得、これはおそらく、組織の品質または患者の疾患状態に依存する。過拘縮は、組織の刺激中の拡張期緊張の増加として見ることができ、心臓虚血における損傷した心筋細胞の強壮短縮に対応する。刺激中の過拘縮は進行性であり得、それによって収縮は12mNの検出限界を超える。しかし、過拘縮はまた、30〜60分以内に自発的に逆転し、組織が回復し得ることを示唆している。組織の回復を改善するために、プリロード設定は、インキュベーションの1時間後、ならびに調製後の2日目、4日目、および6日目に再調整(すなわち、ステップ8.3を繰り返す)されるべきである。過拘縮は、試料の刺激された収縮の有無にかかわらず存在し得る。しかし、1時間以内に収縮が観察されない場合は、サンプルを使用すべきではありません。この場合、組織は回復できない程度に過収縮しているか、そうでなければ損傷を受けている。一般に、提示されたプロトコールによるヒト心筋スライスの培養は、90%の成功率を有することが示されている。
予想される収縮力の変化
多数の要因(例えば、患者、調製物、組織損傷)に応じて、最初に許容可能な収縮を示した筋スライスは、最初の24時間の間に収縮振幅の進行性低下を経験する可能性がある。実際、この行動は、人間の末期の失敗した心臓から得られたスライスに対しても正常であると考えることができます。スライスの予荷重を毎日次の3日間再調整すると、この問題が緩和され、収縮が改善されることが見出された。しかし、24〜48時間後、収縮性は再び増加し始めるはずです。収縮は、栽培の最初の日以内に最初に観察されたレベルに戻らないことに注意してください。
培地交換の直後に、サンプルがインキュベーターに戻されると、収縮は通常、著しく増加した振幅を示す。インキュベーターの開閉は、CO2 レベルを低下させるため、この増加に寄与する。これは、重炭酸緩衝栽培培地内部のpHを上昇させ、これはスライスの正の変力応答を引き起こす。培地交換に続いて、スライスの収縮力は、初期値に達するか、またはそれを超えるまで数時間減少することが多い。刺激プロトコルが培地交換によって影響を受けるのを防ぐために、刺激プロトコルは、培地交換後少なくとも1時間まで実行すべきではない。
メソッドの制限
本技術の利点は、ヒト心筋組織に対する以前の培養方法と比較して、収縮組織に前後負荷を適用(および調節)する可能性である。ただし、この荷重はばね定数とスライス寸法から推定できますが、壁張力の観点から適用荷重を定量化することは困難です。心筋組織の生存率と組織試料の収縮振幅との間には正の関係があると仮定される。しかし、現在のところ、個々のスライスをチャンバに取り付ける前に生存率試験を可能にする方法はありません。比色MTT染色を、培養に使用されていない切断スライスに対して実行して、心筋細胞の生存率を決定することができる。生存可能な細胞では、NADPHは紫色のホルマザン結晶中の黄色MTT塩を減少させる。別の制限は、現在、栽培培地中の栄養素が塩基性成分に限定されていることである。したがって、栄養素および循環因子は、組織が得られた in vivo 環境とは異なる。しかしながら、培地は、必要に応じて補充または修飾することができる。
この方法の潜在的な用途
この方法には、心毒性および薬物検査の観点、ならびに心臓病の病態生理学の理解の両方において、いくつかの潜在的な用途がある。第1に、議論されたプロトコルで使用されるシステムは、薬物および心毒性スクリーニングに使用することができる。プログラム可能な刺激プロトコルの助けを借りて、薬物投与に応答して生理学的変化を分析することができる。不応期の解釈に関しては、これは機能的パラメータであり、活動電位持続時間に対する薬物の効果を厳密に反映していないと考える必要がある。第2に、培養チャンバは、免疫細胞と組み合わせた心筋の種々の共培養実験に利用することができる。この共培養を用いることにより、免疫細胞分泌因子が心筋収縮に及ぼす直接的な影響を評価することができる。最後に、非移植性心筋症サンプルも培養することができるが、これらの非移植組織サンプルは一般に小さく、したがって処理がより困難である。それにもかかわらず、これは新しい治療標的の同定および標的薬の開発の可能性を開くかもしれない。また、患者固有の組織特性評価にこの技術を使用することも考えられ、個別化医療に一歩近づきます。さらに、提示された方法は、非ヒト心筋組織に対して使用することができ、その例はブタおよびウサギである。小型哺乳類(マウス/ラット)の高い生理学的心拍数は、議論されたセットアップを用いた心筋培養の条件下では、その後の高いO2 要求量を満たすことができないため、得られないことを考慮する必要があります。これにより、生理学的に近い環境は、これらの場合に模倣することが困難である。
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Disclosures
JH、PS、DM、およびKLには開示すべきものは何もありません。ADとTSは、Myodish栽培システムを提供するInVitroSys GmbHの株主です。
Acknowledgments
研究は、DZHK助成金81Z0600207(JH、PS、およびDM)および81X2600253(ADおよびTS)によって資金提供されました。
著者らは、Claudia Fahney、Mei-Ping Wu、Matthias Semisch氏に、セットアップの準備における支援と、組織培養の定期的なメンテナンスに感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
