Summary
Vi presenterar ett protokoll för ex vivo odling av human ventrikulär myokardiell vävnad. Det möjliggör detaljerad analys av sammandragningskraft och kinetik, samt applicering av för- och efterbelastning för att efterlikna den fysiologiska miljön in vivo närmare.
Abstract
Kardiomyocytodling har sett ett stort antal utvecklingar, allt från tvådimensionell (2D) cellodling till iPSC-härledda organoider. År 2019 demonstrerades ett ex vivo-sätt att odla myokardskivor erhållna från humana hjärtprover, samtidigt som man närmade sig in vivo-tillstånd av myokardiell sammandragning. Dessa prover kommer främst från hjärttransplantationer eller placeringar av vänsterkammarassistansanordningar. Med hjälp av ett vibratom och ett specialutvecklat odlingssystem placeras 300 μm tjocka skivor mellan en fast och en fjädertråd, vilket möjliggör stabil och reproducerbar odling i flera veckor. Under odlingen stimuleras skivorna kontinuerligt enligt individuella inställningar. Sammandragningar kan visas och registreras i realtid, och farmakologiska medel kan lätt appliceras. Användardefinierade stimuleringsprotokoll kan schemaläggas och utföras för att bedöma vitala sammandragningsparametrar som potentiering efter paus, stimuleringströskel, kraftfrekvensrelation och eldfast period. Dessutom möjliggör systemet en variabel för- och efterspänningsinställning för en mer fysiologisk odling.
Här presenterar vi en steg-för-steg-guide om hur man genererar en framgångsrik långsiktig odling av mänskliga vänstra ventrikulära myokardskivor med hjälp av en kommersiell biomimetisk odlingslösning.
Introduction
Under det senaste decenniet har in vitro-odling av myokardceller gjort stora framsteg, allt från 2D- och tredimensionella (3D) tekniker till användning av organoider och inducerade pluripotenta stamceller differentierade till hjärtmyocyter 1,2,3. Ex vivo- och primärcellsodlingar har visat sig vara av stort värde, särskilt för genetiska studier och läkemedelsutveckling 4,5,6. Att använda mänskliga vävnader förbättrar resultatens translationella värde. Långsiktig 3D-odling av myokardvävnader med intakt geometri är dock inte väletablerad. Den intakta geometrin är en nyckelfunktion för att efterlikna in vivo-förhållanden, eftersom korrekt hjärtfunktion, kommunikation mellan olika celler samt cell-matrisinteraktioner är förutsättningar. Odling av myokardvävnad gick igenom olika utvecklingsfaser. Framgångsgraden och stabiliteten för odling av ex vivo myokardvävnad var initialt ganska låg, men de senaste metoderna har gett lovande resultat 7,8,9,10,11.
var bland dem de första som visade att livskraft och kontraktil prestanda hos mänsklig myokardvävnad kan bibehållas vid ex vivo-cellodling under många veckor7. Deras teknik baserades på tunna vävnadsskivor skurna från explanterat humant myokardium, som monterades i nyutvecklade odlingskammare som gav definierade biomekaniska förhållanden och kontinuerlig elektrisk stimulering. Denna odlingsmetod liknar myokardvävnadens in vivo-funktion och har reproducerats av flera oberoende forskargrupper 2,12,13,14,15. Viktigt är att kamrarna som användes av Fischer m.fl. också möjliggjorde kontinuerlig registrering av utvecklade krafter i upp till 4 månader och därmed öppnade oöverträffade möjligheter för fysiologisk och farmakologisk forskning om intakt humant myokardium7.
Liknande tekniker utvecklades oberoende av andra grupper och tillämpades på humant, råtta, svin och kaninmyokardium 7,10,11. utvecklade därefter en mer fysiologisk metod, som reproducerar det normala kraft-längdförhållandet under en sammandragningscykel, men är mindre lämplig för analys med hög genomströmning16. Som sådan kan det allmänna tillvägagångssättet för biomimetisk odling betraktas som ett ytterligare steg in i minskning, förfining och ersättning (3R) av djurförsök.
Utnyttjandet av denna potential kräver dock standardiserade procedurer, analyser med högt innehåll och en hög genomströmningsnivå. Vi presenterar en teknik som kombinerar automatiserad skivning av levande mänskligt myokardium med in vitro-underhåll i ett biomimetiskt odlingssystem som har blivit kommersiellt tillgängligt (se materialtabell). Med det föreslagna tillvägagångssättet begränsas antalet enskilda skivor som kan genereras från ett enda transmuralt myokardprov endast av bearbetningstiden. Ett prov av tillräcklig storlek och kvalitet (3 cm x 3 cm) ger ofta 20-40 vävnadsskivor som bekvämt skärs med ett automatiserat vibratom. Dessa skivor kan placeras i odlingskamrar som tillhör systemet. Kamrarna möjliggör elektrisk stimulering, vars parametrar kan moduleras (dvs pulsvaraktighet, polaritet, hastighet och ström), samt justering av för- och efterbelastning med hjälp av fjädertrådar inuti kamrarna. Sammandragningen av varje skiva registreras från rörelsen av en liten magnet fäst vid en fjädertråd och visas som en tolkningsbar graf. Data kan spelas in hela tiden och analyseras med hjälp av fritt tillgänglig programvara. Bortsett från den konstanta baslinjepacing kan schemalagda protokoll utföras för att funktionellt bedöma deras eldfasta period, stimuleringströskel, post-paus-potentiering och kraft-frekvensrelation.
Denna långsiktiga biomimetiska odling av flera myokardskivor från ett enskilt hjärta banar väg för framtida ex vivo-forskning i både mänsklig och djurvävnad och underlättar screening för terapeutiska och kardiotoxiska läkemedelseffekter inom kardiovaskulär medicin. Det har redan tillämpats på olika experimentella tillvägagångssätt 2,12,13,15. Här ger vi en detaljerad steg-för-steg-beskrivning av beredningen av mänsklig vävnad och ger lösningar för ofta förekommande odlingsproblem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vävnadsinsamling för de experiment som beskrivs här godkändes av de institutionella granskningsnämnderna vid universitetet i München och Ruhr-University Bochum. Studierna genomfördes enligt Helsingforsdeklarationens riktlinjer. Patienterna gav sitt skriftliga informerade samtycke före vävnadsinsamlingen.
1. Förvärv av mjukpapper
- Få mänsklig vävnad från patienter som genomgår hjärttransplantation eller hjärtkirurgi.
- Innan du skaffar vävnaden, förbered 2 liter kardioplegisk lösning (vidare kallad skivbuffert (tabell 1)).
- Efter att ha erhållit en transmural vänsterkammarbiopsi (L) på 4 cm x 4 cm, placera vävnaden omedelbart (inom 5 minuter efter excision) i en förslutbar steril bägare av plast som innehåller cirka 70 ml kall (4 °C) skivbuffert. Förvaras vid 4 °C.
OBS: Skivbufferten som används i detta protokoll möjliggör kylförvaring (4 °C) av vävnaden i upp till 36 timmar. Detta möjliggör kall transport av vävnaden från kliniker som inte ligger nära laboratoriet. Transporttiderna ≤ 24 h har dock visat sig vara optimala.
2. Förbereda agaros och vibratomet
- Se till att tillräckliga odlingskammare är förberedda och steriliserade (figur 1A).
- Sänk ner kamrarna och grafitelektroderna i 1 liter av en 10% isopropanollösning och agitera över natten. Följande dag överför kamrarna till en 100% isopropanollösning i 3 min och autoklavera grafitelektroderna vid 120 °C i 10 min.
- Låt kamrarna och grafitelektroderna lufttorka under en laminär flödeshuv.
- Fäst ett kretskort till var och en av kamrarna enligt tillgängliga positioner på vippan. Placera två grafitelektroder på kretskortet enligt tillverkarens instruktioner.
- Placera ett 35 mm petriskålslock ovanpå kammaren för att förhindra kontaminering.
- Ställ in det myodiska odlingssystemet (se materialtabell) i en inkubator vid 37 °C och 5 %CO2 genom att ansluta systemet till en dator (figur 1B).
- Förbered 4% lågsmält agaros i skivbuffert (utan glukos; Tabell 2). Agarosen kan förvaras vid 4 °C i 6 månader.
- Smält på experimentdagen en stamvolym av agaroslösning med ett vattenbad på 80 °C. Beroende på mängden tar smältningen cirka 30 minuter.
- När agarosen är flytande, dra upp 8 ml flytande agaros i en 10 ml spruta med ytterligare 2 ml luft. Stäng sprutan med ett sterilt lock och placera den upp och ner i ett vattenbad på 37 °C i 20 minuter för att förhindra att agarosen stelnar och för att balansera dess temperatur för att förhindra hypertermiskador på provet.
- Om det finns, slå på vibratomets vattenkylningsanordning minst 30 minuter före vävnadsskärning för att möjliggöra tillräcklig kylkapacitet. Ställ in temperaturen på vattencirkulationen på 4 °C.
OBS: Skärbrickan och kylplattan som användes här innehöll båda en inbyggd vattencirkulation. Detta rekommenderas starkt för kylning och för att minska föroreningsriskerna. Det är dock också möjligt att använda is som kylteknik. Vattenkylningsanordningen behöver inte heller anslutas till vibratomets skärbricka och/eller kylplatta vid denna punkt i protokollet. - Rengör vibratomets skivbricka och provplatta genom att spola alla ytor med 100% isopropanol i minst 3 min.
OBS: Beroende på vilket vibratomsystem som används kan vibratomuppsättningen skilja sig åt. Se manualen för vibratomet som finns i laboratoriet för information om inställnings- och bladkalibreringsmetoderna. - Fyll skärbrickan upp till 90% -95% med skivbuffert. I det nu använda upplägget motsvarar detta cirka 400 ml. Anslut slangen på vattenkylningsanordningen till ventilerna på vibratomets skärbricka och kylplatta.
- Desinficera alla verktyg som behövs för beredningen genom att sänka dem i en 100% isopropanollösning i 5 s. Ta bort verktygen från isopropanollösningen och lufttorka under den laminära flödeshuven.
3. Trimning och inbäddning av proverna
- Överför vävnadsprovet till en 100 mm petriskål fylld med kall skivbuffert. Förvara skålen på en kylplatta vid 4 °C (ansluten till kylaren eller placerad på is).
- Ta bort endokardiella trabeculae genom att hålla endokardiet med pincett och använda sax för att skära bort cirka 3 mm endokardiell vävnad. På samma sätt, ta bort överdriven fettvävnad under epikardiet om det finns.
- Fixera det skurna vävnadsprovet, endokardiell sida uppåt, till en 2 cm x 2 cm gummilapp med fyra 0,9 mm x 70 mm 20 G nålar som är fixerade i ett fyrkantigt läge (0,9 cm x 0,9 cm; Figur 1C, D). Se till att den diagonala kanten på varje nålspets pekar inåt. Detta förbättrar fixeringen och förhindrar skador på myokardiet.
VARNING: Orienteringen av ovannämnda kvadrat bör vara ortogonal mot den förväntade dominerande myofiberriktningen. - Skär bort all överflödig vävnad utanför fyrkanten med en skalpell. Om storleken på det ursprungliga provet tillåter, använd två myokardvävnadsprover under denna beredning från samma råprov.
- Använd pincett och placera det trimmade provet på en steril bit vävnad för att avlägsna eventuell överflödig skivbuffert som finns kvar på provet. För att förhindra uttorkning av provet, håll inte provet på vävnaden längre än 10 s.
- Placera provet/proverna i en 35 mm petriskål så att bladet skär vinkelrätt mot kardiomyocytinriktningen och epikardiet är vänt nedåt. Om preparatet innehåller två prover, se till att proverna är centrerade och inte rör vid varandra.
- Ta agarossprutan från vattenbadet och sänk ner provet eller proverna i agaros. (Figur 2A). Låt agarosen stelna i 5 min på en kylplatta. Provet /proverna måste hålla kontakten med petriskålen, vilket säkerställer att skärplanet kommer att vara parallellt med den dominerande myokardfiberriktningen.
VARNING: Töm inte sprutan helt för att förhindra luftbubblor. Var uppmärksam på mängden agaros som finns kvar i sprutan under nedsänkning av proverna. När det gäller luftbubblor i skålen med proverna, dra försiktigt tillbaka luftbubblor i sprutan.
4. Placera proverna på skärbrickan
- Avlägsna den stelnade agarosen som innehåller provet eller proverna från 35 mm petriskålen med hjälp av en spatel eller liknande verktyg genom att väva den mellan provet och petriskålens sida. Skär bort en del av agarosen med en skalpell samtidigt som proverna hålls täckta.
VARNING: Ta inte bort för mycket av agarosen. Det bör finnas minst 5 mm agaros kvar på lång- och kortsidorna i X/Z-planet.
OBS: Steg 4.2-4.4 måste utföras i snabb följd (dvs. högst 5 s). Ha alla nödvändiga verktyg inom räckhåll innan du börjar. Ingen omplacering av provet är möjlig efter placering. Försök att begränsa limets exponering för luft och fukt. Kontakt med luft eller vätskor stelnar limet, vilket gör det oanvändbart. - Placera och fördela 60 μL lim i och runt mitten av skärplattformen med en pipett.
- Placera epikardiell sida av provet i agaros ovanpå det limmade området med pincett. Flytta inte om. Provets endokardiella sida måste vara synlig i agarosen. Låt limmet stelna i 1 min. Tryck försiktigt på agarosen som innehåller provet uppifrån med ett trubbigt verktyg (t.ex. pincett) samtidigt som du förhindrar att agarosen skärs eller skadas.
- Placera provplattformen på sitt bestämda läge i vibratomets skärbricka, fylld med skivbuffert.
5. Starta vibratomet
- Ställ in vibrationsamplituden på 1 mm och den initiala skärhastigheten på 0,07 mm/s. Ställ in skivans tjocklek på 300 μm för att skära skivor.
- Så länge bladet bara skär agarosen, öka skärhastigheten till sitt maximala, vilket i detta fall är 1,50 mm/s. Så snart vibratomet börjar skära vävnaden, minska hastigheten till 0,07 mm / s omedelbart.
OBS: Om vävnaden inte skivas smidigt, till exempel om det finns stora fibrotiska områden i provet, kan det bidra till att öka skäramplituden upp till 1,5 mm och minska skärhastigheten till 0,04 mm / s.
6. Medium- och inkubatorberedning under skivningsproceduren
- Fyll varje odlingskammare med 2,4 ml komplett odlingsmedium (tabell 3).
- Placera odlingskamrarna fyllda med medium på odlingssystemet i inkubatorn inställd på 37 °C, 5%CO2, 21%O2 och en fuktighet på 80%. Balansera mediet i minst 20 minuter.
- Anslut odlingssystemet med en dator och starta motsvarande program.
- Ställ in vipphastigheten till 60 varv / min och förinställ stimuleringsparametrarna (stimuleringspulser och frekvens). För mänskliga hjärtskivor, ställ in standardstimuleringen till bifasiska impulser med 50 mA ström, var och en bestående av 3 ms positiv ström, en paus på 1 ms och en 3 ms puls av inverterad ström, med en pacinghastighet på 30 slag per min (BPM).
OBS: I välbevarade vävnader är den typiska stimuleringströskeln cirka 15 mA. För att säkerställa tillförlitlig stimulering och för att ta hänsyn till eventuell ökning av stimuleringströskeln rekommenderas att ställa in strömmen till ett värde som överstiger stimuleringströskeln med två till tre gånger. - Kontrollera programvarans elektrodindikatorer för att verifiera att elektroderna i odlingskamrarna fungerar korrekt.
OBS: Åtgärd krävs när kanalindikatorn i odlingsprogramvaran blir röd. I detta fall är de bipolära pulsladdningarna inte balanserade.
7. Förbereda skivorna
OBS: Initiala subendokardiella skivor är vanligtvis inte lämpliga för vävnadsodling och måste kasseras på grund av ojämn morfologi. Efter de första fem till 10 skivorna förbättras skivstrukturen och morfologin. Den ideala skivan är minst 1 cm x 1 cm, har inga eller endast begränsade fibrotiska fläckar, är inte fragmenterad och har homogen fiberinriktning (figur 2B, D). Interstitiell fibros, som ligger mellan myocytfibrerna, är ofta närvarande i sviktande humant myokardium. Överraskande är detta inte en negativ prediktor för odlingsframgång.
- Häll en tillräcklig mängd kall skivbuffert i ett 5 cm petriskålslock för att säkerställa att skivorna inte torkar ut. Lägg skivorna i petriskålslocket som innehåller den kalla skivbufferten.
- Separera agarosen från vävnaden med hjälp av pincett. Förhindra att du rör vid vävnaden. Hantera vävnaden försiktigt eftersom eventuella skador på vävnaden kommer att minska odlingens framgångsgrad.
- Bestäm riktningen för myokardfibrerna genom noggrann inspektion mot en ljuskälla. Detta är av betydelse när man fäster plasttrianglarna på vävnaden i steg 7.6.
OBS: Steg 7.4 och 7.5 måste utföras i snabb följd, inom 5 s. - Fäst två plasttrianglar på ett prov med lim för att förankra vävnaden inuti odlingskamrarna.
- Placera 1 μL lim på ett sterilt petriskålslock. Använd en krokig pincett för att plocka upp en av de autoklaverade plasttrianglarna. Doppa snabbt triangelns framkant i limet och klistra in triangeln på provet, vinkelrätt mot kardiomyocytinriktningen. Upprepa för den andra triangeln.
- Klipp av vävnad som överskrider triangelbredden med en skalpell (figur 2C). Lägg tillbaka skivan med de två monterade trianglarna i skärbrickans skivbuffert.
OBS: Upprepa steg 7.2 till 7.5 tills tillräckligt många skivor är förberedda för att fylla odlingskamrarna. Vi rekommenderar att du förbereder några ytterligare skivor för att möjliggöra ersättning av skivor med dålig sammandragning.
8. Montering av skivorna
OBS: Efterspänningen bestäms av fjädertrådens styvhet i odlingskamrarna. Tre olika typer finns tillgängliga, baserat på fjädertrådens tjocklek.
- Ta en medelfylld odlingskammare från inkubatorn. Välj en av de förberedda skivorna och sätt in den i kammaren genom att ansluta en triangel till varje stift.
- Justera avståndet mellan monteringsstiften enligt provstorleken. Se till att provet är nedsänkt i medium. Placera kammaren tillbaka i sitt utsedda uttag i odlingssystemet i inkubatorn.
VARNING: Översträck inte vävnaden och böj inte fjädertråden för mycket! - Ställ in förspänningen efter placering av skålen på vippan.
- Minska förspänningen genom att vrida justeringsskruven moturs. Gör detta tills baslinjen för motsvarande graf på datorskärmen inte ändras längre.
- Öka försiktigt förspänningen (dvs öka spänningen) genom att vrida justeringsskruven medurs. För kamrarna med högsta styvhet, fortsätt tills motsvarande baslinje i diagrammet har ökat med 1000-1200 enheter, vilket motsvarar 1 mN förspänning.
OBS: Den exakta justeringen beror på den individuella fjäderkonstanten för en odlingskammare, som kan bestämmas genom kalibrering före ett experiment enligt tillverkarens instruktioner. Inspelningsprogramvaran gör det möjligt att överväga den individuella kammarkalibreringen så att krafterna kommer att visas jämnt i μN. Det rekommenderas att applicera elektrisk stimulering från början av odlingen. Som sådan är det mycket möjligt att skivan börjar dra ihop sig under förspänningsjusteringen. Fokusera i så fall på den diastoliska baslinjen för att bedöma förspänningen.
9. Ändra mediet
- Förbered odlingsmediet enligt receptet i tabell 3. Strax före användning av mediet, tillsätt 50 μL β-merkaptoetanol (50 mM) till ett 50 ml rör. Förvaras vid 4 °C.
- En gång var 2: e dag, byt delvis odlingsmediet. Uppdatera mediet var 2: e dag, om långsiktig odling av myokardskivorna önskas.
- Förvärm det färska mediet i ett vattenbad eller varmluftskuvös vid 37 °C i 30-45 min. Ta bort en odlingskammare från inkubatorn och placera den under en laminär flödeshuv.
VARNING: Det är viktigt att hålla kammaren, såväl som mediet, varm vid 37 ° C (> 35 ° C) för att förhindra hyperkontrakturer på grund av låg temperatur. Mindre distinkt skada kan vara närvarande som en ökning av diastolisk spänning inom några timmar efter medium utbyte. Detta kan tyckas återhämta sig, men upprepad stress kan leda till ackumulerande försämring. - Ta bort mediet från odlingskammaren och lämna cirka 0,8 ml i kammaren. Tillsätt 1,6 ml färskt medium till samma kammare. Den totala volymen medium bör vara cirka 2,4 ml per kammare.
- Placera kammarens lock tillbaka och placera odlingskammaren tillbaka i respektive läge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammandragningen av myokardskivorna visades på datorskärmen efter införande av odlingskammaren i motsvarande kontakt (figur 3). Sammandragning av de mänskliga myokardskivorna började omedelbart efter stimulering. Skivorna hyperkontrakterade i 5-10 min. Detta var synligt som en ökning av diastoliska krafter, orsakad av en tonisk kontraktur av skadade vävnadsfraktioner. Denna process återställdes i varierande grad inom 1-1,5 h. Efter stabilisering visade mänskliga LV-vävnadsskivor ryckkrafter som varierade mellan 1 mN och 3 mN vid stimulering. Systole visas som en stark ökning av kontraktionskraften, följt av diastol med en lika brant minskning av kontraktionskraften.
Sammandragning av myokardskivorna registrerades av odlingsprogramvaran och sparades i en angiven fil. Var och en av de genererade rådatafilerna konverterades till ett läsbart axon binärt filformat (.abf) för enkel analys och kvantifiering av data. För den första analysen öppnades .abf-filen i ett lämpligt program. Cirka 5 minuters kontraktionsdata valdes för att fastställa den genomsnittliga kontraktionsamplituden under denna period. Detta gjordes för flera tidpunkter i den inspelade datafilen. Att plotta dessa kontraktionsvärden över tid gav en användbar graf för att jämföra kontraktionsutveckling i en kontroll- och experimentell miljö. För att få en mer avancerad inblick i prestandan hos de genererade segmenten kördes stimuleringsprotokoll. Under dessa protokoll, som tar cirka 45 minuter, ändrades stimuleringsparametrarna för att bedöma parametrar för kontraktionskoppling.
Det nuvarande stimuleringsprotokollet bestod av fyra distinkta sektioner: post-paus-potentiering, stimuleringströskel, kraftfrekvensförhållande och eldfast period (figur 4, tabell 4). Under potentiering efter paus återupptas stimuleringen efter ett kort stopp på antingen 3, 12, 50 eller 120 s. För att bestämma stimuleringströskeln ökas stimuleringsströmmen i steg om 3 mA var 10: e sekund, med början vid 8 mA och ökar till 90 mA. Med detta test kan den minimala stimuleringsströmmen bestämmas för varje skiva. Detta ändrar inte de allmänna stimuleringsinställningarna utanför stimuleringsprotokollet. Kraftfrekvensförhållandet bedöms genom en stegvis ökning av stimuleringsfrekvensen (20, 30, 45, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 210 och 240 BPM), medan respektive varaktighet för varje steg förkortas parallellt. Med undantag för de två första frekvensinställningarna ger denna regim mellan 20-40 sammandragningar under varje steg. Den eldfasta perioden för varje skiva bedöms genom att skicka en för tidig stimulans (S2) efter en normal stimulans (S1; 30 BPM). S1-S2-intervallet förkortas var 10: e sekund.
För att demonstrera potentialen hos det presenterade odlingssystemet som ett verktyg för att testa farmakologiska ingrepp framställdes ex vivo humana LV-vävnadsskivor från samma patient och utsattes för farmakologiska medel som påverkar de intracellulära kalciumjonnivåerna (Ca2+) (n = 1) efter 2 veckors odling. L-typ Ca2+-kanalantagonisten nifedipin hämmar Ca2+ tillströmning till myokardcellerna och sänker därför den intracellulära tillgängligheten av Ca2+ och minskar kontraktiliteten17. På grund av dess vasodilatorverkan används nifedipin som ett blodtryckssänkande läkemedel. För att påvisa farmakologiska skillnader mellan Ca2+-kanalantagonister undersöktes kalciseptin för jämförelse. Calciseptine är också en L-typ Ca2+-kanal antagonist, extraherad från Dendroaspis p. polylepis gift18. Därför delar den den negativa inotropa verkan av nifedipin. Calciseptine har emellertid olika bindningsegenskaper och är mer potent jämfört med nifedipin19. För att studera de positiva och negativa modulationerna av Ca2+ tillgänglighet testade vi också kalciumkanalagonisten Bay-K8644 (1,4-Dihydro-2,6-dimetyl-5-nitro-4-(2-[trifluormetyl]fenyl)pyridin-3-karboxylsyrametylester)20.
Tre skivor behandlades med nifedipin (125 nM), kalcisepin (70,8 nM) respektive Bay-K8644 (417 nM), medan den fjärde skivan inte fick något läkemedel (kontroll). Kontraktionskrafterna under allmänna stimuleringsparametrar (50 mA ström, bifasiska pulser 3 ms varaktighet, 1 ms intervall och 30 BPM pacing rate) jämfördes före och efter behandling. Vidare, före behandlingen, kördes ett stimuleringsprotokoll för att bedöma baslinjevärdena för potentiering efter paus, stimuleringströskel, kraftfrekvensrelation och eldfast period. Efter 30 minuters behandling kördes ett andra stimuleringsprotokoll. För att eliminera interindividuella skillnader normaliserades kontraktionsamplituden för varje skiva till dess baslinjenivå före behandling. Baslinjen (dvs. 100%) bestämdes genom att analysera de senaste fem kontraktionscyklerna före starten av stimuleringsprotokollet före behandlingen.
Vid analys av sammandragningen av skivorna vid allmän stimulering observerades att sammandragningskraften hos skivorna behandlade med Ca2+ antagonister (nifedipin och kalcistepin) minskade inom 10 min efterbehandling (figur 5) och effekten var närvarande upp till 20 min efterbehandling. Däremot ökade den spänningsstyrda Ca2+ kanalagonisten Bay-K8644 sammandragningskraften hos den behandlade skivan. Kontrollsegmentet visade ingen anmärkningsvärd förändring. Kontraktionsdata som genererades under stimuleringsprotokollen analyserades på ett liknande sätt. Här jämfördes data som genererades av stimuleringsprotokollet som utfördes före behandlingen (förbehandling) med efterbehandlingsdata för samma stimuleringsprotokoll.
Som diskuterats tidigare började stimuleringsprotokollet med bedömningen av potentiering efter paus. Under pausen tas ytterligare Ca2+ upp av sarkoplasmatisk retikulum (SR), som frigörs vid första stimuleringen efter pausen. Därför återspeglar potentiering efter paus intracellulär Ca2+ frisättning från SR. Som sådan kan denna parameter användas för att bedöma det relativa bidraget från Ca2+ som frigörs från SR av ryanodinreceptorn. För att bedöma potentiering av skivorna efter en stimuleringspaus dividerades styrkan hos den första sammandragningen efter pausen med den genomsnittliga sammandragningen före respektive paus. Kontrollsegmentet visade ingen anmärkningsvärd förändring (figur 6A). Det observerades att hämningen av L-typ Ca2+ kanaler ledde till potentiering av den första sammandragningen efter en paus på minst 50 s (figur 6B,D), vilket återspeglar ett högre relativt bidrag från intracellulär Ca2+ frisättning till total kontraktilitet. Den motsatta effekten sågs i skivan behandlad med Bay-K8644, vilket stimulerar inträdet av extracellulär Ca2+ via L-typ Ca2+ kanaler (Figur 6C).
Kraftfrekvensförhållandet bedömdes genom att successivt öka takthastigheten upp till 180 BPM. För bättre visualisering normaliserades kontraktionskraften vid olika stimuleringsfrekvenser till baslinjekontraktionen vid 30 BPM inom samma protokoll (= 100%). Dataanalys visade att behandlingen med calciseptine inte förändrade skivans förmåga att följa stimuli vid ökning av stimuleringsfrekvensen vid jämförelse av data före och efter behandling (figur 7B). Ingen förändring observerades i kontrollsegmentet (figur 7A). I motsats till kalciseptin förhindrade nifedipin en ökning av kontraktiliteten vid högre pacinghastigheter och minskade den maximala infångningshastigheten till 80 BPM (figur 7D). Skivan som behandlades med Ca2+ kanalagonisten Bay-K8644 visade en ökad sammandragningskraft vid mycket låga stimuleringsfrekvenser (figur 7C). Vid frekvenser högre än 50 BPM verkade emellertid kontraktionskraften vara lägre än under förbehandlingstillståndet. Stimuleringströskeln och den eldfasta perioden bestämdes också före och efter behandlingen. Inga skillnader observerades dock och uppgifterna visas därför inte.
Figur 1: Översikt över erforderliga material och odlingssystemet. Kretskortet (1) mäter sammandragningen med en sensor och överför data till styrenheten. (B) Åtta fyllda kamrar placerade på den gungande huvudplattan. Petriskålslock (35 mm) används för att täcka kamrarna. (C) De (kirurgiska) verktyg som behövs för att trimma det transmurala myokardprovet. Avbildade är olika pincett, bladen som behövs för vibratomet och en gummilapp för att hjälpa till med trimning. (D) Fyra 0,9 mm x 70 mm 20 G nålar som är fixerade i ett fyrkantigt läge (0,9 cm x 0,9 cm) med ett fast plastblock. Användning av denna konstruktion förhindrar skador och rörelse av provet vid trimning och ger ett vävnadsblock med de nödvändiga dimensionerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(A) Två myokardvävnadsblock (cirka 1 cm x 1 cm x 1 cm) inbäddade i stelnad lågsmält agaros i en 35 mm petriskål. För demonstrationsändamål användes LV-vävnad från svin. (B) Agarosblocket med de inbäddade proverna avlägsnades från petriskålen, trimmades och limmades på vibratomets skärplattform. Här användes svin LV-vävnad för demonstrationsändamål. Lägg märke till den enhetliga vävnadsfärgen och frånvaron av vit fibrotisk vävnad, indikerad av den röda pilen. (C) Efter skivning avlägsnas agarosen försiktigt och plasttrianglar (1) är anslutna vinkelrätt mot myokardfibrernas riktning. De röda linjerna indikerar riktningen för myokardfibrerna. (D) Human LV-vävnad framställdes, som visade vit fibrotisk vävnad i skivorna. Detta sänker inte nödvändigtvis framgångsgraden för odling; Det rekommenderas dock att använda skivor som inte visar fibros. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Odlingsprogramvaran. Beroende på antalet kanaler som används (högst åtta) visualiseras kontraktionsregistreringen i upp till tre angivna fönster (två synliga i figuren). Varje odlingskammare visas som ett sammandragningsdiagram. I inställningsfönstret kan stimuleringsparametrar ändras och skräddarsys efter önskad experimentell situation. Detta fönster gör det också möjligt att starta eller stoppa stimuleringsprotokollet / schemat som är valt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Avläsning av sammandragningen av fem myokardskivor under ett typiskt stimuleringsprotokoll. I alla paneler visas varje enskilt segment i samma färg. (A) Post-pause-potentiering bedömer den första sammandragningen efter en kort stimuleringspaus på 3, 12, 50 respektive 120 sekunder. (B) Bestämning av stimuleringströskeln genom att öka stimuleringsströmmen i steg om 3 mA var 10: e sekund från 8 mA till 80 mA. (C) Kraftfrekvensförhållandet för varje skiva bedöms genom stegvisa ökningar av stimuleringsfrekvensen från 12 BPM till 240 BPM. Varaktigheten av stimuleringsperioderna blir kortare vid högre frekvenser för att hålla antalet slag konstant vid varje frekvens. (D) För att bedöma den eldfasta perioden utsätts skivorna för för tidiga stimuleringar (S2) med minskande intervall till föregående stimulans (S1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Analys av sammandragningskraften före och efter behandling med L-typ Ca2+ kanalpåverkande medel. Alla data (n = 1) normaliserades till baslinjekontraktiliteten (medelvärde av fem separata slag före behandling (0)). L-typ Ca2+ kanalantagonister nifedipin (125 nM), kalciseptin (70,8 nM) och L-typ Ca2+ kanalagonist Bay-K8644 (417 nM) tillsattes till sammandragande humana LV-myokardskivor. Kontrollskivan fick ingen behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Potentiering efter paus av de behandlade segmenten och kontrollsegmenten. Skillnader i potentiering efter paus observerades (baslinje jämfört med efterbehandling; n = 1). Här normaliserades amplituden för den första sammandragningen efter en paus till den genomsnittliga kontraktionsamplituden före respektive paus. Baslinjen sattes till 100% och liknar den genomsnittliga kontraktionsstyrkan för de senaste fem cyklerna innan den första pausen börjar. Y-axeln visar den normaliserade första sammandragningen efter en paus med olika varaktighet. X-axeln visar baslinje- och pauslängderna. (A) Kontrollera skiva utan behandling. (B) Kalciseptinbehandling. (C) Bay-K8644-behandling. (D) Behandling med nifedipin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Analys av kraftfrekvensförhållandet. Kontraktionsdata (n = 1) normaliserades till kontraktionskraften vid 30 BPM inom respektive protokoll (= 100%). A) Kontrollskivan behandlades inte med något ämne. alla andra aspekter av odlingen var dock desamma som för de behandlade skivorna. (B) Kalciseptinbehandling av en LV-myokardskiva. (C) Bay-K8644-behandling. (D) Behandling med nifedipin. Data om sammandragningskraften för denna skiva under stimuleringsfrekvenser över 80 BPM utelämnades, eftersom sammandragningen inte följde stimuleringsfrekvensen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Sammansättning av den skivningsbuffert som används för transport och under skivningsförfarandet. För framställning av agaros utelämnas glukos. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Sammansättning av 4% agarosgelen. Denna glukosfria lågsmälta agarosgel används för inbäddning av vävnadsproverna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Beredning av mediet för odling. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 4: Detaljer om stimuleringsprotokollet. Stimuleringsprotokollet består av fyra delar, som alla kan ändras för att passa projektets behov. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare har kardiovaskulär forskning gjort stora framsteg inom odling av kardiomyocyter. 3D-odlingen av kardiomyocyter med intakt geometri är dock ännu inte väletablerad. Jämfört med tidigare protokoll som tillämpats för ex vivo-odling av myokardvävnad, liknar protokollet som vi beskrev här vävnadens in vivo-miljö närmare. Dessutom möjliggör tillämpningen av för- och efterlast en mer biomimetisk miljö. Vi kan fullt ut analysera och förstå den kontinuerliga registreringen av sammandragningsdata och sammandragningsparametrar i vävnaden.
Antalet ex vivo-tekniker för odling av kardiovaskulär vävnad med liknande upplägg är begränsattill 11,21,22. En liknande teknik för odling av myokardskivor som har publicerats använder en 6-brunnsplatta för odling av myokardskivor10. En viktig begränsning med just detta upplägg är dock att skivorna inte utsätts för för- och efterlast, och inte heller kan ge en detaljerad bild av sammandragningen över tid utan att vävnaden behöver hanteras. Metoden vi beskrev här minskar risken för vävnadsskada eller infektion. Dessutom ger den en heltäckande bild av möjliga förändringar i kontraktil kraft när ett ämne av intresse läggs till odlingen. Förutom analysen av den normala kontraktionskraften för varje skiva tillåter den aktuella inställningen att regelbundet köra fördefinierade protokoll. Detta möjliggör datainsamling av olika relevanta parametrar för den odlade vävnaden.
Kritiska steg inom protokollet
Vävnadsskador måste undvikas, och detta kan redan inträffa under explantoperationen. Om vävnaden inte omedelbart överförs till kylförvaringslösningen efter excision kan detta leda till skadade vävnadsprover. Det beskrivna protokollet innehåller flera steg som är avgörande för att få tillförlitliga och reproducerbara resultat. Inbäddningsföreningen för agarosvävnad måste framställas med användning av skivbufferten utan glukos för att förhindra eventuell karamellisering av glukosen under smältprocessen före protokollets början. Det är viktigt att undvika skador på grund av hypertermi som orsakas av användning av agaros direkt från 80 °C vattenbad, istället för att inkubera agarosen i en spruta vid 37 °C. Temperaturen bör vara 4 °C under lagring och skärning för att minska ämnesomsättningen och minimera ischemi. Vävnad bör också hanteras med försiktighet genom att ta tag i agarosen snarare än själva vävnaden när du flyttar den mellan skärbrickan och petriskålen för att fästa plasttrianglarna. Det är av yttersta vikt att dessa trianglar är fästa i rätt riktning med avseende på riktningen för myokardfibrerna. Felinriktning av trianglarna kommer att leda till vävnadsskada.
I allmänhet är stimuleringströskeln för nyskurna skivor mellan 10-20 mA, och strömmen bör försiktigt ökas. Överstimulering av vävnaden med en ström som är för hög kan också leda till irreversibel provskada. När stimuleringen har börjat är vävnadsrörning genom att gunga odlingskamrarna nödvändig och bör aldrig stoppas längre än 5 minuter för att säkerställa tillräcklig tillgång på syre och näringsämnen till vävnaden.
Felsökning och ändringar
Hyper kontraktur
Hyperkontraktur av myokardvävnadsprovet är ett av de viktigaste uteslutningskriterierna för det diskuterade protokollet. Detta kan inträffa före och efter beredningen av myokardskivorna. I de fall där vävnaden före preparatet kändes stel vid palpation observerades hyperkontraktion i minst 70% av preparaten. Hyperkontraktur av vävnadsprovet kan också inträffa vid införande på vippan, vilket sannolikt beror på vävnadens kvalitet eller patientens sjukdomstillstånd. Hyperkontraktur kan ses som en ökning av diastolisk ton under stimuleringen av vävnaden, vilket motsvarar den toniska förkortningen av skadade kardiomyocyter vid hjärtischemi. Hyperkontraktur under stimulering kan vara progressiv, varigenom sammandragningen överstiger detektionsgränsen på 12 mN. Hyperkontrakturen kan emellertid också vända spontant inom 30-60 min, vilket tyder på att vävnaden kan återhämta sig. För att förbättra vävnadens återhämtning bör förspänningsinställningarna justeras (dvs upprepa steg 8.3) efter 1 h inkubation, liksom på dag 2, 4 och 6 efter beredning. Hyperkontraktur kan förekomma både med och utan stimulerad sammandragning av proverna. Men om ingen sammandragning observeras inom 1 timme, bör provet inte användas. I detta fall har vävnaden hyperkontrakterat i en grad från vilken den inte kan återhämta sig eller har skadats på annat sätt. I allmänhet har odlingen av mänskliga myokardskivor enligt det presenterade protokollet visat sig ha en framgångsgrad på 90%.
Förväntade kontraktionskraftförändringar
Beroende på en mängd faktorer (t.ex. patient, beredning, vävnadsskada) är det möjligt att myoslices som visade acceptabel sammandragning initialt kommer att genomgå en progressiv nedgång i kontraktila amplituder under de första 24 timmarna. Faktum är att detta beteende till och med kan betraktas som normalt för skivor som erhållits från mänskliga slutstadiums sviktande hjärtan. Justering av förspänningen av skivorna varje dag under de följande 3 dagarna har visat sig lindra detta problem och förbättra sammandragningen. Efter 24 till 48 h bör dock kontraktiliteten börja öka igen. Observera att sammandragningen inte kommer att återgå till sin initialt observerade nivå inom de första dagarna av odlingen.
Strax efter medium utbyte, när proverna återförs till inkubatorn, visar sammandragningen vanligtvis markant ökade amplituder. Öppning och stängning av inkubatorn bidrar till denna ökning, eftersom det får CO2-nivån att sjunka. Detta ökar pH-värdet inuti det bikarbonatbuffrade odlingsmediet, vilket orsakar ett positivt inotropt svar hos skivorna. Efter mediumutbytet minskar skivornas kontraktila kraft ofta i flera timmar tills den når eller överträffar sitt ursprungliga värde. För att förhindra att stimuleringsprotokoll påverkas av mediumutbyte bör stimuleringsprotokoll inte utföras förrän minst 1 h efter medium utbyte.
Metodens begränsningar
En fördel med den nuvarande tekniken jämfört med tidigare odlingsmetoder för human myokardvävnad är möjligheten att applicera (och modulera) för- och efterbelastning på den sammandragande vävnaden. Det är emellertid svårt att kvantifiera den applicerade belastningen när det gäller väggspänning, även om denna belastning kan uppskattas från fjäderkonstanten och skivdimensionerna. Det antas att det finns ett positivt samband mellan livskraften hos myokardvävnad och sammandragningsamplituden hos vävnadsprovet. Ändå finns det för närvarande ingen metod som tillåter viabilitetstestning av varje enskild skiva innan den monteras på kamrarna. En kolorimetrisk MTT-färgning kan utföras på skurna skivor som inte används för odling, för att bestämma livskraften hos myokardcellerna. I celler som är livskraftiga kommer NADPH att minska det gula MTT-saltet i lila formazankristaller. En annan begränsning är att näringsämnena i odlingsmediet för närvarande är begränsade till grundläggande ingredienser. Därför skiljer sig näringsämnen och cirkulationsfaktorer från den in vivo-miljö från vilken vävnaden erhölls. Medium kan dock kompletteras eller modifieras efter behov.
Potentiella tillämpningar av metoden
Det finns flera potentiella tillämpningar av metoden både när det gäller kardiotoxicitet och drogtestning, samt för att förstå patofysiologin för hjärtsjukdomar. För det första kan systemet som används i det diskuterade protokollet användas för läkemedels- och kardiotoxicitetsscreeningar. Med hjälp av de programmerbara stimuleringsprotokollen kan fysiologiska förändringar analyseras som svar på läkemedelsadministration. När det gäller tolkningen av eldfast period måste det beaktas att detta är en funktionell parameter, som inte strikt återspeglar läkemedlets effekt på handlingspotentialens varaktighet. För det andra kan odlingskamrarna användas för olika samodlingsexperiment av myokardium i kombination med immunceller. Genom att använda denna samodling kan de direkta effekterna av immuncellsutsöndrade faktorer på myokardiell sammandragning bedömas. Slutligen kan icke-transplanterade kardiomyopatiprover också odlas, även om dessa icke-transplanterade vävnadsprover i allmänhet är mindre och därför svårare att bearbeta. Detta kan dock öppna möjligheter för identifiering av nya terapeutiska mål och utveckling av riktade läkemedel. Det är också tänkbart att använda tekniken för patientspecifik vävnadskarakterisering, vilket tar oss ett steg närmare personlig medicin. Vidare kan den presenterade metoden användas för icke-mänsklig myokardvävnad, vars exempel är gris och kanin. Det måste beaktas att den höga fysiologiska hjärtfrekvensen hos små däggdjur (mus/råtta) inte kan erhållas, eftersom det efterföljande högreO2-kravet inte kan uppfyllas under villkoren för myokardiell odling med hjälp av den diskuterade uppsättningen. Därmed är en nästan fysiologisk miljö svår att efterlikna i dessa fall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JH, PS, DM och KL har inget att avslöja. AD och TS är aktieägare i InVitroSys GmbH, som tillhandahåller det myodiska odlingssystemet.
Acknowledgments
Forskningen finansierades av DZHK-bidrag 81Z0600207 (JH, PS och DM) och 81X2600253 (AD och TS).
Författarna vill tacka Claudia Fahney, Mei-Ping Wu och Matthias Semisch för deras stöd i förberedelserna av uppläggen, samt för det regelbundna underhållet av vävnadsodlingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
