Summary
אנו מציגים פרוטוקול לטיפוח ex vivo של רקמת שריר הלב החדרית האנושית. זה מאפשר ניתוח מפורט של כוח התכווצות וקינטיקה, כמו גם את היישום של pre- ו- afterload כדי לחקות את הסביבה הפיזיולוגית in vivo מקרוב יותר.
Abstract
גידול קרדיומיוציטים ראה מספר עצום של התפתחויות, החל מגידול תאים דו-ממדי (דו-ממדי) וכלה באורגנואידים שמקורם ב-iPSC. בשנת 2019 הודגמה דרך ex vivo לטפח פרוסות שריר הלב המתקבלות מדגימות לב אנושיות, תוך התקרבות למצב in vivo של התכווצות שריר הלב. דגימות אלה מקורן בעיקר בהשתלות לב או בהצבת מכשירי סיוע לחדר שמאלי. באמצעות ויברטום ומערכת טיפוח שפותחה במיוחד, פרוסות בעובי 300 מיקרומטר ממוקמות בין חוט קבוע לחוט קפיץ, ומאפשרות טיפוח יציב וניתן לשחזור במשך מספר שבועות. במהלך הטיפוח, הפרוסות מגורות באופן רציף על פי הגדרות בודדות. ניתן להציג ולתעד התכווצויות בזמן אמת, וניתן ליישם בקלות חומרים פרמקולוגיים. ניתן לתזמן ולבצע פרוטוקולי גירוי המוגדרים על-ידי המשתמש כדי להעריך פרמטרים חיוניים של כיווץ כמו פוטנציה לאחר ההשהיה, סף הגירוי, יחסי כוח-תדר ותקופת עקשן. יתר על כן, המערכת מאפשרת הגדרה משתנה לפני ואחרי העומס לטיפוח פיזיולוגי יותר.
כאן, אנו מציגים מדריך שלב אחר שלב כיצד ליצור טיפוח מוצלח לטווח ארוך של פרוסות שריר הלב של החדר השמאלי האנושי, באמצעות פתרון גידול ביומימטי מסחרי.
Introduction
בעשור האחרון, גידול במבחנה של תאי שריר הלב עשה התקדמות רבה, החל מטכניקות דו-ממדיות ותלת-ממדיות (תלת-ממדיות) וכלה בשימוש באורגנואידים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שהתמיינו למיוציטים לבביים 1,2,3. גידולי Ex vivo ותאים ראשוניים הראו שהם בעלי ערך רב, במיוחד עבור מחקרים גנטיים ופיתוח תרופות 4,5,6. שימוש ברקמות אנושיות משפר את הערך התרגומי של התוצאות. עם זאת, טיפוח תלת-ממדי ארוך טווח של רקמות שריר הלב עם גיאומטריה שלמה אינו מבוסס היטב. הגיאומטריה השלמה היא תכונה מרכזית לחיקוי תנאי in vivo, שכן תפקוד לב תקין, תקשורת בין תאים שונים, כמו גם אינטראקציות בין מטריצת תאים הם תנאים מוקדמים. טיפוח רקמות שריר הלב עבר שלבים שונים של התפתחות. אחוזי ההצלחה והיציבות של גידול רקמות שריר הלב ex vivo היו בתחילה נמוכים למדי, אך הגישות האחרונות הניבו תוצאות מבטיחות 7,8,9,10,111.
מבין אלה, Fischer et al. היו הראשונים שהדגימו כי ניתן לשמור על כדאיות וביצועים מתכווצים של רקמת שריר הלב האנושית בטיפוח תאי ex vivo במשך שבועות רבים7. הטכניקה שלהם התבססה על פרוסות רקמה דקות שנחתכו מתוך שריר הלב האנושי, שהורכבו בתאי גידול שפותחו לאחרונה וסיפקו תנאים ביומכניים מוגדרים וגירוי חשמלי מתמשך. שיטת טיפוח זו דומה מאוד לתפקוד in vivo של רקמת שריר הלב, ושוכפלה על ידי מספר קבוצות מחקר עצמאיות 2,12,13,14,15. חשוב לציין כי התאים ששימשו את Fischer et al. אפשרו גם רישום רציף של כוחות מפותחים במשך עד 4 חודשים, ובכך פתחו הזדמנויות חסרות תקדים למחקר פיזיולוגי ופרמקולוגי על שריר הלב האנושי השלם7.
טכניקות דומות פותחו באופן עצמאי על ידי קבוצות אחרות ויושמו על בני אדם, חולדות, חזירים וארנבים שריר הלב 7,10,11. Pitoulis et al. פיתחו לאחר מכן שיטה פיזיולוגית יותר, המשחזרת את יחס הכוח-אורך הרגיל במהלך מחזור התכווצות, אך פחות מתאימה לניתוח בתפוקה גבוהה16. ככזו, ניתן לראות את הגישה הכללית של גידול ביומימטי כצעד נוסף לצמצום, עידון והחלפה (3R) של ניסויים בבעלי חיים.
עם זאת, ניצול של פוטנציאל זה דורש נהלים סטנדרטיים, ניתוחי תוכן גבוהים ורמת תפוקה גבוהה. אנו מציגים טכניקה המשלבת חיתוך אוטומטי של שריר הלב האנושי החי עם תחזוקה במבחנה במערכת גידול ביומימטית שהפכה לזמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים). עם הגישה המוצעת, מספר הפרוסות הבודדות שניתן ליצור מדגימה אחת של שריר הלב הטרנסמורלי מוגבל רק על ידי זמן העיבוד. דגימה בגודל ובאיכות מספיקים (3 ס"מ על 3 ס"מ) מניבה לעתים קרובות 20-40 פרוסות רקמה שנחתכות בנוחות עם ויברטום אוטומטי. פרוסות אלה ניתן לשים בתאי טיפוח השייכים למערכת. התאים מאפשרים גירוי חשמלי, שאת הפרמטרים שלו ניתן לווסת (כלומר, משך הדופק, הקוטביות, הקצב והזרם), כמו גם את התאמת העומס לפני ואחרי, באמצעות חוטי קפיץ בתוך התאים. הכיווץ של כל פרוסה נרשם מתנועה של מגנט קטן המחובר לחוט קפיץ ומוצג כגרף הניתן לפרשנות. ניתן להקליט נתונים בכל עת ולנתח אותם באמצעות תוכנה זמינה באופן חופשי. מלבד הקצב הבסיסי הקבוע, ניתן לבצע פרוטוקולים מתוזמנים כדי להעריך באופן פונקציונלי את תקופת העקשנות שלהם, את סף הגירוי, את העוצמה שלאחר ההשהיה ואת הקשר בין הכוח לתדר.
טיפוח ביומימטי ארוך טווח זה של פרוסות שריר הלב מרובות מלב בודד סולל את הדרך למחקר ex vivo עתידי הן ברקמות אנושיות והן ברקמות של בעלי חיים, ומאפשר את הסינון להשפעות תרופתיות טיפוליות וקרדיוטוקסיות ברפואת הלב וכלי הדם. זה כבר יושם על גישות ניסיוניות שונות 2,12,13,15. כאן, אנו נותנים תיאור מפורט שלב אחר שלב של הכנת רקמות אנושיות ומספקים פתרונות לבעיות טיפוח שנתקלים בהן לעתים קרובות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
איסוף הרקמות לניסויים המתוארים כאן אושר על ידי ועדות הביקורת המוסדיות של אוניברסיטת מינכן ובוכום של אוניברסיטת הרוהר. המחקרים נערכו על פי הנחיות הצהרת הלסינקי. המטופלים נתנו את הסכמתם מדעת בכתב לפני איסוף הרקמות.
1. רכישת רקמות
- להשיג רקמה אנושית מחולים שעברו השתלת לב או ניתוח לב.
- לפני רכישת הרקמה, הכן 2 ליטר של תמיסה לב-ריאה (המכונה גם חיץ חיתוך (טבלה 1)).
- לאחר קבלת ביופסיה של חדר שמאלי טרנסמורלי בגודל 4 ס"מ על 4 ס"מ (LV), הניחו את הרקמה מיד (תוך 5 דקות לאחר הכריתה) בכוס סטרילית חד-פעמית מפלסטיק הניתן להסתרה המכילה כ-70 מ"ל של חיץ חיתוך קר (4 מעלות צלזיוס). שמור על 4 מעלות צלזיוס.
הערה: מאגר החיתוך המשמש בפרוטוקול זה מאפשר אחסון קר (4 °C) של הרקמה למשך עד 36 שעות. זה מאפשר הובלה קרה של הרקמה ממרפאות שאינן קרובות למעבדה. עם זאת, זמני ההובלה ≤ 24 שעות הוכיחו את עצמם כאופטימליים.
2. הכנת אגרוז והוויברטום
- ודא שתאי טיפוח מספיקים מוכנים ומעוקרים (איור 1A).
- טבלו את התאים ואלקטרודות הגרפיט ב-1 ליטר של תמיסת איזופרופנול של 10% והתסיסו בן לילה. למחרת, מעבירים את התאים לתמיסת איזופרופנול של 100% למשך 3 דקות ואוטוקלים את אלקטרודות הגרפיט בטמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- תנו לתאים ולאלקטרודות הגרפיט להתייבש באוויר מתחת למכסה המנוע של זרימה למינרית.
- חבר לוח מעגלים לכל אחד מהתאים בהתאם למיקומים הזמינים על הנדנדה. הניחו שתי אלקטרודות גרפיט על לוח המעגלים בהתאם להוראות היצרן.
- מניחים מכסה צלחת פטרי 35 מ"מ על גבי התא כדי למנוע זיהום.
- הגדר את מערכת הטיפוח המיודית (ראו טבלת חומרים) באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 על-ידי חיבור המערכת למחשב (איור 1B).
- להכין את 4% נמוך נמס agarose במאגר חיתוך (ללא גלוקוז; טבלה 2). ניתן לאחסן את האגרוז בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
- ביום הניסוי, להמיס נפח מלאי של תמיסת אגרוז באמצעות אמבט מים שנקבע על 80 מעלות צלזיוס. בהתאם לכמות, ההמסה אורכת כ-30 דקות.
- כאשר האגרוז נוזלי, משכו 8 מ"ל של אגרוז נוזלי למזרק של 10 מ"ל, עם תוספת של 2 מ"ל אוויר. סגור את המזרק עם מכסה סטרילי והנח אותו הפוך באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, כדי למנוע את התמצקות האגרוז, וכדי לאזן את הטמפרטורה שלו כדי למנוע נזקי היפרתרמיה של הדגימה.
- אם קיים, הפעילו את מכשיר קירור המים של הוויברטום לפחות 30 דקות לפני חיתוך הרקמה כדי לאפשר יכולת קירור מספקת. הגדר את הטמפרטורה של זרימת המים ל 4 °C (76 °F).
הערה: מגש החיתוך וצלחת הקירור המשמשים כאן הכילו שניהם זרימת מים מובנית. זה מומלץ מאוד לקירור ולהורדת סיכוני הזיהום. עם זאת, ניתן גם להשתמש בקרח כטכניקת קירור. כמו כן, אין צורך לחבר את התקן קירור המים למגש החיתוך ו/או לצלחת הקירור של הוויברטום בשלב זה של הפרוטוקול. - נקו את מגש החיתוך של הוויברטום ואת צלחת הדגימה על ידי שטיפת כל המשטחים עם 100% איזופרופנול למשך 3 דקות לפחות.
הערה: בהתאם למערכת הוויברטום שבה נעשה שימוש, הגדרת הוויברטום עשויה להיות שונה. עיין במדריך של הוויברטום הקיים במעבדה לקבלת מידע על שיטות ההגדרה וכיול הלהב. - מלאו את מגש החיתוך עד 90%-95% במאגר חיתוך. במערך המשמש כיום, זה מתאים כ 400 מ"ל. חברו את הצינורות של מכשיר קירור המים לשסתומים במגש החיתוך ובפלטת הקירור של הוויברטום.
- יש לחטא את כל הכלים הדרושים להכנה על ידי טבילתם בתמיסת איזופרופנול 100% למשך 5 שניות. הסר את הכלים מתמיסת האיזופרופנול ויבש באוויר מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית.
3. קיצוץ והטמעה של הדגימות
- מעבירים את דגימת הרקמה לצלחת פטרי 100 מ"מ מלאה במאגר חיתוך קר. השאירו את המנה על צלחת קירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (מחוברת לצידנית יותר או מונחת על קרח).
- הסר את הטרבקולה אנדוקרדיאלית על ידי החזקת אנדוקרדיום עם פינצטה ושימוש במספריים כדי לחתוך כ -3 מ"מ של רקמה אנדוקרדיאלית. באותו אופן, להסיר רקמת שומן מוגזמת מתחת לאפיקרדיום אם קיים.
- לקבע את דגימת הרקמה החתוכה, הצד האנדוקרדיאלי כלפי מעלה, לכדי מדבקת גומי בגודל 2 ס"מ על 2 ס"מ באמצעות ארבע מחטים בגודל 0.9 מ"מ x 70 מ"מ 20 גרם המקובעות במצב מרובע (0.9 ס"מ x 0.9 ס"מ; איור 1C, D). ודא שהקצה האלכסוני של כל קצה מחט מצביע פנימה. זה משפר את הקיבעון ומונע נזק לשריר הלב.
אזהרה: הכיוון של הריבוע הנ"ל צריך להיות אורתוגונלי לכיוון המיופייבר השולט הצפוי. - חותכים את כל הרקמה העודפת מחוץ לריבוע ארבע המחטים באמצעות אזמל. אם גודל הדגימה המקורית מאפשר, השתמש בשתי דגימות של רקמות שריר הלב במהלך הכנה זו מאותה דגימה גולמית.
- באמצעות פינצטה, הניחו את הדגימה הגזומה על פיסת רקמה סטרילית כדי להסיר כל חיץ חיתוך עודף שנותר על הדגימה. כדי למנוע ייבוש מתוך הדגימה, אין לשמור את הדגימה על הרקמה במשך יותר מ -10 שניות.
- הניחו את הדגימות בצלחת פטרי 35 מ"מ, כך שהלהב חותך בניצב ליישור הקרדיומיוציטים והאפיקרדיום פונה כלפי מטה. אם ההכנה כוללת שתי דגימות, ודא שהדגימות ממורכזות ואינן נוגעות זו בזו.
- קחו את מזרק האגרוז מאמבט המים והטביעו את הדגימות באגרוז. (איור 2א). תנו לאגרוזה להתמצק במשך 5 דקות על צלחת קירור. הדגימות חייבות להישאר בקשר עם צלחת פטרי, מה שיבטיח שמישור החיתוך יהיה מקביל לכיוון הסיבים שריר הלב השולט.
אזהרה: אין לרוקן את המזרק במלואו, על מנת למנוע בועות אוויר. שימו לב לכמות האגרוז שנותרה במזרק במהלך טבילת הדגימות. במקרה של בועות אוויר בצלחת עם הדגימות, משכו בזהירות את בועות האוויר בחזרה למזרק.
4. הנחת הדוגמאות על מגש החיתוך
- מוציאים את האגרוז המוצק המכיל את הדגימה(ות) מצלחת פטרי 35 מ"מ באמצעות מרית או כלי דומה, על ידי חיטובו בין הדגימה לצד של צלחת הפטרי. חותכים חלק מהאגרוז באמצעות אזמל תוך שמירה על כיסוי הדגימות.
אזהרה: אין להסיר יותר מדי מהאגרוז. צריכים להישאר לפחות 5 מ"מ של אגרוז בצדדים הארוכים והקצרים במישור X/Z.
הערה: שלבים 4.2-4.4 צריכים להתבצע ברצף מהיר (כלומר, מקסימום 5 שניות). יש את כל הכלים הדרושים בהישג יד לפני תחילת העבודה. לא ניתן למקם מחדש את המדגם לאחר ההצבה. נסו להגביל את החשיפה של הדבק לאוויר וללחות. מגע עם אוויר או נוזלים ימצק את הדבק, ויהפוך אותו לבלתי שמיש. - עם פיפטה, מניחים ומפיצים 60 μL של דבק במרכז ומסביב לרציף החיתוך.
- הניחו את הצד האפיקרדיאלי של הדגימה הכלולה באגרוז על גבי האזור המודבק באמצעות פינצטה. אין למקם מחדש. הצד האנדוקרדיאלי של המדגם חייב להיות גלוי באגרוז. תנו לדבק להתמצק למשך דקה אחת. לחץ בעדינות על האגרוז המכיל את הדגימה מלמעלה באמצעות כלי קהה (למשל, פינצטה) תוך מניעת חיתוך לתוך האגרוז או פגיעה בו.
- מקם את פלטפורמת הדגימה במקומה המיועד במגש החיתוך של הוויברטום, המלא במאגר חיתוך.
5. התחלת הוויברטום
- הגדר משרעת רטט ל-1 מ"מ ואת מהירות החיתוך הראשונית ל-0.07 מ"מ לשנייה. הגדר את עובי הפרוסה ל-300 מיקרומטר כדי לחתוך פרוסות.
- כל עוד הלהב רק חותך את האגרוז, הגדל את מהירות החיתוך למקסימום שלה, שבמקרה זה הוא 1.50 מ"מ לשנייה. ברגע שהוויברטום מתחיל לחתוך את הרקמה, הפחיתו את המהירות ל-0.07 מ"מ לשנייה באופן מיידי.
הערה: אם הרקמה אינה פרוסה בצורה חלקה, למשל אם יש אזורים פיברוטיים גדולים במדגם, זה עשוי לעזור להגדיל את משרעת החיתוך עד 1.5 מ"מ ולהפחית את מהירות החיתוך ל -0.04 מ"מ לשנייה.
6. הכנת בינוני וחממה במהלך הליך החיתוך
- מלאו כל תא טיפוח ב-2.4 מ"ל של מדיום גידול מלא (טבלה 3).
- הניחו את תאי הטיפוח המלאים במדיום על מערכת הטיפוח באינקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 21% O2 ולחות של 80%. שיווי המשקל של המדיום למשך 20 דקות לפחות.
- חבר את מערכת הטיפוח עם מחשב והפעל את התוכנה המתאימה.
- הגדר את מהירות הנדנדה ל-60 סל"ד והגדר מראש את פרמטרי הגירוי (פולסים ותדירות גירוי). עבור פרוסות לב אנושיות, הגדר את הגירוי הסטנדרטי לדחפים דו-פאזיים עם זרם של 50 mA, שכל אחד מהם מורכב מזרם חיובי של 3 אלפיות השנייה, הפסקה של 1 אלפיות השנייה ופולס של 3 אלפיות השנייה של זרם הפוך, בקצב קצב של 30 פעימות לדקה (BPM).
הערה: ברקמות שהשתמרו היטב, סף הגירוי האופייני הוא סביב 15 mA. כדי להבטיח גירוי אמין וכדי להסביר כל עלייה אפשרית של סף הגירוי, מומלץ להגדיר את הזרם לערך החורג מסף הגירוי פי שניים עד שלושה. - בדוק את מחווני האלקטרודה של התוכנה כדי לוודא שהאלקטרודות של תאי הטיפוח פועלות כראוי.
הערה: יש צורך בפעולה בכל פעם שמחוון הערוץ בתוכנת הטיפוח הופך לאדום. במקרה זה, מטעני הדו קוטביות של הדו-קוטביות אינן מאוזנות.
7. הכנת הפרוסות
הערה: פרוסות תת-לב ראשוניות בדרך כלל אינן מתאימות לגידול רקמות ויש להשליך אותן בגלל מורפולוגיה לא אחידה. לאחר חמש עד עשר הפרוסות הראשונות, מרקם הפרוסה והמורפולוגיה משתפרים. הפרוסה האידיאלית היא לפחות 1 ס"מ על 1 ס"מ, אין לה או רק טלאים פיברוטיים מוגבלים, היא לא מקוטעת, ויש לה יישור סיבים הומוגני (איור 2B, D). פיברוזיס אינטרסטיציאלי, הממוקם בין סיבי המיוציטים, קיים לעתים קרובות בשריר הלב האנושי הכושל. באופן מפתיע, זה לא מנבא שלילי להצלחת הטיפוח.
- יוצקים כמות מספקת של חיץ חיתוך קר במכסה צלחת פטרי 5 ס"מ כדי להבטיח שהפרוסות לא יתייבשו. מניחים את הפרוסות במכסה צלחת פטרי המכיל את חיץ החיתוך הקר.
- הפרד את האגרוז מהרקמה באמצעות פינצטה. יש למנוע נגיעה ברקמה. טפלו ברקמה בזהירות שכן כל פגיעה ברקמה תפחית את אחוזי ההצלחה של הטיפוח.
- קבע את כיוון סיבי שריר הלב על ידי בדיקה מדוקדקת מול מקור אור. יש לכך חשיבות כאשר מצמידים את משולשי הפלסטיק לרקמה בשלב 7.6.
הערה: שלבים 7.4 ו- 7.5 צריכים להתבצע ברצף מהיר, תוך 5 שניות. - חברו שני משולשי פלסטיק לדגימה באמצעות דבק על מנת לעגן את הרקמה בתוך תאי הטיפוח.
- מניחים 1 μL של דבק על מכסה צלחת פטרי סטרילי. השתמשו בפינצטה מחוברת כדי לאסוף את אחד ממשולשים הפלסטיים האוטומטיים. טבלו במהירות את הקצה הקדמי של המשולש בדבק והדביקו את המשולש על הדגימה, בניצב ליישור הקרדיומיוציטים. חזור על הפעולה עבור המשולש השני.
- חתכו את הרקמה שחורגת מרוחב המשולש עם אזמל (איור 2C). הניחו את הפרוסה עם שני המשולשים המותקנים בחזרה למאגר החיתוך של מגש החיתוך.
הערה: חזור על שלבים 7.2 עד 7.5 עד שיהיו מוכנות מספיק פרוסות כדי למלא את תאי הטיפוח. אנו ממליצים להכין כמה פרוסות נוספות כדי לאפשר החלפת פרוסות בהתכווצות לקויה.
8. הרכבת הפרוסות
הערה: העומס שלאחר מכן נקבע על ידי נוקשות חוט הקפיץ בתאי הטיפוח. שלושה סוגים שונים זמינים, בהתבסס על עובי חוט הקפיץ.
- קח תא גידול מלא בינוני מהחממה. בחר אחת מהפרוסות המוכנות והכנס אותה לתא על ידי חיבור משולש אחד לכל סיכה.
- התאם את המרחק בין פיני ההרכבה בהתאם לגודל המדגם. ודא שהמדגם שקוע במדיום. החזירו את התא לשקע המיועד שלו למערכת הטיפוח בחממה.
אזהרה: אין למתוח יתר על המידה את הרקמה ואל תכופפו יתר על המידה את חוט הקפיץ! - הגדר את מתח הטעינה מראש לאחר מיקום המנה על הנדנדה.
- הקטן את הטעינה מראש על-ידי סיבוב בורג הכוונון נגד כיוון השעון. בצע פעולה זו עד שנקודת ההתחלה של הגרף המתאים על מסך המחשב לא תשתנה עוד.
- הגבירו בזהירות את הטעינה מראש (כלומר, הגבירו את המתח) על ידי סיבוב בורג הכוונון בכיוון השעון. עבור התאים עם הנוקשות הגבוהה ביותר, המשך עד שקו הבסיס המתאים בגרף גדל ב- 1000-1200 יחידות, אשר מתאים ל- 1 mN של טעינה מראש.
הערה: ההתאמה המדויקת תהיה תלויה בקבוע הקפיץ הבודד של תא הטיפוח, אשר ניתן לקבוע על ידי כיול לפני ניסוי על פי הוראות היצרן. תוכנת ההקלטה מאפשרת התחשבות בכיול התא הבודד כך שהכוחות יוצגו באופן אחיד ב- μN. מומלץ ליישם גירוי חשמלי מתחילת הטיפוח. ככזה, ייתכן מאוד שהפרוסה מתחילה להתכווץ במהלך התאמת הטעינה מראש. במקרה זה, התמקדו בקו הבסיס הדיאסטולי כדי להעריך את העומס מראש.
9. שינוי המדיום
- מכינים מדיום גידול על פי המתכון בטבלה 3. זמן קצר לפני השימוש במדיום, הוסיפו 50 μL של β-mercaptoethanol (50 mM) לצינור של 50 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- אחת ליומיים, החליפו חלקית את מדיום הטיפוח. רענן את המדיום כל יומיים, אם יש צורך בטיפוח ארוך טווח של פרוסות שריר הלב.
- מחממים מראש את המדיום הטרי באמבט מים או באינקובטור אוויר חם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות. מוציאים את תא הטיפוח מהאינקובטור ומניחים אותו מתחת למכסה המנוע של זרימה למינרית.
אזהרה: חיוני לשמור על החדר, כמו גם על הבינוני, חם ב 37 ° C (> 35 ° C) כדי למנוע התכווצויות יתר עקב טמפרטורה נמוכה. נזק פחות מובהק עשוי להיות נוכח כעלייה במתח הדיאסטולי תוך מספר שעות לאחר חילופי דברים בינוניים. זה עשוי להיראות מחלים, אבל מתח חוזר ונשנה עלול לגרום להידרדרות מצטברת. - הסר את המדיום מתא הטיפוח, והשאר כ-0.8 מ"ל בתא. הוסף 1.6 מ"ל של מדיום טרי לאותו תא. הנפח הכולל של המדיום צריך להיות סביב 2.4 מ"ל לכל תא.
- מניחים את כיסוי החדר לאחור ומחזירים את תא הטיפוח למקומו המתאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכיווץ של פרוסות שריר הלב הוצג על מסך המחשב לאחר החדרת תא הטיפוח למחבר המתאים לו (איור 3). התכווצות פרוסות שריר הלב האנושיות החלה מיד עם הגירוי. הפרוסות התרכזו יתר על המידה במשך 5-10 דקות. זה נראה לעין כעלייה של כוחות דיאסטולים, שנגרמו על ידי התכווצות טוניקה של שברי רקמה פגומים. תהליך זה הוחזר לדרגות שונות תוך 1-1.5 שעות. לאחר התייצבות, פרוסות רקמות LV אנושיות הראו כוחות עוויתות המשתנים בין 1 mN ל-3 mN בעת הגירוי. Systole מוצג כעלייה חזקה בכוח הכיווץ, ואחריו דיאסטולה עם ירידה תלולה באותה מידה של כוח הכיווץ.
התכווצות פרוסות שריר הלב נרשמה על ידי תוכנת הטיפוח ונשמרה בקובץ ייעודי. כל אחד מקבצי הנתונים הגולמיים שנוצרו הומר לתבנית קובץ בינארית של אקסון (.abf) הניתנת לקריאה לניתוח וכימות קלים של הנתונים. עבור הניתוח הראשוני, קובץ .abf נפתח בתוכנית מתאימה. כ-5 דקות של נתוני התכווצות נבחרו כדי לקבוע את משרעת ההתכווצות הממוצעת בתקופה זו. זה נעשה עבור נקודות זמן מרובות בקובץ הנתונים המוקלט. התוויית ערכי ההתכווצות הללו לאורך זמן הניבה גרף שימושי להשוואת התפתחות התכווצות במסגרת בקרה וניסוי. כדי לקבל תובנה מתקדמת יותר לגבי הביצועים של הפרוסות שנוצרו, הופעלו פרוטוקולי גירוי. במהלך פרוטוקולים אלה, שלוקחים כ-45 דקות, שונו פרמטרי הגירוי כדי להעריך פרמטרים של צימוד התכווצות.
פרוטוקול הגירוי הנוכחי כלל ארבעה חלקים נפרדים: פוטנציה לאחר ההשהיה, סף הגירוי, יחס הכוח-תדר ותקופה עקשן (איור 4, טבלה 4). במהלך הפוטנציה שלאחר ההפסקה, הגירוי מתחדש לאחר הפסקה קצרה של 3, 12, 50 או 120 שניות. כדי לקבוע את סף הגירוי, זרם הגירוי מוגבר בשלבים של 3 mA כל 10 שניות, החל מ-8 mA ועולה ל-90 mA. בבדיקה זו ניתן לקבוע את זרם הגירוי המינימלי עבור כל פרוסה. זה לא משנה את הגדרות הגירוי הכלליות מחוץ לפרוטוקול הגירוי. יחס הכוח-תדר מוערך על ידי עלייה מדורגת של תדירות הגירוי (20, 30, 45, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 210 ו- 240 BPM), בעוד שמשך הזמן המתאים של כל שלב מתקצר במקביל. למעט שתי הגדרות התדר הראשונות, משטר זה מניב בין 20-40 התכווצויות במהלך כל שלב. תקופת העקשנות של כל פרוסה מוערכת על ידי שליחת גירוי מוקדם (S2) לאחר גירוי רגיל (S1; 30 BPM). מרווח S1-S2 מקוצר כל 10 שניות.
כדי להדגים את הפוטנציאל של מערכת הטיפוח המוצגת ככלי לבדיקת התערבויות פרמקולוגיות, פרוסות רקמות LV אנושיות ex vivo הוכנו מאותו מטופל והיו נתונות לחומרים פרמקולוגיים המשפיעים על רמות יון הסידן התוך תאי (Ca2+) (n = 1) לאחר שבועיים של טיפוח. האנטגוניסט מסוג L Ca2+-channel nifedipine מעכב את זרם Ca2+ לתאי שריר הלב ולכן מוריד את הזמינות התוך-תאית של Ca2+ ומפחית את התכווצות17. בגלל פעולת מרחיב כלי הדם שלה, nifedipine משמש כתרופה נגד יתר לחץ דם. כדי להדגים הבדלים פרמקולוגיים של אנטגוניסטים בעלי ערוץCa 2+, נחקר סידן-אפטין לצורך השוואה. קלציצפטין הוא גם אנטגוניסט מסוג C2+ערוץ מסוג L, המופק מארס דנדרואספיס p. polylepis 18. לכן, הוא חולק את הפעולה האינוטרופית השלילית של nifedipine. עם זאת, לקלציצפטין יש תכונות קשירה שונות והוא חזק יותר בהשוואה לניפדיפין19. על מנת לחקור את המודולציות החיוביות והשליליות של זמינות Ca2+ , בדקנו גם את האגוניסט של תעלת הסידן Bay-K8644 (1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-5-nitro-4-(2-[trifluoromethyl]phenyl)pyridine-3-carboxylic acid methyl ester)20.
שלוש פרוסות טופלו בניפדיפין (125 ננומטר), קלציצפטין (70.8 ננומטר) ו-Bay-K8644 (417 ננומטר) בהתאמה, בעוד שהפרוסה הרביעית לא קיבלה תרופה (בקרה). כוחות ההתכווצות תחת פרמטרים של גירוי כללי (זרם 50 mA, פולסים דו-פאזיים במשך 3 אלפיות השנייה, מרווח של 1 אלפיות השנייה וקצב קצב של 30 BPM) הושוו לפני ואחרי הטיפול. יתר על כן, לפני הטיפול הופעל פרוטוקול גירוי כדי להעריך את הערכים הבסיסיים עבור פוטנציה לאחר ההשהיה, סף הגירוי, יחס כוח-תדר ותקופת עקשן. לאחר 30 דקות של טיפול, הופעל פרוטוקול גירוי שני. כדי למנוע הבדלים בין-אישיים, משרעת ההתכווצות של כל פרוסה נורמלה לרמת הבסיס שלה לפני הטיפול. הבסיס (כלומר, 100%) נקבע על ידי ניתוח חמשת מחזורי ההתכווצות האחרונים לפני תחילת פרוטוקול הגירוי לפני הטיפול.
כאשר ניתחו את התכווצות הפרוסות בגירוי כללי, נצפה כי כוח הכיווץ של הפרוסות שטופלו באנטגוניסטים Ca2+ (ניפדיפין וקליספטין) פחת תוך 10 דקות לאחר הטיפול (איור 5) וההשפעה הייתה נוכחת עד 20 דקות לאחר הטיפול. לעומת זאת, אגוניסט ערוץ Ca2+ המגודר במתח Bay-K8644 הגדיל את כוח הכיווץ של הפרוסה המטופלת. פרוסת הבקרה לא הראתה שינוי ראוי לציון. נתוני ההתכווצות שנוצרו במהלך פרוטוקולי הגירוי נותחו באופן דומה. כאן, הנתונים שנוצרו על ידי פרוטוקול הגירוי שבוצע לפני הטיפול (טרום הטיפול) הושוו לנתונים שלאחר הטיפול של אותו פרוטוקול גירוי.
כפי שנדון קודם לכן, פרוטוקול הגירוי התחיל בהערכת הפוטנציה שלאחר ההשהיה. במהלך ההפסקה, Ca2+ נוסף נלקח על ידי הרשתית הסרקופלסמית (SR), אשר משתחררת עם הגירוי הראשון לאחר ההפסקה. לפיכך, פוטנציה לאחר ההשהיה משקפת שחרור Ca2+ תוך תאי מה-SR. ככזה, ניתן להשתמש בפרמטר זה כדי להעריך את התרומה היחסית של Ca2+ ששוחרר מה- SR על ידי קולטן הריאנודין. כדי להעריך את העוצמה של הפרוסות לאחר הפסקת גירוי, עוצמת ההתכווצות הראשונה לאחר ההשהיה התחלקה בהתכווצות הממוצעת לפני ההשהיה המתאימה. פרוסת הבקרה לא הראתה שום שינוי ראוי לציון (איור 6A). נצפה כי העיכוב של תעלות Ca2+ מסוג L הוביל לפוטנציה של ההתכווצות הראשונה לאחר הפסקה של לפחות 50 שניות (איור 6B,D), מה שמשקף תרומה יחסית גבוהה יותר של שחרור Ca2+ תוך-תאי להתכווצות מוחלטת. ההשפעה ההפוכה נראתה בפרוסה שטופלה ב-Bay-K8644, מה שמעורר את כניסתו של Ca2+ חוץ-תאי דרך תעלות Ca2+ מסוג L (איור 6C).
יחס הכוח-תדר הוערך על ידי הגדלה רצופה של קצב הקצב עד 180 BPM. לצורך הדמיה טובה יותר, כוח הכיווץ בתדרי גירוי שונים מנורמל להתכווצות הבסיסית ב-30 BPM בתוך אותו פרוטוקול (=100%). ניתוח הנתונים הראה שהטיפול בקלציצפטין לא שינה את היכולת של הפרוסה לעקוב אחר הגירויים עם העלייה בתדירות הגירוי כאשר משווים את הנתונים לפני ואחרי הטיפול (איור 7B). לא נצפה שינוי בפרוסת הבקרה (איור 7A). בניגוד לקלציצפטין, ניפדיפין מנע עלייה בהתכווצות בקצבי קצב גבוהים יותר והפחית את קצב הלכידה המרבי ל-80 BPM (איור 7D). הפרוסה שטופלה באגוניסט ערוץ Ca2+ Bay-K8644 הראתה כוח כיווץ מוגבר בתדרי גירוי נמוכים מאוד (איור 7C). עם זאת, בתדרים הגבוהים מ-50 BPM, נראה כי כוח ההתכווצות היה נמוך יותר מאשר במהלך המצב שלפני הטיפול. סף הגירוי ותקופת העקשנות נקבעו גם לפני ואחרי הטיפול. עם זאת, לא נצפו הבדלים, ולכן הנתונים אינם מוצגים.
איור 1: סקירה כללית של החומרים הנדרשים ומערכת הטיפוח. לוח המעגלים (1) מודד את ההתכווצות באמצעות חיישן ומעביר את הנתונים לבקר. (B) שמונה תאים מלאים המונחים על הלוח הראשי המתנדנד. מכסי צלחת פטרי (35 מ"מ) משמשים לכיסוי התאים. (C) הכלים (הכירורגיים) הדרושים לחיתוך דגימת שריר הלב הטרנסמורלית. מתוארים פינצטה שונים, הלהבים הדרושים לוויברטום, וכתם גומי כדי לסייע בקיצוץ. (D) ארבע מחטים בגודל 0.9 מ"מ x 70 מ"מ 20 גרם המקובעות במיקום מרובע (0.9 ס"מ x 0.9 ס"מ) על ידי גוש פלסטיק מוצק. שימוש במבנה זה מונע נזק ותזוזה של הדגימה בעת חיתוך ומניב בלוק רקמה עם הממדים הנדרשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: עיבוד של שתי דגימות LV. (A) שני גושי רקמה שריר הלב (בערך 1 ס"מ x 1 ס"מ x 1 ס"מ) המשובצים באגרוז נמוך מומס ממוצק בצלחת פטרי של 35 מ"מ. למטרות הדגמה, נעשה שימוש ברקמת LV חזירית. (B) גוש האגרוז עם הדגימות המוטבעות הוסר מצלחת פטרי, נחתך והודבק על פלטפורמת החיתוך של הוויברטום. כאן, רקמת LV חזירית שימשה למטרות הדגמה. שימו לב לצבע הרקמה האחיד ולהיעדר רקמה פיברוטית לבנה, המסומנת על ידי החץ האדום. (C) לאחר החיתוך, האגרוז מוסר בזהירות, ומשולשים פלסטיים (1) מחוברים בניצב לכיוון סיבי שריר הלב. הקווים האדומים מציינים את כיוון סיבי שריר הלב. (D) רקמת LV אנושית הוכנה, שהראתה רקמה פיברוטית לבנה בתוך הפרוסות. זה לא בהכרח מוריד את אחוזי ההצלחה של הטיפוח; עם זאת מומלץ להשתמש בפרוסות שאינן מציגות פיברוזיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תוכנת הטיפוח. בהתאם למספר הערוצים שבהם נעשה שימוש (מקסימום שמונה), רישום הצמצום יודגם בעד שלושה חלונות ייעודיים (שניים גלויים באיור). כל תא גידול מוצג כגרף כיווץ אחד. בחלון ההגדרות, ניתן לשנות פרמטרים של גירוי ולהתאים אותם למצב הניסוי הרצוי. חלון זה מאפשר גם להתחיל או לעצור את פרוטוקול / לוח הזמנים של הגירוי שנבחר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: קריאה של התכווצות של חמש פרוסות שריר הלב במהלך פרוטוקול גירוי טיפוסי. בכל החלוניות, כל פרוסה בודדת מוצגת באותו צבע. (A) פוטנציה לאחר ההשהיה מעריכה את ההתכווצות הראשונה לאחר הפסקת גירוי קצרה של 3, 12, 50 ו-120 שניות בהתאמה. (B) קביעת סף הגירוי על ידי הגדלת זרם הגירוי בשלבים של 3 mA כל 10 שניות מ-8 mA ל-80 mA. (C) יחס הכוח-תדר של כל פרוסה מוערך על ידי עלייה הדרגתית בתדירות הגירוי מ-12 BPM ל-240 BPM. משך תקופות הגירוי מתקצר בתדרים גבוהים יותר כדי לשמור על מספר הפעימות קבוע בכל תדר. (ד) כדי להעריך את התקופה העקשנית, הפרוסות חשופות לגירויים מוקדמים (S2) במרווחי זמן הולכים ופוחתים לגירוי הקודם (S1). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: ניתוח של כוח התכווצות לפני ואחרי הטיפול בסוכנים המשפיעים על תעלות מסוג L מסוג Ca2+ . כל הנתונים (n = 1) נורמלו להתכווצות הבסיסית (ממוצע של חמש פעימות נפרדות לפני הטיפול (0)). אנטגוניסטים מסוג L מסוג Ca2+ nifedipine (125 nM), calciseptine (70.8 nM) ו-L-type Ca2+ אגוניסט ערוץ Bay-K8644 (417 ננומטר) נוספו לפרוסות שריר הלב האנושיות של LV. פרוסת הבקרה לא קיבלה טיפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: לאחר ההשהיה-פוטנציה של פרוסות הטיפול והבקרה. נצפו הבדלים בעוצמה שלאחר ההשהיה (קו בסיס לעומת לאחר טיפול; n = 1). כאן, המשרעת של ההתכווצות הראשונה לאחר ההשהיה נורמלה למשרעת ההתכווצות הממוצעת לפני ההשהיה המתאימה. קו הבסיס הוגדר כ-100% ודומה לעוצמת הכיווץ הממוצעת של חמשת המחזורים האחרונים לפני תחילת ההפסקה הראשונה. ציר ה-Y מציג את הכיווץ הראשון המנורמל לאחר הפסקה של משכי זמן שונים. ציר ה-X מציג את קו הבסיס ואת אורכי ההשהיה. (א) שליטה בפרוסה ללא טיפול. (B) טיפול בקלציצפטין. (C) טיפול Bay-K8644. (ד) טיפול בניפדיפין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: ניתוח יחס תדר הכוח. נתוני ההתכווצות (n = 1) נורמלו לכוח הכיווץ ב- 30 BPM בתוך הפרוטוקול המתאים (= 100%). (א) פרוסת הבקרה לא טופלה בחומר כלשהו; עם זאת, כל ההיבטים האחרים של הטיפוח היו זהים לאלה של הפרוסות המטופלות. (B) טיפול בקלציצפטין בפרוסת שריר הלב LV אחת. (C) טיפול Bay-K8644. (ד) טיפול בניפדיפין. נתונים על כוח הכיווץ של פרוסה זו במהלך תדרי גירוי מעל 80 BPM הושמטו, מכיוון שההתכווצות לא עקבה אחר תדירות הגירוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: הרכב מאגר החיתוך המשמש להובלה ובמהלך הליך החיתוך. להכנת אגרוז, גלוקוז מושמט. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: הרכב הג'ל 4% אגרוז. ג'ל אגרוז נמוך זה ללא גלוקוז משמש להטבעת דגימות הרקמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: הכנת המדיום לטיפוח. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 4: פרטי פרוטוקול הגירוי. פרוטוקול הגירוי מורכב מארבעה חלקים, שכולם ניתנים לשינוי כדי שיתאימו לצרכי הפרויקט. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבר, מחקר הלב וכלי הדם עשה התקדמות רבה בטיפוח של קרדיומיוציטים. עם זאת, הטיפוח התלת-ממדי של קרדיומיוציטים עם גיאומטריה שלמה עדיין אינו מבוסס היטב. בהשוואה לפרוטוקולים קודמים שיושמו עבור גידול ex vivo של רקמת שריר הלב, הפרוטוקול שתיארנו כאן דומה יותר לסביבת in vivo של הרקמה. יתר על כן, היישום של עומס לפני ואחרי מאפשר סביבה ביומימטית יותר. אנו מסוגלים לנתח ולהבין באופן מלא את הרישום הרציף של נתוני ההתכווצות ופרמטרים של התכווצות הרקמה.
מספר טכניקות גידול רקמות הלב וכלי הדם ex vivo באמצעות מערכים דומים מוגבל 11,21,22. טכניקה דומה לגידול פרוסות שריר הלב שפורסמה משתמשת בצלחת 6 בארות לטיפוח פרוסות שריר הלב10. עם זאת, מגבלה חשובה של מערך מסוים זה היא שהפרוסות אינן חשופות לפני ואחרי העומס, וגם אינן מסוגלות להניב תצוגה מפורטת של ההתכווצות לאורך זמן ללא צורך בטיפול ברקמה. השיטה שתיארנו כאן מפחיתה את הסיכון לנזק לרקמות או לזיהום. יתר על כן, הוא נותן מבט מקיף על השינויים האפשריים בכוח ההתכווצות בכל פעם שמתווסף חומר בעל עניין לטיפוח. בנוסף לניתוח של כוח הכיווץ הנורמלי של כל פרוסה, הגדרת הזרם מאפשרת להריץ באופן קבוע פרוטוקולים מוגדרים מראש. זה מאפשר איסוף נתונים של פרמטרים רלוונטיים שונים של הרקמה המעובדת.
שלבים קריטיים בפרוטוקול
יש להימנע מנזק לרקמות, וזה כבר יכול להתרחש במהלך ניתוח explant. אם הרקמה אינה מועברת מיד לתמיסת האחסון הקרה לאחר הכריתה, הדבר עלול לגרום לדגימות רקמה פגומות. הפרוטוקול המתואר מכיל מספר שלבים שהם קריטיים להשגת תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. יש להכין את תרכובת הטבעת רקמת האגרוז באמצעות חיץ החיתוך ללא גלוקוז, כדי למנוע קרמליזציה אפשרית של הגלוקוז במהלך תהליך ההיתוך לפני תחילת הפרוטוקול. חשוב להימנע מנזק עקב היפרתרמיה הנגרמת על ידי שימוש באגרוז ישירות מאמבט המים של 80 מעלות צלזיוס, במקום לדוגר את האגרוז במזרק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הטמפרטורה צריכה להיות 4 מעלות צלזיוס במהלך האחסון והחיתוך כדי להפחית את חילוף החומרים ולמזער איסכמיה. כמו כן, יש לטפל ברקמות בזהירות, על ידי תפיסת האגרוז ולא הרקמה עצמה, בעת הזזתו בין מגש החיתוך לצלחת פטרי כדי לחבר את משולשי הפלסטיק. יש חשיבות עליונה לכך שמשולשים אלה מחוברים בכיוון הנכון ביחס לכיוון סיבי שריר הלב. אי-התאמה של המשולשים תגרום לנזק לרקמות.
באופן כללי, סף הגירוי של פרוסות שנחתכו לאחרונה הוא בין 10-20 mA, ויש להגדיל בזהירות את הזרם. גירוי יתר של הרקמה על ידי זרם גבוה מדי עלול להוביל גם לנזק בלתי הפיך לדגימה. לאחר תחילת הגירוי, יש צורך בתסיסת רקמות על ידי נדנדת תאי הטיפוח, ואין לעצור אותה למשך יותר מ-5 דקות כדי להבטיח זמינות נאותה של חמצן וחומרים מזינים לרקמה.
פתרון בעיות ושינויים
היפר התכווצות
התכווצות יתר של דגימת רקמת שריר הלב היא אחד הקריטריונים העיקריים להדרה עבור הפרוטוקול הנדון. זה יכול להתרחש לפני ואחרי ההכנה של פרוסות שריר הלב. במקרים בהם, לפני ההכנה, הרקמה הרגישה נוקשה עם המישוש, נצפתה היפר-קונטרהקציה בלפחות 70% מההכנות. התכווצות יתר של דגימת הרקמה עשויה להתרחש גם עם החדרת הנדנדה, מה שככל הנראה תלוי באיכות הרקמה או במצב המחלה של המטופל. היפר התכווצות ניתן לראות כעלייה של הטון הדיאסטולי במהלך הגירוי של הרקמה, המקבילה לקיצור טוניק של קרדיומיוציטים פגומים באיסכמיה לבבית. התכווצות יתר במהלך גירוי יכולה להיות פרוגרסיבית, לפיה ההתכווצות חורגת ממגבלת הגילוי של 12 mN. עם זאת, ההיפר התכווצות עשויה גם להתהפך באופן ספונטני תוך 30-60 דקות, מה שמרמז על כך שהרקמה יכולה להתאושש. כדי לשפר את ההתאוששות של הרקמה, יש להתאים מחדש את הגדרות הטעינה מראש (כלומר, לחזור על שלב 8.3) לאחר שעה אחת של דגירה, כמו גם בימים 2, 4 ו -6 לאחר ההכנה. התכווצות יתר עשויה להיות נוכחת הן עם והן בלי התכווצות מגורה של הדגימות. עם זאת, אם לא נצפתה התכווצות תוך שעה אחת, אין להשתמש במדגם. במקרה זה, הרקמה יש hypercontracted במידה שממנה היא לא יכולה להתאושש או נפגעה אחרת. באופן כללי, טיפוח של פרוסות שריר הלב האנושי על פי הפרוטוקול המוצג, הראה שיש לו שיעור הצלחה של 90%.
שינויים צפויים בכוח ההתכווצות
בהתאם למספר רב של גורמים (למשל, מטופל, הכנה, נזק לרקמות), ייתכן כי מיוסליקים שהראו התכווצות מקובלת בתחילה, יעברו ירידה הדרגתית באמפליטודות התכווצות התכווצות במהלך 24 השעות הראשונות. למעשה, התנהגות זו יכולה אפילו להיחשב נורמלית עבור פרוסות המתקבלות מלבבות כושלים של סוף שלב אנושי. נמצא כי התאמה מחדש של הטעינה מראש של הפרוסות בכל יום במשך 3 הימים הבאים תקל על בעיה זו ותשפר את ההתכווצות. לאחר 24 עד 48 שעות, עם זאת, התכווצות אמורה להתחיל לעלות שוב. שים לב שההתכווצות לא תחזור לרמתה הנצפית הראשונית בימים הראשונים של הטיפוח.
זמן קצר לאחר חילופי הביניים, כאשר הדגימות מוחזרות לחממה, ההתכווצות מראה בדרך כלל משרעת מוגברת במידה ניכרת. פתיחה וסגירה של החממה תורמת לעלייה זו, שכן היא גורמת לרמת ה- CO2 לרדת. זה מגביר את ה-pH בתוך מדיום הטיפוח החצוב של ביקרבונט, מה שגורם לתגובה אינוטרופית חיובית של הפרוסות. לאחר חילופי הביניים, כוח ההתכווצות של הפרוסות פוחת לעתים קרובות במשך מספר שעות עד שהוא מגיע או עולה על ערכן ההתחלתי. כדי למנוע מפרוטוקולי גירוי להיות מושפעים מהחלפה בינונית, אין לבצע פרוטוקולי גירוי עד לפחות שעה אחת לאחר חילופי ביניים.
מגבלות השיטה
יתרון של הטכניקה הנוכחית בהשוואה לשיטות טיפוח מוקדמות יותר לרקמות שריר הלב האנושיות, הוא האפשרות ליישם (ולווסת) לפני ואחרי העומס על הרקמה המתכווצת. עם זאת, קשה לכמת את העומס המופעל במונחים של מתח דופן, אם כי ניתן להעריך עומס זה מקבוע הקפיץ ומממדי הפרוסה. ההנחה היא כי קיים קשר חיובי בין הכדאיות של רקמת שריר הלב לבין משרעת ההתכווצות של דגימת הרקמה. עם זאת, אין כיום שיטה המאפשרת בדיקת כדאיות של כל פרוסה בנפרד לפני הרכבתה לתאים. ניתן לבצע צביעת MTT צבעונית על פרוסות חתוכות שאינן משמשות לטיפוח, כדי לקבוע את הכדאיות של תאי שריר הלב. בתאים בני קיימא, NADPH יפחית את מלח ה-MTT הצהוב בגבישי פורמזן סגולים. מגבלה נוספת היא שכיום, החומרים המזינים במדיום הטיפוח מוגבלים למרכיבים בסיסיים. לפיכך, חומרים מזינים וגורמים במחזור שונים מסביבת in vivo שממנה התקבלה הרקמה. עם זאת, ניתן להשלים את המדיום או לשנותו לפי הצורך.
יישומים פוטנציאליים של השיטה
ישנם מספר יישומים פוטנציאליים של השיטה הן במונחים של קרדיוטוקסיות ובדיקות סמים, כמו גם בהבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות לב. ראשית, המערכת המשמשת בפרוטוקול הנדון יכולה לשמש להקרנות סמים וסיבולת לב-ריאה. בעזרת פרוטוקולי הגירוי הניתנים לתכנות, ניתן לנתח שינויים פיזיולוגיים בתגובה למתן תרופות. לגבי הפרשנות של תקופה עקשן, יש לקחת בחשבון כי זהו פרמטר פונקציונלי, אשר אינו משקף בקפדנות את ההשפעה של תרופות על משך פוטנציאל הפעולה. שנית, ניתן להשתמש בתאי הטיפוח לניסויים שונים של גידול משותף של שריר הלב בשילוב עם תאי מערכת החיסון. על ידי שימוש בטיפוח משותף זה, ניתן להעריך את ההשפעות הישירות של גורמים המופרשים על תאי מערכת החיסון על התכווצות שריר הלב. לבסוף, ניתן גם לטפח דגימות קרדיומיופתיה ללא השתלה, אם כי דגימות רקמה אלה שאינן מושתלות הן בדרך כלל קטנות יותר ולכן קשות יותר לעיבוד. עם זאת, זה עשוי לפתוח אפשרויות לזיהוי מטרות טיפוליות חדשניות ולפיתוח תרופות ממוקדות מטרה. ניתן גם להעלות על הדעת להשתמש בטכניקה לאפיון רקמות ספציפיות למטופל, מה שמקרב אותנו צעד אחד קרוב יותר לרפואה מותאמת אישית. יתר על כן, השיטה המוצגת יכולה לשמש עבור רקמת שריר הלב שאינה אנושית, שדוגמאות להן חזיר וארנב. יש לקחת בחשבון, כי לא ניתן להשיג את קצב הלב הפיזיולוגי הגבוה של יונקים קטנים (עכבר/חולדה), מכיוון שלא ניתן לעמוד בדרישת O2 הגבוהה יותר לאחר מכן בתנאים של טיפוח שריר הלב באמצעות המערך הנדון. לפיכך, קשה לחקות סביבה כמעט פיזיולוגית במקרים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ל-JH, PS, DM ו-KL אין מה לחשוף. AD ו- TS הם בעלי המניות של InVitroSys GmbH, המספקת את מערכת הטיפוח Myodish.
Acknowledgments
המחקר מומן על ידי מענקי DZHK 81Z0600207 (JH, PS ו- DM) ו- 81X2600253 (AD ו- TS).
המחברים רוצים להודות לקלאודיה פאני, מיי-פינג וו ומתיאס סמיש על תמיכתם בהכנת הסט-אפים, כמו גם על התחזוקה השוטפת של גידול הרקמות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
