Summary
İnsan ventriküler miyokard dokusunun ex vivo ekimi için bir protokol sunuyoruz. Kasılma kuvveti ve kinetiğin ayrıntılı analizinin yanı sıra, in vivo fizyolojik ortamı daha yakından taklit etmek için ön ve son yükün uygulanmasına izin verir.
Abstract
Kardiyomiyosit yetiştiriciliği, iki boyutlu (2D) hücre yetiştiriciliğinden iPSC türevi organoidlere kadar çok sayıda gelişme göstermiştir. 2019 yılında, miyokard kasılmasının in vivo durumuna yaklaşırken, insan kalp örneklerinden elde edilen miyokard dilimlerini yetiştirmenin ex vivo bir yolu gösterilmiştir. Bu örnekler çoğunlukla kalp transplantasyonlarından veya sol ventrikül destek cihazı yerleşimlerinden kaynaklanmaktadır. Bir vibratom ve özel olarak geliştirilmiş bir yetiştirme sistemi kullanılarak, sabit ve yaylı bir tel arasına 300 μm kalınlığında dilimler yerleştirilir ve birkaç hafta boyunca istikrarlı ve tekrarlanabilir bir ekime izin verir. Yetiştirme sırasında, dilimler bireysel ayarlara göre sürekli olarak uyarılır. Kasılmalar gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir ve kaydedilebilir ve farmakolojik ajanlar kolayca uygulanabilir. Kullanıcı tanımlı stimülasyon protokolleri, duraklama sonrası potansiyel, stimülasyon eşiği, kuvvet-frekans ilişkisi ve refrakter dönem gibi hayati kasılma parametrelerini değerlendirmek için planlanabilir ve gerçekleştirilebilir. Ayrıca, sistem daha fizyolojik bir yetiştirme için değişken bir ön ve son yük ayarı sağlar.
Burada, ticari bir biyomimetik yetiştirme çözeltisi kullanarak, insan sol ventrikül miyokard dilimlerinin başarılı bir şekilde uzun vadeli bir şekilde nasıl yetiştirileceğine dair adım adım bir kılavuz sunuyoruz.
Introduction
Son on yılda, miyokard hücrelerinin in vitro yetiştirilmesi, 2D ve üç boyutlu (3D) tekniklerden, organoidlerin kullanımına ve kardiyak miyositlere farklılaştırılmış pluripotent kök hücrelerin kullanımına kadar büyük ilerlemeler kaydetmiştir 1,2,3. Ex vivo ve primer hücre yetiştiriciliğinin, özellikle genetik çalışmalar ve ilaç geliştirme için büyük bir değere sahip olduğu gösterilmiştir 4,5,6. İnsan dokularının kullanılması, sonuçların translasyonel değerini arttırır. Bununla birlikte, bozulmamış geometriye sahip miyokard dokularının uzun süreli 3D yetiştiriciliği iyi kurulmamıştır. Bozulmamış geometri, in vivo koşulları taklit etmek için önemli bir özelliktir, çünkü uygun kalp fonksiyonu, farklı hücreler arasındaki iletişim ve hücre-matris etkileşimleri ön koşuldur. Miyokard doku yetiştiriciliği, gelişimin çeşitli aşamalarından geçti. Ex vivo miyokard doku yetiştiriciliğinin başarı oranı ve stabilitesi başlangıçta oldukça düşüktü, ancak son yaklaşımlar umut verici sonuçlar verdi 7,8,9,10,11.
Bunlar arasında, Fischer ve ark., insan miyokard dokusunun yaşayabilirliğinin ve kontraktil performansının ex vivo hücre yetiştiriciliğinde7. hafta boyunca korunabileceğini gösteren ilk kişilerdi. Teknikleri, tanımlanmış biyomekanik koşullar ve sürekli elektriksel stimülasyon sağlayan yeni geliştirilen yetiştirme odalarına monte edilen ekilen insan miyokardından kesilen ince doku dilimlerine dayanıyordu. Bu yetiştirme yöntemi, miyokard dokusunun in vivo fonksiyonuna çok benzemektedir ve birkaç bağımsız araştırma grubu2,12,13,14,15 tarafından çoğaltılmıştır. Daha da önemlisi, Fischer ve ark. tarafından kullanılan odalar, gelişmiş kuvvetlerin 4 aya kadar sürekli olarak kaydedilmesini sağladı ve böylece bozulmamış insan miyokardının7 fizyolojik ve farmakolojik araştırması için benzeri görülmemiş fırsatlar yarattı.
Benzer teknikler diğer gruplar tarafından bağımsız olarak geliştirilmiş ve insan, sıçan, domuz ve tavşan miyokard 7,10,11'e uygulanmıştır. Pitoulis ve ark. daha sonra bir büzülme döngüsü sırasında normal kuvvet-uzunluk ilişkisini yeniden üreten, ancak yüksek verimli analiz için daha az uygun olan daha fizyolojik bir yöntem geliştirdiler16. Bu nedenle, biyomimetik yetiştiriciliğin genel yaklaşımı, hayvan deneylerinin azaltılması, iyileştirilmesi ve değiştirilmesi (3R) için bir sonraki adım olarak kabul edilebilir.
Bununla birlikte, bu potansiyelden yararlanmak için standartlaştırılmış prosedürler, yüksek içerik analizleri ve yüksek bir verim seviyesi gerekir. Yaşayan insan miyokardının otomatik dilimlenmesini, ticari olarak temin edilebilen biyomimetik bir yetiştirme sisteminde in vitro bakım ile birleştiren bir teknik sunuyoruz (bakınız Malzeme Tablosu). Önerilen yaklaşımla, tek bir transmural miyokard örneğinden üretilebilecek bireysel dilimlerin sayısı sadece işlem süresi ile sınırlıdır. Yeterli boyut ve kalitede (3 cm x 3 cm) bir örnek genellikle otomatik bir vibratom ile uygun şekilde kesilen 20-40 doku dilimi verir. Bu dilimler sisteme ait yetiştirme odalarına yerleştirilebilir. Odalar, parametreleri modüle edilebilen elektriksel stimülasyona (yani, darbe süresi, polarite, hız ve akım) ve ayrıca odaların içindeki yaylı teller kullanılarak ön ve son yükün ayarlanmasına izin verir. Her dilimin büzülmesi, bir yay teline bağlı küçük bir mıknatısın hareketinden kaydedilir ve yorumlanabilir bir grafik olarak görüntülenir. Veriler her zaman kaydedilebilir ve serbestçe kullanılabilen yazılımlar kullanılarak analiz edilebilir. Sabit taban çizgisi hızının yanı sıra, refrakter dönemlerini, stimülasyon eşiğini, duraklama sonrası potansiyellerini ve kuvvet-frekans ilişkilerini işlevsel olarak değerlendirmek için planlanmış protokoller gerçekleştirilebilir.
Bireysel bir kalpten çoklu miyokard dilimlerinin bu uzun süreli biyomimetik ekimi, hem insan hem de hayvan dokusunda gelecekteki ex vivo araştırmaların yolunu açar ve kardiyovasküler tıpta terapötik ve kardiyotoksik ilaç etkilerinin taranmasını kolaylaştırır. Çeşitli deneysel yaklaşımlara zaten uygulanmıştır 2,12,13,15. Burada, insan dokusunun hazırlanmasının ayrıntılı bir adım adım tanımını veriyoruz ve sık karşılaşılan yetiştirme sorunlarına çözümler sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan deneyler için doku toplama, Münih Üniversitesi ve Bochum Ruhr Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylanmıştır. Çalışmalar Helsinki Deklarasyonu kılavuzlarına göre yürütülmüştür. Hastalar doku toplamadan önce yazılı bilgilendirilmiş onamlarını verdiler.
1. Doku edinimi
- Kalp nakli veya kalp ameliyatı geçiren hastalardan insan dokusu elde edin.
- Dokuyu tedarik etmeden önce, 2 L kardiyoplejik çözelti hazırlayın (ayrıca dilimleme tamponu olarak adlandırılır (Tablo 1)).
- 4 cm x 4 cm boyutlarında transmural sol ventrikül (LV) biyopsisi elde edildikten sonra, dokuyu derhal (eksizyondan sonraki 5 dakika içinde) yaklaşık 70 mL soğuk (4 °C) dilimleme tamponu içeren kapatılabilir plastik tek kullanımlık steril bir beherin içine yerleştirin. 4 °C'de tutun.
NOT: Bu protokolde kullanılan dilimleme tamponu, dokunun 36 saate kadar soğuk depolanmasına (4 °C) izin verir. Bu, dokunun laboratuvara yakın olmayan kliniklerden soğuk taşınmasına izin verir. Bununla birlikte, 24 saat ≤ taşıma sürelerinin en uygun olduğu kanıtlanmıştır.
2. Agaroz ve vibratomun hazırlanması
- Yeterli yetiştirme odalarının hazırlandığından ve sterilize edildiğinden emin olun (Şekil 1A).
- Odaları ve grafit elektrotları% 10'luk bir izopropanol çözeltisinin 1 L'sine batırın ve gece boyunca çalkalayın. Ertesi gün, odaları 3 dakika boyunca% 100 izopropanol çözeltisine aktarın ve grafit elektrotları 10 dakika boyunca 120 ° C'de otoklav yapın.
- Haznelerin ve grafit elektrotların laminer bir akış başlığı altında hava ile kurumasını bekleyin.
- Rocker üzerindeki mevcut konumlara göre odaların her birine bir devre kartı takın. Üreticinin talimatlarına göre devre kartına iki grafit elektrot yerleştirin.
- Kirlenmeyi önlemek için haznenin üstüne 35 mm'lik bir Petri kabı kapağı yerleştirin.
- Sistemi bir bilgisayara bağlayarak bir inkübatörde 37 °C ve% 5 CO2'de Miyodish yetiştirme sistemini (Malzeme Tablosuna bakınız) kurun (Şekil 1B).
- % 4 düşük eriyik agarozunu dilimleme tamponunda hazırlayın (glikoz olmadan; Tablo 2). Agaroz 6 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- Deney gününde, 80 ° C'de ayarlanmış bir su banyosu kullanarak bir stok hacmi agaroz çözeltisini eritin. Miktara bağlı olarak, erime yaklaşık 30 dakika sürer.
- Agaroz sıvı olduğunda, ek 2 mL hava ile 10 mL'lik bir şırıngaya 8 mL sıvı agaroz çekin. Şırıngayı steril bir kapakla kapatın ve agarozun katılaşmasını önlemek ve numunenin hipertermi hasarını önlemek için sıcaklığını dengelemek için 20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna baş aşağı yerleştirin.
- Varsa, yeterli soğutma kapasitesine izin vermek için doku dilimlemeden en az 30 dakika önce vibratomun su soğutma cihazını açın. Su sirkülasyonunun sıcaklığını 4 °C'ye ayarlayın.
NOT: Burada kullanılan kesme tepsisi ve soğutma plakasının her ikisi de dahili bir su sirkülasyonu içeriyordu. Bu, soğutma ve kontaminasyon risklerini azaltmak için şiddetle tavsiye edilir. Bununla birlikte, buzu bir soğutma tekniği olarak kullanmak da mümkündür. Ayrıca, su soğutma cihazının protokolün bu noktasında vibratomun kesme tepsisine ve / veya soğutma plakasına bağlanması gerekmez. - Vibratomun dilimleme tepsisini ve numune plakasını, tüm yüzeyleri en az 3 dakika boyunca% 100 izopropanol ile yıkayarak temizleyin.
NOT: Kullanılan vibratom sistemine bağlı olarak, vibratom kurulumu farklı olabilir. Kurulum ve bıçak kalibrasyon yöntemleri hakkında bilgi için laboratuvarda bulunan vibratomun el kitabına bakın. - Kesme tepsisini dilimleme tamponu ile %90-%95'e kadar doldurun. Şu anda kullanılan kurulumda, bu yaklaşık 400 mL'ye karşılık gelir. Su soğutma cihazının borusunu, vibratomun kesme tepsisindeki ve soğutma plakasındaki valflere bağlayın.
- Hazırlık için gerekli tüm aletleri, 5 s için% 100 izopropanol çözeltisine batırarak dezenfekte edin. Aletleri izopropanol çözeltisinden çıkarın ve laminer akış başlığının altında hava ile kurulayın.
3. Numunelerin kesilmesi ve gömülmesi
- Doku örneğini soğuk dilimleme tamponu ile doldurulmuş 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Çanağı 4 ° C'de bir soğutma plakasında tutun (soğutucuya bağlı veya buz üzerine yerleştirilmiş).
- Endokardın cımbızla tutulmasını ve yaklaşık 3 mm endokardiyal dokuyu kesmek için makas kullanılmasıyla endokardiyal trabekülleri çıkarın. Aynı şekilde, varsa epikardın altındaki aşırı yağ dokusunu çıkarın.
- Kesilmiş doku numunesini, endokardiyal tarafı yukarıya, kare konumda (0,9 cm x 0,9 cm; Şekil 1C, D). Her iğne ucunun çapraz kenarının içe dönük olduğundan emin olun. Bu, fiksasyonu arttırır ve miyokardın zarar görmesini önler.
DİKKAT: Yukarıda belirtilen karenin oryantasyonu, beklenen baskın miyofiber yönüne ortogonal olmalıdır. - Bir neşter kullanarak dört iğne karesinin dışındaki tüm fazla dokuları kesin. Orijinal numunenin boyutu izin veriyorsa, bu preparat sırasında aynı ham numuneden iki miyokard dokusu örneği kullanın.
- Cımbız kullanarak, numune üzerinde kalan fazla dilimleme tamponunu çıkarmak için kesilmiş numuneyi steril bir doku parçasına yerleştirin. Numunenin kurumasını önlemek için, numuneyi doku üzerinde 10 saniyeden daha uzun süre tutmayın.
- Numuneleri 35 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin, böylece bıçak kardiyomiyosit hizalamasına dik olarak kesilir ve epikard aşağı doğru bakar. Preparat iki numune içeriyorsa, numunelerin ortalandığından ve birbirine temas etmediğinden emin olun.
- Agaroz şırıngasını su banyosundan alın ve örnekleri agaroza batırın. (Şekil 2A). Agarozun bir soğutma plakası üzerinde 5 dakika katılaşmasına izin verin. Numune (ler) Petri kabı ile temas halinde kalmalıdır, bu da kesme düzleminin baskın miyokard lifi yönüne paralel olmasını sağlayacaktır.
DİKKAT: Hava kabarcıklarını önlemek için şırıngayı tamamen boşaltmayın. Numunelerin daldırılması sırasında şırıngada kalan agaroz miktarına dikkat edin. Numunelerle birlikte tabakta hava kabarcıkları olması durumunda, hava kabarcıklarını dikkatlice şırıngaya geri çekin.
4. Numunelerin kesme tepsisine yerleştirilmesi
- Numuneyi (ler) i içeren katılaşmış agarozu, bir spatula veya benzeri bir alet kullanarak, numune ile Petri kabının yan tarafı arasına sokarak 35 mm'lik Petri kabından çıkarın. Örnekleri kapalı tutarken agarozun bir kısmını neşter kullanarak kesin.
DİKKAT: Agarozu çok fazla çıkarmayın. X/Z düzleminde uzun ve kısa kenarlarda en az 5 mm agaroz kalmalıdır.
NOT: Adım 4.2-4.4'ün hızlı bir şekilde art arda (yani, maksimum 5 sn) gerçekleştirilmesi gerekir. Başlamadan önce gerekli tüm araçları elinizin altında bulundurun. Yerleştirmeden sonra numunenin yeniden konumlandırılması mümkün değildir. Tutkalın havaya ve neme maruz kalmasını sınırlamaya çalışın. Hava veya sıvılarla temas, yapıştırıcıyı katılaştıracak ve kullanılamaz hale getirecektir. - Bir pipetle, kesme platformunun ortasına ve çevresine 60 μL yapıştırıcı yerleştirin ve dağıtın.
- Agarozda bulunan numunenin epikardiyal tarafını cımbız kullanarak yapıştırılmış alanın üzerine yerleştirin. Yeniden konumlandırmayın. Numunenin endokardiyal tarafı agarozda görünür olmalıdır. Tutkalın 1 dakika katılaşmasına izin verin. Numuneyi içeren agarozu üstten künt bir aletle (örneğin cımbız) hafifçe bastırırken, agarozun kesilmesini veya zarar görmesini önleyin.
- Numune platformunu, dilimleme tamponu ile doldurulmuş vibratomun kesme tepsisine belirlenen konumuna yerleştirin.
5. Vibratomu başlatma
- Titreşim genliğini 1 mm'ye ve ilk kesme hızını 0,07 mm/sn'ye ayarlayın. Dilimleri kesmek için dilimin kalınlığını 300 μm'ye ayarlayın.
- Bıçak sadece agarozu kestiği sürece, kesme hızını maksimuma çıkarın, bu durumda 1,50 mm / s'dir. Vibratom dokuyu kesmeye başlar başlamaz, hızı hemen 0,07 mm / s'ye düşürün.
NOT: Doku düzgün bir şekilde dilimlenmezse, örneğin numunede geniş fibrotik alanlar varsa, kesme genliğini 1,5 mm'ye kadar artırmaya ve kesme hızını 0,04 mm / s'ye düşürmeye yardımcı olabilir.
6. Dilimleme prosedürü sırasında orta ve inkübatör hazırlığı
- Her yetiştirme odasını 2,4 mL tam yetiştirme ortamı ile doldurun (Tablo 3).
- Yetiştirme sistemi üzerinde ortamla dolu yetiştirme odalarını 37 °C, %5 CO 2, %21 O 2 ve %80 nem olarak ayarlanmış inkübatöre yerleştirin. Ortamı en az 20 dakika boyunca dengeleyin.
- Yetiştirme sistemini bir bilgisayara bağlayın ve ilgili yazılım programını başlatın.
- Rocker hızını 60 rpm'ye ayarlayın ve stimülasyon parametrelerini (stimülasyon darbeleri ve frekansı) önceden ayarlayın. İnsan kalp dilimleri için, standart stimülasyonu, her biri 3 ms pozitif akım, 1 ms duraklama ve 3 ms ters akım darbesinden oluşan, dakikada 30 atım (BPM) hızında 50 mA akımlı bifazik impulslara ayarlayın.
NOT: İyi korunmuş dokularda, tipik stimülasyon eşiği yaklaşık 15 mA'dır. Güvenilir stimülasyonu sağlamak ve stimülasyon eşiğindeki olası herhangi bir artışı hesaba katmak için, akımı stimülasyon eşiğini iki ila üç kat aşan bir değere ayarlamanız önerilir. - Yetiştirme odalarının elektrotlarının doğru çalıştığını doğrulamak için yazılımın elektrot göstergelerini kontrol edin.
NOT: Yetiştirme yazılımındaki kanal göstergesi kırmızıya döndüğünde harekete geçilmesi gerekir. Bu durumda, bipolar nabız yükleri dengeli değildir.
7. Dilimlerin hazırlanması
NOT: İlk subendokardiyal dilimler genellikle doku ekimi için uygun değildir ve düzensiz morfoloji nedeniyle atılması gerekir. İlk beş ila 10 dilimden sonra, dilim dokusu ve morfolojisi gelişir. İdeal dilim en az 1 cm x 1 cm'dir, fibrotik yamaları yoktur veya sadece sınırlı değildir, parçalanmamıştır ve homojen lif hizalamasına sahiptir (Şekil 2B, D). Miyozit lifleri arasında yer alan interstisyel fibroz, başarısız insan miyokardında sıklıkla bulunur. Şaşırtıcı bir şekilde, bu uygulama başarısının olumsuz bir göstergesi değildir.
- Dilimlerin kurumamasını sağlamak için 5 cm'lik Petri kabı kapağına yeterli miktarda soğuk dilimleme tamponu dökün. Dilimleri, soğuk dilimleme tamponunu içeren Petri kabı kapağına yerleştirin.
- Ağarozu cımbız kullanarak dokudan ayırın. Dokuya dokunmayı önleyin. Dokuyu dikkatli bir şekilde ele alın, çünkü dokudaki herhangi bir hasar, yetiştiriciliğin başarı oranını azaltacaktır.
- Bir ışık kaynağına karşı yakın inceleme yaparak miyokard liflerinin yönünü belirleyin. Bu, plastik üçgenleri adım 7.6'da dokuya bağlarken önemlidir.
NOT: Adım 7.4 ve 7.5'in 5 saniye içinde hızlı bir şekilde art arda gerçekleştirilmesi gerekir. - Dokuyu yetiştirme odalarının içine sabitlemek için yapıştırıcı kullanarak bir numuneye iki plastik üçgen takın.
- Steril bir Petri kabı kapağına 1 μL yapıştırıcı yerleştirin. Otoklavlanmış plastik üçgenlerden birini almak için kancalı bir cımbız kullanın. Üçgenin ön kenarını hızlı bir şekilde yapıştırıcıya batırın ve üçgeni kardiyomiyosit hizalamasına dik olarak numuneye yapıştırın. Diğer üçgen için bu işlemi tekrarlayın.
- Üçgen genişliğini aşan dokuyu bir neşter ile kesin (Şekil 2C). Dilimi, takılı iki üçgenle birlikte kesme tepsisinin dilimleme tamponuna geri yerleştirin.
NOT: Yetiştirme odalarını doldurmak için yeterli dilim hazırlanana kadar 7.2 ila 7.5 arasındaki adımları tekrarlayın. Dilimlerin zayıf kasılma ile değiştirilmesine izin vermek için birkaç ek dilim hazırlamanızı öneririz.
8. Dilimlerin montajı
NOT: Son yük, yetiştirme odalarındaki yay telinin sertliği ile belirlenir. Yay telinin kalınlığına bağlı olarak üç farklı tip mevcuttur.
- Kuluçka makinesinden orta dolgulu bir ekim odası alın. Hazırlanan dilimlerden birini seçin ve her pime bir üçgen bağlayarak hazneye yerleştirin.
- Montaj pimleri arasındaki mesafeyi numune boyutuna göre ayarlayın. Numunenin ortama batırıldığından emin olun. Odayı, inkübatördeki yetiştirme sisteminin belirlenmiş soketine geri yerleştirin.
DİKKAT: Dokuyu aşırı germeyin ve yay telini aşırı bükmeyin! - Tabağın rocker'a yerleştirilmesinden sonra ön yük gerilimini ayarlayın.
- Ayar vidasını saat yönünün tersine çevirerek ön yükü azaltın. Bilgisayar ekranındaki ilgili grafiğin taban çizgisi artık değişmeyene kadar bunu yapın.
- Ayar vidasını saat yönünde çevirerek ön yükü dikkatlice artırın (yani gerilimi artırın). En yüksek sertliğe sahip odalar için, grafikteki karşılık gelen taban çizgisi, 1 mN ön yüke karşılık gelen 1000-1200 birim artana kadar devam edin.
NOT: Kesin ayarlama, üreticinin talimatlarına göre bir deneyden önce kalibrasyonla belirlenebilen bir yetiştirme odasının bireysel yay sabitine bağlı olacaktır. Kayıt yazılımı, kuvvetlerin μN cinsinden eşit olarak görüntülenmesi için bireysel oda kalibrasyonunun dikkate alınmasına izin verir. Yetiştiriciliğin başlangıcından itibaren elektriksel stimülasyon uygulanması tavsiye edilir. Bu nedenle, ön yük ayarı sırasında dilimin büzülmeye başlaması mümkündür. Bu durumda, ön yükü değerlendirmek için diyastolik taban çizgisine odaklanın.
9. Ortamın değiştirilmesi
- Tablo 3'teki tarife göre yetiştirme ortamı hazırlayın. Ortamın kullanımından kısa bir süre önce, 50 mL'lik bir tüpe 50 μL β-merkaptoetanol (50 mM) ekleyin. 4 °C'de saklayın.
- Her 2 günde bir, ekim ortamını kısmen değiştirin. Miyokard dilimlerinin uzun süreli ekimi isteniyorsa, ortamı her 2 günde bir yenileyin.
- Taze ortamı bir su banyosunda veya sıcak hava inkübatöründe 37 ° C'de 30-45 dakika önceden ısıtın. Bir yetiştirme odasını inkübatörden çıkarın ve laminer bir akış başlığının altına yerleştirin.
DİKKAT: Düşük sıcaklığa bağlı hiper kontraktürleri önlemek için odayı ve ortamı 37 ° C'de (> 35 ° C) sıcak tutmak önemlidir. Orta değişimden sonraki birkaç saat içinde diyastolik gerilimin artması olarak daha az belirgin hasar mevcut olabilir. Bu iyileşmiş gibi görünebilir, ancak tekrarlanan stres biriken bozulmaya neden olabilir. - Ortamı ekim odasından çıkarın, odada yaklaşık 0,8 mL bırakın. Aynı odaya 1,6 mL taze ortam ekleyin. Toplam ortam hacmi, oda başına yaklaşık 2,4 mL olmalıdır.
- Odanın kapağını geri yerleştirin ve yetiştirme odasını tekrar kendi konumuna getirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Miyokard dilimlerinin daralması, yetiştirme odasının karşılık gelen konektörüne yerleştirilmesinden sonra bilgisayar ekranında görüntülendi (Şekil 3). İnsan miyokard dilimlerinin kasılması, stimülasyondan hemen sonra başladı. Dilimler 5-10 dakika boyunca hiperkontrakte edildi. Bu, hasarlı doku fraksiyonlarının tonik kontraktürünün neden olduğu diyastolik kuvvetlerin artması olarak görülebiliyordu. Bu işlem 1-1.5 saat içinde değişen derecelere geri döndürüldü. Stabilize edildikten sonra, insan LV doku dilimleri, stimülasyon üzerine 1 mN ile 3 mN arasında değişen seğirme kuvvetleri gösterdi. Sistol, büzülme kuvvetinde güçlü bir artış olarak gösterilir, bunu kasılma kuvvetinde eşit derecede dik bir azalma ile diyastol izler.
Miyokard dilimlerinin kasılması, yetiştirme yazılımı tarafından kaydedildi ve belirlenmiş bir dosyaya kaydedildi. Oluşturulan ham veri dosyalarının her biri, verilerin kolay analizi ve nicelleştirilmesi için okunabilir bir Akson ikili dosya biçimine (.abf) dönüştürüldü. İlk çözümleme için, .abf dosyası uygun bir programda açılmıştır. Bu dönemde ortalama kasılma genliğini belirlemek için yaklaşık 5 dakikalık kasılma verisi seçildi. Bu, kaydedilen veri dosyasındaki birden çok zaman noktası için yapıldı. Bu büzülme değerlerini zaman içinde çizmek, kontrol ve deneysel bir ortamda büzülme gelişimini karşılaştırmak için yararlı bir grafik verdi. Oluşturulan dilimlerin performansı hakkında daha gelişmiş bir içgörü elde etmek için, stimülasyon protokolleri çalıştırıldı. Yaklaşık 45 dakika süren bu protokoller sırasında, stimülasyon parametreleri, kasılma kuplajının parametrelerini değerlendirmek için değiştirildi.
Mevcut stimülasyon protokolü dört ayrı bölümden oluşuyordu: duraklama sonrası potansiyel, stimülasyon eşiği, kuvvet-frekans ilişkisi ve refrakter dönem (Şekil 4, Tablo 4). Duraklama sonrası güçlendirme sırasında, 3, 12, 50 veya 120 sn'lik kısa bir duraklamadan sonra stimülasyona devam edilir. Stimülasyon eşiğini belirlemek için, stimülasyon akımı her 10 s'de 3 mA'lık adımlarla arttırılır, 8 mA'dan başlayıp 90 mA'ya çıkarılır. Bu test ile her dilim için minimum stimülasyon akımı belirlenebilir. Bu, stimülasyon protokolünün dışındaki genel stimülasyon ayarlarını değiştirmez. Kuvvet-frekans ilişkisi, stimülasyon frekansının kademeli olarak artmasıyla (20, 30, 45, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 210 ve 240 BPM) değerlendirilirken, her adımın ilgili süresi paralel olarak kısaltılır. İlk iki frekans ayarı dışında, bu rejim her adımda 20-40 kasılma verir. Her dilimin refrakter periyodu, normal bir uyarandan (S1; 30 BPM) sonra erken bir uyaran (S2) gönderilerek değerlendirilir. S1-S2 aralığı her 10 saniyede bir kısaltılır.
Farmakolojik müdahaleleri test etmek için bir araç olarak sunulan yetiştirme sisteminin potansiyelini göstermek için, aynı hastadan ex vivo insan LV doku dilimleri hazırlandı ve 2 haftalık ekimden sonra hücre içi kalsiyum iyonu (Ca2+) seviyelerini (n = 1) etkileyen farmakolojik ajanlara tabi tutuldu. L-tipi Ca 2 + kanallı antagonist nifedipin, miyokard hücrelerine Ca 2 + akışını inhibe eder ve bu nedenle Ca 2 + 'nın hücre içi mevcudiyetini düşürür ve kontraktiliteyi azaltır17. Vazodilatör etkisinden dolayı, nifedipin anti-hipertansif bir ilaç olarak kullanılır. Ca2+-kanal antagonistlerinin farmakolojik farklılıklarını göstermek için, karşılaştırma için kalsiseptin araştırıldı. Kalsiseptin ayrıca Dendroaspis p. polylepis zehiri18'den ekstrakte edilen L-tipi Ca2 + kanallı bir antagonisttir. Bu nedenle, nifedipinin negatif inotropik etkisini paylaşır. Bununla birlikte, kalsiseptin farklı bağlanma özelliklerine sahiptir ve nifedipin19'a kıyasla daha güçlüdür. Ca 2+ mevcudiyetinin pozitif ve negatif modülasyonlarını incelemek için, kalsiyum kanal agonisti Bay-K8644'ü (1,4-Dihidro-2,6-dimetil-5-nitro-4-(2-[triflorometil]fenil)piridin-3-karboksilik asit metil ester)20'yi de test ettik.
Üç dilim sırasıyla nifedipin (125 nM), kalsiseptin (70.8 nM) ve Bay-K8644 (417 nM) ile tedavi edilirken, dördüncü dilim ilaç (kontrol) almadı. Tedavi öncesi ve sonrası genel stimülasyon parametreleri (50 mA akım, bifazik darbeler 3 ms süre, 1 ms aralık ve 30 BPM pacing hızı) altındaki kasılma kuvvetleri karşılaştırıldı. Ayrıca, tedaviden önce, duraklama sonrası potansiyel, stimülasyon eşiği, kuvvet-frekans ilişkisi ve refrakter dönem için temel değerleri değerlendirmek için bir stimülasyon protokolü çalıştırılmıştır. 30 dakikalık tedaviden sonra, ikinci bir stimülasyon protokolü çalıştırıldı. Bireyler arası farklılıkları ortadan kaldırmak için, her dilimin kasılma genliği tedaviden önce temel seviyesine normalleştirildi. Temel çizgi (yani% 100), tedavi öncesi stimülasyon protokolünün başlamasından önceki son beş kasılma döngüsünün analiz edilmesiyle belirlendi.
Genel stimülasyonda dilimlerin kasılmasını analiz ederken, Ca 2+ antagonistleri (nifedipin ve kalsiseptin) ile tedavi edilen dilimlerin kasılma kuvvetinin tedavi sonrası 10 dakika içinde azaldığı (Şekil 5) ve etkinin tedavi sonrası20 dakikaya kadar mevcut olduğu gözlenmiştir. Buna karşılık, voltaj kapılı Ca2+ kanal agonisti Bay-K8644, işlenen dilimin büzülme kuvvetini arttırdı. Kontrol dilimi kayda değer bir değişiklik göstermedi. Stimülasyon protokolleri sırasında üretilen kasılma verileri de benzer şekilde analiz edilmiştir. Burada, tedaviden önce yapılan stimülasyon protokolü (ön tedavi) tarafından üretilen veriler, aynı stimülasyon protokolünün tedavi sonrası verileriyle karşılaştırılmıştır.
Daha önce de tartışıldığı gibi, stimülasyon protokolü, duraklama sonrası potansiyelin değerlendirilmesi ile başladı. Duraklama sırasında, ek Ca2 +, duraklamadan sonra ilk stimülasyonda salınan sarkoplazmik retikulum (SR) tarafından alınır. Bu nedenle, duraklama sonrası potansiye, SR'den hücre içi Ca2 + salınımını yansıtır. Bu nedenle, bu parametre, ryanodin reseptörü tarafından SR'den salınan Ca2 + 'nın göreceli katkısını değerlendirmek için kullanılabilir. Bir stimülasyon duraklamasından sonra dilimlerin güçlenmesini değerlendirmek için, duraklamadan sonraki ilk kasılmanın gücü, ilgili duraklamadan önceki ortalama kasılmaya bölünmüştür. Kontrol dilimi kayda değer bir değişiklik göstermedi (Şekil 6A). L-tipi Ca 2+ kanallarının inhibisyonunun, en az 50 sn (Şekil 6B, D) bir duraklamadan sonra ilk kasılmanın güçlendirilmesine yol açtığı ve hücre içi Ca2+ salınımının toplam kontraktiliteye daha yüksek bir göreceli katkısını yansıttığı gözlenmiştir. Bay-K8644 ile tedavi edilen dilimde tam tersi etki görüldü, bu da hücre dışı Ca 2 + 'nın L-tipi Ca2 + kanalları aracılığıyla girişini uyardı (Şekil 6C).
Kuvvet-frekans ilişkisi, pacing oranının art arda 180 BPM'ye çıkarılmasıyla değerlendirildi. Daha iyi görselleştirme için, farklı stimülasyon frekanslarındaki büzülme kuvveti, aynı protokol içinde 30 BPM'deki (=% 100) temel kasılmaya normalleştirildi. Veri analizi, kalsiseptin ile tedavinin, tedavi öncesi ve sonrası verileri karşılaştırırken stimülasyon sıklığının artması üzerine dilimin uyaranları takip etme yeteneğini değiştirmediğini göstermiştir (Şekil 7B). Kontrol diliminde herhangi bir değişiklik gözlenmedi (Şekil 7A). Kalsiseptinin aksine, nifedipin daha yüksek tempolu oranlarda kontraktilitenin artmasını önledi ve maksimum yakalama oranını 80 BPM'ye düşürdü (Şekil 7D). Ca2+ kanal agonisti Bay-K8644 ile tedavi edilen dilim, çok düşük stimülasyon frekanslarında artmış bir büzülme kuvveti göstermiştir (Şekil 7C). Bununla birlikte, 50 BPM'den daha yüksek frekanslarda, kasılma kuvvetinin ön tedavi durumundan daha düşük olduğu görülmüştür. Stimülasyon eşiği ve refrakter dönem de tedavi öncesi ve sonrası belirlendi. Bununla birlikte, hiçbir fark gözlenmemiştir ve bu nedenle veriler gösterilmemiştir.
Şekil 1: Gerekli malzemelere ve yetiştirme sistemine genel bakış . (A) Yeşil devre kartına bağlı boş bir yetiştirme odası. Devre kartı (1) bir sensörle büzülmeyi ölçer ve verileri kontrolöre iletir. (B) Sallanan ana plaka üzerine yerleştirilmiş sekiz dolu oda. Odaları örtmek için Petri çanak kapakları (35 mm) kullanılır. (C) Transmural miyokard örneğini kesmek için gereken (cerrahi) aletler. Tasvir edilenler çeşitli cımbızlar, vibratom için gerekli bıçaklar ve kırpmaya yardımcı olacak bir lastik yamadır. (D) Katı bir plastik blok ile kare konumda (0,9 cm x 0,9 cm) sabitlenmiş dört adet 0,9 mm x 70 mm 20 G iğne. Bu yapının kullanılması, kırpma sırasında numunenin zarar görmesini ve hareketini önler ve gerekli boyutlarda bir doku bloğu verir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İki AG örneğinin işlenmesi. (A) 35 mm'lik bir Petri kabında katılaşmış düşük eriyikli agaroz içine gömülü iki miyokard doku bloğu (yaklaşık 1 cm x 1 cm x 1 cm). Gösterim amacıyla domuz LV dokusu kullanıldı. (B) Gömülü numunelerle agaroz bloğu Petri kabından çıkarıldı, kesildi ve vibratomun kesme platformuna yapıştırıldı. Burada gösterim amacıyla domuz LV dokusu kullanılmıştır. Tek tip doku rengine ve kırmızı okla gösterilen beyaz fibrotik dokunun yokluğuna dikkat edin. (C) Dilimlemeden sonra, agaroz dikkatlice çıkarılır ve plastik üçgenler (1) miyokard liflerinin yönüne dik olarak bağlanır. Kırmızı çizgiler miyokard liflerinin yönünü gösterir. (D) Dilimler içinde beyaz fibrotik doku gösteren insan LV dokusu hazırlandı. Bu, mutlaka yetiştiriciliğin başarı oranını düşürmez; ancak fibroz göstermeyen dilimlerin kullanılması önerilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yetiştirme yazılımı. Kullanılan kanal sayısına bağlı olarak (en fazla sekiz), kasılma kaydı belirlenen üç pencereye kadar görselleştirilecektir (ikisi şekilde görülebilir). Her yetiştirme odası bir kasılma grafiği olarak görüntülenir. Ayarlar penceresinde, stimülasyon parametreleri değiştirilebilir ve istenen deneysel duruma göre uyarlanabilir. Bu pencere ayrıca seçilen stimülasyon protokolünü / zamanlamasını başlatmaya veya durdurmaya izin verir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tipik bir stimülasyon protokolü sırasında beş miyokard diliminin kasılmasının okunması. Tüm panellerde, her bir dilim aynı renkte gösterilir. (A) Duraklama sonrası potansiyel, sırasıyla 3, 12, 50 ve 120 saniyelik kısa bir stimülasyon duraklamasından sonraki ilk kasılmayı değerlendirir. (B) Her 10 s'de bir 3 mA'lık adımlarla stimülasyon akımının 8 mA'dan 80 mA'ya yükseltilmesiyle stimülasyon eşiğinin belirlenmesi. (C) Her dilimin kuvvet-frekans ilişkisi, stimülasyon frekansının 12 BPM'den 240 BPM'ye kademeli olarak arttırılmasıyla değerlendirilir. Stimülasyon sürelerinin süresi, her frekansta atım sayısını sabit tutmak için daha yüksek frekanslarda kısalır. (D) Refrakter periyodu değerlendirmek için, dilimler önceki uyarana (S1) göre azalan aralıklarla erken stimülasyonlara (S2) maruz bırakılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: L-tipi Ca2+ kanalını etkileyen ajanlarla tedavi öncesi ve sonrası kasılma kuvvetinin analizi. Tüm veriler (n = 1) temel kontraktiliteye normalleştirildi (tedaviden önce beş ayrı atımın ortalaması (0)). Kasılan insan LV miyokard dilimlerine L-tipi Ca 2+ kanal antagonistleri nifedipin (125 nM), kalsiseptin (70.8 nM) ve L-tipi Ca 2+ kanal agonisti Bay-K8644 (417 nM) eklendi. Kontrol dilimi tedavi edilmedi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İşlem gören ve kontrol dilimlerinin duraklama sonrası güçlendirilmesi. Duraklama sonrası potansiyede farklılıklar gözlendi (başlangıç çizgisi ve tedavi sonrası; n = 1). Burada, bir duraklamadan sonraki ilk kasılmanın genliği, ilgili duraklamadan önceki ortalama büzülme genliğine normalleştirildi. Taban çizgisi% 100 olarak ayarlandı ve ilk duraklama başlamadan önceki son beş döngünün ortalama büzülme gücüne benziyor. Y ekseni, çeşitli sürelerde bir duraklamadan sonra normalleştirilmiş ilk daralmayı görüntüler. X ekseni, taban çizgisi ve duraklatma uzunluklarını gösterir. (A) Tedavi edilmeden kontrol dilimi. (B) Kalsiseptin tedavisi. (C) Bay-K8644 tedavisi. (D) Nifedipin tedavisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Kuvvet frekansı ilişkisinin analizi. Kasılma verileri (n = 1), ilgili protokol içinde 30 BPM'de (=% 100) büzülme kuvvetine normalleştirildi. (A) Kontrol dilimi herhangi bir madde ile muamele edilmemiştir; ancak, uygulamanın diğer tüm yönleri, işlenen dilimlerinkilerle aynıydı. (B) Bir LV miyokard diliminin kalsiseptin tedavisi. (C) Bay-K8644 tedavisi. (D) Nifedipin tedavisi. 80 BPM'nin üzerindeki stimülasyon frekansları sırasında bu dilimin büzülme kuvveti hakkındaki veriler, kasılma stimülasyon frekansını takip etmediği için ihmal edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Taşıma için ve dilimleme işlemi sırasında kullanılan dilimleme tamponunun bileşimi. Agarozun hazırlanması için glikoz ihmal edilir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: %4 agaroz jelinin bileşimi. Bu glikozsuz düşük erimeli agaroz jeli, doku örneklerinin gömülmesi için kullanılır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 3: Yetiştirme ortamının hazırlanması. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 4: Stimülasyon protokolünün detayları. Stimülasyon protokolü, hepsi projenin ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilen dört bölümden oluşur. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geçmişte, kardiyovasküler araştırmalar kardiyomiyositlerin yetiştirilmesinde büyük ilerlemeler kaydetmiştir. Bununla birlikte, bozulmamış geometriye sahip kardiyomiyositlerin 3D ekimi henüz iyi kurulmamıştır. Miyokard dokusunun ex vivo yetiştirilmesi için uygulanan önceki protokollerle karşılaştırıldığında, burada anlattığımız protokol, dokunun in vivo ortamını daha yakından andırmaktadır. Ayrıca, yükleme öncesi ve sonrası uygulama daha biyomimetik bir ortam sağlar. Kasılma verilerinin ve dokunun kasılma parametrelerinin sürekli kaydını tam olarak analiz edebiliyor ve anlayabiliyoruz.
Benzer kurulumları kullanan ex vivo kardiyovasküler doku yetiştirme tekniklerinin sayısı 11,21,22 ile sınırlıdır. Yayınlanmış olan miyokard dilimi yetiştiriciliği için benzer bir teknik, miyokard dilimleri10'un yetiştirilmesi için 6 delikli bir plaka kullanır. Bununla birlikte, bu özel kurulumun önemli bir sınırlaması, dilimlerin ön ve son yüke maruz kalmaması ve dokuyu işlemeye gerek kalmadan zaman içinde kasılmanın ayrıntılı bir görünümünü verememesidir. Burada anlattığımız yöntem doku hasarı veya enfeksiyon riskini azaltır. Ayrıca, ekime ilgi çekici bir madde eklendiğinde kontraktil kuvvetteki olası değişikliklerin kapsamlı bir görünümünü verir. Her dilimin normal büzülme kuvvetinin analizine ek olarak, akım kurulumu önceden tanımlanmış protokollerin düzenli olarak çalıştırılmasına izin verir. Bu, ekili dokunun farklı ilgili parametrelerinin veri toplanmasına izin verir.
Protokol içindeki kritik adımlar
Doku hasarından kaçınılmalıdır ve bu, eksplant ameliyatı sırasında zaten ortaya çıkabilir. Doku eksizyondan hemen sonra soğuk hava deposu çözeltisine aktarılmazsa, bu durum hasarlı doku örneklerine neden olabilir. Açıklanan protokol, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahip birkaç adım içerir. Agaroz doku gömme bileşiği, protokolün başlamasından önce eritme işlemi sırasında glikozun olası karamelizasyonunu önlemek için glikozsuz dilimleme tamponu kullanılarak hazırlanmalıdır. Agarozu 37 ° C'de bir şırıngada inkübe etmek yerine, doğrudan 80 ° C su banyosundan agaroz kullanmanın neden olduğu hipertermi nedeniyle hasarı önlemek önemlidir. Metabolizmayı azaltmak ve iskemiyi en aza indirmek için depolama ve kesim sırasında sıcaklık 4 °C olmalıdır. Ayrıca, plastik üçgenleri tutturmak için kesme tepsisi ile Petri kabı arasında hareket ettirilirken, dokunun kendisinden ziyade agarozu yakalayarak doku dikkatle ele alınmalıdır. Bu üçgenlerin miyokard liflerinin yönüne göre uygun yönde tutturulması son derece önemlidir. Üçgenlerin yanlış hizalanması doku hasarına neden olur.
Genel olarak, yeni kesilen dilimlerin stimülasyon eşiği 10-20 mA arasındadır ve akım dikkatlice arttırılmalıdır. Dokunun çok yüksek bir akımla aşırı uyarılması, geri dönüşü olmayan numune hasarına da yol açabilir. Stimülasyon başladıktan sonra, yetiştirme odalarını sallayarak doku ajitasyonu gereklidir ve dokuya yeterli oksijen ve besin maddesi bulunmasını sağlamak için asla 5 dakikadan daha uzun süre durdurulmamalıdır.
Sorun giderme ve değişiklikler
Hiper kontraktür
Miyokard doku örneğinin hiper kontraktürü, tartışılan protokol için ana dışlama kriterlerinden biridir. Bu, miyokard dilimlerinin hazırlanmasından önce ve sonra ortaya çıkabilir. Hazırlıktan önce, palpasyon üzerine dokunun sert hissettiği durumlarda, preparatların en az% 70'inde hiperkontraksiyon gözlenmiştir. Doku örneğinin hiper kontraktürü, rocker üzerine yerleştirildikten sonra da ortaya çıkabilir, bu da muhtemelen dokunun kalitesine veya hastanın hastalık durumuna bağlıdır. Hiper kontraktür, kardiyak iskemide hasarlı kardiyomiyositlerin tonik kısalmasına karşılık gelen dokunun uyarılması sırasında diyastolik tonusun artması olarak görülebilir. Stimülasyon sırasında hiper kontraktür ilerleyici olabilir, böylece kasılma 12 mN'lik tespit sınırını aşar. Bununla birlikte, hiper kontraktür de 30-60 dakika içinde kendiliğinden tersine dönebilir, bu da dokunun iyileşebileceğini düşündürür. Dokunun iyileşmesini iyileştirmek için, ön yükleme ayarları 1 saatlik inkübasyondan sonra ve hazırlıktan sonraki 2, 4 ve 6. günlerde yeniden ayarlanmalıdır (yani, adım 8.3'ü tekrarlayın). Hiper kontraktür, numunelerin uyarılmış kontraksiyonu ile birlikte ve olmadan mevcut olabilir. Ancak, 1 saat içinde herhangi bir kasılma gözlenmezse, numune kullanılmamalıdır. Bu durumda, doku iyileşemeyeceği veya başka türlü hasar görebileceği bir dereceye kadar hiperkontrakte olmuştur. Genel olarak, sunulan protokole göre insan miyokard dilimlerinin yetiştirilmesi, %90'lık bir başarı oranına sahip olduğunu göstermiştir.
Beklenen büzülme kuvveti değişiklikleri
Çok sayıda faktöre (örneğin, hasta, hazırlık, doku hasarı) bağlı olarak, başlangıçta kabul edilebilir kasılma gösteren miyosdilimlerin, ilk 24 saat boyunca kontraktil genliklerde ilerleyici bir düşüşe uğraması mümkündür. Aslında, bu davranış, insanın son aşamadaki başarısız kalplerinden elde edilen dilimler için normal bile kabul edilebilir. Dilimlerin ön yükünün takip eden 3 gün boyunca her gün yeniden ayarlanmasının bu sorunu hafiflettiği ve kasılmayı iyileştirdiği bulunmuştur. Bununla birlikte, 24 ila 48 saat sonra, kontraktilitenin tekrar artmaya başlaması gerekir. Kasılmanın, uygulamanın ilk günlerinde başlangıçta gözlemlenen seviyesine geri dönmeyeceğini unutmayın.
Orta değişimden kısa bir süre sonra, numuneler inkübatöre geri döndüğünde, kasılma tipik olarak belirgin şekilde artmış genlikler gösterir. İnkübatörün açılması ve kapanması, CO2 seviyesinin düşmesine neden olduğu için bu artışa katkıda bulunur. Bu, bikarbonat tamponlu yetiştirme ortamının içindeki pH'ı arttırır ve bu da dilimlerin pozitif inotropik tepkisine neden olur. Orta değişimi takiben, dilimlerin büzülme kuvveti genellikle başlangıç değerine ulaşana veya aşana kadar birkaç saat boyunca azalır. Stimülasyon protokollerinin orta değişimden etkilenmesini önlemek için, stimülasyon protokolleri orta değişimden en az 1 saat sonrasına kadar yürütülmemelidir.
Yöntemin sınırlamaları
Mevcut tekniğin insan miyokard dokusu için daha önceki yetiştirme yöntemlerine kıyasla bir avantajı, kasılma dokusuna ön ve son yük uygulama (ve modüle etme) olasılığıdır. Bununla birlikte, uygulanan yükü duvar gerilimi açısından ölçmek zordur, ancak bu yük yay sabitinden ve dilim boyutlarından tahmin edilebilir. Miyokard dokusunun yaşayabilirliği ile doku örneğinin kasılma genliği arasında pozitif bir ilişki olduğu varsayılmaktadır. Ancak şu anda, her bir dilimi odalara monte etmeden önce uygulanabilirlik testine izin veren bir yöntem yoktur. Miyokard hücrelerinin yaşayabilirliğini belirlemek için ekim için kullanılmayan kesilmiş dilimler üzerinde kolorimetrik MTT boyama yapılabilir. Canlı hücrelerde, NADPH mor formazan kristallerindeki sarı MTT tuzunu azaltacaktır. Diğer bir sınırlama, şu anda, yetiştirme ortamındaki besin maddelerinin temel bileşenlerle sınırlı olmasıdır. Bu nedenle, besinler ve dolaşım faktörleri, dokunun elde edildiği in vivo ortamdan farklıdır. Bununla birlikte, ortam gerektiğinde desteklenebilir veya değiştirilebilir.
Yöntemin potansiyel uygulamaları
Yöntemin hem kardiyotoksisite hem de ilaç testi açısından ve ayrıca kalp hastalığının patofizyolojisini anlamada çeşitli potansiyel uygulamaları vardır. İlk olarak, tartışılan protokolde kullanılan sistem ilaç ve kardiyotoksisite taramaları için kullanılabilir. Programlanabilir stimülasyon protokollerinin yardımıyla, ilaç uygulamasına yanıt olarak fizyolojik değişiklikler analiz edilebilir. Refrakter dönemin yorumlanması ile ilgili olarak, bunun, ilaçların aksiyon potansiyeli süresi üzerindeki etkisini kesinlikle yansıtmayan fonksiyonel bir parametre olduğu düşünülmelidir. İkincisi, yetiştirme odaları, bağışıklık hücreleri ile kombinasyon halinde miyokardın çeşitli birlikte yetiştirme deneyleri için kullanılabilir. Bu ko-ekimi kullanarak, bağışıklık hücresi salgılanan faktörlerin miyokard kontraksiyonu üzerindeki doğrudan etkileri değerlendirilebilir. Son olarak, nakil dışı kardiyomiyopati örnekleri de yetiştirilebilir, ancak bu nakil dışı doku örnekleri genellikle daha küçüktür ve bu nedenle işlenmesi daha zordur. Bununla birlikte, bu, yeni terapötik hedeflerin tanımlanması ve hedeflenen ilaçların geliştirilmesi için olanaklar yaratabilir. Tekniğin hastaya özgü doku karakterizasyonu için kullanılması da düşünülebilir ve bu da bizi kişiselleştirilmiş tıbba bir adım daha yaklaştırır. Ayrıca, sunulan yöntem, örnekleri domuz ve tavşan olan insan dışı miyokard dokusu için kullanılabilir. Küçük memelilerin (fare / sıçan) yüksek fizyolojik kalp atış hızının elde edilemeyeceği göz önünde bulundurulmalıdır, çünkü daha sonra gelen daha yüksekO2 gereksinimi, tartışılan kurulum kullanılarak miyokard yetiştiriciliği koşulları altında karşılanamaz. Bu nedenle, bu durumlarda fizyolojik bir ortamın taklit edilmesi zordur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JH, PS, DM ve KL'nin açıklayacak hiçbir şeyi yoktur. AD ve TS, Myodish yetiştirme sistemini sağlayan InVitroSys GmbH'nin hissedarlarıdır.
Acknowledgments
Araştırma DZHK hibeleri 81Z0600207 (JH, PS ve DM) ve 81X2600253 (AD ve TS) tarafından finanse edildi.
Yazarlar, Claudia Fahney, Mei-Ping Wu ve Matthias Semisch'e, kurulumların hazırlanmasındaki destekleri ve doku ekiminin düzenli olarak sürdürülmesi için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
