Summary
हम मानव वेंट्रिकुलर मायोकार्डियल ऊतक के पूर्व विवो खेती के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह संकुचन बल और कैनेटीक्स के विस्तृत विश्लेषण के साथ-साथ विवो शारीरिक वातावरण में अधिक बारीकी से नकल करने के लिए प्री- और आफ्टरलोड के आवेदन की अनुमति देता है।
Abstract
कार्डियोमायोसाइट की खेती ने द्वि-आयामी (2 डी) सेल खेती से लेकर आईपीएससी व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड तक बड़ी संख्या में विकास देखा है। 2019 में, मायोकार्डियल संकुचन की विवो स्थिति में आने के दौरान, मानव हृदय के नमूनों से प्राप्त मायोकार्डियल स्लाइस की खेती करने के लिए एक पूर्व विवो तरीका प्रदर्शित किया गया था। ये नमूने ज्यादातर हृदय प्रत्यारोपण या बाएं वेंट्रिकुलर सहायता डिवाइस प्लेसमेंट से उत्पन्न होते हैं। एक वाइब्रेटोम और एक विशेष रूप से विकसित खेती प्रणाली का उपयोग करके, 300 μm मोटी स्लाइस को एक निश्चित और एक वसंत तार के बीच रखा जाता है, जिससे कई हफ्तों तक स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य खेती की अनुमति मिलती है। खेती के दौरान, स्लाइस को व्यक्तिगत सेटिंग्स के अनुसार लगातार उत्तेजित किया जाता है। संकुचन को वास्तविक समय में प्रदर्शित और दर्ज किया जा सकता है, और औषधीय एजेंटों को आसानी से लागू किया जा सकता है। उपयोगकर्ता-परिभाषित उत्तेजना प्रोटोकॉल को पोस्ट-पॉज़-पोटेंशिएशन, उत्तेजना थ्रेसहोल्ड, बल-आवृत्ति संबंध और दुर्दम्य अवधि जैसे महत्वपूर्ण संकुचन मापदंडों का आकलन करने के लिए निर्धारित और प्रदर्शन किया जा सकता है। इसके अलावा, सिस्टम अधिक शारीरिक खेती के लिए एक चर प्री- और आफ्टरलोड सेटिंग को सक्षम बनाता है।
यहां, हम एक वाणिज्यिक बायोमिमेटिक खेती समाधान का उपयोग करके मानव बाएं वेंट्रिकुलर मायोकार्डियल स्लाइस की सफल दीर्घकालिक खेती उत्पन्न करने के तरीके पर एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रस्तुत करते हैं।
Introduction
पिछले एक दशक में, मायोकार्डियल कोशिकाओं की इन विट्रो खेती ने 2 डी और त्रि-आयामी (3 डी) तकनीकों से लेकर ऑर्गेनोइड और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के उपयोग तक कार्डियक मायोसाइट्स 1,2,3 में विभेदित महान प्रगति की है। पूर्व विवो और प्राथमिक सेल खेती ने विशेष रूप से आनुवंशिक अध्ययन और दवा विकास 4,5,6 के लिए बहुत मूल्य दिखाया है। मानव ऊतकों का उपयोग परिणामों के अनुवाद मूल्य में सुधार करता है। बरकरार ज्यामिति के साथ मायोकार्डियल ऊतकों की दीर्घकालिक 3 डी खेती, हालांकि, अच्छी तरह से स्थापित नहीं है। बरकरार ज्यामिति विवो स्थितियों में नकल करने के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता है, क्योंकि उचित हृदय समारोह, विभिन्न कोशिकाओं के बीच संचार, साथ ही सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन आवश्यक शर्तें हैं। मायोकार्डियल ऊतक की खेती विकास के विभिन्न चरणों से गुजरी। पूर्व विवो मायोकार्डियल ऊतक खेती की सफलता दर और स्थिरता शुरू में काफी कम थी, लेकिन हाल के दृष्टिकोणों नेआशाजनक परिणाम 7,8,9,10,11 प्राप्त किए हैं।
उनमें से, फिशर एट अल यह प्रदर्शित करने वाले पहले व्यक्ति थे कि मानव मायोकार्डियल ऊतक की व्यवहार्यता और सिकुड़ा हुआ प्रदर्शन कई हफ्तों तक पूर्व विवो सेल खेती में बनाए रखा जा सकता है7. उनकी तकनीक प्रत्यारोपित मानव मायोकार्डियम से काटे गए पतले ऊतक स्लाइस पर आधारित थी, जो नए विकसित खेती कक्षों में घुड़सवार थे जो परिभाषित बायोमैकेनिकल स्थितियों और निरंतर विद्युत उत्तेजना प्रदान करते थे। यह खेती विधि मायोकार्डियल ऊतक के इन विवो फ़ंक्शन से मिलती-जुलती है, और कई स्वतंत्र अनुसंधान समूहों 2,12,13,14,15 द्वारा पुन: पेश की गई है। महत्वपूर्ण बात यह है कि फिशर एट अल द्वारा उपयोग किए जाने वाले कक्षों ने 4 महीने तक विकसित बलों के निरंतर पंजीकरण को सक्षम किया, और इस प्रकार बरकरार मानव मायोकार्डियम7 पर शारीरिक और औषधीय अनुसंधान के लिए अभूतपूर्व अवसर खोले।
इसी तरह की तकनीकों को स्वतंत्र रूप से अन्य समूहों द्वारा विकसित किया गया था और मानव, चूहे, पोर्सिन और खरगोश मायोकार्डियम 7,10,11 पर लागू किया गया था। बाद में एक अधिक शारीरिक विधि विकसित की, जो संकुचन चक्र के दौरान सामान्य बल-लंबाई संबंध को पुन: उत्पन्न करती है, लेकिन उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण16 के लिए कम उपयुक्त है। इस प्रकार, बायोमिमेटिक खेती के सामान्य दृष्टिकोण को पशु प्रयोगों की कमी, शोधन और प्रतिस्थापन (3 आर) में एक और कदम माना जा सकता है।
हालांकि, इस क्षमता के दोहन के लिए मानकीकृत प्रक्रियाओं, उच्च सामग्री विश्लेषण और उच्च थ्रूपुट स्तर की आवश्यकता होती है। हम एक ऐसी तकनीक प्रस्तुत करते हैं जो बायोमिमेटिक खेती प्रणाली में इन विट्रो रखरखाव के साथ जीवित मानव मायोकार्डियम के स्वचालित टुकड़ा करने की क्रिया को जोड़ती है जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गई है ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रस्तावित दृष्टिकोण के साथ, एक एकल ट्रांसम्यूरल मायोकार्डियल नमूने से उत्पन्न होने वाले व्यक्तिगत स्लाइस की संख्या केवल प्रसंस्करण समय तक सीमित होती है। पर्याप्त आकार और गुणवत्ता (3 सेमी x 3 सेमी) का एक नमूना अक्सर 20-40 ऊतक स्लाइस पैदा करता है जिसे आसानी से एक स्वचालित वाइब्रेटोम के साथ काटा जाता है। इन स्लाइसों को सिस्टम से संबंधित खेती कक्षों में रखा जा सकता है। कक्ष विद्युत उत्तेजना के लिए अनुमति देते हैं, जिनमें से मापदंडों को संशोधित किया जा सकता है (यानी, नाड़ी अवधि, ध्रुवीयता, दर और वर्तमान), साथ ही कक्षों के अंदर वसंत तारों का उपयोग करके पूर्व और बाद के समायोजन। प्रत्येक टुकड़े का संकुचन एक वसंत तार से जुड़े एक छोटे चुंबक के आंदोलन से पंजीकृत होता है और एक व्याख्यात्मक ग्राफ के रूप में प्रदर्शित होता है। डेटा को हर समय रिकॉर्ड किया जा सकता है और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है। निरंतर आधारभूत पेसिंग के अलावा, अनुसूचित प्रोटोकॉल को कार्यात्मक रूप से उनकी दुर्दम्य अवधि, उत्तेजना थ्रेसहोल्ड, पोस्ट-पॉज़-पोटेंशिएशन और बल-आवृत्ति संबंध का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
एक व्यक्तिगत हृदय से कई मायोकार्डियल स्लाइस की यह दीर्घकालिक बायोमिमेटिक खेती मानव और पशु ऊतक दोनों में भविष्य के पूर्व विवो अनुसंधान का मार्ग प्रशस्त करती है, और कार्डियोवैस्कुलर दवा में चिकित्सीय और कार्डियोटॉक्सिक दवा प्रभावों के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करती है। यह पहले से ही विभिन्न प्रयोगात्मक दृष्टिकोण 2,12,13,15 पर लागू किया गया है। यहां, हम मानव ऊतक की तैयारी का एक विस्तृत चरण-दर-चरण विवरण देते हैं और अक्सर सामना की जाने वाली खेती की समस्याओं के समाधान प्रदान करते हैं।
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Protocol
यहां वर्णित प्रयोगों के लिए ऊतक संग्रह म्यूनिख विश्वविद्यालय और रूहर-विश्वविद्यालय बोखुम के संस्थागत समीक्षा बोर्डों द्वारा अनुमोदित किया गया था। हेलसिंकी दिशानिर्देशों की घोषणा के अनुसार अध्ययन आयोजित किए गए थे। रोगियों ने ऊतक संग्रह से पहले अपनी लिखित सूचित सहमति दी।
1. ऊतक अधिग्रहण
- हृदय प्रत्यारोपण या हृदय शल्य चिकित्सा से गुजरने वाले रोगियों से मानव ऊतक प्राप्त करें।
- ऊतक खरीदने से पहले, कार्डियोप्लेजिक समाधान के 2 एल तैयार करें (आगे टुकड़ा करने की क्रिया बफर (तालिका 1) के रूप में जाना जाता है)।
- 4 सेमी x 4 सेमी आकार के ट्रांसम्यूरल बाएं वेंट्रिकुलर (एलवी) बायोप्सी प्राप्त करने के बाद, ऊतक को तुरंत (छांटना के बाद 5 मिनट के भीतर) एक क्लूज़ेबल प्लास्टिक एकल-उपयोग बाँझ बीकर में रखें जिसमें लगभग 70 मिलीलीटर ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) टुकड़ा करने की क्रिया बफर होती है। 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल टुकड़ा करने की क्रिया बफर अप करने के लिए 36 घंटे के लिए ऊतक के ठंड भंडारण (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए अनुमति देता है। यह क्लीनिकों से ऊतक के ठंडे परिवहन की अनुमति देता है जो प्रयोगशाला के करीब नहीं हैं। हालांकि, 24 घंटे ≤ परिवहन समय इष्टतम साबित हुआ है।
2. एगरोज़ और वाइब्रेटोम तैयार करना
- सुनिश्चित करें कि पर्याप्त खेती कक्ष तैयार और निष्फल हैं (चित्रा 1 ए)।
- कक्षों और ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड को 10% आइसोप्रोपेनॉल समाधान के 1 एल में डुबोएं और रात भर आंदोलन करें। अगले दिन, कक्षों को 3 मिनट के लिए 100% आइसोप्रोपेनॉल समाधान में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड को आटोक्लेव करें।
- कक्षों और ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड को लामिना के प्रवाह हुड के तहत हवा में सूखने दें।
- घुमाव पर उपलब्ध पदों के अनुसार कक्षों में से प्रत्येक के लिए एक सर्किट बोर्ड संलग्न करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार सर्किट बोर्ड पर दो ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड रखें।
- संदूषण को रोकने के लिए कक्ष के शीर्ष पर 35 मिमी पेट्री डिश ढक्कन रखें।
- 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक इनक्यूबेटर में मायोडिश खेती प्रणाली (सामग्री की तालिका देखें) सिस्टम को कंप्यूटर (चित्रा 1 बी) से जोड़कर स्थापित करें।
- टुकड़ा करने की क्रिया बफर में 4% कम पिघल एगरोज़ तैयार करें (ग्लूकोज के बिना; तालिका 2)। एगरोज़ को 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- प्रयोग के दिन, 80 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान सेट का उपयोग करके एगरोज़ समाधान की स्टॉक मात्रा पिघलाएं। मात्रा के आधार पर, पिघलने में लगभग 30 मिनट लगते हैं।
- जब एगरोज़ तरल होता है, तो अतिरिक्त 2 मिलीलीटर हवा के साथ 10 मिलीलीटर सिरिंज में 8 मिलीलीटर तरल एगरोज़ खींचें। एक बाँझ टोपी के साथ सिरिंज बंद करें और इसे 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में उल्टा रखें, ताकि एगरोज़ को जमने से रोका जा सके, और नमूने के हाइपरथर्मिया क्षति को रोकने के लिए इसके तापमान को संतुलित किया जा सके।
- यदि मौजूद है, तो पर्याप्त शीतलन क्षमता की अनुमति देने के लिए ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया से कम से कम 30 मिनट पहले वाइब्रेटोम के जल शीतलन उपकरण को चालू करें। पानी के परिसंचरण के तापमान को 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
नोट: यहां इस्तेमाल की जाने वाली कटिंग ट्रे और कूलिंग प्लेट दोनों में एक अंतर्निहित जल परिसंचरण था। यह ठंडा करने और संदूषण जोखिम को कम करने के लिए अत्यधिक अनुशंसित है। हालांकि शीतलन तकनीक के रूप में बर्फ का उपयोग करना भी संभव है। इसके अलावा, वॉटर-कूलिंग डिवाइस को प्रोटोकॉल में इस बिंदु पर वाइब्रेटोम की कटिंग ट्रे और / या कूलिंग प्लेट से कनेक्ट करने की आवश्यकता नहीं है। - कम से कम 3 मिनट के लिए 100% आइसोप्रोपेनोल के साथ सभी सतहों को फ्लश करके वाइब्रेटोम की टुकड़ा करने की क्रिया ट्रे और नमूना प्लेट को साफ करें।
नोट: उपयोग किए गए वाइब्रेटोम सिस्टम के आधार पर, वाइब्रेटोम सेट-अप अलग हो सकता है। सेट-अप और ब्लेड अंशांकन विधियों के बारे में जानकारी के लिए प्रयोगशाला में मौजूद वाइब्रेटोम के मैनुअल का संदर्भ लें। - स्लाइसिंग बफर के साथ 90% -95% तक काटने की ट्रे भरें। वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले सेट-अप में, यह लगभग 400 एमएल से मेल खाती है। वाइब्रेटोम की कटिंग ट्रे और कूलिंग प्लेट पर वाल्व के लिए पानी-शीतलन डिवाइस के ट्यूबिंग को कनेक्ट करें।
- तैयारी के लिए आवश्यक सभी उपकरणों को 5 एस के लिए 100% आइसोप्रोपेनॉल समाधान में डुबोकर कीटाणुरहित करें। आइसोप्रोपेनोल समाधान से उपकरण निकालें और लामिना प्रवाह हुड के तहत हवा-सूखा।
3. नमूनों को ट्रिम करना और एम्बेड करना
- ठंड टुकड़ा करने की क्रिया बफर से भरा एक 100 मिमी पेट्री डिश के लिए ऊतक नमूना स्थानांतरण। डिश को कूलिंग प्लेट पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें (कूलर से जुड़ा हुआ है या बर्फ पर रखा गया है)।
- चिमटी के साथ एंडोकार्डियम को पकड़कर और लगभग 3 मिमी एंडोकार्डियल ऊतक को काटने के लिए कैंची का उपयोग करके एंडोकार्डियल ट्रैबेकुले को हटा दें। इसी तरह, मौजूद होने पर एपिकार्डियम के नीचे अत्यधिक वसा ऊतक को हटा दें।
- कट ऊतक नमूना, एंडोकार्डियल पक्ष को चार 0.9 मिमी x 70 मिमी 20 जी सुइयों का उपयोग करके 2 सेमी x 2 सेमी रबर पैच तक ठीक करें जो एक वर्ग स्थिति (0.9 सेमी x 0.9 सेमी) में तय किए जाते हैं; चित्रा 1 सी, डी)। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक सुई टिप का विकर्ण किनारा अंदर की ओर इशारा कर रहा है। यह निर्धारण को बढ़ाता है और मायोकार्डियम को नुकसान से बचाता है।
सावधानी: उपर्युक्त वर्ग का अभिविन्यास अपेक्षित प्रमुख मायोफाइबर दिशा के लिए ऑर्थोगोनल होना चाहिए। - स्केलपेल का उपयोग करके चार सुई वर्ग के बाहर सभी अतिरिक्त ऊतक को काट लें। यदि मूल नमूने का आकार अनुमति देता है, तो एक ही कच्चे नमूने से इस तैयारी के दौरान दो मायोकार्डियल ऊतकों के नमूनों का उपयोग करें।
- चिमटी का उपयोग करके, नमूने पर छोड़े गए किसी भी अतिरिक्त टुकड़ा करने की क्रिया बफर को हटाने के लिए ऊतक के एक बाँझ टुकड़े पर छंटनी किए गए नमूने को रखें। नमूने से सूखने से रोकने के लिए, नमूने को 10 एस से अधिक समय तक ऊतक पर न रखें।
- नमूना (ओं) को 35 मिमी पेट्री डिश में रखें, जैसे कि ब्लेड कार्डियोमायोसाइट संरेखण के लंबवत कटौती करता है और एपिकार्डियम नीचे की ओर सामना कर रहा है। यदि तैयारी में दो नमूने शामिल हैं, तो सुनिश्चित करें कि नमूने केंद्रित हैं और एक दूसरे को स्पर्श नहीं करते हैं।
- पानी के स्नान से एगरोज़ सिरिंज लें और नमूने (ओं) को एगरोज़ में डुबो दें। (चित्रा 2 ए)। एक शीतलन प्लेट पर 5 मिनट के लिए एगरोज़ जमने दें। नमूना (ओं) पेट्री डिश के संपर्क में रहना चाहिए, जो यह सुनिश्चित करेगा कि काटने का विमान प्रमुख मायोकार्डियल फाइबर दिशा के समानांतर होगा।
सावधानी: हवा के बुलबुले को रोकने के लिए सिरिंज को पूरी तरह से खाली न करें। नमूनों के डूबने के दौरान सिरिंज में छोड़े गए एगरोज़ की मात्रा पर ध्यान दें। नमूनों के साथ पकवान में हवा के बुलबुले के मामले में, ध्यान से सिरिंज में हवा के बुलबुले वापस खींचें।
4. काटने ट्रे पर नमूने रखना
- नमूना और पेट्री डिश के किनारे के बीच में वेजिंग करके, एक स्पैटुला या इसी तरह के उपकरण का उपयोग करके 35 मिमी पेट्री डिश से नमूना (ओं) युक्त ठोस एगरोज़ को हटा दें। नमूनों को कवर रखते हुए स्केलपेल का उपयोग करके कुछ एगरोज़ को काट लें।
सावधानी: अगारोज़ का बहुत अधिक न निकालें। जेड विमान में लंबे और छोटे किनारों पर कम से कम 5 मिमी एगरोज़ छोड़ा जाना चाहिए।
नोट: चरण 4.2-4.4 तेजी से उत्तराधिकार (यानी, अधिकतम 5 एस) में प्रदर्शन करने की आवश्यकता है। शुरू करने से पहले पहुंच के भीतर सभी आवश्यक उपकरण रखें। प्लेसमेंट के बाद नमूने का कोई रिपोजिशनिंग संभव नहीं है। गोंद के हवा और नमी के संपर्क को सीमित करने का प्रयास करें। हवा या तरल पदार्थ के साथ संपर्क गोंद को जम जाएगा, जिससे यह अनुपयोगी हो जाएगा। - एक विंदुक के साथ, जगह और गोंद के 60 μL में और काटने के मंच के केंद्र के आसपास वितरित करते हैं।
- चिमटी का उपयोग करके चिपके हुए क्षेत्र के शीर्ष पर एगरोज़ में निहित नमूने के एपिकार्डियल पक्ष को रखें। रिपोजिशन न करें। नमूने का एंडोकार्डियल पक्ष एगरोज़ में दिखाई देना चाहिए। गोंद को 1 मिनट के लिए जमने दें। धीरे-धीरे एक कुंद उपकरण (जैसे, चिमटी) के साथ ऊपर से नमूना युक्त एगरोज़ को दबाएं, जबकि एगरोज़ को काटने या नुकसान पहुंचाने से रोकें।
- टुकड़ा करने की क्रिया बफर से भरा, कंपन की काटने ट्रे में अपनी निर्दिष्ट स्थिति में नमूना मंच रखें।
5. वाइब्रेटोम शुरू करना
- 1 मिमी के लिए कंपन आयाम सेट करें और प्रारंभिक काटने की गति 0.07 मिमी / स्लाइस काटने के लिए स्लाइस की मोटाई 300 μm पर सेट करें।
- जब तक ब्लेड केवल एगरोज़ को काटता है, तब तक काटने की गति को अधिकतम तक बढ़ाएं, जो इस मामले में 1.50 मिमी / जैसे ही वाइब्रेटोम ऊतक को काटना शुरू करता है, गति को तुरंत 0.07 मिमी /
नोट: यदि ऊतक सुचारू रूप से कटा हुआ नहीं है, उदाहरण के लिए यदि नमूने में बड़े फाइब्रोटिक क्षेत्र हैं, तो यह काटने के आयाम को 1.5 मिमी तक बढ़ाने और काटने की गति को 0.04 मिमी /
6. टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान मध्यम और इनक्यूबेटर तैयारी
- प्रत्येक खेती कक्ष को पूर्ण खेती माध्यम के 2.4 मिलीलीटर के साथ भरें (तालिका 3)।
- 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 21% ओ 2, और 80% की आर्द्रता पर इनक्यूबेटर सेट में खेती प्रणाली पर माध्यम से भरे खेती कक्षों को रखें। कम से कम 20 मिनट के लिए माध्यम को संतुलित करें।
- एक कंप्यूटर के साथ खेती प्रणाली कनेक्ट करें और संबंधित सॉफ्टवेयर प्रोग्राम शुरू करें।
- घुमाव गति को 60 आरपीएम पर सेट करें और उत्तेजना मापदंडों (उत्तेजना दालों और आवृत्ति) को पूर्व निर्धारित करें। मानव कार्डियक स्लाइस के लिए, मानक उत्तेजना को 50 एमए वर्तमान के साथ द्विध्रुवी आवेगों के लिए सेट करें, प्रत्येक में 3 एमएस सकारात्मक वर्तमान, 1 एमएस विराम और उल्टे वर्तमान की 3 एमएस पल्स शामिल है, 30 बीट्स प्रति मिनट (बीपीएम) की पेसिंग दर पर।
नोट: अच्छी तरह से संरक्षित ऊतकों में, विशिष्ट उत्तेजना दहलीज लगभग 15 एमए है। विश्वसनीय उत्तेजना सुनिश्चित करने और उत्तेजना थ्रेसहोल्ड की किसी भी संभावित वृद्धि के लिए खाते में, वर्तमान को एक ऐसे मूल्य पर सेट करने की सिफारिश की जाती है जो उत्तेजना सीमा से दो से तीन गुना अधिक हो। - यह सत्यापित करने के लिए सॉफ़्टवेयर के इलेक्ट्रोड संकेतकों की जाँच करें कि खेती कक्षों के इलेक्ट्रोड सही ढंग से काम कर रहे हैं।
नोट: जब भी खेती सॉफ्टवेयर में चैनल सूचक लाल हो जाता है तो कार्रवाई की आवश्यकता होती है। इस मामले में, द्विध्रुवी नाड़ी शुल्क संतुलित नहीं हैं।
7. स्लाइस तैयार करना
नोट: प्रारंभिक सबेंडोकार्डियल स्लाइस आमतौर पर ऊतक की खेती के लिए उपयुक्त नहीं होते हैं और असमान आकृति विज्ञान के कारण त्यागने की आवश्यकता होती है। पहले पांच से 10 स्लाइस के बाद, स्लाइस बनावट और आकृति विज्ञान में सुधार होता है। आदर्श टुकड़ा कम से कम 1 सेमी x 1 सेमी है, इसमें कोई या केवल सीमित फाइब्रोटिक पैच नहीं है, खंडित नहीं है, और सजातीय फाइबर संरेखण (चित्रा 2 बी, डी) है। मायोसाइट फाइबर के बीच स्थित अंतरालीय फाइब्रोसिस, अक्सर असफल मानव मायोकार्डियम में मौजूद होता है। हैरानी की बात है, यह खेती की सफलता का नकारात्मक भविष्यवक्ता नहीं है।
- स्लाइस सूखने से बाहर नहीं होगा यह सुनिश्चित करने के लिए एक 5 सेमी पेट्री डिश ढक्कन में ठंड टुकड़ा करने की क्रिया बफर की पर्याप्त मात्रा डालो। ठंडा टुकड़ा करने की क्रिया बफर युक्त पेट्री डिश ढक्कन में स्लाइस रखें।
- चिमटी का उपयोग करके ऊतक से एगरोज़ को अलग करें। ऊतक को छूने से बचें। ऊतक को सावधानी से संभालें क्योंकि ऊतक को कोई भी नुकसान खेती की सफलता दर को कम कर देगा।
- प्रकाश स्रोत के खिलाफ निकट निरीक्षण द्वारा मायोकार्डियल फाइबर की दिशा निर्धारित करें। चरण 7.6 में ऊतक के लिए प्लास्टिक त्रिकोण संलग्न करते समय यह महत्व का है।
नोट: चरण 7.4 और 7.5 त्वरित उत्तराधिकार में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, 5 एस के भीतर। - खेती कक्षों के अंदर ऊतक लंगर करने के लिए गोंद का उपयोग करके एक नमूने में दो प्लास्टिक त्रिकोण संलग्न करें।
- एक बाँझ पेट्री डिश ढक्कन पर गोंद के 1 μL रखें। आटोक्लेव प्लास्टिक त्रिकोणों में से एक को लेने के लिए एक झुका हुआ चिमटी का उपयोग करें। त्रिकोण के सामने के किनारे को गोंद में जल्दी से डुबोएं और त्रिकोण को नमूने पर पेस्ट करें, कार्डियोमायोसाइट संरेखण के लंबवत। दूसरे त्रिभुज के लिए दोहराएं।
- एक स्केलपेल (चित्रा 2 सी) के साथ त्रिकोण चौड़ाई से अधिक ऊतक ट्रिम करें। दो घुड़सवार त्रिकोणों के साथ टुकड़ा वापस काटने की ट्रे के टुकड़ा करने की क्रिया बफर में रखें।
नोट: खेती कक्षों को भरने के लिए पर्याप्त स्लाइस तैयार होने तक चरण 7.2 से 7.5 दोहराएं। हम खराब संकुचन के साथ स्लाइस के प्रतिस्थापन की अनुमति देने के लिए कुछ अतिरिक्त स्लाइस तैयार करने की सलाह देते हैं।
8. स्लाइस बढ़ते
नोट: आफ्टरलोड खेती कक्षों में वसंत तार की कठोरता से निर्धारित होता है। वसंत तार की मोटाई के आधार पर तीन अलग-अलग प्रकार उपलब्ध हैं।
- इनक्यूबेटर से एक मध्यम भरा खेती कक्ष लें। तैयार स्लाइस में से एक का चयन करें और प्रत्येक पिन के लिए एक त्रिकोण को जोड़कर इसे कक्ष में डालें।
- नमूना आकार के अनुसार बढ़ते पिन के बीच की दूरी समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि नमूना मध्यम में डूबा हुआ है। चैंबर को इनक्यूबेटर में खेती प्रणाली के अपने निर्दिष्ट सॉकेट में वापस रखें।
सावधानी: ऊतक को ओवरस्ट्रेच न करें और वसंत तार को अधिक मोड़ें नहीं! - रॉकर पर पकवान के प्लेसमेंट के बाद प्रीलोड तनाव सेट करें।
- समायोजन पेंच वामावर्त मोड़कर प्रीलोड को कम करें। ऐसा तब तक करें जब तक कि कंप्यूटर स्क्रीन पर संबंधित ग्राफ की आधाररेखा अब नहीं बदलती है।
- सावधानीपूर्वक समायोजित पेंच को दक्षिणावर्त मोड़कर प्रीलोड बढ़ाएं (यानी, तनाव बढ़ाएं)। उच्चतम कठोरता वाले कक्षों के लिए, तब तक जारी रखें जब तक कि ग्राफ में संबंधित आधार रेखा 1000-1200 इकाइयों तक बढ़ न जाए, जो प्रीलोड के 1 एमएन से मेल खाती है।
नोट: सटीक समायोजन एक खेती कक्ष के व्यक्तिगत वसंत स्थिरांक पर निर्भर करेगा, जिसे निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक प्रयोग से पहले अंशांकन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर व्यक्तिगत कक्ष अंशांकन पर विचार करने की अनुमति देता है ताकि बलों को समान रूप से μN में प्रदर्शित किया जाएगा। खेती की शुरुआत से विद्युत उत्तेजना लागू करने की सिफारिश की जाती है। इस प्रकार, यह अच्छी तरह से संभव है कि प्रीलोड समायोजन के दौरान टुकड़ा सिकुड़ना शुरू हो जाए। इस मामले में, प्रीलोड का आकलन करने के लिए डायस्टोलिक बेसलाइन पर ध्यान केंद्रित करें।
9. माध्यम बदलना
- तालिका 3 में नुस्खा के अनुसार खेती का माध्यम तैयार करें। माध्यम के उपयोग से कुछ समय पहले, 50 एमएल ट्यूब में β-मर्कैप्टोएथेनॉल (50 एमएम) के 50 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- हर 2 दिनों में एक बार, आंशिक रूप से खेती के माध्यम का आदान-प्रदान करें। यदि मायोकार्डियल स्लाइस की दीर्घकालिक खेती वांछित है, तो हर 2 दिनों में माध्यम को ताज़ा करें।
- 30-45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान या गर्म हवा इनक्यूबेटर में ताजा माध्यम को पूर्व-गर्म करें। इनक्यूबेटर से एक खेती कक्ष निकालें और इसे एक लामिना प्रवाह हुड के नीचे रखें।
सावधानी: कम तापमान के कारण हाइपर संकुचन को रोकने के लिए कक्ष, साथ ही मध्यम, 37 डिग्री सेल्सियस (> 35 डिग्री सेल्सियस) पर गर्म रखना आवश्यक है। मध्यम विनिमय के बाद कुछ घंटों के भीतर डायस्टोलिक तनाव की वृद्धि के रूप में कम विशिष्ट क्षति मौजूद हो सकती है। यह ठीक होने के लिए प्रतीत हो सकता है, लेकिन बार-बार तनाव के परिणामस्वरूप गिरावट जमा हो सकती है। - खेती कक्ष से मध्यम निकालें, कक्ष में लगभग 0.8 एमएल छोड़ दें। एक ही कक्ष में ताजा माध्यम के 1.6 मिलीलीटर जोड़ें। माध्यम की कुल मात्रा प्रति कक्ष लगभग 2.4 मिलीलीटर होनी चाहिए।
- कक्ष के आवरण को वापस रखें और खेती कक्ष को अपनी संबंधित स्थिति में वापस रखें।
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Representative Results
मायोकार्डियल स्लाइस का संकुचन इसके संबंधित कनेक्टर (चित्रा 3) में खेती कक्ष के सम्मिलन के बाद कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रदर्शित किया गया था। मानव मायोकार्डियल स्लाइस का संकुचन उत्तेजना पर तुरंत शुरू हुआ। स्लाइस 5-10 मिनट के लिए हाइपरकॉन्ट्रैक्टेड। यह क्षतिग्रस्त ऊतक अंशों के टॉनिक संकुचन के कारण डायस्टोलिक बलों की वृद्धि के रूप में दिखाई दे रहा था। इस प्रक्रिया को 1-1.5 घंटे के भीतर अलग-अलग डिग्री पर वापस कर दिया गया था। स्थिर होने के बाद, मानव एलवी ऊतक स्लाइस ने उत्तेजना पर 1 एमएन और 3 एमएन के बीच भिन्न चिकोटी बलों को दिखाया। सिस्टोल को संकुचन बल में एक मजबूत वृद्धि के रूप में दिखाया गया है, इसके बाद संकुचन बल की समान रूप से तेज कमी के साथ डायस्टोल होता है।
मायोकार्डियल स्लाइस का संकुचन खेती सॉफ्टवेयर द्वारा दर्ज किया गया था और एक निर्दिष्ट फ़ाइल में सहेजा गया था। उत्पन्न कच्चे डेटा फ़ाइलों में से प्रत्येक को डेटा के आसान विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के लिए पठनीय एक्सॉन बाइनरी फ़ाइल प्रारूप (.abf) में परिवर्तित किया गया था। प्रारंभिक विश्लेषण के लिए, .abf फाइल एक उपयुक्त प्रोग्राम में खोली गई थी। इस अवधि के दौरान औसत संकुचन आयाम स्थापित करने के लिए लगभग 5 मिनट के संकुचन डेटा का चयन किया गया था। यह रिकॉर्ड की गई डेटा फ़ाइल में कई समय बिंदुओं के लिए किया गया था। समय के साथ इन संकुचन मूल्यों की साजिश रचने से नियंत्रण और प्रयोगात्मक सेटिंग में संकुचन विकास की तुलना करने के लिए एक उपयोगी ग्राफ प्राप्त हुआ। उत्पन्न स्लाइस के प्रदर्शन में अधिक उन्नत अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, उत्तेजना प्रोटोकॉल चलाए गए थे। इन प्रोटोकॉल के दौरान, जो लगभग 45 मिनट लगते हैं, उत्तेजना मापदंडों को संकुचन युग्मन के मापदंडों का आकलन करने के लिए बदल दिया गया था।
वर्तमान उत्तेजना प्रोटोकॉल में चार अलग-अलग खंड शामिल थे: पोस्ट-विराम-पोटेंशिएशन, उत्तेजना थ्रेसहोल्ड, बल-आवृत्ति संबंध, और दुर्दम्य अवधि (चित्रा 4, तालिका 4)। पोस्ट-पॉज़-पोटेंशिएशन के दौरान, उत्तेजना को 3, 12, 50, या 120 एस के संक्षिप्त ठहराव के बाद फिर से शुरू किया जाता है। उत्तेजना थ्रेसहोल्ड निर्धारित करने के लिए, उत्तेजना वर्तमान को हर 10 एस में 3 एमए के चरणों में बढ़ाया जाता है, जो 8 एमए से शुरू होता है और 90 एमए तक बढ़ जाता है। इस परीक्षण के साथ, प्रत्येक टुकड़े के लिए न्यूनतम उत्तेजना वर्तमान निर्धारित किया जा सकता है। यह उत्तेजना प्रोटोकॉल के बाहर सामान्य उत्तेजना सेटिंग्स को नहीं बदलता है। बल-आवृत्ति संबंध का मूल्यांकन उत्तेजना आवृत्ति (20, 30, 45, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 210 और 240 बीपीएम) की चरणबद्ध वृद्धि से किया जाता है, जबकि प्रत्येक चरण की संबंधित अवधि समानांतर में छोटी होती है। पहले दो आवृत्ति सेटिंग्स को छोड़कर, यह आहार प्रत्येक चरण के दौरान 20-40 संकुचन के बीच पैदावार देता है। प्रत्येक टुकड़े की दुर्दम्य अवधि का मूल्यांकन एक सामान्य उत्तेजना (एस 1; 30 बीपीएम) के बाद समय से पहले उत्तेजना (एस 2) भेजकर किया जाता है। एस 1-एस 2 अंतराल को हर 10 एस में छोटा किया जाता है।
औषधीय हस्तक्षेपों के परीक्षण के लिए एक उपकरण के रूप में प्रस्तुत खेती प्रणाली की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, पूर्व विवो मानव एलवी ऊतक स्लाइस एक ही रोगी से तैयार किए गए थे और औषधीय एजेंटों के अधीन थे जो खेती के 2 सप्ताह के बाद इंट्रासेल्युलर कैल्शियम आयन (सीए2 +) स्तर (एन = 1) को प्रभावित करते हैं। एल-टाइप सीए2 +-चैनल प्रतिपक्षी निफेडिपिन मायोकार्डियल कोशिकाओं में सीए2 + प्रवाह को रोकता है और इसलिए सीए2 + की इंट्रासेल्युलर उपलब्धता को कम करता है और सिकुड़न17 को कम करता है। इसकी वासोडिलेटर कार्रवाई के कारण, निफेडिपिन का उपयोग एंटी-हाइपरटेंसिव दवा के रूप में किया जाता है। सीए2 +-चैनल विरोधी के औषधीय मतभेदों को प्रदर्शित करने के लिए, तुलना के लिए कैल्सीसेप्टाइन की जांच की गई थी। कैल्सीसेप्टाइन भी एक एल-टाइप सीए2 +-चैनल विरोधी है, जो डेंड्रोस्पिस पी पॉलीलेपिस जहर18 से निकाला गया है। इसलिए, यह निफेडिपिन की नकारात्मक इनोट्रोपिक कार्रवाई को साझा करता है। हालांकि, कैल्सीसेप्टाइन में अलग-अलग बाध्यकारी विशेषताएं हैं और निफेडिपिन19 की तुलना में अधिक शक्तिशाली है। सीए2+ उपलब्धता के सकारात्मक और नकारात्मक मॉड्यूलेशन का अध्ययन करने के लिए, हमने कैल्शियम चैनल एगोनिस्ट बे-के 8644 (1,4-डायहाइड्रो-2,6-डाइमिथाइल-5-नाइट्रो-4-(2-[ट्राइफ्लोरोमेथिल] फिनाइल) पाइरिडीन-3-कार्बोक्जिलिक एसिड मिथाइल एस्टर) 20 का भी परीक्षण किया।
तीन स्लाइसों को क्रमशः निफेडिपिन (125 एनएम), कैल्सीसेप्टाइन (70.8 एनएम), और बे-के 8644 (417 एनएम) के साथ इलाज किया गया था, जबकि चौथे स्लाइस को कोई दवा (नियंत्रण) नहीं मिली थी। सामान्य उत्तेजना मापदंडों (50 एमए वर्तमान, द्विध्रुवी दालों 3 एमएस अवधि, 1 एमएस अंतराल, और 30 बीपीएम पेसिंग दर) के तहत संकुचन बलों की तुलना उपचार से पहले और बाद में की गई थी। इसके अलावा, उपचार से पहले, पोस्ट-पॉज़-पोटेंशिएशन, उत्तेजना थ्रेसहोल्ड, बल-आवृत्ति संबंध और दुर्दम्य अवधि के लिए आधारभूत मूल्यों का आकलन करने के लिए एक उत्तेजना प्रोटोकॉल चलाया गया था। उपचार के 30 मिनट के बाद, एक दूसरा उत्तेजना प्रोटोकॉल चलाया गया था। अंतर-व्यक्तिगत मतभेदों को खत्म करने के लिए, प्रत्येक टुकड़े के संकुचन आयाम को उपचार से पहले अपने आधारभूत स्तर पर सामान्यीकृत किया गया था। बेसलाइन (यानी, 100%) पूर्व-उपचार उत्तेजना प्रोटोकॉल की शुरुआत से पहले पिछले पांच संकुचन चक्रों का विश्लेषण करके निर्धारित किया गया था।
सामान्य उत्तेजना पर स्लाइस के संकुचन का विश्लेषण करते समय, यह देखा गया कि सीए2 + विरोधी (निफेडिपिन और कैल्सीसेप्टाइन) के साथ इलाज किए गए स्लाइस का संकुचन बल 10 मिनट के बाद उपचार (चित्रा 5) के भीतर कम हो गया और प्रभाव 20 मिनट के बाद उपचार तक मौजूद था। इसके विपरीत, वोल्टेज गेटेड सीए2+ चैनल एगोनिस्ट बे-के 8644 ने इलाज किए गए टुकड़े के संकुचन बल में वृद्धि की। नियंत्रण स्लाइस ने एक उल्लेखनीय परिवर्तन नहीं दिखाया। उत्तेजना प्रोटोकॉल के दौरान उत्पन्न संकुचन डेटा का विश्लेषण इसी तरह से किया गया था। यहां, उपचार (पूर्व-उपचार) से पहले किए गए उत्तेजना प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न डेटा की तुलना उसी उत्तेजना प्रोटोकॉल के उपचार के बाद के डेटा से की गई थी।
जैसा कि पहले चर्चा की गई थी, उत्तेजना प्रोटोकॉल पोस्ट-पॉज़-पोटेंशिएशन के मूल्यांकन के साथ शुरू हुआ। ठहराव के दौरान, अतिरिक्त सीए2+ सार्कोप्लाज्मिक रेटिकुलम (एसआर) द्वारा लिया जाता है, जो विराम के बाद पहली उत्तेजना पर जारी किया जाता है। इसलिए, पोस्ट-पॉज़-पोटेंशिएशन एसआर से इंट्रासेल्युलर सीए2 + रिलीज को दर्शाता है। इस प्रकार, इस पैरामीटर का उपयोग रयानोडीन रिसेप्टर द्वारा एसआर से जारी सीए2 + के सापेक्ष योगदान का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। उत्तेजना विराम के बाद स्लाइस की शक्ति का आकलन करने के लिए, ठहराव के बाद पहले संकुचन की ताकत को संबंधित विराम से पहले औसत संकुचन से विभाजित किया गया था। नियंत्रण टुकड़ा किसी भी उल्लेखनीय परिवर्तन (चित्रा 6 ए) नहीं दिखाया। यह देखा गया कि एल-टाइप सीए2 + चैनलों के निषेध ने कम से कम 50 एस (चित्रा 6 बी, डी) के ठहराव के बाद पहले संकुचन की शक्ति का नेतृत्व किया, जो कुल संकुचन के लिए इंट्रासेल्युलर सीए2 + रिलीज के उच्च सापेक्ष योगदान को दर्शाता है। बे-के 8644 के साथ इलाज किए गए टुकड़े में विपरीत प्रभाव देखा गया था, जो एल-टाइप सीए2 + चैनलों (चित्रा 6 सी) के माध्यम से बाह्य सीए2 + के प्रवेश को उत्तेजित करता है।
180 बीपीएम तक पेसिंग दर को क्रमिक रूप से बढ़ाकर बल-आवृत्ति संबंध का मूल्यांकन किया गया था। बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, विभिन्न उत्तेजना आवृत्तियों पर संकुचन बल को एक ही प्रोटोकॉल (= 100%) के भीतर 30 बीपीएम पर आधारभूत संकुचन के लिए सामान्यीकृत किया गया था। डेटा विश्लेषण से पता चला है कि कैल्सीसेप्टाइन के साथ उपचार ने पूर्व और बाद के उपचार डेटा (चित्रा 7 बी) की तुलना करते समय उत्तेजना आवृत्ति की वृद्धि पर उत्तेजनाओं का पालन करने के लिए टुकड़ा की क्षमता को नहीं बदला। नियंत्रण टुकड़ा (चित्रा 7 ए) में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया था। कैल्सीसेप्टाइन के विपरीत, निफेडिपिन ने उच्च पेसिंग दरों पर संकुचन की वृद्धि को रोका और अधिकतम कैप्चर दर को 80 बीपीएम (चित्रा 7 डी) तक कम कर दिया। सीए2 + चैनल एगोनिस्ट बे-के 8644 के साथ इलाज किए गए टुकड़े ने बहुत कम उत्तेजना आवृत्तियों (चित्रा 7 सी) पर एक बढ़ी हुई संकुचन बल दिखाया। हालांकि, 50 बीपीएम से अधिक आवृत्तियों पर, संकुचन बल पूर्व-उपचार की स्थिति की तुलना में कम दिखाई दिया। उत्तेजना सीमा और दुर्दम्य अवधि भी उपचार से पहले और बाद में निर्धारित की गई थी। हालांकि, कोई अंतर नहीं देखा गया था, और इसलिए डेटा नहीं दिखाया गया है।
चित्र 1: आवश्यक सामग्रियों और खेती प्रणाली का अवलोकन। (ए) ग्रीन सर्किट बोर्ड से जुड़ा एक खाली खेती कक्ष। सर्किट बोर्ड (1) एक सेंसर के साथ संकुचन को मापता है और नियंत्रक को डेटा प्रसारित करता है। (बी) रॉकिंग मुख्य प्लेट पर रखे गए आठ भरे हुए कक्ष। पेट्री डिश ढक्कन (35 मिमी) का उपयोग कक्षों को कवर करने के लिए किया जाता है। (सी) ट्रांसम्यूरल मायोकार्डियल नमूने को ट्रिम करने के लिए आवश्यक (सर्जिकल) उपकरण। चित्रित विभिन्न चिमटी, वाइब्रेटोम के लिए आवश्यक ब्लेड, और ट्रिमिंग में सहायता के लिए एक रबर पैच हैं। (डी) चार 0.9 मिमी x 70 मिमी 20 जी सुइयों जो प्लास्टिक के एक ठोस ब्लॉक द्वारा एक वर्ग स्थिति (0.9 सेमी x 0.9 सेमी) में तय की जाती हैं। इस निर्माण का उपयोग ट्रिमिंग करते समय नमूने के नुकसान और आंदोलन को रोकता है और आवश्यक आयामों के साथ एक ऊतक ब्लॉक पैदा करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: दो एलवी नमूनों का प्रसंस्करण( ए) दो मायोकार्डियल ऊतक ब्लॉक (लगभग 1 सेमी x 1 सेमी x 1 सेमी) 35 मिमी पेट्री डिश में ठोस कम पिघल एगरोज में एम्बेडेड। प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए, पोर्सिन एलवी ऊतक का उपयोग किया गया था। (बी) एम्बेडेड नमूनों के साथ एगरोज़ ब्लॉक पेट्री डिश से हटा दिया गया था, छंटनी की गई थी, और वाइब्रेटोम के काटने के मंच पर चिपकाया गया था। यहां, प्रदर्शन उद्देश्यों के लिए पोर्सिन एलवी ऊतक का उपयोग किया गया था। लाल तीर द्वारा इंगित समान ऊतक रंग और सफेद फाइब्रोटिक ऊतक की अनुपस्थिति पर ध्यान दें। (सी) टुकड़ा करने की क्रिया के बाद, एगरोज़ को सावधानीपूर्वक हटा दिया जाता है, और प्लास्टिक त्रिकोण (1) मायोकार्डियल फाइबर की दिशा में लंबवत जुड़े होते हैं। लाल रेखाएं मायोकार्डियल फाइबर की दिशा को इंगित करती हैं। (डी) मानव एलवी ऊतक तैयार किया गया था, जो स्लाइस के भीतर सफेद फाइब्रोटिक ऊतक दिखाता था। यह जरूरी नहीं कि खेती की सफलता दर को कम करे; हालाँकि स्लाइस का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जो फाइब्रोसिस प्रदर्शित नहीं करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: खेती सॉफ्टवेयर। उपयोग किए गए चैनलों की संख्या (अधिकतम आठ) के आधार पर, संकुचन पंजीकरण को तीन निर्दिष्ट खिड़कियों (आंकड़े में दिखाई देने वाली दो) में देखा जाएगा। प्रत्येक खेती कक्ष को एक संकुचन ग्राफ के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। सेटिंग्स विंडो में, उत्तेजना मापदंडों को बदला जा सकता है और वांछित प्रयोगात्मक स्थिति के अनुरूप बनाया जा सकता है। यह विंडो चयनित उत्तेजना प्रोटोकॉल/शेड्यूल को शुरू करने या रोकने की भी अनुमति देती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: एक विशिष्ट उत्तेजना प्रोटोकॉल के दौरान पांच मायोकार्डियल स्लाइस के संकुचन से बाहर पढ़ें। सभी पैनलों में, प्रत्येक व्यक्तिगत टुकड़ा एक ही रंग में दिखाया गया है। (ए) पोस्ट-पॉज़-पोटेंशिएशन क्रमशः 3, 12, 50 और 120 सेकंड के संक्षिप्त उत्तेजना विराम के बाद पहले संकुचन का आकलन करता है। (बी) 8 एमए से 80 एमए तक हर 10 एस में 3 एमए के चरणों में उत्तेजना वर्तमान को बढ़ाकर उत्तेजना सीमा का निर्धारण। (सी) प्रत्येक टुकड़े के बल-आवृत्ति संबंध का मूल्यांकन 12 बीपीएम से 240 बीपीएम तक उत्तेजना आवृत्ति की चरणबद्ध वृद्धि द्वारा किया जाता है। प्रत्येक आवृत्ति पर धड़कन की संख्या को स्थिर रखने के लिए उच्च आवृत्तियों पर उत्तेजना अवधि की अवधि कम हो जाती है। (डी) दुर्दम्य अवधि का आकलन करने के लिए, स्लाइस पूर्ववर्ती उत्तेजना (एस 1) के घटते अंतराल पर समय से पहले उत्तेजना (एस 2) के संपर्क में आते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: एल-प्रकार सीए2 + चैनल प्रभावित एजेंटों के साथ उपचार से पहले और बाद में संकुचन बल का विश्लेषण। सभी डेटा (एन = 1) को आधारभूत संकुचन (उपचार से पहले पांच अलग-अलग धड़कनों का मतलब (0)) के लिए सामान्यीकृत किया गया था। एल-टाइप सीए2+ चैनल विरोधी निफेडिपिन (125 एनएम), कैल्सीसेप्टाइन (70.8 एनएम), और एल-टाइप सीए2 + चैनल एगोनिस्ट बे-के 8644 (417 एनएम) को मानव एलवी मायोकार्डियल स्लाइस को अनुबंधित करने के लिए जोड़ा गया था। नियंत्रण स्लाइस को कोई उपचार नहीं मिला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: इलाज और नियंत्रण स्लाइस के पोस्ट-विराम-पोटेंशिएशन। पोस्ट-पॉज़-पोटेंशिएशन में अंतर देखा गया (बेसलाइन बनाम पोस्ट-ट्रीटमेंट; एन = 1)। यहां, एक ठहराव के बाद पहले संकुचन के आयाम को संबंधित विराम से पहले औसत संकुचन आयाम के लिए सामान्यीकृत किया गया था। बेसलाइन को 100% के रूप में सेट किया गया था और पहला ठहराव शुरू होने से पहले पिछले पांच चक्रों की औसत संकुचन शक्ति जैसा दिखता है। वाई-अक्ष विभिन्न अवधियों के विराम के बाद सामान्यीकृत पहले संकुचन को प्रदर्शित करता है। एक्स-अक्ष बेसलाइन और विराम लंबाई दिखाता है। (ए) उपचार के बिना नियंत्रण टुकड़ा। (बी) कैल्सीसेप्टाइन उपचार। (सी) बे-के 8644 उपचार। (डी) निफेडिपिन उपचार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7: बल आवृत्ति संबंध का विश्लेषण। संकुचन डेटा (एन = 1) संबंधित प्रोटोकॉल (= 100%) के भीतर 30 बीपीएम पर संकुचन बल के लिए सामान्यीकृत किया गया था। (ए) नियंत्रण टुकड़ा किसी भी पदार्थ के साथ इलाज नहीं किया गया था; हालाँकि, खेती के अन्य सभी पहलू इलाज किए गए स्लाइस के समान थे। (बी) एक एलवी मायोकार्डियल स्लाइस का कैल्सीसेप्टाइन उपचार। (सी) बे-के 8644 उपचार। (डी) निफेडिपिन उपचार। 80 बीपीएम से ऊपर उत्तेजना आवृत्तियों के दौरान इस टुकड़े के संकुचन बल के बारे में डेटा को छोड़ दिया गया था, क्योंकि संकुचन उत्तेजना आवृत्ति का पालन नहीं कर रहा था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1: परिवहन के लिए और टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान उपयोग किए जाने वाले स्लाइसिंग बफर की संरचना। एगरोज़ की तैयारी के लिए, ग्लूकोज को छोड़ दिया जाता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 2: 4% एगरोज़ जेल की संरचना। इस ग्लूकोज मुक्त कम पिघल एगरोज जेल ऊतक के नमूनों के एम्बेडिंग के लिए प्रयोग किया जाता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 3: खेती के लिए माध्यम की तैयारी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 4: उत्तेजना प्रोटोकॉल का विवरण। उत्तेजना प्रोटोकॉल में चार भाग होते हैं, जिन्हें परियोजना की जरूरतों के अनुरूप सभी को बदला जा सकता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
अतीत में, कार्डियोवैस्कुलर अनुसंधान ने कार्डियोमायोसाइट्स की खेती में बहुत प्रगति की है। हालांकि, बरकरार ज्यामिति के साथ कार्डियोमायोसाइट्स की 3 डी खेती अभी तक अच्छी तरह से स्थापित नहीं है। मायोकार्डियल ऊतक के पूर्व विवो खेती के लिए लागू पिछले प्रोटोकॉल की तुलना में, प्रोटोकॉल है कि हम यहाँ वर्णित ऊतक के विवो वातावरण में और अधिक बारीकी से जैसा दिखता है। इसके अलावा, प्री- और आफ्टरलोड का आवेदन अधिक बायोमिमेटिक वातावरण की अनुमति देता है। हम पूरी तरह से विश्लेषण और ऊतक के संकुचन डेटा और संकुचन मापदंडों की निरंतर रिकॉर्डिंग को समझने में सक्षम हैं।
समान सेट-अप का उपयोग करके पूर्व विवो कार्डियोवैस्कुलर ऊतक खेती तकनीकों की संख्यासीमित 11,21,22 है। मायोकार्डियल स्लाइस खेती के लिए एक समान तकनीक जो प्रकाशित की गई है, मायोकार्डियल स्लाइस10 की खेती के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करती है। हालांकि, इस विशेष सेट-अप की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि स्लाइस प्री-और आफ्टरलोड के संपर्क में नहीं आते हैं, न ही यह ऊतक को संभालने की आवश्यकता के बिना समय के साथ संकुचन का विस्तृत दृश्य उत्पन्न करने में सक्षम है। हमने यहां जिस विधि का वर्णन किया है, वह ऊतक क्षति या संक्रमण के जोखिम को कम करता है। इसके अलावा, यह सिकुड़ा हुआ बल में संभावित परिवर्तनों का एक व्यापक दृष्टिकोण देता है जब भी खेती में ब्याज का पदार्थ जोड़ा जाता है। प्रत्येक स्लाइस के सामान्य संकुचन बल के विश्लेषण के अलावा, वर्तमान सेट अप नियमित रूप से पूर्व-परिभाषित प्रोटोकॉल चलाने की अनुमति देता है। यह खेती किए गए ऊतक के विभिन्न प्रासंगिक मापदंडों के डेटा संग्रह की अनुमति देता है।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
ऊतक क्षति से बचा जाना चाहिए, और यह पहले से ही एक्सप्लांट सर्जरी के दौरान हो सकता है। यदि छांटना के बाद ऊतक को तुरंत कोल्ड स्टोरेज समाधान में स्थानांतरित नहीं किया जाता है, तो इसके परिणामस्वरूप क्षतिग्रस्त ऊतक के नमूने हो सकते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि कई कदम हैं। प्रोटोकॉल की शुरुआत से पहले पिघलने की प्रक्रिया के दौरान ग्लूकोज के संभावित कारमेलाइजेशन को रोकने के लिए, ग्लूकोज के बिना टुकड़ा करने की क्रिया बफर का उपयोग करके एगारोज़ ऊतक एम्बेडिंग यौगिक तैयार किया जाना चाहिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर सिरिंज में एगरोज को इनक्यूबेट करने के बजाय 80 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान से सीधे एगरोज का उपयोग करने के कारण हाइपरथर्मिया के कारण होने वाले नुकसान से बचना महत्वपूर्ण है। चयापचय को कम करने और इस्किमिया को कम करने के लिए भंडारण और काटने के दौरान तापमान 4 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए। इसके अलावा, ऊतक को देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए, ऊतक के बजाय एगरोज़ को पकड़कर, जब इसे प्लास्टिक त्रिकोण संलग्न करने के लिए काटने की ट्रे और पेट्री डिश के बीच ले जाया जाता है। यह अत्यंत महत्वपूर्ण है कि ये त्रिकोण मायोकार्डियल फाइबर की दिशा के संबंध में उचित दिशा में जुड़े हों। त्रिकोणों के गलत संरेखण के परिणामस्वरूप ऊतक क्षति होगी।
सामान्य तौर पर, नए कट स्लाइस की उत्तेजना सीमा 10-20 एमए के बीच होती है, और वर्तमान को सावधानीपूर्वक बढ़ाया जाना चाहिए। एक वर्तमान द्वारा ऊतक का ओवरस्टिम्यूलेशन जो बहुत अधिक है, अपरिवर्तनीय नमूना क्षति का कारण बन सकता है। एक बार उत्तेजना शुरू हो जाने के बाद, खेती कक्षों को रॉक करके ऊतक आंदोलन आवश्यक है, और ऊतक को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की पर्याप्त उपलब्धता सुनिश्चित करने के लिए 5 मिनट से अधिक समय तक कभी नहीं रोका जाना चाहिए।
समस्या निवारण और संशोधन
हाइपर संकुचन
मायोकार्डियल ऊतक नमूने का हाइपर संकुचन चर्चा प्रोटोकॉल के लिए मुख्य बहिष्करण मानदंडों में से एक है। यह मायोकार्डियल स्लाइस की तैयारी से पहले और बाद में हो सकता है। ऐसे मामलों में जहां, तैयारी से पहले, ऊतक तालमेल पर कठोर महसूस करता था, कम से कम 70% तैयारी में हाइपरकंट्रैक्शन देखा गया था। ऊतक नमूने का हाइपर संकुचन घुमावदार पर सम्मिलन पर भी हो सकता है, जो संभवतः ऊतक की गुणवत्ता या रोगी की रोग स्थिति पर निर्भर करता है। हाइपर सिकुड़न को ऊतक की उत्तेजना के दौरान डायस्टोलिक टोन की वृद्धि के रूप में देखा जा सकता है, जो कार्डियक इस्किमिया में क्षतिग्रस्त कार्डियोमायोसाइट्स के टॉनिक शॉर्टनिंग के अनुरूप है। उत्तेजना के दौरान हाइपर संकुचन प्रगतिशील हो सकता है, जिससे संकुचन 12 एमएन की पहचान सीमा से अधिक हो जाता है। हालांकि, हाइपर संकुचन भी 30-60 मिनट के भीतर अनायास रिवर्स हो सकता है, यह सुझाव देते हुए कि ऊतक ठीक हो सकता है। ऊतक की वसूली में सुधार करने के लिए, प्रीलोड सेटिंग्स को इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद समायोजित किया जाना चाहिए (यानी, चरण 8.3 दोहराएं), साथ ही तैयारी के बाद दिन 2, 4 और 6 पर। हाइपर संकुचन नमूनों के उत्तेजित संकुचन के साथ और बिना दोनों मौजूद हो सकता है। फिर भी, यदि 1 घंटे के भीतर कोई संकुचन नहीं देखा जाता है, तो नमूने का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। इस मामले में, ऊतक एक डिग्री तक हाइपरकॉन्ट्रैक्ट हो गया है जहां से यह ठीक नहीं हो सकता है या अन्यथा क्षतिग्रस्त हो गया है। सामान्य तौर पर, प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुसार मानव मायोकार्डियल स्लाइस की खेती, 90% की सफलता दर दिखाई गई है।
अपेक्षित संकुचन बल परिवर्तन
कारकों की एक भीड़ (जैसे, रोगी, तैयारी, ऊतक क्षति) के आधार पर, यह संभव है कि मायोस्लाइस जो शुरू में स्वीकार्य संकुचन दिखाते हैं, पहले 24 घंटे के दौरान सिकुड़ा हुआ आयाम में प्रगतिशील गिरावट से गुजरेंगे। वास्तव में, इस व्यवहार को मानव अंत-चरण असफल दिलों से प्राप्त स्लाइस के लिए भी सामान्य माना जा सकता है। अगले 3 दिनों के लिए प्रत्येक दिन स्लाइस के प्रीलोड को समायोजित करना इस समस्या को कम करने और संकुचन में सुधार करने के लिए पाया गया है। 24 से 48 घंटे के बाद, हालांकि, सिकुड़न फिर से बढ़ना शुरू हो जाना चाहिए। ध्यान दें कि संकुचन खेती के पहले दिनों के भीतर अपने शुरुआती स्तर पर वापस नहीं आएगा।
मध्यम विनिमय के तुरंत बाद, जब नमूने इनक्यूबेटर में वापस आ जाते हैं, तो संकुचन आमतौर पर स्पष्ट रूप से बढ़े हुए आयाम दिखाता है। इनक्यूबेटर को खोलना और बंद करना इस वृद्धि में योगदान देता है, क्योंकि यह सीओ2 स्तर को छोड़ने का कारण बनता है। यह बाइकार्बोनेट-बफर खेती माध्यम के अंदर पीएच को बढ़ाता है, जो स्लाइस की सकारात्मक इनोट्रोपिक प्रतिक्रिया का कारण बनता है। मध्यम विनिमय के बाद, स्लाइस का सिकुड़ा हुआ बल अक्सर कई घंटों तक कम हो जाता है जब तक कि यह अपने प्रारंभिक मूल्य तक नहीं पहुंच जाता है या पार नहीं हो जाता है। मध्यम विनिमय से प्रभावित होने वाले उत्तेजना प्रोटोकॉल को रोकने के लिए, मध्यम विनिमय के बाद कम से कम 1 घंटे तक उत्तेजना प्रोटोकॉल निष्पादित नहीं किया जाना चाहिए।
विधि की सीमाएँ
मानव मायोकार्डियल ऊतक के लिए पहले की खेती के तरीकों की तुलना में वर्तमान तकनीक का एक लाभ, अनुबंधित ऊतक पर पूर्व और बाद में लागू करने (और संशोधित) करने की संभावना है। हालांकि, दीवार तनाव के संदर्भ में लागू भार को निर्धारित करना मुश्किल है, हालांकि इस भार का अनुमान वसंत स्थिरांक और टुकड़ा आयामों से लगाया जा सकता है। यह माना जाता है कि मायोकार्डियल ऊतक की व्यवहार्यता और ऊतक नमूने के संकुचन आयाम के बीच एक सकारात्मक संबंध है। फिर भी वर्तमान में कोई विधि नहीं है जो कक्षों में बढ़ने से पहले प्रत्येक व्यक्तिगत टुकड़े के व्यवहार्यता परीक्षण की अनुमति देती है। मायोकार्डियल कोशिकाओं की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए खेती के लिए उपयोग नहीं किए जाने वाले कट स्लाइस पर एक वर्णमितीय एमटीटी धुंधला किया जा सकता है। व्यवहार्य कोशिकाओं में, एनएडीपीएच बैंगनी फॉर्माज़न क्रिस्टल में पीले एमटीटी नमक को कम कर देगा। एक और सीमा यह है कि वर्तमान में, खेती के माध्यम में पोषक तत्व बुनियादी अवयवों तक सीमित हैं। इसलिए, पोषक तत्व और परिसंचारी कारक विवो वातावरण से अलग हैं जिससे ऊतक प्राप्त किया गया था। हालांकि, मध्यम को आवश्यकतानुसार पूरक या संशोधित किया जा सकता है।
विधि के संभावित अनुप्रयोग
कार्डियोटॉक्सिसिटी और ड्रग परीक्षण के साथ-साथ हृदय रोग के पैथोफिजियोलॉजी को समझने के संदर्भ में विधि के कई संभावित अनुप्रयोग हैं। सबसे पहले, चर्चा किए गए प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली प्रणाली का उपयोग दवा और कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है। प्रोग्राम करने योग्य उत्तेजना प्रोटोकॉल की मदद से, दवा प्रशासन के जवाब में शारीरिक परिवर्तनों का विश्लेषण किया जा सकता है। दुर्दम्य अवधि की व्याख्या के संबंध में, यह विचार करने की आवश्यकता है कि यह एक कार्यात्मक पैरामीटर है, जो कार्रवाई संभावित अवधि पर दवाओं के प्रभाव को सख्ती से प्रतिबिंबित नहीं करता है। दूसरा, खेती कक्षों का उपयोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ संयोजन में मायोकार्डियम के विभिन्न सह-खेती प्रयोगों के लिए किया जा सकता है। इस सह-खेती का उपयोग करके, मायोकार्डियल संकुचन पर प्रतिरक्षा कोशिका स्रावित कारकों के प्रत्यक्ष प्रभावों का आकलन किया जा सकता है। अंत में, गैर-प्रत्यारोपण कार्डियोमायोपैथी नमूनों की भी खेती की जा सकती है, हालांकि ये गैर-प्रत्यारोपण ऊतक के नमूने आम तौर पर छोटे होते हैं और इसलिए प्रक्रिया करना अधिक कठिन होता है। फिर भी, यह उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और लक्षित दवाओं के विकास के लिए संभावनाएं खोल सकता है। रोगी विशिष्ट ऊतक लक्षण वर्णन के लिए तकनीक का उपयोग करना भी कल्पनीय है, जिससे हमें व्यक्तिगत दवा के करीब एक कदम लाया जा सकता है। इसके अलावा, प्रस्तुत विधि का उपयोग गैर-मानव मायोकार्डियल ऊतक के लिए किया जा सकता है, जिसके उदाहरण सुअर और खरगोश हैं। यह विचार किया जाना चाहिए, कि छोटे स्तनधारियों (माउस / चूहे) की उच्च शारीरिक हृदय गति प्राप्त नहीं की जा सकती है, क्योंकि बाद में उच्च ओ2 आवश्यकता को चर्चा किए गए सेट अप का उपयोग करके मायोकार्डियल खेती की शर्तों के तहत संतुष्ट नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, इन मामलों में निकट-शारीरिक वातावरण की नकल करना मुश्किल है।
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Disclosures
जेएच, पीएस, डीएम और केएल के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है। एडी और टीएस इनविट्रोसिस जीएमबीएच के शेयरधारक हैं, जो मायोडिश खेती प्रणाली प्रदान करता है।
Acknowledgments
अनुसंधान को डीजेडएचके अनुदान 81 जेड0600207 (जेएच, पीएस, और डीएम) और 81X2600253 (एडी और टीएस) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
लेखक क्लाउडिया फहनी, मेई-पिंग वू और मैथियास सेमिश को सेट-अप तैयार करने में उनके समर्थन के साथ-साथ ऊतक खेती के नियमित रखरखाव के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
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