Summary
Los organoides cerebrales proporcionan oportunidades sin precedentes para estudiar el desarrollo de órganos y la patología de enfermedades humanas. Aunque se ha logrado un gran éxito con los sistemas de cultivo de organoides cerebrales, todavía existen dificultades operativas en la aplicación de esta tecnología. El presente protocolo describe un procedimiento organoide cerebral que facilita el cambio medio y la transferencia de organoides.
Abstract
En la actualidad, la tecnología de cultivo de organoides cerebrales sigue siendo complicada de operar y difícil de aplicar a gran escala. Es necesario encontrar una solución simple y práctica. Por lo tanto, en el presente estudio se propone un protocolo organoide cerebral más factible. Para resolver los inconvenientes inevitables en el cambio medio y la transferencia de organoides en la etapa inicial, la investigación actual optimiza la tecnología de operación mediante la aplicación del principio de ingeniería. Se adoptó una lámpara de luz suave para iluminar lateralmente las muestras del cuerpo embrionario (EB), lo que permite que los EB se vean a simple vista a través del efecto de reflexión difusa mejorado. Utilizando el principio de flujo secundario generado por rotación, los organoides se reúnen hacia el centro del pozo, lo que facilita la operación de cambio de medio o transferencia de organoides. En comparación con la célula dispersa, el cuerpo embrionario se asienta más rápido en la pipeta. Usando este fenómeno, la mayoría de las células libres y los fragmentos de células muertas se pueden eliminar de manera efectiva de una manera simple, evitando que los EB incurran en daños por centrifugación. Este estudio facilita el funcionamiento del cultivo de organoides cerebrales y ayuda a promover la aplicación de organoides cerebrales.
Introduction
En comparación con los sistemas de cultivo bidimensionales (2D), los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) tienen varias ventajas, incluida la replicación genuina y la reproducción eficiente de estructuras complejas de ciertos órganos1. Por lo tanto, los organoides cerebrales son uno de los métodos auxiliares importantes para los campos de investigación del desarrollo del cerebro humano y la enfermedad2, la detección de drogas y la terapia celular.
El cultivo de organoides cerebrales por el método de suspensión rotativa es propicio para su desarrollo y maduración3. Aunque los sistemas de cultivo de organoides cerebrales han logrado un gran éxito, todavía se enfrentan a desafíos críticos que limitan su aplicación. Por ejemplo, el cultivo manual implica pasos de manipulación complicados e introduce obstáculos para lograr aplicaciones a gran escala. Además, en cada etapa del desarrollo en el cultivo de organoides cerebrales, se necesitan cambios en diferentes medios y citoquinas4. Sin embargo, en la etapa temprana, los organoides o EB tienen tamaños pequeños (aproximadamente 200 μm a 300 μm) y son casi visualmente inaccesibles sin el aparato adecuado. Inevitablemente, una cierta cantidad de preciosas muestras de organoides se eliminan cuando se cambia el medio. Se han explorado muchas técnicas para superar esto en otros tipos de cultivos de organoides, y algunos ejemplos incluyen sumergir chips organoides enteros en un medio de cultivo durante 3 días sin intervención5; agregar un medio fresco a través de la cubierta después de que el medio viejo se absorba con papel absorbente5; o la aplicación de tuberías microfluídicas complejas para el intercambio de fluidos 6,7,8. Otro obstáculo encontrado en la etapa temprana del cultivo de organoides es la dificultad de lograr observaciones directas a simple vista, lo que puede causar operaciones deficientes que conducen a daños y pérdidas de organoides durante los pasos de transferencia de organoides. Por lo tanto, es necesario establecer un protocolo más factible que facilite el cambio medio y la transferencia de organoides para generar organoides.
Se propone una operación optimizada correspondiente basada en principios de ingeniería para superar estos problemas, lo que facilita de manera significativa y conveniente muchos procedimientos organoides. En la naturaleza, cuando el sol brilla en una casa a través de un hueco en la ventana, el ojo desnudo puede ver el polvo bailando en el haz de luz. Debido al reflejo difuso de la luz solar sobre el polvo, parte de la luz se refracta en el globo ocular para producir una imagen visual. Inspirado en el principio de este fenómeno 9,10, este estudio hizo una lámpara de luz suave e iluminó los EB lateralmente. Se encontró que los EB podían ser visualmente claros sin afectar el alcance de visualización. Se genera un flujo secundario que apunta al centro en el líquido girando la placa de cultivo debido a las corrientes de Foucault11. Los EB originalmente dispersos se acumulan en el centro de la placa. En base a esto, y al fenómeno de que la velocidad de sedimentación de los organoides es más rápida que la de las células, se propone un método de fácil operación de cambio de medio y transferencia de organoides sin centrifugación. Los organoides en el medio de cultivo se pueden separar eficazmente de las células libres y los fragmentos de células muertas a través de esta operación de transferencia.
Aquí, se propone un protocolo que es fácil de operar para generar organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes humanas. La tecnología de operación se optimizó aplicando el principio de ingeniería, haciendo que las operaciones en la cultura 3D sean tan simples y factibles como las de la cultura 2D. El método mejorado de intercambio de líquidos y la operación de transferencia de organoides también son útiles para otros tipos de cultivo de organoides y el diseño de máquinas de cultivo automático.
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Protocol
El protocolo se llevó a cabo después de la Declaración de Helsinki. La aprobación fue otorgada por el Comité de Ética del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou (Revisión médica y ética [2021] No. 022). Antes del experimento, cada medio se preparaba de acuerdo con la fórmula12 de Juergen A. Knoblich (Tablas suplementarias 1-4), o se utilizó un kit de organoides cerebrales disponible comercialmente (ver Tabla de materiales). Las iPSC utilizadas en este estudio fueron establecidas previamente por nuestro laboratorio y han obtenido una exención informada. Las SCA3-iPSCs se generaron a partir de una paciente con ataxia espinocerebelosa tipo 3 (SCA3) de 31 años de edad genotipada como portadora de repeticiones CAG 26/78 en el gen ATXN313 (Figura Suplementaria 1A). Las iPSC humanas normales mencionadas en un artículo anterior fueron seleccionadas como NC-iPSCs14, y se identificó que el gen ATXN3 tenía repeticiones CAG 14/14 (Figura suplementaria 1B).
1. Preparación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC)
- Recolectar 3 ml de sangre periférica por venopunción con el consentimiento informado de voluntarios y pacientes.
- Aislar células mononucleares de sangre periférica según el método Ficoll-Paque15.
- Establecer iPSCs de acuerdo al protocolo del Kit de Reprogramación de Sendai (ver Tabla de Materiales).
- Cultive las iPSC con medio mTeSR1 en placas de Petri de 35 mm cubiertas con Matrigel (una matriz de membrana basal, ver Tabla de Materiales). Cambia el medio todos los días. La densidad de crecimiento de iPSC no debe exceder el 75%.
- Digerir las células con solución de disociación PSC (ver Tabla de Materiales) y subcultivarlas en una proporción de 1:5 cada 3-5 días.
PRECAUCIÓN: El virus Sendai se usa aquí. Debe ser operado en el gabinete de bioseguridad, y se deben tomar medidas de autoprotección. Debe quedar claro si se puede usar legalmente en el país local. Las leyes y regulaciones locales de bioseguridad deben seguirse estrictamente cuando se usan.
2. Preparación de EB (días 0-1)
- Retire el medio mTeSR1 de las iPSC con una pipeta y lávelo 2x con 1 mL de 1x PBS.
- Retire el PBS con una pipeta y agregue 300 μL de solución de desprendimiento celular (consulte la Tabla de materiales) para digerir las iPSC en celdas individuales durante 3-4 min a 37 °C.
- Resuspender las células en 2 ml de medio de formación de EB (Tabla suplementaria 1) y luego centrifugar la muestra durante 5 min a 300 x g (temperatura ambiente).
- Pretratar la placa especializada de 24 pocillos con solución de enjuague antiadherencia (500 μL/pocillo) durante 5 min (ver Tabla de Materiales).
NOTA: La solución de enjuague antiadherencia es esencial para la formación óptima de EB y esferoides. - Resuspend las células en medio de formación EB que contiene Y-27632 (concentración final, 10 μM, ver Tabla de Materiales), con una densidad celular de 1,5 x 106 células/mL.
- Retire la solución de enjuague antiadherencia y enjuague cada pozo con 2 ml de medio de formación de EB.
- Agregue las células a las placas especializadas de 24 pocillos a una densidad de 3 x 106 celdas/ pozo (Figura 1A, izquierda).
NOTA: Normalmente, se pueden preparar 300 EB en cada pozo. Este método puede preparar grandes cantidades de EB del mismo tamaño. - Centrifugar la placa a 100 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Distribuya uniformemente las celdas en cada cámara en la parte inferior de la placa (Figura 1A, derecha).
NOTA: Si no hay una centrífuga adecuada, la placa también se puede colocar directamente en la incubadora para el cultivo estático, pero el tiempo de formación de la bola EB será varias horas más tarde que en la centrifugación normal. - Incubar las muestras a 37 °C y 5% CO2 durante 24 h. Si no se utilizó la centrifugación en el paso anterior, incubar durante 36 h. Mantenga la muestra estable y no la saque de la incubadora durante este período.
3. Preparación de la lámpara de luz suave (día 1)
- Use una placa acrílica transparente con un grosor de 0.3-0.5 cm en el tamaño del papel A5. Pegue almohadillas blancas en la parte frontal y posterior de la placa acrílica.
- Instale una fila de luces blancas LED en el borde de la placa para que las luces puedan entrar desde el lado de la placa acrílica y luego dispararse en paralelo (Figura suplementaria 2A-F, Figura 1B).
NOTA: Como los diámetros de los EB en la etapa inicial son de aproximadamente 200 μm a 300 μm, es difícil observarlos claramente a simple vista bajo la lámpara fluorescente de bancos limpios. Por el contrario, debido a la mejora de la reflexión difusa, podemos detectar los EB claramente mediante el uso de luz suave iluminada lateralmente (Figura 1B, C). Se recomienda una placa de 6 pocillos para cultivos de EB en experimentos posteriores. Sin embargo, para mostrar mejor el efecto visual de la luz suave, los platos a veces se utilizan para tomar fotos y videos en este estudio en lugar de platos, así que por favor no malinterprete. La lámpara de luz suave iluminada lateralmente también se puede utilizar para la placa de 6 pocillos.
- Instale una fila de luces blancas LED en el borde de la placa para que las luces puedan entrar desde el lado de la placa acrílica y luego dispararse en paralelo (Figura suplementaria 2A-F, Figura 1B).
4. Transferencia EB y reemplazo medio (días 2-5)
- Prepare una nueva placa de baja adherencia de 6 pocillos y agregue 2 ml de medio de formación de EB a cada pozo.
- Retire los EB junto con el medio con una punta de pipeta de diámetro ancho de 1000 μL (consulte la Tabla de materiales) y transfiéralos a la placa de baja adherencia de 6 pocillos (~ 100 EB / pozo).
NOTA: El proceso de operación adopta una lámpara de luz suave (mencionada en el paso 3.) para que los EB sean más fáciles de observar. Apague otras fuentes de luz interiores para obtener un mejor efecto visual de la luz suave. - Reemplace con el mismo volumen de medio de formación de EB fresco todos los días. Utilice el flujo secundario para reunir los EB en el centro y cambiar el medio.
- Aspire el medio viejo mediante pipeteos hasta el borde del pozo lentamente. No chupe demasiado fuerte; de lo contrario, los EB se eliminarán juntos. Luego, agregue un medio fresco para volver a suspender los EB.
NOTA: El flujo secundario principal (Figura 1D). Inducir un flujo de remolino girando el plato a lo largo de una órbita circular. Debido al flujo de remolino, se induce un flujo secundario dirigido hacia el centro. Los EB u organoides convergen al centro del pozo debido al flujo secundario generado a través de la rotación, después del cual el cambio de medio o la transferencia de embriones se pueden ejecutar fácilmente.
- Aspire el medio viejo mediante pipeteos hasta el borde del pozo lentamente. No chupe demasiado fuerte; de lo contrario, los EB se eliminarán juntos. Luego, agregue un medio fresco para volver a suspender los EB.
5. Comprobación de la pluripotencia mediante el etiquetado con el marcador de pluripotencia OCT4 (día 4)
NOTA: Cuando el diámetro de los EB sea superior a 300 μm, tome varios EB para la tinción de inmunofluorescencia del marcador OCT4 para detectar su pluripotencia.
- Fije los EB en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 30 min, seguido de un lavado en 1x PBS 3x durante 10 min cada vez.
- Transfiera los EB a PBS a temperatura ambiente que contengan 0.3% tritón X-100 y 3% BSA durante 2 h, seguido de lavado en PBS 3x durante 10 minutos cada vez.
NOTA: Después de ser tratados con Triton X-100, los EB flotan en la superficie líquida y pueden ser fácilmente succionados con el líquido durante la limpieza. Se recomienda la operación bajo un estereomicroscopio. - Diluya el anticuerpo primario OCT4 (ver Tabla de Materiales) con 1 ml de 1 pbS que contenga 1% de BSA en una proporción de 1:200 y agregue a los EB para incubación a 4 ° C durante la noche, luego lave en PBS 3x durante 10 minutos cada vez.
- Diluya el anticuerpo secundario respectivo (ver Tabla de Materiales) con 1x PBS a 1:500 y agregue 1 ml a los EB.
- Después de incubar a temperatura ambiente durante 2 h, lave las células en 1x PBS 3x durante 10 min cada vez.
- Retire el PBS, agregue 2 ml de 1 solución de PBS que contenga 1 μg/ ml de DAPI, incube a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego lave en PBS 3 veces durante 10 minutos cada vez.
- Mueva el EB que contiene una pequeña cantidad de líquido sobre el portaobjetos, selle el portaobjetos con una cubierta de vidrio recubierta con vaselina disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en el borde, y luego observe y recoja la imagen bajo el microscopio confocal de fluorescencia.
Nota : la expresión OCT4 representa la pluripotencia EB12. Cuando la expresión de OCT4 es inferior al 90 %, los EB deben descartarse y los EB deben prepararse de nuevo.
6. Inducción neural (días 5-7)
- Prepare una nueva placa de 6 pocillos con baja adherencia y agregue 3 ml de medio de inducción neural (Tabla suplementaria 2) a cada pozo.
- Encienda la luz suave lateral (mencionada en el paso 3.) y apague otras fuentes de luz interiores.
- Transfiera los EB a la placa de 6 pocillos con medio de inducción neural agregado (~ 100 EB / pozo). Agregue lo menos posible del medio original al nuevo pozo.
NOTA: Introducir habilidades simples de transferencia de organoides. Naturalmente, bajo gravedad y con una densidad relativamente mayor que el medio, los EB resuspendidos se hundirán gradualmente aplicando la operación que se muestra en la Figura 1E. Por lo tanto, los EB se pueden transferir convenientemente. Dado que, en comparación con los EB, las células libres y los fragmentos de células muertas se hunden más lentamente, la mayoría de las células libres y los fragmentos de células muertas se pueden eliminar a través de este método de sedimentación (Figura 1F). - Incubar las muestras a 37 °C y 5% CO2 durante 24 h.
NOTA: Bajo el microscopio, el diámetro de los EB era de aproximadamente 500 μm, y el borde era translúcido, lo que indica que se formó una capa neuroepitelial. - Continúe con el siguiente paso.
7. Incrustación en la matriz de la membrana basal (días 7-10)
- Coloque la matriz de membrana en un refrigerador de 4 °C con 60 minutos de anticipación para disolverla. Calcule la cantidad de la matriz requerida por adelantado. Aproximadamente 100 EB se incrustaron en 1,5 ml de la matriz de membrana.
- Encienda la luz suave lateral y apague la fuente de luz en la parte superior de la consola.
- Mantenga la matriz de membrana sobre hielo para evitar la solidificación.
- Transfiera una pequeña cantidad de EB a un plato de 60 mm que contenga medio de expansión fresco (Tabla suplementaria 3) cada vez. Reduzca el número de EB para que sea más fácil eliminar un solo EB.
- Luego, use una nueva placa de baja adherencia de 6 pocillos. Succione un solo EB (que contenga aproximadamente 10 μL de medio) con una punta de pipeta de diámetro ancho de 200 μL (consulte la Tabla de materiales) cada vez, y luego agréguelo a la parte inferior de la placa de 6 pocillos para hacer gotas. Use cinco gotas por pozo.
NOTA: La clave es ajustar el alcance de la pistola de pipeta a 50 μL y succionar un EB, y luego consultar el funcionamiento de la Figura 1E. Cuando el EB se asienta en el orificio de la punta de la pipeta, la punta toca rápidamente el fondo del pozo de la placa y empuja aproximadamente 10 μL de líquido para formar una gota. - Agregue 15 μL de la matriz de membrana a cada gota que contenga EB y mézclela rápidamente. Incrusta la bola EB en el centro de la gota.
NOTA: Los EB no deben aspirarse con una punta de pipeta estándar, lo que daña el EB. En su lugar, debe utilizarse la punta de pipeta de diámetro ancho de 200 μL. - Coloque la placa de 6 pocillos en una incubadora de 37 °C durante 30 minutos y solidifique las gotas de la matriz de membrana que contienen EB.
- Agregue 3 ml del medio de expansión a cada pozo y explote suavemente los EB incrustados en la matriz para suspenderlos.
- Incubar a 37 °C y 5% co2 durante 3 días.
NOTA: Si se observa brotación en la superficie de eb, significa que se ha formado un neuroepitelio expandido16.
8. Maduración organoide (días 10-40)
- Retire suavemente el medio original y agregue 3 ml de medio de maduración (Tabla suplementaria 4) a cada pocillo.
- Coloque la placa organoide en un agitador horizontal en una incubadora de 37 °C.
- Continúe rotando la cultura horizontalmente. Ajuste el agitador a la velocidad adecuada.
NOTA: Al cultivar organoides cerebrales en una placa de 6 pocillos, una fuerza centrífuga relativa (RCF) de 0.11808 x g es más apropiada, según el fabricante del agitador horizontal (ver Tabla de Materiales). De acuerdo con la conversión entre la fuerza centrífuga relativa y la velocidad de rotación 17,18, RCF = 1.118 x 10−5 × R × rpm2, donde RCF = fuerza centrífuga relativa (g), rpm = revoluciones por minuto (r / min) y R = radio de rotación (cm), también conocido como lanzamiento de agitación. Los parámetros de lanzamiento de agitación de diferentes agitadores pueden ser diferentes. Por lo tanto, se puede estimar que la velocidad de rotación es rpm = 299 x (RCF/R)1/2. - Cambie el medio de maduración fresco cada 2-3 días.
- Después de 20-30 días, cultive gradualmente los organoides cerebrales hasta la madurez.
NOTA: Durante este período, los organoides se pueden utilizar para experimentos y detección, como la detección de marcadores neuronales y la secuenciación del transcriptoma 19,20,21.
9. Secciones congeladas e inmunofluorescencia de organoides cerebrales
- Fije los organoides en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 16 h y luego lávelos 3x con 1x PBS durante 10 min cada vez.
- Retire el PBS y sumerja los organoides en sacarosa al 30% a 4 °C durante la noche.
- Incruste los organoides en gelatina/sacarosa al 10%/7,5% a 37 °C durante 1 h y luego transfiéralos rápidamente al molde de incrustación.
- Agregue hielo seco al 100% de etanol para preparar una suspensión seca de hielo / etanol, y coloque las muestras de organoides en ella para una congelación rápida.
- Almacene las muestras congeladas en un congelador de -80 °C. Cuando sea necesario, haga secciones congeladas con un grosor de 20 μm.
- Consulte los pasos 5.3.-5.5. para la inmunofluorescencia. Utilice el anticuerpo PAX6 para etiquetar las células progenitoras apicales, el anticuerpo TUJ1 (consulte la Tabla de materiales) para etiquetar las células neuronales 22,23,24 y DAPI para la tinción del ADN nuclear.
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Representative Results
El presente estudio indujo iPSC (Figura 2B) en organoides cerebrales (Figura 2C). Los EB cultivados en la etapa temprana expresaron el marcador OCT4 (Figura 2A), que indicó una buena pluripotencia. En la etapa posterior, los EB se convirtieron en organoides cerebrales maduros (Figura 2D). La investigación cultivó iPSCs de individuos sanos normales y pacientes con SCA3 en organoides cerebrales (Figura 3A). SCA3, también conocida como enfermedad de Machado-Joseph (MJD), es un trastorno neurodegenerativo causado por una expansión de poliglutamina en el gen ATXN325. Los datos de ARN-seq (cargados en un repositorio público, ver Tabla de Materiales) revelaron diferencias significativas en los perfiles de expresión génica entre el grupo organoide cerebral normal y el grupo organoide cerebral SCA3 en vías como el transporte de neurotransmisores, la formación de sinapsis y la regulación (Figura 3B). Se utilizó el software Cufflinks para calcular el nivel de expresión génica y la diferencia26. DEseq2 se utilizó además para analizar los datos27.
Figura 1: Optimización de las operaciones de cambio y transferencia de medios de los EB. (A) Preparación de EB. Las iPSC fueron digeridas y añadidas a las placas especializadas de 24 pocillos (izquierda). Las células formaron EB (derecha). La barra de escala es de 400 μm. (B) Diagrama esquemático de luz suave iluminada lateralmente para ayudar a observar organoides. (C) Los EB se observaron con diferentes fuentes de luz. Flecha amarilla: luz iluminada lateralmente; flecha roja: fondo oscuro; flechas verdes: EBs. (D) Un flujo de remolino se induce girando el plato a lo largo de una órbita circular. Debido al flujo de remolino, se induce un flujo secundario dirigido hacia el centro. Los EB convergen al centro del plato impulsados por el flujo secundario generado a través de la rotación. Flechas blancas: EBs. (E) Transferencia de organoides. (I) En primer lugar, se utiliza una punta de pipeta de boca ancha para succionar la solución de mezcla, incluidos los EB y el medio de cultivo. (II) Luego, mientras se mantiene la pipeta en posición vertical, los EB se hunden gradualmente bajo el efecto de gravedad y convergen hacia la boca de la punta de la pipeta. (III) A medida que la boca de la punta de la pipeta toca la superficie del líquido (generalmente el medio fresco) nuevamente, y debido a la tensión de la superficie del líquido, (IV) los EB se hunden rápidamente en el medio (sin necesidad de soplado adicional mediante pipeteo manual). Línea roja: el nivel de líquido; flechas amarillas: EBs. (F) Dado que las células libres y los fragmentos de células muertas se hunden más lentamente que los EB, la mayoría de las células libres y los fragmentos de células muertas pueden eliminarse mediante el método de sedimentación anterior para facilitar la transferencia de embriones. El cuadro rojo en la esquina superior derecha es una imagen ampliada. La barra de escala es de 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Inducción de iPSCs en organoides cerebrales. (A) Tinción de inmunofluorescencia de EB. OCT4: factor de transcripción de unión a octámeros-4; DAPI: Diclorhidrato DAPI. La barra de escala es de 100 μm. (B) iPSCs. La barra de escala es de 400 μm. (C) Organoides cerebrales. La barra de escala es de 200 μm. (D) Tinción por inmunofluorescencia de organoides cerebrales. PAX6: la caja pareada 6 es el marcador de las células progenitoras apicales; TUJ1: la clase III específica de la neurona β-tubulina es un marcador específico de la neurona. La barra de escala es de 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cultivo de iPSCs de individuos sanos y pacientes SCA3 en organoides cerebrales. (A) Diferentes etapas que cubren la maduración de los organoides cerebrales a partir de ebs. NC: grupo normal; SCA3: Grupo SCA3/MJD. Las barras de escala de imágenes de bajo y alto aumento son de 400 μm y 200 μm, respectivamente. (B) Tabla de análisis de enriquecimiento de GO de genes regulados a la baja y expresados diferencialmente entre organoides normales y organoides SCA3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Identificación de repeticiones ATXN3 CAG por electroforesis capilar. (A) Se identificó que el paciente SCA3 iPSC (SCA3-iPSC) tenía 26/78 repeticiones CAG en el gen ATXN3. (B) Se identificó que la iPSC humana normal (NC-iPSC) tenía 14/14 repeticiones CAG en el gen ATXN3. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Preparación de la lámpara de luz suave. (A) La fuente de alimentación y las luces LED se instalaron en un lado de la placa acrílica (como se muestra en la caja de puntos rojos). La longitud de onda de dispersión de la lámpara de luz suave LED es de 450-470 nm, el flujo luminoso es de 1300-1800 lm y el índice de reproducción cromática es de 75-85 Ra. (B) Se comprobó si las bombillas LED podían encenderse normalmente (como se muestra en el cuadro de puntos rojos). (C) Se pegó una almohadilla blanca en la parte delantera y posterior de la placa acrílica (como lo indican las flechas rojas). (D) La apariencia general de la lámpara de luz suave. (E) La lámpara de luz suave también se puede reemplazar por una almohadilla de luz de pintura LED comercial sin marco, que generalmente se usa para rastrear al copiar bocetos. Una capa de película blanca debe pegarse directamente sobre la almohadilla de luz de pintura LED. (F) La lámpara de luz suave en el trabajo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria 1: Composición del medio de formación EB. En la etapa inicial de la formación de EB (generalmente los primeros 2 días), Y-27632 (50 μM) y bFGF (4 ng / mL) deben agregarse al medio de formación de EB. El medio debe filtrarse con una unidad de filtro de 0,2 μm y almacenarse a -20 °C. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla complementaria 2: Composición del medio de inducción neural. El medio debe filtrarse con una unidad de filtro de 0,2 μm y almacenarse a -20 °C. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla suplementaria 3: Composición del medio de expansión. Se preparó una dilución de 1:100 de 2-mercaptoetanol en DMEM-F12, y se agregaron 87,5 μL de este al medio de expansión. La B27 no debe contener vitamina A. El medio debe filtrarse con una unidad de filtro de 0,2 μm y almacenarse a -20 °C. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla complementaria 4: Composición del medio de maduración. Se preparó una dilución 1:100 de 2-mercaptoetanol en DMEM-F12 y se agregaron 87,5 μL de este al medio de maduración. La B27 no debe contener vitamina A. El medio debe filtrarse con una unidad de filtro de 0,2 μm y almacenarse a -20 °C. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Los organoides cerebrales abren nuevas vías para la investigación médica. Muchas aplicaciones útiles de esta tecnología apenas están comenzando a ser exploradas28. Esta investigación encontró que los resultados de la secuenciación del transcriptoma de los organoides cerebrales genéticamente enfermos y los organoides cerebrales normales pueden reflejar las diferencias entre la enfermedad y la salud. Por ejemplo, los resultados del análisis de datos de ARN-seq (Figura 3B) son consistentes con muchos estudios reportados sobre enfermedades SCA3 29,30,31,32. Las operaciones experimentales, como el cambio medio, la transferencia de EB y el envoltorio, son cruciales para cultivar organoides cerebrales y determinar si se pueden preparar organoides con buena uniformidad33,34. En este estudio, se introduce un protocolo de organoides cerebrales que facilitó el cambio de medio y la transferencia de organoides. Una lámpara lateral de luz suave puede ayudar en gran medida en el funcionamiento del cultivo de organoides. Sin embargo, no es difícil de hacer, la almohadilla de luz de pintura LED y el procesamiento simple también pueden reemplazarlo. El método simple de intercambio de líquidos y la operación de transferencia de organoides facilitan todo el proceso de cultivo. La aplicación de organoides cerebrales a menudo se ve afectada por el problema de la pobre uniformidad35. La mayor diferencia entre este estudio y otras pautas de cultivo de organoides cerebrales es que el enfoque está en optimizar la operación para que el experimento sea más repetible.
Es muy importante mantener la estabilidad del sistema de cultivo. Si las condiciones lo permiten, se sugiere priorizar el medio organoide cerebral comercial, que puede reducir efectivamente las grandes diferencias en los resultados experimentales en diferentes lotes debido a la inestabilidad del medio. Además, el almacenamiento del medio organoide cerebral a 4 °C no debe durar más de 2 semanas; de lo contrario, afectará la estabilidad del sistema de cultivo. Por supuesto, también es importante asegurarse de que las iPSC utilizadas sean pluripotentes en lugar de diferenciadas. Se puede utilizar la detección de inmunofluorescencia OCT4. Si las células OCT4 positivas son inferiores al 90%, se recomienda reemplazarlas con iPSC de mayor calidad y cultivar organoides cerebrales nuevamente.
Existen algunas limitaciones en la tecnología de cultivo de organoides cerebrales introducida en este estudio. Por ejemplo, los organoides cerebrales no se pueden cultivar intensamente en la etapa posterior del desarrollo, lo que es un desperdicio de espacio de cultivo. Este es también un problema urgente a resolver en la aplicación de organoides cerebrales. Si muchos organoides cerebrales exhiben expansión hueca, el número de organoides en cada pozo se reduce, la frecuencia de intercambio medio aumenta y los organoides están en un estado no hipóxico con suficientes nutrientes.
Este estudio es un complemento operativo de muchos métodos de cultivo de organoides cerebrales existentes 12,36,37 e incluso de otros tipos de métodos de cultivo de órganos 38,39. Esto ayudará a desarrollar sistemas automatizados de cultivo de organoides en el futuro y promoverá la investigación y aplicación de organoides. Si la tecnología de mejorar el efecto de reflexión difusa de la luz de los organoides se utiliza en el sistema de cultivo inteligente automático, teóricamente puede reemplazar la cámara de amplificación de imágenes de alta precisión, y solo se debe instalar un dispositivo de reconocimiento de imágenes ordinario. Además, el intercambio de medios y la transferencia de organoides a través del flujo secundario generado por la rotación y la sedimentación natural en el cabezal de succión son teóricamente más factibles que la centrifugación en futuros equipos de cultivo automático.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong (Subvención No. 2020A0505100062), el Proyecto de Temas Clave de Ciencia y Tecnología de la Ciudad de Guangzhou (Subvención No. 201904020025), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nos. 31872800, 32070582, 82101937) y el proyecto de Beca de Investigación Postdoctoral de la Ciudad de Guangzhou (a Bangzhu Chen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
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