Summary
Organoides cerebrais oferecem oportunidades sem precedentes para estudar o desenvolvimento de órgãos e a patologia da doença humana. Embora tenha sido alcançado grande sucesso com sistemas de cultura organoides cerebrais, ainda há dificuldades operacionais na aplicação dessa tecnologia. O presente protocolo descreve um procedimento organoide cerebral que facilita a mudança média e a transferência organoide.
Abstract
Atualmente, a tecnologia de cultura organoide cerebral ainda é complicada de operar e difícil de aplicar em larga escala. É necessário encontrar uma solução simples e prática. Portanto, um protocolo organoide cerebral mais viável é proposto no presente estudo. Para resolver o inevitável inconveniente na mudança média e na transferência organoide no estágio inicial, a pesquisa atual otimiza a tecnologia de operação aplicando o princípio da engenharia. Uma lâmpada de luz macia foi adotada para iluminar lateralmente as amostras do corpo embrionário (EB), permitindo que os EBs fossem vistos a olho nu através do efeito de reflexão difusa aprimorado. Utilizando o princípio do fluxo secundário gerado pela rotação, os organoides se reúnem em direção ao centro do poço, o que facilita o funcionamento de mudança média ou transferência organoide. Comparado com a célula dispersa, o corpo embrionário se instala mais rápido na pipeta. Usando este fenômeno, a maioria das células livres e fragmentos de células mortas podem ser efetivamente removidos de forma simples, impedindo que os EBs incorram em danos causados por centrifugação. Este estudo facilita o funcionamento da cultura organoide cerebral e ajuda a promover a aplicação de organoides cerebrais.
Introduction
Em comparação com sistemas de cultura bidimensionais (2D), sistemas de cultura tridimensionais (3D) têm várias vantagens, incluindo replicação genuína e reprodução eficiente de estruturas complexas de determinados órgãos1. Portanto, organoides cerebrais são um dos importantes métodos auxiliares para os campos de pesquisa do desenvolvimento cerebral humano e da doença2, rastreamento de drogas e terapia celular.
A colheita de organoides cerebrais pelo método de suspensão rotativa é propícia ao seu desenvolvimento e maturação3. Embora os sistemas de cultura organoide cerebral tenham alcançado grande sucesso, eles ainda enfrentam desafios críticos que limitam sua aplicação. Por exemplo, o cultivo manual envolve etapas complicadas de manipulação e introduz obstáculos para alcançar aplicações em larga escala. Além disso, em cada estágio de desenvolvimento na cultura dos organoides cerebrais, são necessárias mudanças em diferentes mídias e citocinas4. No entanto, no estágio inicial, os organoides ou EBs têm tamanhos minúsculos (aproximadamente 200 μm a 300 μm) e são quase visualmente inacessíveis sem aparelhos apropriados. Inevitavelmente, uma certa quantidade de amostras organoides preciosas são lavadas quando o meio é alterado. Muitas técnicas têm sido exploradas para superar isso em outros tipos de culturas organoides, e alguns exemplos incluem a imersão de chips organoides inteiros em um meio de cultura por 3 dias sem intervenção5; adicionando um meio fresco através do deslizamento de tampas depois que o meio antigo é absorvido usando papel absorvente5; ou aplicar dutos microfluidos complexos para troca de fluidos 6,7,8. Outro obstáculo encontrado no estágio inicial do cultivo organoide é a dificuldade de alcançar observações diretas a olho nu, o que pode causar más operações que levam a danos organoides e perda durante as etapas de transferência organoide. Portanto, é necessário estabelecer um protocolo mais viável que facilite a mudança média e a transferência organoide para gerar organoides.
Propõe-se uma operação otimizada correspondente com base nos princípios da engenharia para superar esses problemas, o que facilita significativa e convenientemente muitos procedimentos organoides. Na natureza, quando o sol brilha em uma casa através de uma abertura de janela, o olho nu pode ver a poeira dançando no feixe de luz. Devido ao reflexo difuso da luz solar sobre a poeira, alguma luz é refratada no globo ocular para produzir uma imagem visual. Inspirado no princípio desse fenômeno 9,10, este estudo fez uma lâmpada de luz macia e iluminou os EBs lateralmente. Verificou-se que os EBs poderiam ser visualmente claros sem afetar o escopo de visualização. Um fluxo secundário apontando para o centro é gerado no líquido girando a placa de cultura devido às correntes de eddy11. EBs originalmente dispersos se acumulam no centro da placa. Com base nisso, e no fenômeno de que a velocidade de sedimentação dos organoides é mais rápida que a das células, propõe-se um método de operação fácil de mudança média e transferência organoide sem centrifugação. Os organoides no meio da cultura podem ser efetivamente separados de células livres e fragmentos de células mortas através desta operação de transferência.
Aqui, um protocolo de fácil funcionamento é proposto para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes humanas. A tecnologia de operação foi otimizada aplicando o princípio da engenharia, tornando as operações na cultura 3D tão simples e viáveis quanto as da cultura 2D. O método de troca de líquidos melhorado e a operação de transferência organoide também são úteis para outros tipos de cultura organoide e o projeto de máquinas de cultura automática.
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Protocol
O protocolo foi conduzido após a Declaração de Helsinque. A aprovação foi concedida pelo Comitê de Ética do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangzhou (Revisão Médica e Ética [2021] Nº 022). Antes do experimento, cada meio foi preparado de acordo com a fórmula12 de Juergen A. Knoblich (Tabelas Suplementares 1-4), ou um Kit Organoide Cerebral comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Os iPSCs utilizados neste estudo foram previamente estabelecidos pelo nosso laboratório e obtiveram isenção informada. Os SCA3-iPSCs foram gerados a partir de uma ataxia spinocerebellar fêmea de 31 anos de idade genótipo 3 (SCA3) genótipado como abrigando 26/78 CAG repetições no gene ATXN313 (Figura Suplementar 1A). Os iPSCs humanos normais mencionados em artigo anterior foram selecionados como NC-iPSCs14, e o gene ATXN3 foi identificado como tendo repetições de CAG 14/14 (Figura Suplementar 1B).
1. Preparação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)
- Coletar 3 mL de sangue periférico por venipuntura com o consentimento informado de voluntários e pacientes.
- Isole as células mononucleares periféricas de acordo com o método Ficoll-Paque15.
- Estabelecer iPSCs de acordo com o protocolo do Kit de Reprogramação Sendai (ver Tabela de Materiais).
- Cultura os iPSCs com mTeSR1 médio em placas de Petri de 35 mm cobertas com Matrigel (uma matriz de membrana de porão, ver Tabela de Materiais). Mude o meio todos os dias. A densidade de crescimento do IPSC não deve exceder 75%.
- Digerir as células com solução de dissociação de PSC (ver Tabela de Materiais) e subcultura-las a uma razão de 1:5 a cada 3-5 dias.
ATENÇÃO: O vírus Sendai é usado aqui. Deve ser operado no gabinete de biossegurança, e medidas de autoproteção devem ser tomadas. Deve ficar claro se pode ser usado legalmente no país local. As leis e regulamentos locais de biossegurança devem ser rigorosamente seguidos quando utilizados.
2. Preparação do EB (dias 0-1)
- Retire o meio mTeSR1 dos iPSCs com uma pipeta e lave-o 2x com 1 mL de 1x PBS.
- Remova o PBS com uma pipeta e adicione 300 μL de solução de descolamento celular (ver Tabela de Materiais) para digerir os iPSCs em células únicas por 3-4 min a 37 °C.
- Resuspenda as células em 2 mL de meio de formação de EB (Tabela Suplementar 1) e, em seguida, centrifugar a amostra por 5 min a 300 x g (temperatura ambiente).
- Pré-tre a placa especializada de 24 poços com solução anti-adesão enxaguante (500 μL/well) por 5 min (ver Tabela de Materiais).
NOTA: A solução de lavagem anti-adesão é essencial para a formação ideal de EB e esferoide. - Resuspentive as células em meio de formação de EB contendo Y-27632 (concentração final, 10 μM, ver Tabela de Materiais), com densidade celular de 1,5 x 106 células/mL.
- Remova a solução anti-adesão e enxágue cada poço com 2 mL de meio de formação de EB.
- Adicione as células às placas especializadas de 24 poços a uma densidade de 3 x 106 células/bem (Figura 1A, à esquerda).
NOTA: Normalmente, 300 EBs podem ser preparados em cada poço. Este método pode preparar grandes quantidades de EBs do mesmo tamanho. - Centrifugar a placa a 100 x g por 2 min a temperatura ambiente. Distribua uniformemente as células em cada câmara na parte inferior da placa (Figura 1A, à direita).
NOTA: Se não houver centrífuga adequada, a placa também pode ser diretamente colocada na incubadora para cultura estática, mas o tempo de formação da bola EB será várias horas mais tarde do que o sob centrifugação normal. - Incubar as amostras a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h. Se a centrifugação não foi utilizada na etapa anterior, incubar por 36 h. Mantenha a amostra estável e não a tire da incubadora durante esse período.
3. Preparação da lâmpada de luz macia (dia 1)
- Use uma placa de acrílico transparente com uma espessura de 0,3-0,5 cm no tamanho do papel A5. Cole almofadas brancas na frente e atrás da placa acrílica.
- Instale uma fileira de luzes brancas led na borda da placa para que as luzes possam entrar pelo lado da placa acrílica e, em seguida, disparar em paralelo (Figura Suplementar 2A-F, Figura 1B).
NOTA: Como os diâmetros dos EBs no estágio inicial são de aproximadamente 200 μm a 300 μm, é difícil observá-los claramente a olho nu sob a lâmpada fluorescente de bancos limpos. Em contraste, devido ao aprimoramento da reflexão difusa, podemos detectar claramente os EBs usando luz suave iluminada lateralmente (Figura 1B, C). Uma placa de 6 poços é recomendada para culturas EB em experimentos subsequentes. No entanto, para mostrar melhor o efeito visual da luz suave, os pratos às vezes são usados para tirar fotos e vídeos neste estudo em vez de pratos, por isso, por favor, não entenda mal. A lâmpada de luz macia iluminada lateralmente também pode ser usada para a placa de 6 poços.
- Instale uma fileira de luzes brancas led na borda da placa para que as luzes possam entrar pelo lado da placa acrílica e, em seguida, disparar em paralelo (Figura Suplementar 2A-F, Figura 1B).
4. Transferência de EB e substituição média (dias 2-5)
- Prepare uma nova placa de adesão de 6 poços e adicione 2 mL de meio de formação EB a cada poço.
- Remova os EBs junto com o meio com uma ponta de pipeta de 1000 μL (ver Tabela de Materiais) e transfira-os para a placa de adesão de 6 poços (~100 EBs/well).
NOTA: O processo de operação adota uma lâmpada de luz macia (mencionada na etapa 3.) para tornar os EBs mais fáceis de observar. Desligue outras fontes de luz interior para obter melhor o efeito visual da luz suave. - Substitua pelo mesmo volume de meio de formação de EB fresco todos os dias. Use o fluxo secundário para reunir os EBs para o centro e alterar o meio.
- Aspire o velho meio por pipetar até a borda do poço lentamente. Não chupe muito forte; caso contrário, os EBs serão removidos juntos. Em seguida, adicione meio fresco para resuspensar os EBs.
NOTA: O fluxo secundário de princípio (Figura 1D). Induzir um fluxo de redemoinho girando o prato ao longo de uma órbita circular. Devido ao fluxo de redemoinho, um fluxo secundário é induzido direcionado para o centro. Os EBs ou organoides convergem para o centro do poço devido ao fluxo secundário gerado através da rotação, após o qual a mudança média ou a transferência embrionária podem ser executadas prontamente.
- Aspire o velho meio por pipetar até a borda do poço lentamente. Não chupe muito forte; caso contrário, os EBs serão removidos juntos. Em seguida, adicione meio fresco para resuspensar os EBs.
5. Verificar a pluripotência rotulando com marcador de pluripotência OCT4 (dia 4)
NOTA: Quando o diâmetro dos EBs for superior a 300 μm, leve vários EBs para coloração de imunofluorescência marcador OCT4 para detectar sua pluripotência.
- Fixar os EBs em 4% de paraformaldeído a 4 °C por 30 min, seguido de lavagem em 1x PBS 3x por 10 min cada vez.
- Transfira os EBs para PBS de temperatura ambiente contendo 0,3% Triton X-100 e 3% BSA por 2 h, seguido de lavagem em PBS 3x por 10 min cada vez.
NOTA: Após serem tratados com o TR X-100, os EBs flutuam na superfície líquida e podem ser facilmente sugados com o líquido durante a limpeza. Recomenda-se a operação sob um estereótipo. - Diluir o anticorpo primário OCT4 (ver Tabela de Materiais) com 1 mL de 1x PBS contendo 1% de BSA a uma proporção de 1:200 e adicionar aos EBs para incubação a 4 °C durante a noite, em seguida, lavar em PBS 3x por 10 minutos cada vez.
- Diluir o respectivo anticorpo secundário (ver Tabela de Materiais) com 1x PBS às 1:500 e adicionar 1 mL aos EBs.
- Depois de incubar à temperatura ambiente por 2h, lave as células em 1x PBS 3x por 10 minutos cada vez.
- Retire o PBS, adicione 2 mL de solução PBS 1x contendo 1 μg/mL DAPI, incubar em temperatura ambiente por 10 minutos e depois lavar em PBS 3x por 10 minutos cada vez.
- Mova o EB contendo uma pequena quantidade de líquido no slide, sele o slide com um vidro de cobertura revestido com geleia de petróleo comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) na borda e, em seguida, observe e colete a imagem sob o microscópio confocal de fluorescência.
NOTA: A expressão OCT4 representa a pluripotência EB12. Quando a expressão de OCT4 for inferior a 90%, os EBs devem ser descartados, e os EBs devem ser preparados novamente.
6. Indução neural (dias 5-7)
- Prepare uma nova placa de 6 poços com baixa adesão e adicione 3 mL de meio de indução neural (Tabela Suplementar 2) a cada poço.
- Ligue a luz suave lateral (mencionada na etapa 3.) e desligue outras fontes de luz interior.
- Transfira os EBs para a placa de 6 poços com meio de indução neural adicionado (~100 EBs/bem). Adicione o mínimo possível do meio original ao novo poço.
NOTA: Introduza habilidades simples de transferência oforganoid. Naturalmente, sob gravidade e com uma densidade relativamente maior do que o médio, os EBs resuspended afundarão gradualmente aplicando a operação mostrada na Figura 1E. Assim, os EBs podem ser convenientemente transferidos. Uma vez que, em comparação com os EBs, células livres e fragmentos de células mortas afundam mais lentamente, a maioria das células livres e fragmentos de células mortas podem, assim, ser removidos através deste método de sedimentação (Figura 1F). - Incubar as amostras a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.
NOTA: Sob o microscópio, o diâmetro dos EBs era de aproximadamente 500 μm, e a borda era translúcida, indicando que uma camada neuroepitelial se formou. - Prossiga para o próximo passo.
7. Incorporação na matriz de membrana do porão (dias 7-10)
- Coloque a matriz de membrana em uma geladeira de 4 °C com 60 minutos de antecedência para dissolver. Calcule a quantidade da matriz necessária com antecedência. Aproximadamente 100 EBs foram incorporados em 1,5 mL da matriz de membrana.
- Ligue a luz lateral e desligue a fonte de luz na parte superior do console.
- Mantenha a matriz de membrana no gelo para evitar a solidificação.
- Transfira uma pequena quantidade de EBs para um prato de 60 mm contendo meio de expansão fresco (Tabela Suplementar 3) cada vez. Reduza o número de EBs para facilitar a remoção de um único EB.
- Em seguida, use uma nova placa de adesão de 6 poços baixos. Chupe um único EB (contendo aproximadamente 10 μL médio) com uma ponta de pipeta de 200 μL (ver Tabela de Materiais) cada vez, e depois adicione-o ao fundo da placa de 6 poços para fazer gotículas. Use cinco gotículas por poço.
NOTA: A chave é ajustar o alcance da arma pipeta para 50 μL e chupar um EB e, em seguida, referir-se ao funcionamento da Figura 1E. Quando o EB se acomoda ao furo da ponta da pipeta, a ponta toca rapidamente o fundo da placa e empurra aproximadamente 10 μL de líquido para formar uma gota. - Adicione 15 μL da matriz de membrana a cada gota contendo EB e misture-a rapidamente. Incorpore a bola EB no centro da gota.
NOTA: Os EBs não devem ser aspirados com uma ponta de pipeta padrão, que danifica o EB. A ponta de pipeta de 200 μL precisa ser usada em seu lugar. - Coloque a placa de 6 poços em uma incubadora de 37 °C por 30 minutos e solidifique as gotículas da matriz de membrana que contêm EBs.
- Adicione 3 mL do meio de expansão a cada poço e exploda suavemente os EBs incorporados pela matriz para suspendê-los.
- Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 3 dias.
NOTA: Se a brotação na superfície da EB for observada, significa que um neuroepithelium expandido foi formado16.
8. Maturação organoide (dias 10-40)
- Retire suavemente o meio original e adicione 3 mL de meio de maturação (Tabela Suplementar 4) a cada poço.
- Coloque a placa organoide em um agitador horizontal em uma incubadora de 37 °C.
- Continue a girar a cultura horizontalmente. Coloque o agitador na velocidade apropriada.
NOTA: Ao esculpir organoides cerebrais em uma placa de 6 poços, uma força centrífuga relativa (RCF) de 0,11808 x g é mais apropriada, de acordo com o fabricante do agitador horizontal (ver Tabela de Materiais). De acordo com a conversão entre a força centrífuga relativa e a velocidade rotativa17,18, RCF = 1,118 x 10-5 × R × rpm2, onde RCF = força centrífuga relativa (g), rpm = revoluções por minuto (r/min) e R = raio de rotação (cm), também conhecido como arremesso de tremor. Os parâmetros de arremesso de diferentes shakers podem ser diferentes. Portanto, pode-se estimar que a velocidade rotativa seja rpm = 299 x (RCF/R)1/2. - Mude o meio de maturação fresco a cada 2-3 dias.
- Após 20-30 dias, gradualmente cultura os organoides cerebrais até a maturidade.
NOTA: Durante esse período, os organoides podem ser usados para experimentos e detecção, como detecção de marcadores neurais e sequenciamento de transcriptome 19,20,21.
9. Seções congeladas e imunofluorescência de organoides cerebrais
- Fixar os organoides em 4% de paraformaldeído a 4 °C por 16 h e depois lavá-los 3x com 1x PBS por 10 min cada vez.
- Remova o PBS e mergulhe os organoides em 30% de sacarose a 4 °C durante a noite.
- Incorpore os organoides em 10%/7,5% de gelatina/sacarose a 37 °C por 1h e, em seguida, transfira rapidamente para o molde de incorporação.
- Adicione gelo seco a 100% etanol para preparar um chorume seco de gelo/etanol, e coloque as amostras organoides nele para congelamento rápido.
- Armazene as amostras congeladas em um congelador de −80 °C. Quando necessário, faça seções congeladas com uma espessura de 20 μm.
- Consulte as etapas 5.3.-5.5. para imunofluorescência. Use o anticorpo PAX6 para rotular células progenitoras apical, o anticorpo TUJ1 (ver Tabela de Materiais) para rotular células neuronais 22,23,24 e DAPI para coloração de DNA nuclear.
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Representative Results
O presente estudo induziu iPSCs (Figura 2B) em organoides cerebrais (Figura 2C). Os EBs cultivados na fase inicial expressaram o marcador OCT4 (Figura 2A), que indicava boa pluripotência. No estágio posterior, os EBs desenvolveram-se em organoides cerebrais maduros (Figura 2D). A pesquisa cultivou iPSCs de indivíduos saudáveis normais e pacientes SCA3 em organoides cerebrais (Figura 3A). SCA3, também conhecida como doença de Machado-Joseph (MJD), é uma doença neurodegenerativa causada por uma expansão de poliglutamina no gene ATXN325. Os dados do RNA-seq (enviados para um repositório público, ver Tabela de Materiais) revelaram diferenças significativas nos perfis de expressão genética entre o grupo organoide cerebral normal e o grupo organoide SCA3-cerebral em vias como transporte neurotransmissor, formação de sinapse e regulação (Figura 3B). O software cufflinks foi usado para calcular o nível de expressão genética e a diferença26. O DEseq2 foi ainda utilizado para analisar os dados27.
Figura 1: Operações otimizadas de alteração média e transferência de EBs. (A) EB. Os iPSCs foram digeridos e adicionados às placas especializadas de 24 poços (esquerda). As células formaram EBs (à direita). A barra de escala é de 400 μm. (B) Diagrama esquemático de luz macia iluminada lateralmente para auxiliar na observação de organoides. (C) Os EBs foram observados com diferentes fontes de luz. Seta amarela: luz iluminada lateralmente; seta vermelha: fundo escuro; setas verdes: EBs. (D) Um fluxo de redemoinho é induzido girando o prato ao longo de uma órbita circular. Devido ao fluxo de redemoinho, um fluxo secundário direcionado para o centro é induzido. Os EBs convergem para o centro do prato impulsionado pelo fluxo secundário gerado através da rotação. Setas brancas: EBs. (E) Transferência organoide. (I) Primeiro, uma ponta de pipeta de boca larga é usada para sugar a solução de mistura, incluindo tanto os EBs quanto o meio de cultura. (II) Em seguida, mantendo a pipeta ereto, os EBs gradualmente afundam sob o efeito gravitacional e convergem em direção à boca da ponta da pipeta. (III) À medida que a boca da ponta da pipeta toca novamente a superfície líquida (geralmente o meio fresco) e, devido à tensão da superfície líquida, (IV) os EBs afundam rapidamente no meio (não há necessidade de soprar adicional por pipetação manualmente). Linha vermelha: o nível líquido; setas amarelas: EBs. (F) Uma vez que células livres e fragmentos de células mortas afundam mais lentamente do que os EBs, a maioria das células livres e fragmentos de células mortas podem, assim, ser removidos através do método de sedimentação acima para facilitar a transferência embrióide. A caixa vermelha no canto superior direito é uma imagem ampliada. A barra de escala é de 400 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Indução de iPSCs em organoides cerebrais. (A) Coloração de imunofluorescência de EBs. OCT4: fator de transcrição vinculante de octamer-4; DAPI: DIHIDROCloreto DAPI. A barra de escala é de 100 μm. (B) iPSCs. A barra de escala é de 400 μm. (C) Organoides cerebrais. A barra de escala é de 200 μm. (D) Mancha de imunofluorescência de organoides cerebrais. PAX6: caixa emparelhada 6 é o marcador de células progenitoras apical; TUJ1: a classe III específica do neurônio β-tubulina é um marcador específico do neurônio. A barra de escala é de 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cultivo de iPSCs de indivíduos saudáveis e pacientes SCA3 em organoides cerebrais. (A) Diferentes estágios que abrangem a maturação de organoides cerebrais a partir de EBs. NC: grupo normal; SCA3: Grupo SCA3/MJD. Barras de escala de imagens de baixa e alta ampliação são de 400 μm e 200 μm, respectivamente. (B) Gráfico de análise de enriquecimento de GO de genes regulados e expressos diferencialmente entre organoides normais e organoides SCA3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Identificação de ATXN3 CAG se repete por eletroforese capilar. (A) O paciente SCA3 iPSC (SCA3-iPSC) foi identificado como tendo repetições de CAG 26/78 no gene ATXN3. (B) O iPSC humano normal (NC-iPSC) foi identificado como tendo repetições de CAG 14/14 no gene ATXN3. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 2: Preparação da lâmpada de luz macia. (A) A fonte de alimentação e as luzes LED foram instaladas em um lado da placa acrílica (como mostrado na caixa pontilhada vermelha). O comprimento de onda de dispersão da lâmpada de luz macia led é de 450-470 nm, o fluxo luminoso é de 1300-1800 lm, e o índice de renderização de cores é de 75-85 Ra. (B) Foi verificado se as lâmpadas LED poderiam acender normalmente (como mostrado na caixa pontilhada vermelha). (C) Uma almofada branca foi colada na parte frontal e atrás da placa acrílica (como indicado pelas setas vermelhas). (D) A aparência geral da lâmpada de luz macia. (E) A lâmpada de luz macia também pode ser substituída por uma almofada de luz de pintura LED comercial sem um quadro, que geralmente é usado para rastreamento ao copiar esboços. Uma camada de filme branco precisa ser colada diretamente acima da almofada de luz de pintura led. (F) A lâmpada de luz macia no trabalho. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Tabela Suplementar 1: Composição do meio de formação de EB. Na fase inicial da formação de EB (geralmente nos primeiros 2 dias), Y-27632 (50 μM) e bFGF (4ng/mL) precisam ser adicionados ao meio de formação de EB. O meio precisa ser filtrado com uma unidade de filtro de 0,2 μm e armazenado a −20 °C. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela suplementar 2: Composição do meio de indução neural. O meio precisa ser filtrado com uma unidade de filtro de 0,2 μm e armazenado a −20 °C. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela Suplementar 3: Composição do meio de Expansão. Uma diluição de 1:100 de 2-Mercaptoetanol foi preparada no DMEM-F12, e 87,5 μL deste foi adicionado ao meio de expansão. B27 não deve conter vitamina A. O meio precisa ser filtrado com uma unidade de filtro de 0,2 μm e armazenado a −20 °C. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela Suplementar 4: Composição do meio de Maturação. Foi preparada uma diluição de 1:100 de 2-Mercaptoetanol no DMEM-F12 e 87,5 μL deste foi adicionado ao meio de Maturação. B27 não deve conter vitamina A. O meio precisa ser filtrado com uma unidade de filtro de 0,2 μm e armazenado a −20 °C. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Organoides cerebrais abrem novos caminhos para a pesquisa médica. Muitas aplicações úteis desta tecnologia estão apenas começando a ser exploradas28. Esta pesquisa constatou que os resultados de sequenciamento de transcritos de organoides cerebrais geneticamente doentes e organoides cerebrais normais podem refletir as diferenças entre doença e saúde. Por exemplo, os resultados da análise de dados do RNA-seq (Figura 3B) são consistentes com muitos estudos relatados sobre doenças SCA3 29,30,31,32. Operações experimentais, como mudança média, transferência de EB e embrulho, são cruciais para o cultivo de organoides cerebrais e para determinar se organoides com boa uniformidade podem ser preparados33,34. Neste estudo, é introduzido um protocolo organoide cerebral que facilitou a mudança média e a transferência organoide. Uma lâmpada de luz macia lateral pode ajudar muito no funcionamento da cultura organoide. No entanto, não é difícil de fazer, o bloco de luz de pintura LED e o processamento simples também podem substituí-lo. O método simples de troca de líquidos e a operação de transferência organoide facilitam todo o processo de cultura. A aplicação de organoides cerebrais é frequentemente afetada pelo problema da baixa uniformidade35. A maior diferença entre este estudo e outras diretrizes de cultura organoide cerebral é que o foco é otimizar a operação para tornar o experimento mais repetitivo.
É muito importante manter a estabilidade do sistema cultural. Se as condições permitirem, sugere-se priorizar o meio organoide cerebral comercial, o que pode efetivamente reduzir as grandes diferenças nos resultados experimentais em diferentes lotes devido à instabilidade do meio. Além disso, o armazenamento médio organoide cerebral a 4 °C não deve durar mais de 2 semanas; caso contrário, afetará a estabilidade do sistema cultural. É claro que também é importante garantir que os iPSCs utilizados sejam pluripotentes e não diferenciados. A detecção de imunofluorescência OCT4 pode ser usada. Se as células OCT4-positivas forem inferiores a 90%, recomenda-se substituí-las por iPSCs de maior qualidade e organoides cerebrais de cultura novamente.
Existem algumas limitações na tecnologia de cultura organoide cerebral introduzida neste estudo. Por exemplo, organoides cerebrais não podem ser intensamente cultivados no estágio posterior do desenvolvimento, que é um desperdício de espaço cultural. Este também é um problema urgente a ser resolvido na aplicação de organoides cerebrais. Se muitos organoides cerebrais apresentarem expansão oca, o número de organoides em cada poço é reduzido, a frequência média de troca aumenta, e os organoides estão em um estado não-leve com nutrientes suficientes.
Este estudo é um suplemento operacional para muitos métodos de cultura organoide cerebral existentes 12,36,37 e até mesmo outros tipos de métodos de cultura de órgãos38,39. Isso ajudará a desenvolver sistemas automatizados de cultura organoide no futuro e promoverá a pesquisa e a aplicação de organoides. Se a tecnologia de melhorar o efeito de reflexão difusa da luz dos organoides for usada no sistema de cultivo inteligente automático, ela pode teoricamente substituir a câmera de amplificação de imagem de alta precisão, e apenas um dispositivo comum de reconhecimento de imagem precisa ser instalado. Além disso, a troca média e a transferência organoide através do fluxo secundário gerado pela rotação e sedimentação natural na cabeça de sucção são teoricamente mais viáveis do que a centrifugação em futuros equipamentos de cultura automática.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong (Grant No. 2020A0505100062), o Projeto de Temas-Chave de Ciência e Tecnologia da Cidade de Guangzhou (Grant No. 201904020025), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant No. 31872800, 32070582, 82101937) e o projeto Guangzhou City Postdoctor Research Grant (para Bangzhu Chen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
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