Summary
Cerebrala organoider ger oöverträffade möjligheter att studera organutveckling och mänsklig sjukdomspatologi. Även om stor framgång har uppnåtts med cerebrala organoidkultursystem, finns det fortfarande operativa svårigheter att tillämpa denna teknik. Detta protokoll beskriver ett cerebralt organoidförfarande som underlättar mediumförändring och organoidöverföring.
Abstract
För närvarande är cerebral organoidodlingsteknik fortfarande komplicerad att använda och svår att tillämpa i stor skala. Det är nödvändigt att hitta en enkel och praktisk lösning. Därför föreslås ett mer genomförbart cerebralt organoidprotokoll i den aktuella studien. För att lösa det oundvikliga besväret vid mediumförändring och organoidöverföring i ett tidigt skede optimerar den nuvarande forskningen driftstekniken genom att tillämpa ingenjörsprincipen. En mjuk ljuslampa antogs för att i sidled belysa embryoidkroppsproverna (EB), vilket gör att DE EBs kan ses med blotta ögat genom den förbättrade diffusa reflektionseffekten. Med hjälp av principen om sekundärt flöde som genereras genom rotation samlas organoiderna mot mitten av brunnen, vilket underlättar driften av mediumförändring eller organoidöverföring. Jämfört med den dispergerade cellen sätter sig embryoidkroppen snabbare i pipetten. Med hjälp av detta fenomen kan de flesta fria celler och döda cellfragment effektivt avlägsnas på ett enkelt sätt, vilket förhindrar att EBs ådrar sig skador från centrifugering. Denna studie underlättar driften av cerebral organoidkultur och hjälper till att främja tillämpningen av hjärnorganoider.
Introduction
Jämfört med tvådimensionella (2D) odlingssystem har tredimensionella (3D) odlingssystem flera fördelar, inklusive äkta replikering och effektiv reproduktion av komplexa strukturer av vissa organ1. Därför är cerebrala organoider en av de viktiga hjälpmetoderna för forskningsområdena mänsklig hjärnutveckling och sjukdom2, läkemedelsscreening och cellterapi.
Odling av cerebrala organoider med den roterande suspensionsmetoden bidrar till deras utveckling och mognad3. Även om cerebrala organoidkultursystem har uppnått stor framgång, står de fortfarande inför kritiska utmaningar som begränsar deras tillämpning. Till exempel innebär manuell odling komplicerade manipulationssteg och introducerar hinder för att uppnå storskaliga applikationer. Dessutom behövs vid varje utvecklingsstadium i kulturen av cerebrala organoider förändringar i olika medier och cytokiner4. I det tidiga skedet har emellertid organoiderna eller DE små storlekarna (cirka 200 μm till 300 μm) och är nästan visuellt otillgängliga utan lämplig apparat. Oundvikligen spolas en viss mängd värdefulla organoidprover bort när mediet byts ut. Många tekniker har utforskats för att övervinna detta i andra typer av organoidkulturer, och några exempel inkluderar nedsänkning av hela organoidchips i ett odlingsmedium i 3 dagar utan intervention5; tillsätt ett nytt medium genom täckglaset efter att det gamla mediet absorberats med absorberande papper5; eller applicera komplexa mikrofluidiska rörledningar för vätskeutbyte 6,7,8. Ett annat hinder som uppstår i det tidiga skedet av organoidodling är svårigheten att uppnå direkta observationer med blotta ögat, vilket kan orsaka dåliga operationer som leder till organoidskador och förlust under organoidöverföringsstegen. Därför är det nödvändigt att upprätta ett mer genomförbart protokoll som underlättar mediumförändring och organoidöverföring för att generera organoider.
En motsvarande optimerad operation baserad på tekniska principer föreslås för att övervinna dessa problem, vilket avsevärt och bekvämt underlättar många organoidprocedurer. I naturen, när solen skiner in i ett hus genom ett fönstergap, kan blotta ögat se dammet dansa i ljusstrålen. På grund av den diffusa reflektionen av solljus på damm bryts lite ljus in i ögongloben för att producera en visuell bild. Inspirerad av principen om detta fenomen 9,10 gjorde denna studie en mjuk ljuslampa och upplyste DE EBs i sidled. Det konstaterades att de verkställande organen kunde vara visuellt tydliga utan att det påverkade tittaromfattningen. Ett sekundärt flöde som pekar mot mitten genereras i vätskan genom att rotera odlingsplattan på grund av virvelströmmar11. Ursprungligen spridda EP ackumuleras i mitten av plattan. Baserat på detta och fenomenet att organoidernas sedimenteringshastighet är snabbare än cellernas, föreslås en enkel driftsmetod för mediumförändring och organoidöverföring utan centrifugering. Organoiderna i odlingsmediet kan effektivt separeras från fria celler och döda cellfragment genom denna överföringsoperation.
Här föreslås ett protokoll som är lätt att använda för att generera cerebrala organoider från humana pluripotenta stamceller. Driftstekniken optimerades genom att tillämpa ingenjörsprincipen, vilket gjorde operationer i 3D-kultur lika enkla och genomförbara som de i 2D-kulturen. Den förbättrade vätskeutbytesmetoden och organoidöverföringsoperationen är också till hjälp för andra typer av organoidkultur och utformningen av automatiska odlingsmaskiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet genomfördes efter Helsingforsdeklarationen. Godkännande beviljades av etikkommittén för det tredje anslutna sjukhuset vid Guangzhou Medical University (medicinsk och etisk granskning [2021] nr 022). Före experimentet framställdes varje medium enligt Juergen A. Knoblichs formel12 (tilläggstabellerna 1-4), eller så användes ett kommersiellt tillgängligt Cerebral Organoid Kit (se materialtabell). De iPSC som används i denna studie har tidigare fastställts av vårt laboratorium och har fått ett informerat undantag. SCA3-iPSC genererades från en 31-årig kvinnlig spinocerebellär ataxi typ 3 (SCA3) patient genotypad som innehöll 26/78 CAG-repetitioner i ATXN3-genen13 (kompletterande figur 1A). De normala humana iPSC: erna som nämns i en tidigare artikel valdes ut som NC-iPSCs14, och ATXN3-genen identifierades ha 14/14 CAG-upprepningar (kompletterande figur 1B).
1. Beredning av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)
- Samla in 3 ml perifert blod genom venipunktur med informerat samtycke från volontärer och patienter.
- Isolera mononukleära celler i perifert blod enligt Ficoll-Paque-metoden15.
- Upprätta iPSCs enligt protokollet för Sendai Reprogramming Kit (se materialtabell).
- Odla iPSC: erna med mTeSR1-medium i 35 mm petriskålar täckta med Matrigel (en källarmembranmatris, se materialtabell). Byt medium varje dag. iPSC-tillväxttätheten får inte överstiga 75%.
- Smält cellerna med PSC-dissociationslösning (se materialtabell) och subkulturera dem i förhållandet 1: 5 var 3-5: e dag.
VARNING: Sendai virus används här. Det måste användas i biosäkerhetsskåpet och självskyddsåtgärder måste vidtas. Det bör vara klart om det kan användas lagligt i det lokala landet. Lokala lagar och förordningar om biosäkerhet måste följas strikt när de används.
2. EB-beredning (dag 0-1)
- Ta bort mTeSR1-mediet från iPSC: erna med en pipett och tvätta det 2x med 1 ml 1x PBS.
- Ta bort PBS med en pipett och tillsätt 300 μL cellavskiljningslösning (se materialtabell) för att smälta iPSC i enstaka celler i 3-4 minuter vid 37 °C.
- Återsuspendera cellerna i 2 ml EB-bildningsmedium (tilläggstabell 1) och centrifugera sedan provet i 5 min vid 300 x g (rumstemperatur).
- Förbehandla den specialiserade 24-brunnsplattan med sköljlösning mot vidhäftning (500 μL/brunn) i 5 minuter (se materialtabell).
OBS: Sköljlösning mot vidhäftning är avgörande för optimal EB- och sfäroidbildning. - Återsuspendera cellerna i EB-bildningsmedium innehållande Y-27632 (slutlig koncentration, 10 μM, se materialtabell), med en celltäthet på 1,5 x 106 celler/ml.
- Ta bort sköljlösningen mot vidhäftning och skölj varje brunn med 2 ml EB-bildningsmedium.
- Lägg till cellerna i de specialiserade 24-brunnsplattorna med en densitet på 3 x 106 celler / brunn (figur 1A, vänster).
OBS: Normalt kan 300 EBs beredas i varje brunn. Denna metod kan förbereda stora mängder EBs av samma storlek. - Centrifugera plattan vid 100 x g i 2 min vid rumstemperatur. Fördela cellerna jämnt i varje kammare längst ner på plattan (figur 1A, höger).
OBS: Om det inte finns någon lämplig centrifug kan plattan också placeras direkt i inkubatorn för statisk odling, men bildningstiden för EB-bollen kommer att vara flera timmar senare än den under normal centrifugering. - Inkubera proverna vid 37 °C och 5 %CO2 i 24 timmar. Om centrifugering inte användes i föregående steg, inkubera i 36 timmar. Håll provet stabilt och ta det inte ur inkubatorn under denna period.
3. Förberedelse av den mjuka ljuslampan (dag 1)
- Använd en transparent akrylplatta med en tjocklek av 0,3-0,5 cm i storleken på A5-papper. Klistra in vita dynor på framsidan och baksidan av akrylplattan.
- Installera en rad led-vita lampor på kanten av plattan så att lamporna kan komma in från sidan av akrylplattan och skjut sedan ut parallellt (kompletterande figur 2A-F, figur 1B).
OBS: Eftersom diametrarna för EBs i det tidiga skedet är cirka 200 μm till 300 μm är det svårt att observera dem tydligt med blotta ögat under lysröret på rena bänkar. Däremot, på grund av förbättringen av diffus reflektion, kan vi upptäcka DE EBs tydligt genom att använda lateralt upplyst mjukt ljus (Figur 1B, C). En 6-brunnsplatta rekommenderas för EB-kulturer i efterföljande experiment. Men för att bättre visa den visuella effekten av mjukt ljus används rätter ibland för att ta bilder och videor i denna studie istället för tallrikar, så missförstå inte. Den lateralt upplysta mjuka ljuslampan kan också användas för 6-brunnsplattan.
- Installera en rad led-vita lampor på kanten av plattan så att lamporna kan komma in från sidan av akrylplattan och skjut sedan ut parallellt (kompletterande figur 2A-F, figur 1B).
4. EB-överföring och medium ersättning (dag 2-5)
- Förbered en ny 6-brunnars platta med låg vidhäftning och tillsätt 2 ml EB-bildningsmedium till varje brunn.
- Ta bort DE elektriska och elektroniska organen tillsammans med mediet med en pipettspets på 1000 μL med bred hål (se materialtabell) och överför dem till 6-brunnsplattan med låg vidhäftning (~ 100 EBs / brunn).
OBS: Driftsprocessen antar en mjuk ljuslampa (som nämns i steg 3.) för att göra DE ELEKTRISKA OCH: erna lättare att observera. Stäng av andra inomhusljuskällor för att få den visuella effekten av det mjuka ljuset bättre. - Byt ut med samma volym färskt EB-bildningsmedium varje dag. Använd det sekundära flödet för att samla de externa obligationerna till mitten och ändra mediet.
- Aspirera det gamla mediet genom att långsamt pipettera till kanten av brunnen. Sug inte för hårt; I annat fall kommer de verkställande organen att tas bort tillsammans. Lägg sedan till nytt medium för att återsuspendera de verkställande organen.
OBS: Principen sekundärt flöde (figur 1D). Inducera ett virvelflöde genom att rotera skålen längs en cirkulär bana. På grund av virvelflödet induceras ett sekundärt flöde riktat mot mitten. EM eller organoiderna konvergerar till mitten av brunnen på grund av det sekundära flödet som genereras genom rotation, varefter mediumförändring eller embryoidöverföring lätt kan utföras.
- Aspirera det gamla mediet genom att långsamt pipettera till kanten av brunnen. Sug inte för hårt; I annat fall kommer de verkställande organen att tas bort tillsammans. Lägg sedan till nytt medium för att återsuspendera de verkställande organen.
5. Kontrollera pluripotens genom märkning med pluripotensmarkör OCT4 (dag 4)
OBS: När diametern på DE EBs är större än 300 μm, ta flera EBs för OCT4-markör immunofluorescensfärgning för att detektera deras pluripotens.
- Fixera DE VEGETABILISKA i 4% paraformaldehyd vid 4 °C i 30 min, följt av tvätt i 1x PBS 3x i 10 min varje gång.
- Överför EBs till rumstemperatur PBS innehållande 0,3% Triton X-100 och 3% BSA i 2 timmar, följt av tvätt i PBS 3x i 10 min varje gång.
OBS: Efter att ha behandlats medTriton X-100 flyter EP: erna på vätskeytan och kan lätt sugas bort med vätskan under rengöring. Användning under ett stereomikroskop rekommenderas. - Späd den primära OCT4-antikroppen (se materialtabell) med 1 ml 1x PBS innehållande 1 % BSA i förhållandet 1:200 och tillsätt till DE VEGETABILISKA organen för inkubation vid 4 °C över natten och tvätta sedan i PBS 3x i 10 minuter varje gång.
- Späd respektive sekundär antikropp (se materialtabell) med 1x PBS vid 1:500 och tillsätt 1 ml till de elektriska och elektroniska organen.
- Efter inkubering vid rumstemperatur i 2 timmar, tvätta cellerna i 1x PBS 3x i 10 min varje gång.
- Ta bort PBS, tillsätt 2 ml 1x PBS-lösning innehållande 1 μg/ml DAPI, inkubera vid rumstemperatur i 10 min och tvätta sedan i PBS 3x i 10 min varje gång.
- Flytta EB som innehåller en liten mängd vätska på bilden, försegla bilden med ett täckglas belagt med kommersiellt tillgänglig vaselin (se materialtabell) på kanten och observera och samla sedan bilden under fluorescenskonfokalmikroskopet.
OBS: OCT4-uttryck representerar EB-pluripotens12. När uttrycket för OCT4 är mindre än 90 % bör de verkställande organen kasseras och de verkställande organen bör förberedas igen.
6. Neural induktion (dag 5-7)
- Förbered en ny 6-brunnsplatta med låg vidhäftning och tillsätt 3 ml neuralt induktionsmedium (tilläggstabell 2) till varje brunn.
- Slå på det laterala mjuka ljuset (nämns i steg 3.) och stäng av andra inomhusljuskällor.
- Överför EBs till 6-brunnsplattan med tillsatt neuralt induktionsmedium (~ 100 EP / brunn). Lägg till så lite som möjligt av det ursprungliga mediet till den nya brunnen.
OBS: Introducera enkla färdigheter förorganoid överföring. Naturligtvis, under tyngdkraften och med en relativt högre densitet än mediet, kommer de återsuspenderade EBs gradvis att sjunka genom att tillämpa den operation som visas i figur 1E. Därför kan DE EBs enkelt överföras. Eftersom fria celler och döda cellfragment sjunker långsammare jämfört med EBs, kan de flesta fria celler och döda cellfragment således avlägsnas genom denna sedimenteringsmetod (figur 1F). - Inkubera proverna vid 37 °C och 5 %CO2 i 24 timmar.
OBS: Under mikroskopet var diametern på DE ELEKTRISKA och bulens cirka 500 μm och kanten var genomskinlig, vilket indikerar att ett neuroepitelskikt bildades. - Fortsätt till nästa steg.
7. Inbäddning i källarmembranmatrisen (dag 7-10)
- Placera membranmatrisen i ett kylskåp på 4 °C i 60 minuter i förväg för att lösa upp den. Beräkna mängden av den önskade matrisen i förväg. Cirka 100 EBs var inbäddade i 1,5 ml av membranmatrisen.
- Slå på det laterala mjuka ljuset och stäng av ljuskällan på toppen av konsolen.
- Håll membranmatrisen på is för att förhindra stelning.
- Överför en liten mängd EBs till en 60 mm skål som innehåller färskt expansionsmedium (tilläggstabell 3) varje gång. Minska antalet EBs för att göra det lättare att ta bort en enda EB.
- Använd sedan en ny 6-brunnars platta med låg vidhäftning. Sug en enda EB (innehållande cirka 10 μL medium) med en 200 μL bredborrad pipettspets (se materialtabell) varje gång och lägg den sedan till botten av 6-brunnsplattan för att göra droppar. Använd fem droppar per brunn.
OBS: Nyckeln är att justera pipettpistolens räckvidd till 50 μL och suga en EB och sedan hänvisa till driften av figur 1E. När EB sätter sig till pipettspetsens borrning, berör spetsen snabbt plattans brunnsbotten och skjuter ut cirka 10 μL vätska för att bilda en droppe. - Tillsätt 15 μL av membranmatrisen till varje droppe som innehåller EB och blanda den snabbt. Bädda in EB-bollen i mitten av droppen.
OBS: EBs får inte aspireras med en standardpipettspets, vilket skadar EB. Pipettspetsen på 200 μL bredborr måste användas istället. - Placera 6-brunnsplattan i en 37 °C inkubator i 30 minuter och stelna membranmatrisdropparna som innehåller EBs.
- Tillsätt 3 ml expansionsmedium till varje brunn och blås försiktigt upp de matrisinbäddade EBs för att suspendera dem.
- Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i 3 dagar.
OBS: Om spirande på ytan av EB observeras betyder det att ett expanderat neuroepitel har bildats16.
8. Organoid mognad (dagar 10-40)
- Ta försiktigt bort det ursprungliga mediet och tillsätt 3 ml mognadsmedium (tilläggstabell 4) till varje brunn.
- Placera organoidplattan på en horisontell skakapparat i en 37 °C inkubator.
- Fortsätt att rotera kulturen horisontellt. Ställ in skakapparaten på lämplig hastighet.
OBS: Vid odling av cerebrala organoider på en 6-brunnsplatta är en relativ centrifugalkraft (RCF) på 0,11808 x g lämpligare, enligt tillverkaren av den horisontella skakapparaten (se materialtabell). Enligt omvandlingen mellan den relativa centrifugalkraften och rotationshastigheten17,18, RCF = 1,118 x 10−5 × R × rpm2, där RCF = relativ centrifugalkraft (g), rpm = varv per minut (r / min) och R = rotationsradie (cm), även känd som skakningskast. Skakningskastparametrarna för olika shakers kan vara olika. Därför kan det uppskattas att rotationshastigheten är rpm = 299 x (RCF / R)1/2. - Byt det färska mognadsmediet var 2-3: e dag.
- Efter 20-30 dagar, odla gradvis hjärnorganoiderna till mognad.
OBS: Under denna period kan organoider användas för experiment och detektion, såsom neural markördetektering och transkriptomsekvensering 19,20,21.
9. Frysta sektioner och immunofluorescens av cerebrala organoider
- Fixera organoiderna i 4% paraformaldehyd vid 4 °C i 16 timmar och tvätta dem sedan 3x med 1x PBS i 10 min varje gång.
- Ta bort PBS och sänk ner organoiderna i 30 % sackaros vid 4 °C över natten.
- Bädda in organoiderna i 10%/7,5% gelatin/sackaros vid 37 °C i 1 timme och överför dem sedan snabbt till inbäddningsformen.
- Tillsätt torris till 100% etanol för att förbereda en torris / etanoluppslamning och placera organoidproverna i den för snabb frysning.
- Förvara de frysta proverna i en frys på −80 °C. Gör vid behov frysta sektioner med en tjocklek av 20 μm.
- Se steg 5.3.-5.5. för immunofluorescens. Använd PAX6-antikroppen för att märka apikala stamceller, TUJ1-antikroppen (se materialtabell) för att märka neuronala celler 22,23,24 och DAPI för kärn-DNA-färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den aktuella studien inducerade iPSCs (figur 2B) till cerebrala organoider (figur 2C). De EBs som odlades i ett tidigt skede uttryckte OCT4-markören (figur 2A), vilket indikerade god pluripotens. I det senare skedet utvecklades de europeiska organen till mogna cerebrala organoider (figur 2D). Forskningen odlade iPSCs från normala friska individer och SCA3-patienter till cerebrala organoider (figur 3A). SCA3, även känd som Machado-Josephs sjukdom (MJD), är en neurodegenerativ sjukdom som orsakas av en polyglutaminexpansion i ATXN3-genen25. RNA-seq-data (uppladdade till ett offentligt arkiv, se materialtabell) avslöjade signifikanta skillnader i genuttrycksprofiler mellan den normala cerebrala organoidgruppen och SCA3-cerebral organoidgruppen i vägar såsom neurotransmittortransport, synapsbildning och reglering (figur 3B). Manschettknappar programvara användes för att beräkna genuttrycksnivån och skillnaden26. DEseq2 användes vidare för att analysera data27.
Figur 1: Optimerad mediumförändring och överföringsoperationer för EBs. IPSC: erna smältes och tillsattes till de specialiserade 24-brunnsplattorna (vänster). Cellerna bildade EBs (höger). Skalstrecket är 400 μm. (B) Schematiskt diagram över lateralt upplyst mjukt ljus för att hjälpa till att observera organoider. (C) De EBs observerades med olika ljuskällor. Gul pil: lateralt upplyst ljus; röd pil: mörk bakgrund; gröna pilar: EBs. (D) Ett virvelflöde induceras genom att rotera skålen längs en cirkulär bana. På grund av virvelflödet induceras ett sekundärt flöde riktat mot mitten. EP: erna konvergerar till mitten av skålen som drivs av det sekundära flödet som genereras genom rotation. Vita pilar: EBs. (E) Organoid överföring. (I) För det första används en pipettspets med bred mun för att suga upp blandningslösningen, inklusive både DEN VEGETABILISKA och odlingsmediet. (II) Sedan, medan pipetten hålls upprätt, sjunker DE IV gradvis under tyngdkraftseffekten och konvergerar mot pipettspetsens mynning. (III) När pipettspetsens mynning vidrör vätskans (vanligtvis det färska mediets) yta igen, och på grund av vätskeytans spänning, (IV) sjunker DE ELEKTRISKA och elektroniska organen snabbt in i mediet (inget behov av ytterligare utblåsning genom pipettering manuellt). Röd linje: vätskenivån; gula pilar: EBs. (F) Eftersom fria celler och döda cellfragment sjunker långsammare än EBs, kan de flesta fria celler och döda cellfragment således avlägsnas genom ovanstående sedimenteringsmetod för att underlätta embryoidöverföringen. Den röda rutan i det övre högra hörnet är en förstorad bild. Skalstrecket är 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Induktion av iPSCs i cerebrala organoider. OCT4: oktamerbindande transkriptionsfaktor-4; DAPI: DAPI-dihydroklorid. Skalstrecket är 100 μm. (B) iPSCs. Skalstrecket är 400 μm. (C) Cerebrala organoider. Skalstrecket är 200 μm. (D) Immunofluorescensfärgning av cerebrala organoider. PAX6: parad ruta 6 är markören för apikala stamceller; TUJ1: neuronspecifik klass III-β-tubulin är en neuronspecifik markör. Skalstrecket är 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Odling av iPSCs från friska individer och SCA3-patienter till cerebrala organoider. (A) Olika stadier som täcker mognaden av cerebrala organoider med början från EBs. NC: normal grupp; SCA3: SCA3/MJD-koncernen. Skalstrecken för bilder med låg och hög förstoring är 400 μm respektive 200 μm. (B) Go-anrikningsanalysdiagram över nedreglerade, differentiellt uttryckta gener mellan normala organoider och SCA3-organoider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Identifiering av ATXN3 CAG-upprepningar med kapillärelektrofores. (A) SCA3-patientens iPSC (SCA3-iPSC) identifierades ha 26/78 CAG-repetitioner i ATXN3-genen. (B) Den normala humana iPSC (NC-iPSC) identifierades ha 14/14 CAG-repetitioner i ATXN3-genen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Förberedelse av den mjuka ljuslampan. (A) Strömförsörjningen och LED-lamporna installerades på ena sidan av akrylkortet (som visas i den röda prickade lådan). LED-lampans spridningsvåglängd är 450-470 nm, ljusflödet är 1300-1800 lm, och färgåtergivningsindex är 75-85 Ra. (C) En vit dyna klistrades på framsidan och baksidan av akrylplattan (vilket indikeras av de röda pilarna). (D) Det övergripande utseendet på den mjuka ljuslampan. (E) Den mjuka ljuslampan kan också ersättas med en kommersiell LED-målningsljusplatta utan ram, som vanligtvis används för spårning vid kopiering av skisser. Ett lager vit film måste klistras in direkt ovanför LED-målningsljusplattan. F) Den mjuka ljuslampan på jobbet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 1: Sammansättningen av EB-bildningsmediet. Vid det inledande skedet av EB-bildning (vanligtvis de första 2 dagarna) måste Y-27632 (50 μM) och bFGF (4 ng / ml) tillsättas till EB-bildningsmediet. Mediet måste filtreras med en 0,2 μm filterenhet och förvaras vid −20 °C. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tilläggstabell 2: Sammansättning av det neurala induktionsmediet. Mediet måste filtreras med en 0,2 μm filterenhet och förvaras vid −20 °C. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tilläggstabell 3: Expansionsmediets sammansättning. En 1:100 utspädning av 2-merkaptoetanol framställdes i DMEM-F12 och 87,5 μl av detta tillsattes till expansionsmediet. B27 får inte innehålla vitamin A. Mediet måste filtreras med en 0,2 μm filterenhet och förvaras vid −20 °C. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tilläggstabell 4: Mognadsmediets sammansättning. En 1:100 utspädning av 2-merkaptoetanol i DMEM-F12 framställdes och 87,5 μl av detta tillsattes mognadsmediet. B27 får inte innehålla vitamin A. Mediet måste filtreras med en 0,2 μm filterenhet och förvaras vid −20 °C. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cerebrala organoider öppnar nya vägar för medicinsk forskning. Många användbara tillämpningar av denna teknik börjar bara utforskas28. Denna forskning fann att transkriptomsekvenseringsresultaten av genetiskt sjuka cerebrala organoider och normala cerebrala organoider kan återspegla skillnaderna mellan sjukdom och hälsa. Till exempel överensstämmer resultaten av RNA-seq-dataanalysen (figur 3B) med många rapporterade studier på SCA3-sjukdomar 29,30,31,32. Experimentella operationer, såsom medium förändring, EB-överföring och inslagning, är avgörande för att odla cerebrala organoider och bestämma om organoider med god enhetlighet kan framställas 33,34. I denna studie införs ett cerebralt organoidprotokoll som underlättade mediumförändring och organoidöverföring. En lateral mjuk ljuslampa kan i hög grad hjälpa till vid driften av organoidkulturen. Det är dock inte svårt att göra, LED-målningsljusplattan och enkel bearbetning kan också ersätta den. Den enkla vätskeutbytesmetoden och organoidöverföringsoperationen gör hela odlingsprocessen enklare. Tillämpningen av cerebrala organoider påverkas ofta av problemet med dålig enhetlighet35. Den största skillnaden mellan denna studie och andra riktlinjer för cerebral organoidkultur är att fokus ligger på att optimera operationen för att göra experimentet mer repeterbart.
Det är mycket viktigt att upprätthålla stabiliteten i kultursystemet. Om förhållandena tillåter, föreslås att prioritera det kommersiella cerebrala organoidmediet, vilket effektivt kan minska de stora skillnaderna i experimentella resultat i olika satser på grund av mediets instabilitet. Dessutom bör lagring av cerebral organoid medium vid 4 °C inte vara längre än 2 veckor. annars kommer det att påverka kultursystemets stabilitet. Naturligtvis är det också viktigt att se till att de iPSC: er som används är pluripotenta snarare än differentierade. OCT4 immunofluorescensdetektering kan användas. Om OCT4-positiva celler är mindre än 90% rekommenderas att ersätta dem med iPSCs av högre kvalitet och odla cerebrala organoider igen.
Det finns vissa begränsningar i den cerebrala organoidkulturtekniken som introducerades i denna studie. Till exempel kan cerebrala organoider inte intensivt odlas i det senare utvecklingsstadiet, vilket är slöseri med kulturutrymme. Detta är också ett brådskande problem som ska lösas vid applicering av cerebrala organoider. Om många cerebrala organoider uppvisar ihålig expansion reduceras antalet organoider i varje brunn, medelutbytesfrekvensen ökar och organoiderna är i ett icke-hypoxiskt tillstånd med tillräckliga näringsämnen.
Denna studie är ett operativt komplement till många befintliga cerebrala organoidodlingsmetoder 12,36,37 och även andra typer av organodlingsmetoder 38,39. Detta kommer att bidra till att utveckla automatiserade organoidodlingssystem i framtiden och främja forskning och tillämpning av organoider. Om tekniken för att förbättra den ljusdiffunderiska reflektionseffekten hos organoider används i det automatiska intelligenta odlingssystemet, kan den teoretiskt ersätta bildförstärkningskameran med hög precision, och endast en vanlig bildigenkänningsanordning behöver installeras. Dessutom är mediumutbyte och organoidöverföring genom sekundärt flöde som genereras genom rotation och naturlig sedimentering på sughuvudet teoretiskt mer genomförbart än centrifugering i framtida automatisk odlingsutrustning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen (bidrag nr 2020A0505100062), Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (bidrag nr 201904020025), National Natural Science Foundation of China (Bidrag nr 31872800, 32070582, 82101937) och Guangzhou City Postdoctoral Research Grant-projektet (till Bangzhu Chen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7.1 (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W.
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L.
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, Pt 11 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B.
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
