Summary
Gli organoidi cerebrali offrono opportunità senza precedenti per lo studio dello sviluppo degli organi e della patologia delle malattie umane. Sebbene sia stato ottenuto un grande successo con i sistemi di coltura di organoidi cerebrali, ci sono ancora difficoltà operative nell'applicazione di questa tecnologia. Il presente protocollo descrive una procedura organoide cerebrale che facilita il cambiamento del mezzo e il trasferimento degli organoidi.
Abstract
Allo stato attuale, la tecnologia di coltura degli organoidi cerebrali è ancora complicata da utilizzare e difficile da applicare su larga scala. È necessario trovare una soluzione semplice e pratica. Pertanto, nel presente studio viene proposto un protocollo organoide cerebrale più fattibile. Per risolvere l'inevitabile inconveniente nel cambio del mezzo e nel trasferimento degli organoidi nella fase iniziale, la ricerca attuale ottimizza la tecnologia operativa applicando il principio ingegneristico. Una lampada a luce morbida è stata adottata per illuminare lateralmente i campioni del corpo embrionale (EB), consentendo agli EB di essere visti ad occhio nudo attraverso l'effetto di riflessione diffusa potenziato. Utilizzando il principio del flusso secondario generato dalla rotazione, gli organoidi si raccolgono verso il centro del pozzo, il che facilita l'operazione di cambio medio o trasferimento organoide. Rispetto alla cellula dispersa, il corpo embrioide si deposita più velocemente nella pipetta. Utilizzando questo fenomeno, la maggior parte delle cellule libere e dei frammenti di cellule morte possono essere efficacemente rimossi in modo semplice, impedendo agli EB di incorrere in danni da centrifugazione. Questo studio facilita il funzionamento della coltura di organoidi cerebrali e aiuta a promuovere l'applicazione di organoidi cerebrali.
Introduction
Rispetto ai sistemi di coltura bidimensionali (2D), i sistemi di coltura tridimensionali (3D) presentano diversi vantaggi, tra cui la replica autentica e la riproduzione efficiente di strutture complesse di alcuni organi1. Pertanto, gli organoidi cerebrali sono uno degli importanti metodi ausiliari per i campi di ricerca dello sviluppo del cervello umano e della malattia2, dello screening farmacologico e della terapia cellulare.
La coltura di organoidi cerebrali con il metodo della sospensione rotante favorisce il loro sviluppo e la loro maturazione3. Sebbene i sistemi di coltura di organoidi cerebrali abbiano ottenuto un grande successo, devono ancora affrontare sfide critiche che ne limitano l'applicazione. Ad esempio, la coltivazione manuale comporta complicate fasi di manipolazione e introduce ostacoli al raggiungimento di applicazioni su larga scala. Inoltre, in ogni fase dello sviluppo nella coltura di organoidi cerebrali, sono necessari cambiamenti in diversi mezzi e citochine4. Tuttavia, nella fase iniziale, gli organoidi o EB hanno dimensioni minuscole (circa 200 μm a 300 μm) e sono quasi visivamente inaccessibili senza un apparato appropriato. Inevitabilmente, una certa quantità di preziosi campioni di organoidi viene lavata via quando il mezzo viene cambiato. Molte tecniche sono state esplorate per superare questo in altri tipi di colture organoidiche, e alcuni esempi includono l'immersione di interi chip organoidi in un terreno di coltura per 3 giorni senza intervento5; aggiungere un mezzo fresco attraverso il coperchio dopo che il vecchio mezzo è stato assorbito con carta assorbente5; o applicando tubazioni microfluidiche complesse per lo scambio di fluidi 6,7,8. Un altro ostacolo incontrato nella fase iniziale della coltivazione degli organoidi è la difficoltà di ottenere osservazioni dirette ad occhio nudo, che possono causare operazioni scadenti che portano a danni organoidi e perdite durante le fasi di trasferimento degli organoidi. Pertanto, è necessario stabilire un protocollo più fattibile che faciliti il cambiamento del mezzo e il trasferimento degli organoidi per generare organoidi.
Per superare questi problemi viene proposta una corrispondente operazione ottimizzata basata su principi ingegneristici, che facilita in modo significativo e conveniente molte procedure organoidiche. In natura, quando il sole splende in una casa attraverso una finestra, l'occhio nudo può vedere la polvere danzare nel fascio di luce. A causa del riflesso diffuso della luce solare sulla polvere, una parte della luce viene rifratta nel bulbo oculare per produrre un'immagine visiva. Ispirato al principio di questo fenomeno 9,10, questo studio ha realizzato una lampada a luce morbida e illuminato gli EB lateralmente. Si è scoperto che gli EB potevano essere visivamente chiari senza influire sull'ambito di visualizzazione. Un flusso secondario che punta al centro viene generato nel liquido ruotando la piastra di coltura a causa delle correnti parassite11. Gli EB originariamente dispersi si accumulano al centro della piastra. Sulla base di questo, e del fenomeno che la velocità di sedimentazione degli organoidi è più veloce di quella delle cellule, viene proposto un metodo di facile funzionamento del cambio del mezzo e del trasferimento organoide senza centrifugazione. Gli organoidi nel terreno di coltura possono essere efficacemente separati dalle cellule libere e dai frammenti di cellule morte attraverso questa operazione di trasferimento.
Qui, viene proposto un protocollo facile da usare per generare organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti umane. La tecnologia operativa è stata ottimizzata applicando il principio di ingegneria, rendendo le operazioni nella cultura 3D semplici e fattibili come quelle nella cultura 2D. Il metodo di scambio liquido migliorato e l'operazione di trasferimento degli organoidi sono utili anche per altri tipi di coltura organoide e per la progettazione di macchine automatiche per la coltura.
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Protocol
Il protocollo è stato condotto a seguito della Dichiarazione di Helsinki. L'approvazione è stata concessa dal Comitato Etico del Terzo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina di Guangzhou (Revisione medica ed etica [2021] n. 022). Prima dell'esperimento, ogni mezzo è stato preparato secondo la formula12 di Juergen A. Knoblich (tabelle supplementari 1-4), oppure è stato utilizzato un kit di organoidi cerebrali disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali). Le iPSC utilizzate in questo studio sono state precedentemente stabilite dal nostro laboratorio e hanno ottenuto un'esenzione informata. Le SCA3-iPSC sono state generate da una paziente femmina di atassia spinocerebellare di tipo 3 (SCA3) di 31 anni genotipizzata come portatrice di 26/78 ripetizioni CAG nel gene ATXN313 (Figura supplementare 1A). Le iPSC umane normali menzionate in un precedente articolo sono state selezionate come NC-iPSCs14 e il gene ATXN3 è stato identificato come avente 14/14 ripetizioni CAG (Figura supplementare 1B).
1. Preparazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)
- Raccogliere 3 ml di sangue periferico per venipuntura con il consenso informato di volontari e pazienti.
- Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico secondo il metodo Ficoll-Paque15.
- Stabilire iPSC secondo il protocollo del Kit di Riprogrammazione sendai (vedi Tabella dei Materiali).
- Coltivare le iPSC con mezzo mTeSR1 in piastre di Petri da 35 mm ricoperte di Matrigel (una matrice di membrana basale, vedi Tabella dei materiali). Cambia il mezzo ogni giorno. La densità di crescita dell'iPSC non deve superare il 75%.
- Digerire le cellule con la soluzione di dissociazione PSC (vedi Tabella dei materiali) e sottocolturarle in un rapporto di 1:5 ogni 3-5 giorni.
ATTENZIONE: il virus Sendai viene utilizzato qui. Deve essere utilizzato nell'armadio di biosicurezza e devono essere prese misure di autoprotezione. Dovrebbe essere chiaro se può essere utilizzato legalmente nel paese locale. Le leggi e i regolamenti locali sulla biosicurezza devono essere rigorosamente seguiti quando vengono utilizzati.
2. Preparazione EB (giorni 0-1)
- Rimuovere il supporto mTeSR1 dagli iPSC con una pipetta e lavarlo 2 volte con 1 mL di 1x PBS.
- Rimuovere il PBS con una pipetta e aggiungere 300 μL di soluzione di distacco cellulare (vedere Tabella dei materiali) per digerire le iPSC in singole celle per 3-4 minuti a 37 °C.
- Risospenare le cellule in 2 mL di terreno di formazione EB (Tabella supplementare 1) e quindi centrifugare il campione per 5 minuti a 300 x g (temperatura ambiente).
- Pretrattare la piastra specializzata a 24 pozzetti con soluzione di risciacquo anti aderenza (500 μL/pozzetto) per 5 min (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: La soluzione di risciacquo anti-aderenza è essenziale per una formazione ottimale di EB e sferoidi. - Risospese le cellule in mezzo di formazione EB contenente Y-27632 (concentrazione finale, 10 μM, vedi Tabella dei materiali), con una densità cellulare di 1,5 x 106 celle/mL.
- Rimuovere la soluzione di risciacquo anti aderenza e risciacquare ogni pozzetto con 2 ml di mezzo di formazione EB.
- Aggiungere le celle alle piastre specializzate a 24 pozzetti ad una densità di 3 x 106 celle/pozzetto (Figura 1A, a sinistra).
NOTA: Normalmente, 300 EB possono essere preparati in ogni pozzo. Questo metodo può preparare grandi quantità di EB della stessa dimensione. - Centrifugare la piastra a 100 x g per 2 minuti a temperatura ambiente. Distribuire uniformemente le celle in ogni camera nella parte inferiore della piastra (Figura 1A, a destra).
NOTA: Se non esiste una centrifuga adatta, la piastra può anche essere posizionata direttamente nell'incubatore per la coltura statica, ma il tempo di formazione della sfera EB sarà di diverse ore dopo quello della normale centrifugazione. - Incubare i campioni a 37 °C e 5% CO2 per 24 ore. Se la centrifugazione non è stata utilizzata nella fase precedente, incubare per 36 ore. Mantenere il campione stabile e non estrarlo dall'incubatore durante questo periodo.
3. Preparazione della lampada a luce soffusa (giorno 1)
- Utilizzare un pannello acrilico trasparente con uno spessore di 0,3-0,5 cm nel formato della carta A5. Incolla pastiglie bianche sulla parte anteriore e posteriore della piastra acrilica.
- Installare una fila di luci bianche a LED sul bordo della piastra in modo che le luci possano entrare dal lato della piastra acrilica e quindi sparare in parallelo (Figura supplementare 2A-F, Figura 1B).
NOTA: Poiché i diametri degli EB nella fase iniziale sono di circa 200 μm a 300 μm, è difficile osservarli chiaramente ad occhio nudo sotto la lampada fluorescente dei banchi puliti. Al contrario, grazie al miglioramento della riflessione diffusa, possiamo rilevare chiaramente gli EB utilizzando una luce soffusa illuminata lateralmente (Figura 1B, C). Una piastra a 6 pozzetti è raccomandata per le colture EB negli esperimenti successivi. Tuttavia, per mostrare meglio l'effetto visivo della luce soffusa, i piatti vengono talvolta utilizzati per scattare foto e video in questo studio invece di piatti, quindi per favore non fraintendere. La lampada a luce soffusa illuminata lateralmente può essere utilizzata anche per la piastra a 6 pozzetti.
- Installare una fila di luci bianche a LED sul bordo della piastra in modo che le luci possano entrare dal lato della piastra acrilica e quindi sparare in parallelo (Figura supplementare 2A-F, Figura 1B).
4. Trasferimento EB e sostituzione media (giorni 2-5)
- Preparare una nuova piastra a bassa adesione a 6 pozzetti e aggiungere 2 ml di mezzo di formazione EB a ciascun pozzetto.
- Rimuovere gli EB insieme al mezzo con una punta della pipetta a foro largo da 1000 μL (vedere Tabella dei materiali) e trasferirli sulla piastra a bassa adesione a 6 pozzetti (~ 100 EBs / pozzetto).
NOTA: il processo operativo adotta una lampada a luce morbida (menzionata nel passaggio 3.) per rendere gli EB più facili da osservare. Spegni altre fonti di luce interna per ottenere meglio l'effetto visivo della luce soffusa. - Sostituire con lo stesso volume di mezzo di formazione EB fresco ogni giorno. Utilizzare il flusso secondario per raccogliere gli EB al centro e cambiare il mezzo.
- Aspirare lentamente il vecchio mezzo pipettando fino al bordo del pozzo. Non succhiare troppo forte; in caso contrario, gli EB verranno rimossi insieme. Quindi, aggiungere il mezzo fresco per risospese gli EB.
NOTA: il flusso secondario principale (Figura 1D). Indurre un flusso vorticoso ruotando la parabola lungo un'orbita circolare. A causa del flusso vorticoso, viene indotto un flusso secondario diretto verso il centro. Gli EB o organoidi convergono al centro del pozzo a causa del flusso secondario generato attraverso la rotazione, dopo di che il cambiamento del mezzo o il trasferimento dell'embrione possono essere eseguiti facilmente.
- Aspirare lentamente il vecchio mezzo pipettando fino al bordo del pozzo. Non succhiare troppo forte; in caso contrario, gli EB verranno rimossi insieme. Quindi, aggiungere il mezzo fresco per risospese gli EB.
5. Controllo della pluripotenza mediante etichettatura con marcatore di pluripotenza OCT4 (giorno 4)
NOTA: Quando il diametro degli EB è superiore a 300 μm, prendere diversi EB per la colorazione di immunofluorescenza del marcatore OCT4 per rilevarne la pluripotenza.
- Fissare gli EB in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 30 minuti, seguito dal lavaggio in 1x PBS 3x per 10 minuti ogni volta.
- Trasferire gli EB a PBS a temperatura ambiente contenenti 0,3% Triton X-100 e 3% BSA per 2 ore, seguito da lavaggio in PBS 3x per 10 minuti ogni volta.
NOTA: Dopo essere stati trattati con Triton X-100, gli EB galleggiano sulla superficie del liquido e possono essere facilmente aspirati con il liquido durante la pulizia. Si consiglia il funzionamento sotto uno stereomicroscopio. - Diluire l'anticorpo primario OCT4 (vedere Tabella dei materiali) con 1 mL di 1x PBS contenente l'1% di BSA in un rapporto di 1:200 e aggiungere agli EB per l'incubazione a 4 °C durante la notte, quindi lavare in PBS 3x per 10 minuti ogni volta.
- Diluire il rispettivo anticorpo secondario (vedere Tabella dei materiali) con 1x PBS a 1:500 e aggiungere 1 mL agli EB.
- Dopo l'incubazione a temperatura ambiente per 2 ore, lavare le celle in 1x PBS 3x per 10 minuti ogni volta.
- Rimuovere il PBS, aggiungere 2 mL di 1 soluzione PBS contenente 1 μg/mL DAPI, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi lavare in PBS 3x per 10 minuti ogni volta.
- Spostare l'EB contenente una piccola quantità di liquido sul vetrino, sigillare il vetrino con un vetro di copertura rivestito con vaselina disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) sul bordo, quindi osservare e raccogliere l'immagine al microscopio confocale a fluorescenza.
NOTA: l'espressione OCT4 rappresenta la pluripotenza EB12. Quando l'espressione di OCT4 è inferiore al 90%, gli EB devono essere scartati e gli EB devono essere preparati di nuovo.
6. Induzione neurale (giorni 5-7)
- Preparare una nuova piastra a 6 pozzetti con bassa adesione e aggiungere 3 ml di mezzo di induzione neurale (Tabella supplementare 2) a ciascun pozzetto.
- Accendere la luce soffusa laterale (menzionata al punto 3)) e spegnere altre sorgenti luminose interne.
- Trasferire gli EB sulla piastra a 6 pozzetti con l'aggiunta di un mezzo di induzione neurale (~ 100 EBs / pozzetto). Aggiungi il meno possibile del mezzo originale al nuovo pozzo.
NOTA: Introdurre semplici abilità ditrasferimento di organi. Naturalmente, sotto gravità e con una densità relativamente più elevata rispetto al mezzo, gli EB risospesi affonderanno gradualmente applicando l'operazione mostrata nella Figura 1E. Quindi, gli EB possono essere comodamente trasferiti. Poiché, rispetto agli EB, le cellule libere e i frammenti di cellule morte affondano più lentamente, la maggior parte delle cellule libere e dei frammenti di cellule morte possono quindi essere rimossi attraverso questo metodo di sedimentazione (Figura 1F). - Incubare i campioni a 37 °C e 5% CO2 per 24 ore.
NOTA: Al microscopio, il diametro degli EB era di circa 500 μm e il bordo era traslucido, indicando che si formava uno strato neuroepiteliale. - Procedere al passaggio successivo.
7. Incorporamento nella matrice della membrana basale (giorni 7-10)
- Posizionare la matrice a membrana in frigorifero a 4 °C con 60 minuti di anticipo per sciogliersi. Calcola in anticipo l'importo della matrice richiesta. Circa 100 EB sono stati incorporati in 1,5 ml della matrice di membrana.
- Accendere la luce soffusa laterale e spegnere la sorgente luminosa sulla parte superiore della console.
- Mantenere la matrice di membrana sul ghiaccio per evitare la solidificazione.
- Trasferire una piccola quantità di EB in un piatto da 60 mm contenente un mezzo di espansione fresco (tabella supplementare 3) ogni volta. Ridurre il numero di EB per semplificare la rimozione di un singolo EB.
- Quindi, utilizzare una nuova piastra a bassa adesione a 6 pozzetti. Aspirare ogni volta un singolo EB (contenente circa 10 μL di mezzo) con una punta di pipetta a foro largo da 200 μL (vedere Tabella dei materiali), quindi aggiungerlo sul fondo della piastra a 6 pozzetti per produrre goccioline. Utilizzare cinque goccioline per pozzetto.
NOTA: la chiave è regolare l'intervallo della pistola a pipetta a 50 μL e aspirare un EB, quindi fare riferimento al funzionamento della Figura 1E. Quando l'EB si deposita sul foro della punta della pipetta, la punta tocca rapidamente il fondo del pozzo della piastra e spinge fuori circa 10 μL di liquido per formare una goccia. - Aggiungere 15 μL della matrice di membrana a ogni goccia contenente EB e mescolarla rapidamente. Incorporare la palla EB al centro della goccia.
NOTA: gli EB non devono essere aspirati con una punta di pipetta standard, che danneggia l'EB. Al suo posto è necessario utilizzare la punta della pipetta a foro largo da 200 μL. - Posizionare la piastra a 6 pozzetti in un incubatore a 37 °C per 30 minuti e solidificare le goccioline della matrice di membrana contenenti EB.
- Aggiungere 3 mL del mezzo di espansione a ciascun pozzetto e far esplodere delicatamente gli EB incorporati nella matrice per sospenderli.
- Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 3 giorni.
NOTA: Se si osserva un germogliamento sulla superficie di EB, significa che si è formato un neuroepitelio espanso16.
8. Maturazione organoide (giorni 10-40)
- Rimuovere delicatamente il supporto originale e aggiungere 3 ml di terreno di maturazione (Tabella supplementare 4) a ciascun pozzetto.
- Posizionare la piastra organoide su uno shaker orizzontale in un incubatore a 37 °C.
- Continuare a ruotare la cultura orizzontalmente. Impostare lo shaker alla velocità appropriata.
NOTA: Quando si coltivano organoidi cerebrali su una piastra a 6 pozzetti, una forza centrifuga relativa (RCF) di 0,11808 x g è più appropriata, secondo il produttore dello shaker orizzontale (vedi Tabella dei materiali). Secondo la conversione tra la forza centrifuga relativa e la velocità di rotazione17,18, RCF = 1.118 x 10−5 × R × rpm2, dove RCF = forza centrifuga relativa (g), rpm = giri al minuto (r/min) e R = raggio di rotazione (cm), noto anche come lancio di scuotimento. I parametri di lancio di scuotimento di diversi agitatori possono essere diversi. Pertanto, si può stimare che la velocità di rotazione sia rpm = 299 x (RCF/R)1/2. - Cambiare il mezzo di maturazione fresco ogni 2-3 giorni.
- Dopo 20-30 giorni, coltivare gradualmente gli organoidi cerebrali fino alla maturità.
NOTA: Durante questo periodo, gli organoidi possono essere utilizzati per esperimenti e rilevamenti, come il rilevamento di marcatori neurali e il sequenziamento del trascrittoma 19,20,21.
9. Sezioni congelate e immunofluorescenza di organoidi cerebrali
- Fissare gli organoidi in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 16 ore e poi lavarli 3x con 1x PBS per 10 min ogni volta.
- Rimuovere il PBS e immergere gli organoidi nel 30% di saccarosio a 4 °C durante la notte.
- Incorporare gli organoidi in gelatina/saccarosio al 10%/7,5% a 37 °C per 1 ora e quindi trasferirli rapidamente nello stampo di incorporamento.
- Aggiungere ghiaccio secco al 100% di etanolo per preparare un impasto di ghiaccio secco / etanolo e posizionare i campioni organoidi in esso per un congelamento rapido.
- Conservare i campioni congelati in un congelatore a -80 °C. Quando necessario, realizzare sezioni congelate con uno spessore di 20 μm.
- Fare riferimento ai passaggi 5.3.-5.5. per immunofluorescenza. Utilizzare l'anticorpo PAX6 per etichettare le cellule progenitrici apicali, l'anticorpo TUJ1 (vedi Tabella dei materiali) per etichettare le cellule neuronali 22,23,24 e DAPI per la colorazione del DNA nucleare.
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Representative Results
Il presente studio ha indotto iPSC (Figura 2B) in organoidi cerebrali (Figura 2C). Gli EB coltivati nella fase iniziale esprimevano il marcatore OCT4 (Figura 2A), che indicava una buona pluripotenza. Nella fase successiva, gli EB si sono sviluppati in organoidi cerebrali maturi (Figura 2D). La ricerca ha coltivato iPSC da individui sani normali e pazienti SCA3 in organoidi cerebrali (Figura 3A). La SCA3, nota anche come malattia di Machado-Joseph (MJD), è una malattia neurodegenerativa causata da un'espansione della poliglutammina nel gene ATXN325. I dati RNA-seq (caricati in un archivio pubblico, vedi Tabella dei materiali) hanno rivelato differenze significative nei profili di espressione genica tra il normale gruppo organoide cerebrale e il gruppo organoide SCA3-cerebrale in percorsi come il trasporto di neurotrasmettitori, la formazione di sinapsi e la regolazione (Figura 3B). Il software Cufflinks è stato utilizzato per calcolare il livello di espressione genica e la differenza26. DEseq2 è stato ulteriormente utilizzato per analizzare i dati27.
Figura 1: Operazioni ottimizzate di cambio e trasferimento dei mezzi degli EB. (A) Preparazione EB. Le iPSC sono state digerite e aggiunte alle piastre specializzate a 24 pozzetti (a sinistra). Le cellule formavano EB (a destra). La barra della scala è di 400 μm. (B) Diagramma schematico di luce soffusa illuminata lateralmente per aiutare nell'osservazione degli organoidi. (C) Gli EB sono stati osservati con diverse sorgenti luminose. Freccia gialla: luce illuminata lateralmente; freccia rossa: sfondo scuro; frecce verdi: EBs. (D) Un flusso vorticoso è indotto ruotando la parabola lungo un'orbita circolare. A causa del flusso vorticoso, viene indotto un flusso secondario diretto verso il centro. Gli EB convergono al centro del piatto guidato dal flusso secondario generato attraverso la rotazione. Frecce bianche: EBs. E) Trasferimento di organoidi. (I) In primo luogo, una punta di pipetta a bocca larga viene utilizzata per aspirare la soluzione di miscela, compresi sia gli EB che il terreno di coltura. (II) Quindi, mantenendo la pipetta in posizione verticale, gli EB affondano gradualmente sotto l'effetto gravità e convergono verso la bocca della punta della pipetta. (III) Quando la bocca della punta della pipetta tocca nuovamente la superficie del liquido (di solito il mezzo fresco) e, a causa della tensione superficiale del liquido, (IV) gli EB affondano rapidamente nel mezzo (non è necessario soffiare ulteriormente mediante pipettaggio manuale). Linea rossa: il livello del liquido; frecce gialle: EBs. (F) Poiché le cellule libere e i frammenti di cellule morte affondano più lentamente degli EB, la maggior parte delle cellule libere e dei frammenti di cellule morte possono quindi essere rimossi attraverso il metodo di sedimentazione di cui sopra per facilitare il trasferimento dell'embrioide. La casella rossa nell'angolo in alto a destra è un'immagine ingrandita. La barra della scala è di 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Induzione di iPSC in organoidi cerebrali. (A) Colorazione immunofluorescenza di EB. OCT4: fattore di trascrizione ottamero-legante-4; DAPI: DAPI dicloridrato. La barra della scala è 100 μm. (B) iPSC. La barra della scala è 400 μm. (C) Organoidi cerebrali. La barra della scala è 200 μm. (D) Colorazione di immunofluorescenza di organoidi cerebrali. PAX6: la scatola accoppiata 6 è il marcatore delle cellule progenitrici apicali; TUJ1: la β-tubulina di classe III specifica del neurone è un marcatore neurone-specifico. La barra della scala è di 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Coltivazione di iPSC da individui sani e pazienti SCA3 in organoidi cerebrali. (A) Diverse fasi di maturazione degli organoidi cerebrali a partire dagli EB. NC: gruppo normale; SCA3: gruppo SCA3/MJD. Le barre di scala delle immagini a basso e alto ingrandimento sono rispettivamente di 400 μm e 200 μm. (B) Tabella di analisi dell'arricchimento GO di geni down-regolati e differenzialmente espressi tra organoidi normali e organoidi SCA3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Identificazione delle ripetizioni CAG di ATXN3 mediante elettroforesi capillare. (A) Il paziente SCA3 iPSC (SCA3-iPSC) è stato identificato come avente 26/78 ripetizioni CAG nel gene ATXN3. (B) L'iPSC umano normale (NC-iPSC) è stato identificato come avente 14/14 ripetizioni CAG nel gene ATXN3. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Preparazione della lampada a luce soffusa. (A) L'alimentatore e le luci a LED sono stati installati su un lato del pannello acrilico (come mostrato nella casella tratteggiata rossa). La lunghezza d'onda di diffusione della lampada a luce morbida a LED è 450-470 nm, il flusso luminoso è 1300-1800 lm e l'indice di resa cromatica è 75-85 Ra. (B) È stato controllato se le lampadine a LED potevano accendersi normalmente (come mostrato nella casella tratteggiata rossa). (C) Un tampone bianco è stato incollato sulla parte anteriore e posteriore della lastra acrilica (come indicato dalle frecce rosse). (D) L'aspetto generale della lampada a luce soffusa. (E) La lampada a luce morbida può anche essere sostituita da un pad luminoso commerciale per verniciatura a LED senza cornice, che di solito viene utilizzato per il tracciamento durante la copia di schizzi. Uno strato di pellicola bianca deve essere incollato direttamente sopra il pad luminoso di verniciatura a LED. F) La lampada a luce soffusa al lavoro. Fare clic qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 1: Composizione del mezzo di formazione EB. Nella fase iniziale della formazione di EB (generalmente i primi 2 giorni), Y-27632 (50 μM) e bFGF (4 ng / mL) devono essere aggiunti al mezzo di formazione EB. Il supporto deve essere filtrato con un'unità filtrante da 0,2 μm e conservato a -20 °C. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare 2: Composizione del mezzo di induzione neurale. Il supporto deve essere filtrato con un'unità filtrante da 0,2 μm e conservato a -20 °C. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare 3: Composizione del mezzo di espansione. Una diluizione 1:100 di 2-Mercaptoetanolo è stata preparata in DMEM-F12 e 87,5 μL di questo sono stati aggiunti al mezzo di espansione. B27 non deve contenere vitamina A. Il supporto deve essere filtrato con un'unità filtrante da 0,2 μm e conservato a -20 °C. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare 4: Composizione del mezzo di maturazione. È stata preparata una diluizione 1:100 di 2-Mercaptoetanolo in DMEM-F12 e 87,5 μL di questo sono stati aggiunti al mezzo di maturazione. B27 non deve contenere vitamina A. Il supporto deve essere filtrato con un'unità filtrante da 0,2 μm e conservato a -20 °C. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Gli organoidi cerebrali aprono nuove strade per la ricerca medica. Molte applicazioni utili di questa tecnologia stanno solo iniziando ad essere esplorate28. Questa ricerca ha scoperto che i risultati del sequenziamento del trascrittoma di organoidi cerebrali geneticamente malati e normali organoidi cerebrali possono riflettere le differenze tra malattia e salute. Ad esempio, i risultati dell'analisi dei dati RNA-seq (Figura 3B) sono coerenti con molti studi riportati sulle malattie SCA3 29,30,31,32. Le operazioni sperimentali, come il cambiamento del mezzo, il trasferimento di EB e l'avvolgimento, sono cruciali per coltivare organoidi cerebrali e determinare se gli organoidi con una buona uniformità possono essere preparati33,34. In questo studio, viene introdotto un protocollo organoide cerebrale che ha facilitato il cambiamento del mezzo e il trasferimento degli organoidi. Una lampada a luce morbida laterale può aiutare notevolmente nel funzionamento della coltura organoide. Tuttavia, non è difficile da realizzare, il pad luminoso di verniciatura a LED e la semplice elaborazione possono anche sostituirlo. Il semplice metodo di scambio di liquidi e l'operazione di trasferimento degli organoidi facilitano l'intero processo di coltura. L'applicazione di organoidi cerebrali è spesso influenzata dal problema della scarsa uniformità35. La più grande differenza tra questo studio e altre linee guida per la coltura di organoidi cerebrali è che l'attenzione si concentra sull'ottimizzazione dell'operazione per rendere l'esperimento più ripetibile.
È molto importante mantenere la stabilità del sistema culturale. Se le condizioni lo consentono, si suggerisce di dare la priorità al mezzo organoide cerebrale commerciale, che può ridurre efficacemente le grandi differenze nei risultati sperimentali in diversi lotti a causa dell'instabilità del mezzo. Inoltre, la conservazione del mezzo organoide cerebrale a 4 °C non dovrebbe durare più di 2 settimane; in caso contrario, influenzerà la stabilità del sistema culturale. Naturalmente, è anche importante garantire che le iPSC utilizzate siano pluripotenti piuttosto che differenziate. È possibile utilizzare il rilevamento dell'immunofluorescenza OCT4. Se le cellule OCT4-positive sono inferiori al 90%, si consiglia di sostituirle nuovamente con iPSC di qualità superiore e organoidi cerebrali di coltura.
Ci sono alcune limitazioni nella tecnologia di coltura organoide cerebrale introdotta in questo studio. Ad esempio, gli organoidi cerebrali non possono essere coltivati intensivamente nella fase successiva dello sviluppo, che è uno spreco di spazio di coltura. Questo è anche un problema urgente da risolvere nell'applicazione di organoidi cerebrali. Se molti organoidi cerebrali mostrano un'espansione cava, il numero di organoidi in ciascun pozzetto è ridotto, la frequenza di scambio medio aumenta e gli organoidi sono in uno stato non ipossico con nutrienti sufficienti.
Questo studio è un supplemento operativo a molti metodi di coltura di organoidi cerebrali esistenti 12,36,37 e anche altri tipi di metodi di coltura d'organo 38,39. Ciò contribuirà a sviluppare sistemi automatizzati di coltura di organoidi in futuro e promuoverà la ricerca e l'applicazione di organoidi. Se la tecnologia per migliorare l'effetto di riflessione diffusa della luce degli organoidi viene utilizzata nel sistema di coltivazione intelligente automatico, può teoricamente sostituire la telecamera di amplificazione dell'immagine ad alta precisione e solo un normale dispositivo di riconoscimento delle immagini deve essere installato. Inoltre, lo scambio medio e il trasferimento organoide attraverso il flusso secondario generato dalla rotazione e dalla sedimentazione naturale sulla testa di aspirazione sono teoricamente più fattibili della centrifugazione nelle future apparecchiature di coltura automatica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dalla Natural Science Foundation della provincia del Guangdong (grant n. 2020A0505100062), dal Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (Grant No. 201904020025), dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31872800, 32070582, 82101937) e dal guangzhou City Postdoctoral Research Grant project (a Bangzhu Chen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
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