Summary
Cerebrale organoider giver hidtil usete muligheder for at studere organudvikling og human sygdomspatologi. Selvom der er opnået stor succes med cerebrale organoidkultursystemer, er der stadig operationelle vanskeligheder med at anvende denne teknologi. Den nuværende protokol beskriver en cerebral organoid procedure, der letter medium forandring og organoid overførsel.
Abstract
På nuværende tidspunkt er cerebral organoidkulturteknologi stadig kompliceret at betjene og vanskelig at anvende i stor skala. Det er nødvendigt at finde en enkel og praktisk løsning. Derfor foreslås en mere gennemførlig cerebral organoidprotokol i denne undersøgelse. For at løse de uundgåelige ulemper ved medium ændring og organoidoverførsel i den tidlige fase optimerer den nuværende forskning driftsteknologien ved at anvende ingeniørprincippet. En blød lyslampe blev vedtaget til sideværts at belyse embryoidlegemet (EB) prøver, så EB'erne kunne ses med det blotte øje gennem den forbedrede diffuse refleksionseffekt. Ved hjælp af princippet om sekundær strømning genereret ved rotation samles organoiderne mod midten af brønden, hvilket letter driften af medium ændring eller organoidoverførsel. Sammenlignet med den dispergerede celle sætter den embryoide krop sig hurtigere i pipetten. Ved hjælp af dette fænomen kan de fleste af de frie celler og døde cellefragmenter fjernes effektivt på en enkel måde, hvilket forhindrer EB'er i at pådrage sig skader fra centrifugering. Denne undersøgelse letter driften af cerebral organoidkultur og hjælper med at fremme anvendelsen af hjerneorganoider.
Introduction
Sammenlignet med todimensionale (2D) kultursystemer har tredimensionelle (3D) kultursystemer flere fordele, herunder ægte replikation og effektiv reproduktion af komplekse strukturer af visse organer1. Derfor er cerebrale organoider en af de vigtige hjælpemetoder til forskningsområderne for menneskelig hjerneudvikling og sygdom2, lægemiddelscreening og celleterapi.
Dyrkning af cerebrale organoider ved den roterende suspensionsmetode er befordrende for deres udvikling og modning3. Selvom cerebrale organoidkultursystemer har opnået stor succes, står de stadig over for kritiske udfordringer, der begrænser deres anvendelse. For eksempel involverer manuel dyrkning komplicerede manipulationstrin og introducerer hindringer for at opnå store applikationer. Derudover er der på hvert udviklingsstadium i kulturen af cerebrale organoider behov for ændringer i forskellige medier og cytokiner4. I det tidlige stadium har organoiderne eller EB'erne imidlertid små størrelser (ca. 200 μm til 300 μm) og er næsten visuelt utilgængelige uden passende apparater. Uundgåeligt skylles en vis mængde dyrebare organoidprøver væk, når mediet ændres. Mange teknikker er blevet udforsket for at overvinde dette i andre former for organoidkulturer, og nogle eksempler inkluderer nedsænkning af hele organoidchips i et kulturmedium i 3 dage uden intervention5; tilsætning af et friskt medium gennem dækslippen, efter at det gamle medium er absorberet ved hjælp af absorberende papir5; eller anvendelse af komplekse mikrofluidiske rørledninger til væskeudveksling 6,7,8. En anden hindring, der opstår i den tidlige fase af organoiddyrkning, er vanskeligheden ved at opnå direkte observationer med det blotte øje, hvilket kan forårsage dårlige operationer, der fører til organoidskade og tab under organoidoverførselstrinnene. Derfor er det nødvendigt at etablere en mere gennemførlig protokol, der letter medium forandring og organoidoverførsel for at generere organoider.
En tilsvarende optimeret drift baseret på tekniske principper foreslås for at overvinde disse problemer, hvilket betydeligt og bekvemt letter mange organoidprocedurer. I naturen, når solen skinner ind i et hus gennem et vindueshul, kan det blotte øje se støvet danse i lysstrålen. På grund af den diffuse refleksion af sollys på støv brydes noget lys ind i øjeæblet for at producere et visuelt billede. Inspireret af princippet om dette fænomen 9,10 lavede denne undersøgelse en blød lyslampe og oplyste EB'erne sideværts. Det blev konstateret, at EB'er kunne være visuelt klare uden at påvirke visningsomfanget. En sekundær strømning, der peger mod midten, genereres i væsken ved at dreje kulturpladen på grund af hvirvelstrømme11. Oprindeligt spredte EB'er akkumuleres i midten af pladen. Baseret på dette og det fænomen, at organoidernes sedimentationshastighed er hurtigere end cellernes, foreslås en nem driftsmetode til mediumændring og organoidoverførsel uden centrifugering. Organoiderne i kulturmediet kan effektivt adskilles fra frie celler og døde cellefragmenter gennem denne overførselsoperation.
Her foreslås en protokol, der er let at betjene, for at generere cerebrale organoider fra humane pluripotente stamceller. Driftsteknologien blev optimeret ved at anvende ingeniørprincippet, hvilket gjorde operationer i 3D-kultur så enkle og gennemførlige som dem i 2D-kultur. Den forbedrede væskeudvekslingsmetode og organoidoverførselsoperation er også nyttige til andre typer organoidkultur og design af automatiske kulturmaskiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen blev gennemført efter Helsingfors-erklæringen. Godkendelse blev givet af den etiske komité for det tredje tilknyttede hospital i Guangzhou Medical University (medicinsk og etisk gennemgang [2021] nr. 022). Før eksperimentet blev hvert medium fremstillet i henhold til Juergen A. Knoblichs formel12 (supplerende tabeller 1-4), eller der blev anvendt et kommercielt tilgængeligt cerebralt organoidsæt (se materialetabel). De iPSC'er, der anvendes i denne undersøgelse, blev tidligere etableret af vores laboratorium og har opnået en informeret undtagelse. SCA3-iPSC'erne blev genereret fra en 31-årig kvindelig spinocerebellær ataksi type 3 (SCA3) patient genotypet som indeholdende 26/78 CAG-gentagelser i ATXN3-genet13 (supplerende figur 1A). De normale humane iPSC'er, der er nævnt i en tidligere artikel, blev valgt som NC-iPSC'er14, og ATXN3-genet blev identificeret som havende 14/14 CAG-gentagelser (supplerende figur 1B).
1. Fremstilling af inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er)
- Indsamle 3 ml perifert blod ved venipunktur med informeret samtykke fra frivillige og patienter.
- Mononukleære celler i perifert blod isoleres efter Ficoll-Paque-metoden15.
- Opret iPSC'er i henhold til protokollen for Sendai-omprogrammeringssættet (se Materialetabel).
- Kultur iPSC'erne med mTeSR1 medium i 35 mm petriskåle dækket med Matrigel (en kældermembranmatrix, se Materialetabel). Skift medie hver dag. iPSC-væksttætheden må ikke overstige 75%.
- Fordøje cellerne med PSC-dissociationsopløsning (se materialetabel) og subkulturere dem i et forhold på 1: 5 hver 3-5 dage.
FORSIGTIG: Sendai-virus bruges her. Det skal betjenes i biosikkerhedsskabet, og der skal træffes selvbeskyttelsesforanstaltninger. Det skal være klart, om det kan bruges lovligt i det lokale land. Lokale biosikkerhedslove og -regler skal følges nøje, når de anvendes.
2. EB-forberedelse (dag 0-1)
- Fjern mTeSR1-mediet fra iPSC'erne med en pipette, og vask det 2x med 1 ml 1x PBS.
- PBS'en fjernes med en pipette, og der tilsættes 300 μL celleafmonteringsopløsning (se Materialetabel) for at fordøje iPSC'erne i enkeltceller i 3-4 minutter ved 37 °C.
- Cellerne resuspenderes i 2 ml EB-dannelsesmedium (supplerende tabel 1), og prøven centrifugeres derefter i 5 minutter ved 300 x g (stuetemperatur).
- Forbehandle den specialiserede 24-brønds plade med anti-adhærens skylleopløsning (500 μL /brønd) i 5 minutter (se materialetabel).
BEMÆRK: Skylleopløsning mod overholdelse er afgørende for optimal DANNELSE AF EB og sfæroid. - Resuspend cellerne i EB-formationsmedium indeholdende Y-27632 (slutkoncentration, 10 μM, se materialetabel) med en celletæthed på 1,5 x 106 celler / ml.
- Fjern skyllevæsken mod vedhæftning, og skyl hver brønd med 2 ml EB-dannelsesmedium.
- Tilsæt cellerne til de specialiserede 24-brøndplader med en tæthed på 3 x 106 celler / brønd (figur 1A, venstre).
BEMÆRK: Normalt kan der fremstilles 300 EB'er i hver brønd. Denne metode kan forberede store mængder EB'er af samme størrelse. - Pladen centrifugeres ved 100 x g i 2 min ved stuetemperatur. Fordel cellerne ensartet i hvert kammer i bunden af pladen (figur 1A, højre).
BEMÆRK: Hvis der ikke er nogen passende centrifuge, kan pladen også placeres direkte i inkubatoren til statisk kultur, men EB-kuglens dannelsestid vil være flere timer senere end den under normal centrifugering. - Prøverne inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer. Hvis centrifugering ikke blev anvendt i det foregående trin, inkuberes i 36 timer. Hold prøven stabil, og tag den ikke ud af inkubatoren i denne periode.
3. Klargøring af soft light lampen (dag 1)
- Brug et gennemsigtigt akrylbræt med en tykkelse på 0,3-0,5 cm i størrelsen af A5-papir. Indsæt hvide puder på forsiden og bagsiden af akrylpladen.
- Installer en række hvide LED-lys på kanten af pladen, så lysene kan komme ind fra siden af akrylpladen, og skyd derefter parallelt ud (supplerende figur 2A-F, figur 1B).
BEMÆRK: Da EB'ernes diametre i det tidlige stadium er ca. 200 μm til 300 μm, er det vanskeligt at observere dem tydeligt med det blotte øje under lysstofrøret på rene bænke. På grund af forbedringen af diffus refleksion kan vi derimod registrere EB'erne tydeligt ved hjælp af sideværts oplyst blødt lys (figur 1B, C). En 6-brønds plade anbefales til EB-kulturer i efterfølgende forsøg. Men for bedre at vise den visuelle effekt af blødt lys, bruges retter undertiden til at tage billeder og videoer i denne undersøgelse i stedet for tallerkener, så misforstå ikke. Den sideværts oplyste bløde lyslampe kan også bruges til 6-brøndpladen.
- Installer en række hvide LED-lys på kanten af pladen, så lysene kan komme ind fra siden af akrylpladen, og skyd derefter parallelt ud (supplerende figur 2A-F, figur 1B).
4. EB-overførsel og medium udskiftning (dag 2-5)
- Forbered en ny 6-brønd lav vedhæftningsplade, og tilsæt 2 ml EB-formationsmedium til hver brønd.
- Fjern EB'erne sammen med mediet med en 1000 μL bredboret pipettespids (se Materialetabel), og overfør dem til 6-brønds lav vedhæftningspladen (~ 100 EB'er / brønd).
BEMÆRK: Driftsprocessen vedtager en blød lyslampe (nævnt i trin 3.) for at gøre EB'erne lettere at observere. Sluk for andre indendørs lyskilder for at få den visuelle effekt af det bløde lys bedre. - Udskift med det samme volumen frisk EB-formationsmedium hver dag. Brug det sekundære flow til at samle EB'erne til midten og ændre mediet.
- Opsuge det gamle medium ved at pipettere langsomt til kanten af brønden. Sut ikke for hårdt; Ellers vil EB'erne blive fjernet sammen. Tilsæt derefter frisk medium for at resuspend EB'erne.
BEMÆRK: Princippet sekundær strømning (figur 1D). Inducer en hvirvelstrøm ved at dreje skålen langs en cirkulær bane. På grund af hvirvelstrømmen induceres en sekundær strømning rettet mod midten. EB'erne eller organoiderne konvergerer til midten af brønden på grund af den sekundære strømning, der genereres gennem rotation, hvorefter mediumændring eller embryoidoverførsel let kan udføres.
- Opsuge det gamle medium ved at pipettere langsomt til kanten af brønden. Sut ikke for hårdt; Ellers vil EB'erne blive fjernet sammen. Tilsæt derefter frisk medium for at resuspend EB'erne.
5. Kontrol af pluripotens ved mærkning med pluripotensmarkør OCT4 (dag 4)
BEMÆRK: Når EB'ernes diameter er større end 300 μm, skal du tage flere EB'er til OCT4-markørimmunfluorescensfarvning for at detektere deres pluripotens.
- Eb'erne anbringes i 4 % paraformaldehyd ved 4 °C i 30 min, efterfulgt af vask i 1x PBS 3x i 10 minutter hver gang.
- EB'erne overføres til PBS ved stuetemperatur indeholdende 0,3 % Triton X-100 og 3 % BSA i 2 timer, efterfulgt af vask i PBS 3x i 10 minutter hver gang.
BEMÆRK: Efter behandling medTriton X-100 flyder EB'erne på væskeoverfladen og kan let suges væk med væsken under rengøring. Betjening under stereomikroskop anbefales. - Det primære OCT4-antistof (se materialetabel) fortyndes med 1 ml 1x PBS indeholdende 1 % BSA i forholdet 1:200, og der tilsættes til EB'erne til inkubation ved 4 °C natten over, hvorefter PBS vaskes i PBS 3x i 10 minutter hver gang.
- Fortynd det respektive sekundære antistof (se materialetabel) med 1x PBS ved 1:500 og tilsæt 1 ml til EB'erne.
- Efter inkubation ved stuetemperatur i 2 timer vaskes cellerne i 1x PBS 3x i 10 minutter hver gang.
- PBS fjernes, der tilsættes 2 ml 1x PBS-opløsning indeholdende 1 μg/ml DAPI, inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter, og der vaskes derefter PBS 3x i 10 minutter hver gang.
- Flyt EB indeholdende en lille mængde væske på diaset, forsegl diaset med et dækglas belagt med kommercielt tilgængelig vaselin (se Materialetabel) på kanten, og observer og saml derefter billedet under fluorescenskonfokalmikroskopet.
BEMÆRK: OCT4-udtryk repræsenterer EB-pluripotens12. Når OCT4-ekspressionen er mindre end 90 %, skal EB'erne kasseres, og EB'erne skal forberedes igen.
6. Neural induktion (dag 5-7)
- Forbered en ny 6-brønds plade med lav vedhæftning, og tilsæt 3 ml neuralt induktionsmedium (supplerende tabel 2) til hver brønd.
- Tænd det laterale bløde lys (nævnt i trin 3.), og sluk for andre indendørs lyskilder.
- Overfør EB'erne til 6-brøndpladen med tilsat neuralt induktionsmedium (~ 100 EB'er / brønd). Tilføj så lidt som muligt af det originale medium til den nye brønd.
BEMÆRK: Indfør enkle færdigheder iorganoid overførsel. Under tyngdekraften og med en relativt højere densitet end mediet vil de resuspenderede EB'er naturligvis gradvist synke ved at anvende operationen vist i figur 1E. Derfor kan EB'erne bekvemt overføres. Da frie celler og døde cellefragmenter synker langsommere sammenlignet med EB'er, kan de fleste frie celler og døde cellefragmenter således fjernes gennem denne sedimenteringsmetode (figur 1F). - Prøverne inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
BEMÆRK: Under mikroskopet var EB'ernes diameter ca. 500 μm, og kanten var gennemskinnelig, hvilket indikerer, at der dannedes et neuroepitellag. - Fortsæt til næste trin.
7. Indlejring i kældermembranmatrixen (dag 7-10)
- Anbring membranmatrixen i et køleskab på 4 °C i 60 minutter i forvejen for at opløse den. Beregn mængden af den krævede matrix på forhånd. Ca. 100 EB'er blev indlejret i 1,5 ml af membranmatrixen.
- Tænd for det laterale bløde lys, og sluk lyskilden øverst på konsollen.
- Hold membranmatrixen på is for at forhindre størkning.
- Overfør en lille mængde EB'er til en 60 mm skål indeholdende frisk ekspansionsmedium (supplerende tabel 3) hver gang. Reducer antallet af EB'er for at gøre det lettere at fjerne en enkelt EB.
- Brug derefter en ny 6-brønds lav vedhæftningsplade. Sug en enkelt EB (indeholdende ca. 10 μL medium) med en 200 μL bredboret pipettespids (se Materialetabel) hver gang, og tilsæt den derefter til bunden af pladen med 6 brønde for at lave dråber. Brug fem dråber pr. Brønd.
BEMÆRK: Nøglen er at justere pipettepistolens rækkevidde til 50 μL og suge en EB og derefter henvise til betjeningen af figur 1E. Når EB sætter sig til pipettespidsens boring, rører spidsen hurtigt brøndbunden af pladen og skubber ca. 10 μL væske ud for at danne en dråbe. - Der tilsættes 15 μL af membranmatrixen til hver dråbe indeholdende EB, og den blandes hurtigt. Integrer EB-bolden i midten af dråben.
BEMÆRK: EB'er må ikke aspireres med en standard pipettespids, som beskadiger EB. Pipettespidsen med 200 μL bred boring skal anvendes i stedet. - Anbring 6-brøndpladen i en 37 ° C inkubator i 30 minutter, og størk membranmatrixdråberne indeholdende EB'er.
- Tilsæt 3 ml ekspansionsmedium til hver brønd, og spræng forsigtigt de matrixindlejrede EB'er op for at suspendere dem.
- Der inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 3 dage.
BEMÆRK: Hvis der observeres spirende på overfladen af EB, betyder det, at der er dannet et ekspanderet neuroepitel16.
8. Organoid modning (dag 10-40)
- Fjern forsigtigt det originale medium, og tilsæt 3 ml modningsmedium (supplerende tabel 4) til hver brønd.
- Organoidpladen anbringes på en vandret ryster i en 37 °C inkubator.
- Fortsæt med at rotere kulturen vandret. Indstil rysteren til den passende hastighed.
BEMÆRK: Ved dyrkning af cerebrale organoider på en 6-brønds plade er en relativ centrifugalkraft (RCF) på 0,11808 x g mere passende ifølge producenten af den vandrette ryster (se Materialetabel). I henhold til konverteringen mellem den relative centrifugalkraft og rotationshastigheden17,18 er RCF = 1,118 x 10-5 × R × omdr./min. 2, hvor RCF = relativ centrifugalkraft (g), rpm = omdrejninger pr. minut (r/min) og R = rotationsradius (cm), også kendt som rystekast. Rystekastparametrene for forskellige rystere kan være forskellige. Derfor kan det anslås, at rotationshastigheden er rpm = 299 x (RCF/R)1/2. - Skift det friske modningsmedium hver 2-3 dage.
- Efter 20-30 dage skal du gradvist dyrke cerebrale organoider til modenhed.
BEMÆRK: I denne periode kan organoider bruges til eksperimenter og detektion, såsom neural markørdetektion og transkriptomsekventering 19,20,21.
9. Frosne sektioner og immunfluorescens af cerebrale organoider
- Organoiderne anbringes i 4 % paraformaldehyd ved 4 °C i 16 timer, og de vaskes derefter 3x med 1x PBS i 10 minutter hver gang.
- PBS fjernes, og organoiderne nedsænkes i 30 % saccharose ved 4 °C natten over.
- Organoiderne anbringes i 10%/7,5% gelatine/saccharose ved 37 °C i 1 time, og de overføres derefter hurtigt til indlejringsformen.
- Tilsæt tøris til 100% ethanol for at forberede en tøris / ethanolopslæmning, og læg organoidprøverne i den for hurtig frysning.
- Opbevar de frosne prøver i en -80 °C fryser. Lav om nødvendigt frosne sektioner med en tykkelse på 20 μm.
- Se trin 5.3.-5.5. til immunfluorescens. Brug PAX6-antistoffet til at mærke apikale stamceller, TUJ1-antistoffet (se materialetabel) til at mærke neuronale celler 22,23,24 og DAPI til nuklear DNA-farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den foreliggende undersøgelse inducerede iPSC'er (figur 2B) i cerebrale organoider (figur 2C). De EB'er, der blev dyrket i den tidlige fase, udtrykte OCT4-markøren (figur 2A), som indikerede god pluripotens. I den senere fase udviklede EB'erne sig til modne cerebrale organoider (figur 2D). Forskningen dyrkede iPSC'er fra normale raske individer og SCA3-patienter til cerebrale organoider (figur 3A). SCA3, også kendt som Machado-Joseph sygdom (MJD), er en neurodegenerativ lidelse forårsaget af en polyglutaminudvidelse i ATXN3-genet25. RNA-seq-dataene (uploadet til et offentligt lager, se Materialetabel) afslørede signifikante forskelle i genekspressionsprofiler mellem den normale cerebrale organoidgruppe og SCA3-cerebral organoidgruppen i veje såsom neurotransmittertransport, synapsedannelse og regulering (figur 3B). Cufflinks software blev brugt til at beregne genekspressionsniveauet og forskellen26. DEseq2 blev yderligere brugt til at analysere dataene27.
Figur 1: Optimerede medium ændrings- og overførselsoperationer af EB'er. (A) EB-forberedelse. IPSC'erne blev fordøjet og tilføjet til de specialiserede 24-brøndplader (venstre). Cellerne dannede EB'er (højre). Skalabjælken er 400 μm. (B) Skematisk diagram over sideværts belyst blødt lys for at hjælpe med at observere organoider. (C) EB'erne blev observeret med forskellige lyskilder. Gul pil: sideværts oplyst lys; rød pil: mørk baggrund; grønne pile: EB'er. (D) En hvirvelstrøm induceres ved at rotere skålen langs en cirkulær bane. På grund af hvirvelstrømmen induceres en sekundær strømning rettet mod midten. EB'erne konvergerer til midten af skålen drevet af den sekundære strømning, der genereres gennem rotation. Hvide pile: EB'er. (E) Organoid overførsel. (I) For det første anvendes en bredmundet pipettespids til at suge blandingsopløsningen op, herunder både EB'erne og kulturmediet. (II) Derefter synker EB'erne gradvist under tyngdekraftseffekten og konvergerer mod pipettespidsens munding, mens pipetten holdes oprejst. (III) Når pipettespidsens munding rører ved den flydende (normalt den friske medium) overflade igen, og på grund af væskeoverfladespænding, (IV) synker EB'erne hurtigt ned i mediet (intet behov for yderligere udblæsning ved pipettering manuelt). Rød linje: væskeniveauet; gule pile: EB'er. (F) Da frie celler og døde cellefragmenter synker langsommere end EB'er, kan de fleste frie celler og døde cellefragmenter således fjernes gennem ovennævnte sedimenteringsmetode for at lette embryoidoverførsel. Den røde boks i øverste højre hjørne er et forstørret billede. Skalabjælken er 400 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Induktion af iPSC'er i cerebrale organoider. (A) Immunofluorescensfarvning af EB'er. OCT4: octamerbindende transkriptionsfaktor-4; DAPI: DAPI dihydrochlorid. Skalalinjen er 100 μm. (B) iPSC'er. Skalabjælken er 400 μm. (C) Cerebrale organoider. Skalabjælken er 200 μm. (D) Immunofluorescensfarvning af cerebrale organoider. PAX6: parret boks 6 er markøren for apikale stamceller; TUJ1: neuronspecifik klasse III β-tubulin er en neuronspecifik markør. Skalabjælken er 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dyrkning af iPSC'er fra raske individer og SCA3-patienter til cerebrale organoider. (A) Forskellige stadier, der dækker modning af cerebrale organoider startende fra EB'er. NC: normal gruppe; SCA3: SCA3/MJD-gruppen. Skalabjælker af billeder med lav og høj forstørrelse er henholdsvis 400 μm og 200 μm. (B) GO-berigelsesanalysediagram over nedregulerede, differentielt udtrykte gener mellem normale organoider og SCA3-organoider. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Identifikation af ATXN3 CAG-gentagelser ved kapillær elektroforese. (A) SCA3-patientens iPSC (SCA3-iPSC) blev identificeret som havende 26/78 CAG-gentagelser i ATXN3-genet. (B) Den normale humane iPSC (NC-iPSC) blev identificeret som havende 14/14 CAG-gentagelser i ATXN3-genet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Klargøring af soft light lampen. (A) Strømforsyningen og LED-lysene blev installeret på den ene side af akrylpladen (som vist i den røde stiplede boks). LED-soft light lampens spredningsbølgelængde er 450-470 nm, lysstrømmen er 1300-1800 lm, og farvegengivelsesindekset er 75-85 Ra. (B) Det blev kontrolleret, om LED-pærerne kunne lyse normalt (som vist i den røde stiplede boks). (C) En hvid pude blev klistret på forsiden og bagsiden af akrylpladen (som angivet med de røde pile). (D) Den bløde lyslampes overordnede udseende. (E) Den bløde lyslampe kan også erstattes af en kommerciel LED-malelyspude uden ramme, som normalt bruges til sporing ved kopiering af skitser. Et lag hvid film skal indsættes direkte over LED-malingslyspuden. (F) Den bløde lyslampe på arbejde. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Eb-formationsmediets sammensætning. I den indledende fase af EB-dannelsen (generelt de første 2 dage) skal Y-27632 (50 μM) og bFGF (4 ng / ml) føjes til EB-formationsmediet. Mediet skal filtreres med en 0,2 μm filterenhed og opbevares ved −20 °C. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 2: Sammensætning af det neurale induktionsmedium. Mediet skal filtreres med en 0,2 μm filterenhed og opbevares ved −20 °C. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 3: Udvidelsesmediets sammensætning. En 1:100 fortynding af 2-Mercaptoethanol blev fremstillet i DMEM-F12, og 87,5 μL af dette blev tilsat til ekspansionsmediet. B27 må ikke indeholde vitamin A. Mediet skal filtreres med en 0,2 μm filterenhed og opbevares ved −20 °C. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 4: Modningsmediets sammensætning. En 1:100 fortynding af 2-Mercaptoethanol i DMEM-F12 blev fremstillet, og 87,5 μL af denne blev tilsat til modningsmediet. B27 må ikke indeholde vitamin A. Mediet skal filtreres med en 0,2 μm filterenhed og opbevares ved −20 °C. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cerebrale organoider åbner nye veje til medicinsk forskning. Mange nyttige anvendelser af denne teknologi er kun begyndt at blive udforsket28. Denne forskning viste, at transkriptomsekventeringsresultaterne af genetisk syge cerebrale organoider og normale cerebrale organoider kan afspejle forskellene mellem sygdom og sundhed. For eksempel er RNA-seq-dataanalyseresultaterne (figur 3B) i overensstemmelse med mange rapporterede undersøgelser af SCA3-sygdomme 29,30,31,32. Eksperimentelle operationer, såsom medium ændring, EB-overførsel og indpakning, er afgørende for dyrkning af cerebrale organoider og bestemmelse af, om organoider med god ensartethed kan fremstilles33,34. I denne undersøgelse introduceres en cerebral organoidprotokol, der lettede medium forandring og organoidoverførsel. En lateral blød lyslampe kan i høj grad hjælpe med driften af organoidkultur. Det er dog ikke svært at lave, LED-malingslyspuden og enkel behandling kan også erstatte den. Den enkle væskeudvekslingsmetode og organoidoverførselsoperation gør hele kulturprocessen lettere. Anvendelsen af cerebrale organoider påvirkes ofte af problemet med dårlig ensartethed35. Den største forskel mellem denne undersøgelse og andre retningslinjer for cerebral organoidkultur er, at fokus er på at optimere operationen for at gøre eksperimentet mere gentageligt.
Det er meget vigtigt at opretholde kultursystemets stabilitet. Hvis forholdene tillader det, foreslås det at prioritere det kommercielle cerebrale organoidmedium, som effektivt kan reducere de store forskelle i eksperimentelle resultater i forskellige partier på grund af mediets ustabilitet. Derudover bør cerebral organoid medium opbevaring ved 4 ° C ikke vare mere end 2 uger; ellers vil det påvirke kultursystemets stabilitet. Det er naturligvis også vigtigt at sikre, at de anvendte iPSC'er er pluripotente snarere end differentierede. OCT4 immunofluorescensdetektion kan anvendes. Hvis OCT4-positive celler er mindre end 90%, anbefales det at erstatte dem med iPSC'er af højere kvalitet og dyrke cerebrale organoider igen.
Der er nogle begrænsninger i den cerebrale organoidkulturteknologi, der introduceres i denne undersøgelse. For eksempel kan cerebrale organoider ikke dyrkes intensivt i det senere udviklingsstadium, hvilket er spild af kulturrum. Dette er også et presserende problem, der skal løses ved anvendelse af cerebrale organoider. Hvis mange cerebrale organoider udviser hul ekspansion, reduceres antallet af organoider i hver brønd, mediumudvekslingsfrekvensen øges, og organoiderne er i en ikke-hypoxisk tilstand med tilstrækkelige næringsstoffer.
Denne undersøgelse er et operationelt supplement til mange eksisterende cerebrale organoidkulturmetoder 12,36,37 og endda andre typer organkulturmetoder 38,39. Dette vil bidrage til at udvikle automatiserede organoidkultursystemer i fremtiden og fremme forskning og anvendelse af organoider. Hvis teknologien til forbedring af organoidernes lysdiffusive refleksionseffekt anvendes i det automatiske intelligente dyrkningssystem, kan det teoretisk erstatte højpræcisionskameraet til billedforstærkning, og kun en almindelig billedgenkendelsesenhed skal installeres. Derudover er medium udveksling og organoidoverførsel gennem sekundær strømning genereret ved rotation og naturlig sedimentering på sugehovedet teoretisk mere gennemførlig end centrifugering i fremtidigt automatisk kulturudstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2020A0505100062), Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (Grant No. 201904020025), National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31872800, 32070582, 82101937) og Guangzhou City Postdoctoral Research Grant-projektet (til Bangzhu Chen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7.1 (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W.
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L.
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, Pt 11 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B.
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
