Summary
脑类器官为研究器官发育和人类疾病病理学提供了前所未有的机会。虽然脑类器官培养系统取得了巨大成功，但在应用这项技术方面仍然存在操作困难。本方案描述了一种促进介质改变和类器官转移的脑类器官程序。
Abstract
目前，脑类器官培养技术操作仍复杂，难以大规模应用。有必要找到一个简单而实用的解决方案。因此，本研究提出了一种更可行的脑类器官方案。为了解决早期介质变化和类器官转移中不可避免的不便，目前的研究通过应用工程原理优化了操作技术。采用柔和的光灯横向照亮胚体（EB）样品，通过增强的漫反射效果，肉眼可以看到EB。利用旋转产生的二次流动原理，类器官向孔中心聚集，这有利于介质变化或类器官转移的操作。与分散的细胞相比，胚状体在移液器中沉降得更快。利用这种现象，可以以简单的方式有效地去除大多数游离细胞和死细胞碎片，防止EB因离心而受到损害。本研究促进脑类器官培养的操作，并有助于促进脑类器官的应用。
Introduction
与二维（2D）培养系统相比，三维（3D）培养系统具有几个优点，包括某些器官的复杂结构的真实复制和有效复制1。因此，脑类器官是人脑发育与疾病2、药物筛选、细胞治疗等研究领域的重要辅助方法之一。
通过旋转悬浮法培养脑类器官有利于它们的发育和成熟3.虽然大脑类器官培养系统取得了巨大的成功，但它们仍然面临着限制其应用的关键挑战。例如，手工栽培涉及复杂的操作步骤，并给实现大规模应用带来了障碍。此外，在脑类器官培养的每个发育阶段，需要改变不同的培养基和细胞因子4.然而，在早期阶段，类器官或EB具有微小的尺寸（约200μm至300μm），并且在没有适当的设备的情况下几乎无法在视觉上进入。不可避免地，当介质发生变化时，一定量的珍贵类器官样品被冲走。已经探索了许多技术来克服其他类型的类器官培养物中的这一点，一些例子包括将整个类器官芯片浸入培养基中3天而不进行干预5;在旧介质被吸收后，使用吸水纸5通过盖玻片添加新鲜介质;或应用复杂的微流体管道进行流体交换6，7，8。在类器官培养的早期阶段遇到的另一个障碍是难以用肉眼进行直接观察，这可能导致操作不良，导致类器官移植步骤中的类器官损伤和丢失。因此，有必要建立一个更可行的方案，促进介质变化和类器官转移以产生类器官。
为了克服这些问题，提出了一种基于工程原理的相应优化操作，这显着且方便地促进了许多类器官手术。在自然界中，当太阳透过窗户缝隙照射到房屋中时，肉眼可以看到光束中舞动的灰尘。由于太阳光对尘埃的漫反射，一些光线被折射到眼球中以产生视觉图像。受9，10现象原理的启发，本研究制作了柔和的光灯并横向照亮了EB。研究发现，EB可以在不影响观察范围的情况下在视觉上清晰可见。由于涡流11，通过旋转培养板在液体中产生指向中心的二次流。原本分散的EB积聚在板的中心。基于此，针对类器官沉降速度快于细胞的现象，提出一种无需离心即可进行介质更换和类器官转移的简便操作方法。通过这种转移操作，培养基中的类器官可以有效地与游离细胞和死细胞碎片分离。
这里提出了一种易于操作的方案，从人多能干细胞中产生脑类器官。通过应用工程原理优化操作技术，使3D文化中的操作与2D文化中的操作一样简单可行。改进的液体交换方法和类器官转移操作也有助于其他类型的类器官培养和自动培养机的设计。
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Protocol
该议定书是在《赫尔辛基宣言》之后进行的。经广州医科大学第三附属医院伦理委员会批准（医德伦理审查[2021]022号）。在实验之前，每种培养基都是根据Juergen A. Knoblich的配方12 （补充表1-4）制备的，或者使用市售的脑类器官试剂盒（见 材料表）。本研究中使用的iPSC先前由我们的实验室建立，并已获得知情豁免。SCA3-iPSCs由一名31岁的女性脊髓小脑共济失调3型（SCA3）患者产生，该患者基因型为ATXN3基因13 中含有26/78 CAG重复序列（补充图1A）。上一篇文章中提到的正常人iPSC被选为NC-iPSCs14，并且ATXN3基因被鉴定为具有14/14个CAG重复序列（补充图1B）。
1. 诱导多能干细胞（iPSCs）的制备
- 在志愿者和患者知情同意的情况下，通过静脉穿刺收集3 mL外周血。
- 根据菲科尔-帕克方法15分离外周血单核细胞。
- 根据仙台重编程套件的协议建立 iPSC（参见 材料表）。
- 用mTeSR1培养基将iPSC培养在覆盖有基质胶（基底膜基质，参见 材料表）的35mm培养皿中。每天更换培养基。iPSC生长密度不得超过75%。
- 用PSC解离溶液消化细胞（参见 材料表），并以每3-5天1：5的比例传代培养它们。
注意：这里使用仙台病毒。它必须在生物安全柜中操作，并且必须采取自我保护措施。应该清楚它是否可以在当地合法使用。使用时必须严格遵守当地生物安全法律法规。
2. EB 准备（第 0-1 天）
- 用移液管从 iPSC 中取出 mTeSR1 培养基，并用 1 mL 1x PBS 洗涤 2 倍。
- 用移液管取出PBS，并加入300μL细胞分离溶液（参见 材料表）以在37°C下将iPSC消化到单个细胞中3-4分钟。
- 将细胞重悬于2mLEB形成培养基中（补充表1），然后在300× g （室温）下将样品离心5分钟。
- 用抗粘附冲洗液（500μL /孔）预处理专用的24孔板5分钟（参见 材料表）。
注意：抗粘附漂洗液对于最佳的EB和球状体形成至关重要。 - 将细胞重悬于含有Y-27632（终浓度，10μM，参见 材料表）的EB形成培养基中，细胞密度为1.5×106 个细胞/ mL。
- 取出抗粘附冲洗液，并用2 mL EB形成培养基冲洗每个孔。
- 将细胞以3×106 个细胞/孔的密度加入专门的24孔板中（图1A，左）。
注意：通常，每个孔中可以制备300个EB。该方法可以制备大量相同大小的EB。 - 在室温下以100× g 离心板2分钟。将细胞均匀分布在板底部的每个腔室中（图1A，右）。
注意：如果没有合适的离心机，也可以将板直接放入培养箱中进行静态培养，但EB球的形成时间将比正常离心下晚几个小时。 - 将样品在37°C和5%CO2 下孵育24小时。如果在上一步中未使用离心，则孵育36小时。保持样品稳定，在此期间不要将其带出培养箱。
3. 柔光灯的准备（第1天）
- 使用厚度为0.3-0.5厘米的透明亚克力板，尺寸为A5纸。将白色垫贴在亚克力板的正面和背面。
- 在板的边缘安装一排LED白光灯，使灯可以从亚克力板的侧面进入，然后平行射出（补充图2A-F，图1B）。
注意：由于早期阶段EB的直径约为200μm至300μm，因此很难在洁净长凳的荧光灯下用肉眼清楚地观察到它们。相比之下，由于漫反射的增强，我们可以通过使用横向照明的柔光清楚地检测EB（图1B，C）。在随后的实验中，建议使用6孔板进行EB培养。但是，为了更好地展示柔光的视觉效果，本研究中有时使用盘子代替盘子来拍照和录像，所以请不要误解。侧照柔光灯也可用于6孔板。
- 在板的边缘安装一排LED白光灯，使灯可以从亚克力板的侧面进入，然后平行射出（补充图2A-F，图1B）。
4. EB 转移和介质更换（第 2-5 天）
- 准备一个新的6孔低粘附板，并向每个孔中加入2 mL EB形成培养基。
- 用1000μL宽孔移液器吸头（参见 材料表）将EB与培养基一起除去，并将其转移到6孔低粘附板（〜100 EBs /孔）。
注：操作过程采用柔光灯（步骤3中提到），使EB更易于观察。关闭其他室内光源，以获得更好的柔光的视觉效果。 - 每天用相同体积的新鲜EB形成培养基替换。使用辅助流将EB收集到中心并更换介质。
- 通过缓慢移液到孔的边缘来吸出旧培养基。不要吸吮太用力;否则，这些 EB 将一起删除。然后，加入新的培养基以重悬EB。
注：原理二次流（图1D）。通过沿圆形轨道旋转培养皿来诱导涡流。由于涡流，二次流被诱导到中心。由于通过旋转产生的次级流动，EBs或类器官会聚到孔的中心，之后可以很容易地进行介质变化或胚状转移。
- 通过缓慢移液到孔的边缘来吸出旧培养基。不要吸吮太用力;否则，这些 EB 将一起删除。然后，加入新的培养基以重悬EB。
5. 通过用多能性标记物OCT4标记来检查多能性（第4天）
注意：当EB的直径大于300μm时，取几个EB进行OCT4标记免疫荧光染色以检测其多能性。
- 将EB固定在4%多聚甲醛中，在4°C下30分钟，然后每次在1x PBS 3x中洗涤10分钟。
- 将EB转移到含有0.3%曲拉第X-100和3%BSA的室温PBS中2小时，然后每次在PBS 3x中洗涤10分钟。
注意：使用Triton X-100处理后，EBs漂浮在液体表面上，在清洁过程中可以很容易地与液体一起吸走。建议在立体显微镜下操作。 - 用1mL含有1%BSA的1x PBS以1：200的比例稀释OCT4一抗（参见 材料表），并加入EBs中在4°C下孵育过夜，然后每次在PBS中洗涤10分钟。
- 在1：500下用1x PBS稀释相应的二抗（参见 材料表），并向EB中加入1 mL。
- 在室温下孵育2小时后，每次以1x PBS 3x洗涤细胞10分钟。
- 取出PBS，加入2mL含有1μg/ mL DAPI的1x PBS溶液，在室温下孵育10分钟，然后每次在PBS中洗涤3x10分钟。
- 将含有少量液体的EB移动到载玻片上，用涂有市售凡士林的盖玻片密封载玻片（参见 材料表），然后在荧光共聚焦显微镜下观察并收集图像。
注意：OCT4 表达式表示 EB 多能性12。当 OCT4 的表达式小于 90% 时，应丢弃 EB，并再次准备 EB。
6. 神经诱导（第5-7天）
- 制备具有低粘附力的新6孔板，并向每个孔中加入3mL神经诱导培养基（补充表2）。
- 打开横向柔光（在步骤 3 中提到）并关闭其他室内光源。
- 将EB转移到6孔板中，并添加神经诱导介质（〜100 EB /孔）。尽可能少地将原始培养基添加到新井中。
注意：介绍一下类有机体转移的简单技能。当然，在重力作用下，密度相对高于介质，重悬的EB将通过应用 图1E所示的操作逐渐下沉。因此，可以方便地转移EB。由于与EBs相比，游离细胞和死细胞碎片的下沉速度较慢，因此可以通过这种沉淀方法去除大多数游离细胞和死细胞碎片（图1F）。 - 将样品在37°C和5%CO2 下孵育24小时。
注意：在显微镜下，EBs的直径约为500μm，边缘是半透明的，表明形成了神经上皮层。 - 继续执行下一步。
7.嵌入基底膜基质（第7-10天）
- 将膜基质提前在4°C冰箱中放置60分钟以溶解。提前计算所需矩阵的数量。大约100个EB被包埋在1.5 mL的膜基质中。
- 打开横向柔光灯，然后关闭主机顶部的光源。
- 将膜基质保持在冰上以防止凝固。
- 每次将少量EB转移到含有新鲜膨胀培养基的60毫米培养皿中（补充表3）。减少 EB 的数量，以便更轻松地删除单个 EB。
- 然后，使用新的6孔低粘附板。每次用200μL宽口径移液器吸头（参见 材料表）吸入单个EB（含有约10μL培养基），然后将其添加到6孔板的底部以产生液滴。每孔使用五个液滴。
注意：关键是将移液枪的范围调整到50μL并吸出EB，然后参考 图1E的操作。当 EB 沉降到移液器吸头的孔口时，吸头迅速接触板的孔底部，并推出约 10 μL 液体以形成液滴。 - 将15μL膜基质加入含有EB的每滴中，并快速混合。将 EB 球嵌入液滴的中心。
注意：EB 不得使用标准移液器吸头吸出，否则会损坏 EB。需要改用 200 μL 宽孔移液器吸头。 - 将6孔板放入37°C培养箱中30分钟，并固化含有EB的膜基质液滴。
- 向每个孔中加入3 mL膨胀培养基，并轻轻吹起基质嵌入的EB以悬浮它们。
- 在37°C和5%CO2 下孵育3天。
注意：如果观察到EB表面的萌芽，则意味着已经形成了扩展的神经上皮16。
8. 类器官成熟（第10-40天）
- 轻轻取出原始培养基，并向每个孔中加入3mL成熟培养基（补充表4）。
- 将类器官板放在37°C培养箱中的水平振荡器上。
- 继续水平旋转区域性。将摇床设置为适当的速度。
注意：根据水平振荡器的制造商的说法，在6孔板上培养脑类器官时，相对离心力（RCF）为0.11808 x g 更合适（见 材料表）。根据相对离心力与转速17，18之间的换算， RCF = 1.118 x 10−5 × R × rpm2，其中 RCF =相对离心力（g）， rpm =每分钟转数（r /min）， R =旋转半径（cm），也称为振动抛掷。不同摇床的晃动投掷参数可能不同。因此，可以估计转速为 rpm = 299 x （RCF/R）1/2。 - 每2-3天更换一次新鲜成熟培养基。
- 20-30天后，逐渐培养大脑类器官至成熟。
注意：在此期间，类器官可用于实验和检测，例如神经标志物检测和转录组测序19，20，21。
9. 脑类器官的冷冻切片和免疫荧光
- 将类器官固定在4%多聚甲醛中，在4°C下16小时，然后每次用1x PBS洗涤3x，每次10分钟。
- 除去PBS，并将类器官浸入4°C的30%蔗糖中过夜。
- 将类器官在37°C下嵌入10%/ 7.5%明胶/蔗糖中1小时，然后快速将其转移到包埋模具中。
- 将干冰加入100%乙醇中，制备干冰/乙醇浆料，并将类器官样品放入其中快速冷冻。
- 将冷冻样品储存在−80°C冰箱中。需要时，制作厚度为20μm的冷冻切片。
- 请参阅步骤 5.3.-5.5。用于免疫荧光。使用PAX6抗体标记顶端祖细胞，使用TUJ1抗体（见 材料表）标记神经元细胞22，23，24和DAPI进行核DNA染色。
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Representative Results
本研究诱导iPSCs（图2B）进入脑类器官（图2C）。早期培养的EB表示OCT4标记（图2A），表明良好的多能性。在后期阶段，EBs发育成成熟的脑类器官（图2D）。该研究将iPSC从正常健康个体和SCA3患者培养成脑类器官（图3A）。SCA3，也称为马查多- 约瑟夫病（MJD），是由ATXN3基因25中的聚谷氨酰胺扩增引起的神经退行性疾病。RNA-seq数据（上传到公共存储库，见 材料表）显示，正常脑类器官组和SCA3-脑类器官组在神经递质转运、突触形成和调节等途径上的基因表达谱存在显着差异（图3B）。使用袖扣软件计算基因表达水平和差异26。DEseq2被进一步用于分析数据27。
图 1：优化的 EB 介质更换和传输操作。iPSCs被消化并添加到专门的24孔板中（左）。细胞形成EB（右）。比例尺为400μm（B）横向照明的柔光示意图，以帮助观察类器官。（C）用不同的光源观察EB。黄色箭头：横向照明的光;红色箭头：深色背景;绿色箭头：EB。（D）通过沿圆形轨道旋转碟形物来诱导涡流。由于涡流，会感应到指向中心的二次流。EB在旋转产生的次级流动的驱动下收敛到碟形的中心。白色箭头：EB。（E） 类器官移植。（I）首先，使用宽口移液器吸头来吸收混合溶液，包括EB和培养基。（II）然后，在保持移液器直立的同时，EBs在重力作用下逐渐下沉并收敛到移液器尖端的口。（III）当移液器吸头的口再次接触液体（通常是新鲜介质）表面时，并且由于液体表面张力，（IV）EBs迅速沉入介质中（无需手动移液额外吹出）。红线：液位;黄色箭头：EB。（F）由于游离细胞和死细胞片段的下沉速度比EBs慢，因此可以通过上述沉淀方法去除大部分游离细胞和死细胞片段，以利于胚芽转移。右上角的红色框是放大的图像。比例尺为400 μm，请点击此处查看此图的大图。
图2：将iPSC诱导到脑类器官中。 （A）EBs的免疫荧光染色。OCT4：八聚体结合转录因子-4;滴氮：二盐酸盐。比例尺为 100 μm. （B） iPSC。比例尺是400μm.（C）脑类器官。比例尺为200μm（D）脑类器官的免疫荧光染色。PAX6：配对盒6是顶端祖细胞的标记;TUJ1：神经元特异性III类β-微管蛋白是一种神经元特异性标志物。比例尺为50 μm， 请点击此处查看此图的大图。
图3：将iPSCs从健康个体和SCA3患者培养成脑类器官。 （A）涵盖从EBs开始的脑类器官成熟的不同阶段。NC：正常组;SCA3：SCA3/美日病组。低放大倍率和高放大率图像的比例尺分别为 400 μm 和 200 μm。（B）正常类器官和SCA3类器官之间下调、差异表达基因的GO富集分析图。 请点击此处查看此图的大图。
补充图1：通过毛细管电泳鉴定ATXN3 CAG重复序列。 （A）SCA3患者iPSC（SCA3-iPSC）被鉴定为在ATXN3基因中具有26/78个CAG重复序列。（B）正常人iPSC（NC-iPSC）被鉴定为在ATXN3基因中具有14/14个CAG重复序列。 请按此下载此档案。
补充图2：柔光灯的制备。 （A）电源和LED灯安装在亚克力板的一侧（如红色虚线框所示）。LED柔光灯的散射波长为450-470nm，光通量为1300-1800 lm，显色指数为75-85 Ra。（C）将白色垫粘贴在丙烯酸板的正面和背面（如红色箭头所示）。（四）柔光灯的整体外观。（五）柔光灯也可以用不带边框的商用LED涂装灯垫代替，通常用于抄写草图时的跟踪。需要将一层白色薄膜粘贴在LED涂装光垫的正上方。（六）工作中的柔光灯。请按此下载此档案。
补充表1：EB形成介质的组成。 在EB形成的初始阶段（通常是前2天），需要将Y-27632（50μM）和bFGF（4ng / mL）添加到EB形成培养基中。介质需要用0.2μm过滤装置过滤并储存在−20° C。
补充表2：神经诱导介质的组成。 介质需要用0.2μm过滤装置过滤并储存在−20° C。
附表3：膨胀介质的组成。 在DMEM-F12中制备1：100稀释的2-巯基乙醇，并将87.5μL加入到膨胀培养基中。B27不得含有维生素A。介质需要用0.2μm过滤装置过滤并储存在−20° C。
附表4：成熟培养基的组成。 制备DMEM-F12中2-巯基乙醇的1∶100稀释液，并将其87.5μL加入到成熟培养基中。B27不得含有维生素A。介质需要用0.2μm过滤装置过滤并储存在−20° C。
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Discussion
大脑类器官为医学研究开辟了新的途径。该技术的许多有用应用才刚刚开始探索28.本研究发现，遗传性疾病性脑类器官与正常脑类器官的转录组测序结果可以反映疾病与健康之间的差异。例如，RNA-seq数据分析结果（图3B）与许多报道的SCA3疾病29，30，31，32的研究一致。实验操作，如介质变化，EB转移和包装，对于培养大脑类器官和确定是否可以制备具有良好均匀性的类器官至关重要33，34。在这项研究中，引入了一种促进培养基改变和类器官转移的脑类器官方案。侧向柔光灯可以极大地帮助类器官培养的操作。但是，制作起来并不难，LED涂装光垫和简单的加工也可以替代它。简单的液体交换方法和类器官转移操作使整个培养过程更容易。脑类器官的应用经常受到均匀性差问题的影响35.这项研究与其他大脑类器官培养指南之间的最大区别在于，重点是优化操作以使实验更具可重复性。
保持养殖系统的稳定性非常重要。如果条件允许，建议优先考虑商用脑类器官培养基，这可以有效减少由于培养基的不稳定性而导致不同批次实验结果的巨大差异。此外，脑类器官培养基在4°C下储存不应超过2周;否则，会影响养殖系统的稳定性。当然，确保所使用的iPSC是多能的而不是差异化的也很重要。可以使用OCT4免疫荧光检测。如果OCT4阳性细胞小于90%，建议用更高质量的iPSC替换它们并再次培养脑类器官。
本研究介绍的脑类器官培养技术存在一些局限性。例如，大脑类器官不能在发育后期进行集约化培养，这是对培养空间的浪费。这也是应用大脑类器官时亟待解决的问题。如果许多脑类器官表现出空心扩张，则每个孔中的类器官数量减少，介质交换频率增加，并且类器官处于非缺氧状态，具有足够的营养。
本研究是对许多现有脑类器官培养方法12、36、37甚至其他类型的器官培养方法38、39的操作补充。这将有助于未来开发自动化类器官培养系统，并促进类器官的研究和应用。如果在自动智能栽培系统中采用增强类器官漫反射效果的技术，理论上可以取代高精度的图像放大相机，只需要安装一个普通的图像识别设备。此外，通过旋转和吸入头上的自然沉降产生的二次流进行的培养基交换和类器官转移理论上比在未来的自动培养设备中离心更可行。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究由广东省自然科学基金（批准号：2020A0505100062）、广州市科技重点课题项目（第201904020025号）、国家自然科学基金项目（31872800号、32070582、82101937）和广州市博士后科研资助项目（陈邦珠）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
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