Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הקלה על תרבית אורגנואידית מוחית באמצעות תאורת אור רך לרוחב

Published: June 6, 2022 doi: 10.3791/63989
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Obstetrics and Gynecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes, 3School of Biotechnology and Health Sciences, Wuyi University

Summary

אורגנואידים מוחיים מספקים הזדמנויות חסרות תקדים לחקר התפתחות איברים ופתולוגיה של מחלות אנושיות. למרות שהצלחה רבה הושגה עם מערכות תרבית אורגנואידיות מוחיות, עדיין ישנם קשיים תפעוליים ביישום טכנולוגיה זו. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך אורגנואידי מוחי המאפשר שינוי בינוני והעברת אורגנואידים.

Abstract

נכון לעכשיו, טכנולוגיית תרבית אורגנואידית מוחית עדיין מסובכת לתפעול וקשה ליישום בקנה מידה גדול. יש צורך למצוא פתרון פשוט ומעשי. לכן, פרוטוקול אורגנואידים מוחי אפשרי יותר מוצע במחקר הנוכחי. כדי לפתור את אי הנוחות הבלתי נמנעת בשינוי בינוני והעברה אורגנואידית בשלב מוקדם, המחקר הנוכחי מייעל את טכנולוגיית הפעולה על ידי יישום העיקרון ההנדסי. מנורת אור רכה אומצה כדי להאיר לרוחב את דגימות הגוף העוברי (EB), מה שמאפשר לראות את ה-EBs בעין בלתי דרך אפקט ההשתקפות המפוזרת המשופרת. באמצעות העיקרון של זרימה משנית שנוצרת על ידי סיבוב, האורגנואידים מתאספים לכיוון מרכז הבאר, מה שמקל על פעולת השינוי הבינוני או העברת האורגנואידים. בהשוואה לתא המפוזר, הגוף העוברי מתיישב מהר יותר בפיפטה. באמצעות תופעה זו, ניתן להסיר ביעילות את רוב התאים החופשיים ואת שברי התאים המתים בצורה פשוטה, ולמנוע מ-EBs לגרום נזק מצנטריפוגה. מחקר זה מקל על הפעולה של תרבית אורגנואידים מוחית ומסייע לקדם את היישום של אורגנואידים במוח.

Introduction

בהשוואה למערכות תרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות), למערכות תרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) יש מספר יתרונות, כולל שכפול אמיתי ושחזור יעיל של מבנים מורכבים של איברים מסוימים1. לכן, אורגנואידים מוחיים הם אחת משיטות העזר החשובות לתחומי המחקר של התפתחות המוח האנושי ומחלות2, בדיקת תרופות וטיפול בתאים.

גידול אורגנואידים מוחיים בשיטת ההשעיה המסתובבת תורם להתפתחותם ולהבשלתם3. למרות שמערכות תרביות אורגנואידיות מוחיות זכו להצלחה רבה, הן עדיין מתמודדות עם אתגרים קריטיים המגבילים את יישומן. לדוגמה, טיפוח ידני כרוך בשלבי מניפולציה מסובכים ומציג מכשולים להשגת יישומים בקנה מידה גדול. בנוסף, בכל שלב התפתחותי בתרבית האורגנואידים המוחיים, יש צורך בשינויים במדיה ובציטוקינים שונים4. עם זאת, בשלב המוקדם, האורגנואידים או ה- EBs הם בעלי גדלים זעירים (כ-200 מיקרומטר עד 300 מיקרומטר) והם כמעט בלתי נגישים מבחינה חזותית ללא מנגנון מתאים. באופן בלתי נמנע, כמות מסוימת של דגימות אורגנואידיות יקרות נשטפות כאשר המדיום משתנה. טכניקות רבות נחקרו כדי להתגבר על כך בסוגים אחרים של תרביות אורגנואידיות, וכמה דוגמאות כוללות טבילה של שבבי אורגנואידים שלמים במדיום תרבית למשך 3 ימים ללא התערבות5; הוספת מדיום טרי דרך הכיסוי לאחר שהמדיום הישן נספג באמצעות נייר סופג5; או החלת צינורות מיקרופלואידיים מורכבים להחלפת נוזלים 6,7,8. מכשול נוסף שנתקל בו בשלב המוקדם של גידול האורגנואידים הוא הקושי להשיג תצפיות ישירות בעין בלתי, מה שעלול לגרום לפעולות לקויות שמובילות לנזק ואובדן אורגנואידים במהלך שלבי העברת האורגנואידים. לכן, יש צורך להקים פרוטוקול ריאלי יותר המאפשר שינוי בינוני והעברת אורגנואידים כדי ליצור אורגנואידים.

פעולה מותאמת המתאימה המבוססת על עקרונות הנדסיים מוצעת כדי להתגבר על בעיות אלה, אשר באופן משמעותי ונוח מקל על הליכים אורגנואידים רבים. בטבע, כאשר השמש זורחת לתוך בית דרך מרווח חלון, העין הבלתי יכולה לראות את האבק רוקד בקרן האור. בשל ההשתקפות המפוזרת של אור השמש על האבק, חלק מהאור נשבר לתוך גלגל העין כדי לייצר תמונה חזותית. בהשראת העיקרון של תופעה זו 9,10, מחקר זה יצר מנורת אור רכה והאיר את ה- EBs לרוחב. נמצא כי EBs יכולים להיות ברורים מבחינה ויזואלית מבלי להשפיע על היקף הצפייה. זרימה משנית המצביעה על המרכז נוצרת בנוזל על ידי סיבוב צלחת התרבית עקב זרמי אדי11. EBs מפוזרים במקור מצטברים במרכז הצלחת. בהתבסס על זה, ועל התופעה כי מהירות השקיעה של אורגנואידים היא מהירה יותר מזו של תאים, מוצעת שיטת פעולה קלה של שינוי בינוני והעברה אורגנואידית ללא צנטריפוגה. האורגנואידים במדיום התרבית יכולים להיות מופרדים ביעילות מתאים חופשיים ושברי תאים מתים באמצעות פעולת העברה זו.

כאן, פרוטוקול קל לתפעול מוצע כדי ליצור אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. טכנולוגיית הפעולה עברה אופטימיזציה על ידי יישום העיקרון ההנדסי, מה שהופך את הפעולות בתרבות התלת-ממדית לפשוטות וישימות כמו אלה שבתרבות הדו-ממדית. שיטת החלפת הנוזלים המשופרת ופעולת העברת האורגנואידים מועילות גם לסוגים אחרים של תרבית אורגנואידים ולתכנון של מכונות תרבית אוטומטיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול נערך בעקבות הצהרת הלסינקי. האישור ניתן על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המסונף השלישי של האוניברסיטה הרפואית של גואנגג'ואו (סקירה רפואית ואתית [2021] מס '022). לפני הניסוי, כל מדיום הוכן על פי הנוסחה12 של יורגן א. קנובליך (טבלאות משלימות 1-4), או שנעשה שימוש בערכת אורגנואידים מוחית זמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים). ה-iPSCs ששימשו במחקר זה הוקמו בעבר על ידי המעבדה שלנו וקיבלו פטור מושכל. ה-SCA3-iPSCs נוצרו מנקבה בת 31 של נקבת אטקסיה ספינוקרבלרית מסוג אטקסיה מסוג 3 (SCA3) שעברה גנוטיפ של נקבה בעלת 26/78 חזרות CAG בגן ATXN313 (איור משלים 1A). ה-iPSCs האנושיים הרגילים שהוזכרו במאמר קודם נבחרו כ-NC-iPSCs14, והגן ATXN3 זוהה כבעל חזרות CAG של 14/14 (איור משלים 1B).

1. הכנת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs)

  1. לאסוף 3 מ"ל של דם היקפי על ידי venipuncture עם הסכמה מדעת של מתנדבים וחולים.
  2. לבודד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי על פי שיטת Ficoll-Paque15.
  3. קבעו iPSCs בהתאם לפרוטוקול של ערכת התכנות מחדש של סנדאי (ראו טבלת חומרים).
    1. תרבית את ה-iPSCs עם תווך mTeSR1 בצלחות פטרי 35 מ"מ המכוסות במטריגל (מטריצת קרום מרתף, ראו טבלת חומרים). לשנות את המדיום כל יום. צפיפות הצמיחה של iPSC לא תעלה על 75%.
    2. לעכל את התאים עם תמיסת דיסוציאציה של PSC (ראה טבלת חומרים) ולחלק אותם בתת-תרבות ביחס של 1:5 כל 3-5 ימים.
      אזהרה: וירוס סנדאי משמש כאן. יש להפעיל אותה בארון הבטיחות הביולוגית, ולנקוט באמצעי הגנה עצמית. זה צריך להיות ברור אם זה יכול לשמש באופן חוקי במדינה המקומית. יש להקפיד על החוקים והתקנות המקומיים בתחום הבטיחות הביולוגית בעת השימוש בהם.

2. הכנת EB (ימים 0-1)

  1. הסר את מדיום mTeSR1 מה- iPSCs עם פיפטה ושטף אותו 2x עם 1 מ"ל של 1x PBS.
  2. הסר את ה- PBS עם פיפטה, והוסף 300 μL של תמיסת ניתוק תאים (ראה טבלת חומרים) כדי לעכל את ה- iPSCs לתאים בודדים למשך 3-4 דקות ב- 37 ° C.
  3. בצעו החייאה של התאים ב-2 מ"ל של מדיום היווצרות EB (טבלה משלימה 1) ולאחר מכן עשו צנטריפוגה על הדגימה למשך 5 דקות ב-300 x גרם (טמפרטורת החדר).
  4. תכננו מראש את צלחת 24 הקידוחים המיוחדת עם תמיסת שטיפה נגד הדבקות (500 μL/well) למשך 5 דקות (ראו טבלת חומרים).
    הערה: תמיסת שטיפה נגד דבקות חיונית להיווצרות אופטימלית של EB וספרואידים.
  5. בצעו החייאה של התאים במדיום היווצרות EB המכיל Y-27632 (ריכוז סופי, 10 μM, ראו טבלת חומרים), עם צפיפות תאים של 1.5 x 106 תאים/מ"ל.
  6. הסירו את תמיסת השטיפה נגד הדבקות, ושטפו כל באר ב-2 מ"ל של מדיום ליצירת EB.
  7. הוסיפו את התאים ללוחות המיוחדים של 24 בארות בצפיפות של 3 x 106 תאים/באר (איור 1A, משמאל).
    הערה: בדרך כלל, ניתן להכין 300 EBs בכל באר. שיטה זו יכולה להכין כמויות גדולות של EBs באותו גודל.
  8. צנטריפוגה הצלחת ב 100 x g במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. פזרו באופן אחיד את התאים בכל תא בתחתית הצלחת (איור 1A, מימין).
    הערה: אם אין צנטריפוגה מתאימה, ניתן גם למקם את הצלחת ישירות לתוך האינקובטור לתרבית סטטית, אך זמן ההיווצרות של כדור ה- EB יהיה מספר שעות מאוחר יותר מזה תחת צנטריפוגה רגילה.
  9. דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות. אם צנטריפוגה לא שימשה בשלב הקודם, דגירה במשך 36 שעות. שמור על המדגם יציב, ואל תוציא אותו מהאינקובטור בתקופה זו.

3. הכנת מנורת האור הרכה (יום 1)

  1. יש להשתמש בלוח אקריליק שקוף בעובי של 0.3-0.5 ס"מ בגודל של נייר A5. הדבק רפידות לבנות בחלק הקדמי והאחורי של הצלחת האקרילית.
    1. התקינו שורה של נורות LED לבנות על קצה הצלחת, כך שהפנסים יוכלו להיכנס מהצד של הלוחית האקרילית ואז לירות החוצה במקביל (איור משלים 2A-F, איור 1B).
      הערה: מכיוון שקטריהם של EBs בשלב המוקדם הם כ-200 מיקרומטר עד 300 מיקרומטר, קשה לצפות בהם בבירור בעין בלתי מתחת למנורה הפלואורסצנטית של ספסלים נקיים. לעומת זאת, הודות לשיפור ההשתקפות המפוזרת, אנו יכולים לזהות את ה-EBs בבירור על-ידי שימוש באור רך המואר לרוחב (איור 1B, C). צלחת של 6 בארות מומלצת לתרביות EB בניסויים הבאים. עם זאת, כדי להראות טוב יותר את האפקט החזותי של אור רך, כלים משמשים לעתים לצילום תמונות וסרטונים במחקר זה במקום צלחות, אז אנא אל תבינו לא נכון. מנורת התאורה הרכה המוארת לרוחב יכולה לשמש גם לצלחת בעלת 6 הבארות.

4. העברת EB והחלפה בינונית (ימים 2-5)

  1. הכינו צלחת הידבקות נמוכה חדשה בת 6 בארות, והוסיפו 2 מ"ל של מדיום היווצרות EB לכל באר.
  2. הסר את ה- EBs יחד עם המדיום עם קצה פיפטה רחב של 1000 μL (ראה טבלת חומרים) והעביר אותם ללוחית הידבקות נמוכה של 6 בארות (כ-100 EBs/well).
    הערה: תהליך הפעולה מאמץ מנורת אור רכה (המוזכרת בשלב 3.) כדי להפוך את ה- EBs לקלים יותר לצפייה. כבה מקורות אור פנימיים אחרים כדי לשפר את האפקט החזותי של האור הרך.
  3. החלף באותו נפח של מדיום טרי ליצירת EB בכל יום. השתמש בזרימה המשנית כדי לאסוף את ה- EBs למרכז ולשנות את המדיום.
    1. שאפו את המדיום הישן על ידי צנרת לקצה הבאר באיטיות. אל תמצוץ חזק מדי; אחרת, ה- EBs יוסרו יחד. לאחר מכן, הוסיפו מדיום רענן להחייאת ה-EBs.
      הערה: הזרימה המשנית העיקרית (איור 1D). לגרום לזרימת מערבולת על ידי סיבוב המנה לאורך מסלול מעגלי. בשל זרימת המערבולת, זרימה משנית מושרית המופנית לכיוון המרכז. ה- EBs או האורגנואידים מתכנסים למרכז הבאר בשל הזרימה המשנית הנוצרת באמצעות סיבוב, ולאחר מכן ניתן לבצע שינוי בינוני או העברה עוברית בקלות.

5. בדיקת פלוריפוטנטיות על ידי תיוג עם סמן פלוריפוטנטיות OCT4 (יום 4)

הערה: כאשר הקוטר של ה- EBs גדול מ- 300 מיקרומטר, קח מספר EBs עבור צביעת סמן OCT4 immunofluorescence כדי לזהות את הפלוריפוטנטיות שלהם.

  1. תקן את ה- EBs ב- 4% paraformaldehyde ב- 4 ° C למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטיפה ב 1x PBS 3x במשך 10 דקות בכל פעם.
  2. העבר את ה- EBs ל- PBS בטמפרטורת החדר המכיל 0.3% Triton X-100 ו- 3% BSA למשך 2 שעות, ולאחר מכן שטיפה ב- PBS 3x למשך 10 דקות בכל פעם.
    הערה: לאחר טיפול ב-Triton X-100, ה- EBs צפים על פני השטח הנוזליים וניתן לשאוב אותם בקלות עם הנוזל במהלך הניקוי. מומלץ לפעול תחת סטריאומיקרוסקופ.
  3. דיללו את הנוגדן הראשוני OCT4 (ראו טבלת חומרים) עם 1 מ"ל של 1x PBS המכיל 1% BSA ביחס של 1:200 והוסיפו ל-EBs לדגירה ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה, ואז שטפו ב-PBS 3x למשך 10 דקות בכל פעם.
  4. דיללו את הנוגדן המשני המתאים (ראו טבלת חומרים) עם 1x PBS בשעה 1:500 והוסיפו 1 מ"ל ל-EBs.
  5. לאחר דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות, לשטוף את התאים ב 1x PBS 3x במשך 10 דקות בכל פעם.
  6. הסר את ה- PBS, הוסף 2 מ"ל של תמיסת PBS 1x המכילה 1 מיקרוגרם / מ"ל DAPI, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף ב- PBS 3x למשך 10 דקות בכל פעם.
  7. הזיזו את ה-EB המכיל כמות קטנה של נוזל על המגלשה, אטמו את המגלשה בזכוכית כיסוי המצופה בג'לי נפט זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) בקצה, ולאחר מכן צפו ואספו את התמונה תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי הקונפוקלי.
    הערה: ביטוי OCT4 מייצג EB pluripotency12. כאשר הביטוי של OCT4 הוא פחות מ -90%, יש להשליך את ה- EBs, ויש להכין את ה- EBs שוב.

6. אינדוקציה עצבית (ימים 5-7)

  1. הכינו צלחת חדשה בת 6 בארות עם הידבקות נמוכה, והוסיפו 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה עצבי (טבלה משלימה 2) לכל באר.
  2. הפעילו את האור הרך לרוחב (המוזכר בשלב 3)וכבו מקורות אור פנימיים אחרים.
  3. העבר את ה- EBs ללוח 6 הבארות עם תוספת של מדיום אינדוקציה עצבית (~ 100 EBs / באר). הוסף כמה שפחות מהמדיום המקורי לבאר החדשה.
    הערה: הצג מיומנויות פשוטות של העברת אורגניזם. באופן טבעי, תחת כוח הכבידה ועם צפיפות גבוהה יחסית מהתווך, ה-EBs המחודשים ישקעו בהדרגה על ידי יישום הפעולה המוצגת באיור 1E. לפיכך, ניתן להעביר את ה- EBs בנוחות. מאחר שבהשוואה ל-EBs, תאים חופשיים ושברי תאים מתים שוקעים לאט יותר, ניתן להסיר את רוב התאים החופשיים ואת שברי התאים המתים באמצעות שיטת שקיעה זו (איור 1F).
  4. דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות.
    הערה: תחת המיקרוסקופ, הקוטר של ה- EBs היה בערך 500 מיקרומטר, והקצה היה שקוף, מה שמעיד על כך שנוצרה שכבה נוירואפיתליאלית.
  5. המשך לשלב הבא.

7. הטמעה במטריצת קרום המרתף (ימים 7-10)

  1. מקם את מטריצת הממברנה במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות מראש כדי להתמוסס. חשב את כמות המטריצה הנדרשת מראש. כ-100 EBs הוטמעו ב-1.5 מ"ל של מטריצת הממברנה.
  2. הדליקו את האור הרך לרוחב וכבו את מקור האור בחלק העליון של הקונסולה.
  3. שמור את מטריצת הממברנה על קרח כדי למנוע התמצקות.
  4. מעבירים כמות קטנה של EBs למנה של 60 מ"מ המכילה מדיום הרחבה טרי (טבלה משלימה 3) בכל פעם. הקטן את מספר ה- EBs כדי להקל על הסרת EB יחיד.
  5. לאחר מכן, השתמש בצלחת הידבקות נמוכה חדשה של 6 בארות. מוצצים EB יחיד (המכיל כ-10 μL בינוני) עם קצה פיפטה רחב של 200 μL (ראו טבלת חומרים) בכל פעם, ולאחר מכן מוסיפים אותו לתחתית הצלחת בעלת 6 הבארות כדי ליצור טיפות. השתמש בחמש טיפות לכל באר.
    הערה: המפתח הוא להתאים את הטווח של אקדח הפיפטה ל-50 μL ולמצוץ EB, ולאחר מכן להתייחס לפעולה של איור 1E. כאשר ה-EB מתיישב לבור של קצה הפיפטה, הקצה נוגע במהירות בתחתית הבאר של הצלחת ודוחף החוצה כ-10 מיקרול של נוזל כדי ליצור טיפה.
  6. הוסף 15 μL של מטריצת הממברנה לכל טיפה המכילה EB וערבב אותה במהירות. הטמיעו את כדור ה-EB במרכז הטיפה.
    הערה: אסור לשאוף ל-EBs עם קצה פיפטה סטנדרטי, מה שפוגע ב-EB. יש להשתמש במקום זאת בקצה הפיפטה בעל הקידוח הרחב של 200 μL.
  7. ממקמים את צלחת 6 הקידוחים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, וממצקים את טיפות מטריצת הממברנה המכילות EBs.
  8. הוסף 3 מ"ל של מדיום ההרחבה לכל באר ופוצץ בעדינות את ה- EBs המוטבעים במטריצה כדי להשעות אותם.
  9. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 3 ימים.
    הערה: אם נצפה ניצנים על פני השטח של EB, זה אומר שנוצר נוירו-פיתליום מורחב16.

8. התבגרות אורגנואידית (ימים 10-40)

  1. הסר בעדינות את המדיום המקורי, והוסף 3 מ"ל של מדיום הבשלה (טבלה משלימה 4) לכל באר.
  2. הניחו את הצלחת האורגנואידית על שייקר אופקי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
  3. המשך לסובב את התרבות אופקית. הגדר את השייקר למהירות המתאימה.
    הערה: בעת גידול אורגנואידים מוחיים על צלחת של 6 בארות, כוח צנטריפוגלי יחסי (RCF) של 0.11808 x g מתאים יותר, על פי היצרן של השייקר האופקי (ראה טבלת חומרים). על פי ההמרה בין הכוח הצנטריפוגלי היחסי למהירות הסיבוב17,18, RCF = 1.118 x 10−5 × R × סל"ד2, כאשר RCF = כוח צנטריפוגלי יחסי (g), סל"ד = סיבובים לדקה (r/min), ו- R = רדיוס סיבוב (cm), הידוע גם בשם זריקת טלטולים. הפרמטרים של זריקת הרעידות של שייקרים שונים עשויים להיות שונים. לכן, ניתן להעריך כי מהירות הסיבוב היא סל"ד = 299 x (RCF / R) 1/2.
  4. שנה את מדיום ההתבגרות הטרי כל 2-3 ימים.
  5. לאחר 20-30 יום, בהדרגה תרבית את האורגנואידים המוחיים לבגרות.
    הערה: במהלך תקופה זו, ניתן להשתמש באורגנואידים לניסויים וזיהוי, כגון זיהוי סמנים עצביים וריצוף תעתיק 19,20,21.

9. מקטעים קפואים ואימונופלואורסצנציה של אורגנואידים מוחיים

  1. תקן את האורגנואידים ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C במשך 16 שעות ולאחר מכן לשטוף אותם 3x עם 1x PBS במשך 10 דקות בכל פעם.
  2. הסר את ה- PBS, וטבול את האורגנואידים ב 30% סוכרוז ב 4 ° C לילה.
  3. הטמיעו את האורגנואידים ב-10%/7.5% ג'לטין/סוכרוז ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת ולאחר מכן העבירו אותם במהירות לתבנית ההטבעה.
  4. הוסיפו קרח יבש ל-100% אתנול כדי להכין קרח יבש/אתנול, והניחו בו את הדגימות האורגנואידיות להקפאה מהירה.
  5. אחסן את הדגימות הקפואות במקפיא של −80 מעלות צלזיוס. בעת הצורך, לעשות חלקים קפואים בעובי של 20 מיקרומטר.
  6. עיין בשלבים 5.3.-5.5. עבור אימונופלואורסצנציה. השתמש בנוגדן PAX6 כדי לסמן תאי אב אפיקליים, בנוגדן TUJ1 (ראה טבלת חומרים) כדי לתייג תאים עצביים 22,23,24, וב-DAPI עבור צביעת DNA גרעינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המחקר הנוכחי גרם ל-iPSCs (איור 2B) לתוך אורגנואידים מוחיים (איור 2C). ה-EBs שטופחו בשלב המוקדם ביטאו את סמן OCT4 (איור 2A), שהצביע על פלוריפוטנטיות טובה. בשלב מאוחר יותר, ה-EBs התפתחו לאורגנואידים מוחיים בוגרים (איור 2D). המחקר טיפח iPSCs מאנשים בריאים רגילים ומחולי SCA3 לאורגנואידים מוחיים (איור 3A). SCA3, הידועה גם בשם מחלת מצ'אדו-ג'וזף (MJD), היא הפרעה נוירודגנרטיבית הנגרמת על ידי התפשטות פוליגלוטמין בגן ATXN325. נתוני ה-RNA-seq (שהועלו למאגר ציבורי, ראו טבלת חומרים) חשפו הבדלים משמעותיים בפרופילי ביטוי הגנים בין קבוצת האורגנואידים המוחיים הנורמלית לבין קבוצת האורגנואידים המוחיים SCA3 במסלולים כגון הובלת מוליכים עצביים, היווצרות סינפסות וויסות (איור 3B). תוכנת Cufflinks שימשה לחישוב רמת ביטוי הגנים וההבדל26. DEseq2 שימש גם לניתוח הנתונים27.

Figure 1
איור 1: פעולות אופטימיזציה של שינוי והעברה בינונית של EBs. (A) הכנת EB. ה-iPSCs עוכלו והוספו ללוחות המיוחדים של 24 בארות (משמאל). התאים יצרו EBs (מימין). פס קנה המידה הוא 400 μm. (B) דיאגרמה סכמטית של אור רך מואר לרוחב כדי לסייע בהתבוננות באורגנואידים. (C) ה-EBs נצפו עם מקורות אור שונים. חץ צהוב: אור מואר לרוחב; חץ אדום: רקע כהה; חצים ירוקים: EBs. (D) זרימת מערבולת מושרית על ידי סיבוב התבנית לאורך מסלול מעגלי. בשל זרימת המערבולת, מושרית זרימה משנית המופנית לכיוון המרכז. ה- EBs מתכנסים למרכז המנה המונעת על ידי הזרימה המשנית הנוצרת באמצעות סיבוב. חצים לבנים: EBs. (E) העברה אורגנואידית. (I) ראשית, קצה פיפטה רחב פה משמש למציצת תמיסת התערובת, כולל גם את ה-EBs וגם את מדיום התרבית. (II) לאחר מכן, תוך שמירה על הפיפטה זקופה, ה-EBs שוקעים בהדרגה תחת אפקט הכבידה ומתכנסים לכיוון הפה של קצה הפיפטה. (III) כאשר פיו של קצה הפיפטה נוגע שוב במשטח הנוזלי (בדרך כלל המדיום הטרי), ובשל מתח פני השטח הנוזלי, (IV) ה-EBs שוקעים במהירות לתוך המדיום (אין צורך בניפוח נוסף על ידי צנרת ידנית). קו אדום: רמת הנוזל; חצים צהובים: EBs. (F) מכיוון שהתאים החופשיים ושברי התאים המתים שוקעים לאט יותר מאשר EBs, לפיכך ניתן להסיר את רוב התאים החופשיים ואת שברי התאים המתים באמצעות שיטת השקיעה לעיל כדי להקל על העברת העוברים. התיבה האדומה בפינה הימנית העליונה היא תמונה מוגדלת. סרגל קנה המידה הוא 400 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: אינדוקציה של iPSCs לארגנואידים מוחיים. OCT4: גורם שעתוק מחייב אוקטאמר-4; DAPI: DAPI דיהידרוכלוריד. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. סרגל קנה המידה הוא 400 מיקרומטר. סרגל קנה המידה הוא 200 מיקרומטר( D) צביעה אימונופלואורסצנטית של אורגנואידים מוחיים. PAX6: תיבה משויכת 6 היא הסמן של תאי אב אפיקליים; TUJ1: מחלקה III ספציפית לנוירון β-טובולין הוא סמן ספציפי לנוירון. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: טיפוח של iPSCs מאנשים בריאים וחולי SCA3 לאורגנואידים מוחיים. (A) שלבים שונים המכסים את ההבשלה של אורגנואידים מוחיים החל מ- EBs. NC: קבוצה נורמלית; SCA3: קבוצת SCA3/MJD. פסי קנה מידה של תמונות בהגדלה נמוכה וגבוהה הם 400 מיקרומטר ו-200 מיקרומטר, בהתאמה. (B) תרשים ניתוח העשרת GO של גנים מווסתים כלפי מטה, המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין אורגנואידים רגילים לבין אורגנואידים SCA3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: זיהוי של ATXN3 CAG חוזר על עצמו על ידי אלקטרופורזה נימית. (A) ה-iPSC של חולה ה-SCA3 (SCA3-iPSC) זוהה כבעל 26/78 CAG חוזר בגן ATXN3. (B) ה-iPSC האנושי הרגיל (NC-iPSC) זוהה כבעל 14/14 CAG חוזר בגן ATXN3. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: הכנת מנורת האור הרכה. (A) ספק הכוח ונורות ה-LED הותקנו בצד אחד של הלוח האקרילי (כפי שמוצג בתיבה המנוקדת האדומה). אורך הגל המתפזר של מנורת התאורה הרכה LED הוא 450-470 ננומטר, השטף הזוהר הוא 1300-1800 ל"מ, ומדד עיבוד הצבע הוא 75-85 Ra. (B) נבדק אם נורות ה-LED יכולות להידלק כרגיל (כפי שמוצג בתיבה המנוקדת האדומה). (C) כרית לבנה הודבקה על החלק הקדמי והאחורי של הלוח האקרילי (כפי שמציינים החצים האדומים). (D) המראה הכללי של מנורת האור הרכה. (E) ניתן להחליף את מנורת התאורה הרכה גם במשטח תאורה מסחרי לציור LED ללא מסגרת, המשמש בדרך כלל למעקב בעת העתקת סקיצות. שכבה של סרט לבן צריכה להיות מודבקת ישירות מעל כרית תאורת צביעת ה-LED. (ו) מנורת האור הרכה בעבודה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 1: הרכב מדיום היווצרות ה-EB. בשלב הראשוני של היווצרות EB (בדרך כלל ביומיים הראשונים), יש להוסיף Y-27632 (50 μM) ו- bFGF (4 ng/mL) למדיום היווצרות EB. המדיום צריך להיות מסונן עם יחידת מסנן 0.2 μm ומאוחסן ב - −20 °C. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 2: הרכב מדיום האינדוקציה העצבית. המדיום צריך להיות מסונן עם יחידת מסנן 0.2 μm ומאוחסן ב - −20 °C. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 3: הרכב מדיום ההרחבה. דילול של 1:100 של 2-Mercaptoethanol הוכן ב-DMEM-F12, ו-87.5 μL מזה נוספו למדיום ההרחבה. אסור ש-B27 יכיל ויטמין A. המדיום צריך להיות מסונן עם יחידת מסנן 0.2 μm ומאוחסן ב - −20 °C. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 4: הרכב מדיום ההבשלה. הוכן דילול של 1:100 של 2-Mercaptoethanol ב-DMEM-F12 ו-87.5 μL מזה נוספו למדיום ההבשלה. אסור ש-B27 יכיל ויטמין A. המדיום צריך להיות מסונן עם יחידת מסנן 0.2 μm ומאוחסן ב - −20 °C. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אורגנואידים מוחיים פותחים אפיקים חדשים למחקר רפואי. יישומים שימושיים רבים של טכנולוגיה זו מתחילים להיחקר רק28. מחקר זה מצא כי תוצאות ריצוף השעתוק של אורגנואידים מוחיים חולים גנטית ואורגנואידים מוחיים רגילים יכולות לשקף את ההבדלים בין מחלה לבריאות. לדוגמה, תוצאות ניתוח הנתונים של RNA-seq (איור 3B) עולות בקנה אחד עם מחקרים רבים שדווחו על מחלות SCA3 29,30,31,32. פעולות ניסיוניות, כגון שינוי בינוני, העברת EB ועטיפה, הן חיוניות לטיפוח אורגנואידים מוחיים ולקביעת האם ניתן להכין אורגנואידים עם אחידות טובה 33,34. במחקר זה, פרוטוקול אורגנואידים מוחיים שאיפשר שינוי בינוני והעברת אורגנואידים הוא הציג. מנורת אור רכה לרוחב יכולה לסייע מאוד בהפעלת תרבית האורגנואידים. עם זאת, זה לא קשה לעשות, כרית אור ציור LED ועיבוד פשוט יכול גם להחליף אותו. שיטת החלפת הנוזלים הפשוטה ופעולת העברת האורגנואידים הופכים את כל תהליך התרבית לקל יותר. היישום של אורגנואידים מוחיים מושפע לעתים קרובות על ידי הבעיה של אחידות ירודה35. ההבדל הגדול ביותר בין מחקר זה לבין הנחיות אחרות של תרבית אורגנואידים מוחית הוא שהמיקוד הוא באופטימיזציה של הפעולה כדי להפוך את הניסוי לחוזר על עצמו יותר.

חשוב מאוד לשמור על יציבותה של מערכת התרבות. אם התנאים מאפשרים זאת, מוצע לתעדף את המדיום האורגנואידי המוחי המסחרי, שיכול להפחית ביעילות את ההבדלים הגדולים בתוצאות הניסוי בקבוצות שונות בשל חוסר היציבות של המדיום. בנוסף, אחסון בינוני אורגנואידי מוחי ב 4 °C (4 °F) לא צריך להימשך יותר משבועיים; אחרת, זה ישפיע על היציבות של מערכת התרבות. כמובן, חשוב גם לוודא כי iPSCs בשימוש הם פלוריפוטנטיים ולא מובחנים. ניתן להשתמש בזיהוי אימונופלואורסצנציה OCT4. אם תאים חיוביים ל-OCT4 הם פחות מ-90%, מומלץ להחליף אותם ב-iPSCs באיכות גבוהה יותר ולתרבית אורגנואידים מוחיים שוב.

ישנן כמה מגבלות בטכנולוגיית תרבית האורגנואידים במוח שהוצגה במחקר זה. לדוגמה, אורגנואידים מוחיים אינם יכולים להיות מתורבתים באופן אינטנסיבי בשלב מאוחר יותר של ההתפתחות, שהוא בזבוז של מרחב התרבות. זוהי גם בעיה דחופה שיש לפתור ביישום אורגנואידים מוחיים. אם אורגנואידים מוחיים רבים מפגינים התפשטות חלולה, מספר האורגנואידים בכל באר מצטמצם, תדירות החילוף הבינונית עולה, והאורגנואידים נמצאים במצב לא אבעבועות עם מספיק חומרים מזינים.

מחקר זה הוא תוסף תפעולי לשיטות קיימות רבות של תרבית אורגנואידים מוחית 12,36,37 ואפילו סוגים אחרים של שיטות תרבית איברים 38,39. זה יעזור לפתח מערכות תרביות אורגנואידים אוטומטיות בעתיד ולקדם את המחקר והיישום של אורגנואידים. אם הטכנולוגיה של שיפור אפקט ההשתקפות המפוזרת של אורגנואידים משמשת במערכת הטיפוח החכמה האוטומטית, היא יכולה תיאורטית להחליף את מצלמת הגברת התמונה המדויקת הגבוהה, ויש להתקין רק התקן זיהוי תמונה רגיל. בנוסף, חילופי תווים והעברה אורגנואידית באמצעות זרימה משנית הנוצרת על ידי סיבוב ושקיעה טבעית על ראש היניקה אפשריים יותר מבחינה תיאורטית מאשר צנטריפוגה בציוד תרבית אוטומטי עתידי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (מענק מס ' 2020A0505100062), פרויקט נושאי מפתח למדע וטכנולוגיה של העיר גואנגג'ואו (מענק מס '201904020025), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '31872800, 32070582, 82101937), ופרויקט מענק המחקר הפוסט-דוקטורט של העיר גואנגג'ואו (לבנגז'ו צ'ן).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm Filter NEST Biotechnology, China 331001
1000 μL wide-bore pipette tip Thermo Fisher Scientific, USA 9405163
200 μL wide-bore pipette tip Thermo Fisher Scientific, USA 9405020
2-Mercaptoethanol Merck, Germany 8057400005
4% Paraformaldehyde Servicebio, China G1101
6-well low adhesion plate NEST Biotechnology, China 703011 It is used for EBs suspension cultures
Aaccute cell detachment solution STEMCELL Technologies, Canada 07920 It is used to digest iPSC into single cells.
AggreWell800 24-well STEMCELL Technologies, Canada 34811 Microporous culture plate for EBs preparation.
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies, Canada 07010 Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion
B27-vit. A supplement Thermo Fisher Scientific, USA 12587010
bFGF Peprotech, USA GMP100-18B
BSA Beyotime Biotechnology, China ST025
Centrifuge Eppendorf, Germany 5810 R It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.
Cover glass Shitai Laboratory Equipment, China 10212020C
DAPI Beyotime Biotechnology, China C1002 Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific, USA 11330032
ES-quality FBS Thermo Fisher Scientific, USA 10270106
Ficoll Paque General Electric Company, USA 17-5442-02 Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.
Gelatin Sangon Bioteach, China A609764
Glutamax supplement Thermo Fisher Scientific, USA 35050061
Glutamax supplement Thermo Fisher Scientific, USA 17504044
Goat anti-Chicken IgY  secondary antibody Abcam, UK ab150171 Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody Abcam, UK ab150120 Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody Abcam, UK ab150077 Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.
Heparin Merck, Germany H3149
Horizontal shaker Servicebio, China DS-H200 Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).
Insulin Merck, Germany I9278-5ML
KOSR Thermo Fisher Scientific, USA 10828028
Matrigel Corning, USA 354277 Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature.
MEM-NEAA Thermo Fisher Scientific, USA 11140050
mTeSR1 STEMCELL Technologies, Canada 85850 iPSC culture medium
N2 supplement Thermo Fisher Scientific, USA 17502048
Neurobasal Thermo Fisher Scientific, USA 21103049
OCT4 primary antibody Abcam, UK ab19857 Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution.
Pathological frozen slicer Leica, Germany Leica CM1860
PAX6 primary antibody Abcam, UK ab78545 Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.
PBS STEMCELL Technologies, Canada 37350
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific, USA 15140122
PSC dissociation solution Beijing Saibei Biotechnology, China CA3001500 Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.
Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific, USA A16518 Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.
Slide Glass Shitai Laboratory Equipment, China 188105W
Soft light lamp NUT NUT A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.
STEMdiff Cerebral Organoid Kit STEMCELL Technologies, Canada 8570 Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit STEMCELL Technologies, Canada 8571 Maturation Medium
Sucrose Sangon Bioteach, China A502792
Triton X-100 Merck, Germany X100
TUJ1 primary antibody Abcam, UK ab41489 Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.
Vaseline Sangon Bioteach, China A510146
Y-27632 STEMCELL Technologies, Canada 72302 Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS.
Weblink
Raw sequencing data Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences GSA-Human: HRA002430 https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
  2. Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  5. Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
  6. Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
  7. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
  8. Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
  9. Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
  10. Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
  11. Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
  12. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  13. Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
  14. Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
  15. Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7.1 (2001).
  16. Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
  17. Rieder, H. L., Smithwick, R. W. RPM or RCF. The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371 (1985).
  18. Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
  19. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  20. Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
  21. Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  22. Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  23. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  24. Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
  25. Costa, M., Paulson, H. L. Toward understanding Machado-Joseph disease. Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).
  26. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
  27. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
  28. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  29. Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
  30. Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
  31. Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, Pt 11 3221-3237 (2015).
  32. Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
  33. Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Camp, J. G., Treutlein, B. Human development: Advances in mini-brain technology. Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).
  36. Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
  37. Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
  38. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  39. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 184
הקלה על תרבית אורגנואידית מוחית <em>באמצעות</em> תאורת אור רך לרוחב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, B., Lin, Q., Liu, N., Chen,… More

Chen, B., Lin, Q., Liu, N., Chen, D., Zhang, Y., Sun, X. Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination. J. Vis. Exp. (184), e63989, doi:10.3791/63989 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter