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Bioengineering

Faciliter la culture organoïde cérébrale grâce à l’éclairage latéral à lumière douce

Published: June 6, 2022 doi: 10.3791/63989
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Obstetrics and Gynecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes, 3School of Biotechnology and Health Sciences, Wuyi University

Summary

Les organoïdes cérébraux offrent des possibilités sans précédent d’étudier le développement des organes et la pathologie des maladies humaines. Bien qu’un grand succès ait été obtenu avec les systèmes de culture organoïdes cérébrales, il existe encore des difficultés opérationnelles dans l’application de cette technologie. Le présent protocole décrit une procédure organoïde cérébrale qui facilite le changement de milieu et le transfert organoïde.

Abstract

À l’heure actuelle, la technologie de culture organoïde cérébrale est encore compliquée à utiliser et difficile à appliquer à grande échelle. Il est nécessaire de trouver une solution simple et pratique. Par conséquent, un protocole organoïde cérébral plus réalisable est proposé dans la présente étude. Pour résoudre les inconvénients inévitables du changement moyen et du transfert organoïde à un stade précoce, la recherche actuelle optimise la technologie d’exploitation en appliquant le principe d’ingénierie. Une lampe à lumière douce a été adoptée pour éclairer latéralement les échantillons de corps embryoïde (EB), permettant aux EB d’être vus à l’œil nu grâce à l’effet de réflexion diffuse amélioré. En utilisant le principe de l’écoulement secondaire généré par la rotation, les organoïdes se rassemblent vers le centre du puits, ce qui facilite le fonctionnement du changement de milieu ou du transfert organoïde. Par rapport à la cellule dispersée, le corps embryoïde s’installe plus rapidement dans la pipette. En utilisant ce phénomène, la plupart des cellules libres et des fragments de cellules mortes peuvent être éliminés efficacement de manière simple, empêchant les EB d’être endommagés par la centrifugation. Cette étude facilite le fonctionnement de la culture organoïde cérébrale et aide à promouvoir l’application d’organoïdes cérébraux.

Introduction

Par rapport aux systèmes de culture bidimensionnelle (2D), les systèmes de culture tridimensionnelle (3D) présentent plusieurs avantages, notamment une véritable réplication et une reproduction efficace des structures complexes de certains organes1. Par conséquent, les organoïdes cérébraux sont l’une des méthodes auxiliaires importantes pour les domaines de recherche du développement du cerveau humain et de la maladie2, du dépistage des médicaments et de la thérapie cellulaire.

La culture d’organoïdes cérébraux par la méthode de suspension rotative est propice à leur développement et à leur maturation3. Bien que les systèmes de culture organoïdes cérébrales aient connu un grand succès, ils sont toujours confrontés à des défis critiques qui limitent leur application. Par exemple, la culture manuelle implique des étapes de manipulation compliquées et introduit des obstacles à la réalisation d’applications à grande échelle. De plus, à chaque stade de développement de la culture d’organoïdes cérébraux, des changements dans différents milieux et cytokines sont nécessaires4. Cependant, au stade précoce, les organoïdes ou EB ont des tailles minuscules (environ 200 μm à 300 μm) et sont presque visuellement inaccessibles sans appareil approprié. Inévitablement, une certaine quantité d’échantillons organoïdes précieux est évacuée lorsque le milieu est changé. De nombreuses techniques ont été explorées pour surmonter cela dans d’autres types de cultures organoïdes, et certains exemples incluent l’immersion de puces organoïdes entières dans un milieu de culture pendant 3 jours sans intervention5; ajouter un milieu frais à travers la couche de couverture après l’absorption de l’ancien milieu à l’aide de papier absorbant5; ou l’application de pipelines microfluidiques complexes pour l’échange de fluides 6,7,8. Un autre obstacle rencontré au début de la culture organoïde est la difficulté d’obtenir des observations directes à l’œil nu, ce qui peut provoquer de mauvaises opérations entraînant des dommages et des pertes organoïdes pendant les étapes de transfert organoïdes. Par conséquent, il est nécessaire d’établir un protocole plus réalisable qui facilite le changement de milieu et le transfert d’organoïdes pour générer des organoïdes.

Un fonctionnement optimisé correspondant basé sur des principes d’ingénierie est proposé pour surmonter ces problèmes, ce qui facilite considérablement et commodément de nombreuses procédures organoïdes. Dans la nature, lorsque le soleil brille dans une maison à travers un espace de fenêtre, l’œil nu peut voir la poussière danser dans le faisceau lumineux. En raison de la réflexion diffuse de la lumière du soleil sur la poussière, une partie de la lumière est réfractée dans le globe oculaire pour produire une image visuelle. Inspirée par le principe de ce phénomène 9,10, cette étude a réalisé une lampe à lumière douce et a éclairé les EB latéralement. Il a été constaté que les EB pouvaient être visuellement clairs sans affecter la portée de visualisation. Un écoulement secondaire pointant vers le centre est généré dans le liquide en faisant tourner la plaque de culture en raison des courants de Foucault11. Les EB dispersés à l’origine s’accumulent au centre de la plaque. Sur cette base, et le phénomène selon lequel la vitesse de sédimentation des organoïdes est plus rapide que celle des cellules, une méthode d’utilisation facile de changement de milieu et de transfert d’organoïdes sans centrifugation est proposée. Les organoïdes dans le milieu de culture peuvent être efficacement séparés des cellules libres et des fragments de cellules mortes grâce à cette opération de transfert.

Ici, un protocole facile à utiliser est proposé pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes humaines. La technologie d’exploitation a été optimisée en appliquant le principe d’ingénierie, rendant les opérations en culture 3D aussi simples et réalisables que celles en culture 2D. La méthode d’échange de liquide améliorée et l’opération de transfert organoïde sont également utiles pour d’autres types de culture organoïde et la conception de machines de culture automatiques.

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Protocol

Le protocole a été élaboré à la suite de la Déclaration d’Helsinki. L’approbation a été accordée par le Comité d’éthique du troisième hôpital affilié de l’Université médicale de Guangzhou (examen médical et éthique [2021] n ° 022). Avant l’expérience, chaque milieu était préparé selon la formule12 de Juergen A. Knoblich (tableaux supplémentaires 1 à 4), ou un kit d’organoïdes cérébraux disponible dans le commerce était utilisé (voir tableau des matériaux). Les CSPi utilisées dans cette étude ont déjà été établies par notre laboratoire et ont obtenu une exemption éclairée. Les SCA3-iPSC ont été générés à partir d’un patient femelle atteint d’ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3) âgé de 31 ans génotypé comme hébergeant 26/78 répétitions CAG dans le gène ATXN313 (Figure supplémentaire 1A). Les CSPi humaines normales mentionnées dans un article précédent ont été sélectionnées comme NC-iPSC14, et le gène ATXN3 a été identifié comme ayant des répétitions CAG 14/14 (figure supplémentaire 1B).

1. Préparation de cellules souches pluripotentes induites (CSPi)

  1. Prélever 3 mL de sang périphérique par ponction veineuse avec le consentement éclairé des volontaires et des patients.
  2. Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique selon la méthode Ficoll-Paque15.
  3. Établissez des IPSC selon le protocole du kit de reprogrammation de Sendai (voir tableau des matériaux).
    1. Cultiver les cspi avec un milieu mTeSR1 dans des boîtes de Petri de 35 mm recouvertes de Matrigel (une matrice de membrane basale, voir Tableau des matériaux). Changez le médium tous les jours. La densité de croissance iPSC ne doit pas dépasser 75%.
    2. Digérez les cellules avec une solution de dissociation PSC (voir Tableau des matériaux) et sous-cultivez-les dans un rapport de 1:5 tous les 3-5 jours.
      ATTENTION: Le virus Sendai est utilisé ici. Il doit être utilisé dans l’armoire de biosécurité et des mesures d’autoprotection doivent être prises. Il devrait être clair s’il peut être utilisé légalement dans le pays local. Les lois et règlements locaux en matière de biosécurité doivent être strictement respectés lorsqu’ils sont utilisés.

2. Préparation EB (jours 0-1)

  1. Retirez le support mTeSR1 des iPSC avec une pipette et lavez-le 2x avec 1 mL de 1x PBS.
  2. Retirez le PBS à l’aide d’une pipette et ajoutez 300 μL de solution de détachement de cellule (voir Tableau des matériaux) pour digérer les CSPi en cellules individuelles pendant 3 à 4 minutes à 37 °C.
  3. Remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu de formation EB (tableau supplémentaire 1), puis centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 300 x g (température ambiante).
  4. Prétraitez la plaque spécialisée de 24 puits avec une solution de rinçage antiadhésive (500 μL/puits) pendant 5 min (voir tableau des matériaux).
    REMARQUE: La solution de rinçage anti-adhérence est essentielle pour une formation optimale d’EB et de sphéroïdes.
  5. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de formation EB contenant Y-27632 (concentration finale, 10 μM, voir Tableau des matériaux), avec une densité cellulaire de 1,5 x 106 cellules/mL.
  6. Retirer la solution de rinçage anti-adhérence et rincer chaque puits avec 2 mL de milieu de formation d’EB.
  7. Ajouter les cellules aux plaques spécialisées de 24 puits à une densité de 3 x 106 cellules/puits (Figure 1A, à gauche).
    REMARQUE: Normalement, 300 EB peuvent être préparés dans chaque puits. Cette méthode permet de préparer de grandes quantités d’EB de même taille.
  8. Centrifuger la plaque à 100 x g pendant 2 min à température ambiante. Répartir uniformément les cellules dans chaque chambre au bas de la plaque (Figure 1A, à droite).
    REMARQUE: S’il n’y a pas de centrifugeuse appropriée, la plaque peut également être placée directement dans l’incubateur pour la culture statique, mais le temps de formation de la boule EB sera plusieurs heures plus tard que celui sous centrifugation normale.
  9. Incuber les échantillons à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h. Si la centrifugation n’a pas été utilisée à l’étape précédente, incuber pendant 36 h. Gardez l’échantillon stable et ne le sortez pas de l’incubateur pendant cette période.

3. Préparation de la lampe à lumière douce (jour 1)

  1. Utilisez un panneau acrylique transparent d’une épaisseur de 0,3 à 0,5 cm dans la taille du papier A5. Collez des tampons blancs à l’avant et à l’arrière de la plaque acrylique.
    1. Installez une rangée de voyants blancs à DEL sur le bord de la plaque afin que les feux puissent entrer par le côté de la plaque acrylique, puis jaillir en parallèle (Figure supplémentaire 2A-F, Figure 1B).
      REMARQUE: Comme les diamètres des EB au stade précoce sont d’environ 200 μm à 300 μm, il est difficile de les observer clairement à l’œil nu sous la lampe fluorescente des bancs propres. En revanche, en raison de l’amélioration de la réflexion diffuse, nous pouvons détecter clairement les EB en utilisant une lumière douce éclairée latéralement (Figure 1B, C). Une plaque de 6 puits est recommandée pour les cultures EB dans les expériences ultérieures. Cependant, pour mieux montrer l’effet visuel de la lumière douce, la vaisselle est parfois utilisée pour prendre des photos et des vidéos dans cette étude au lieu d’assiettes, alors ne vous méprenez pas. La lampe à lumière douce éclairée latéralement peut également être utilisée pour la plaque à 6 puits.

4. Transfert EB et remplacement moyen (jours 2-5)

  1. Préparez une nouvelle plaque à faible adhérence de 6 puits et ajoutez 2 mL de milieu de formation EB à chaque puits.
  2. Retirez les EB avec le milieu avec une pointe de pipette à large alésage de 1000 μL (voir tableau des matériaux) et transférez-les sur la plaque à faible adhérence de 6 puits (~ 100 EB / puits).
    REMARQUE: Le processus de fonctionnement adopte une lampe à lumière douce (mentionnée à l’étape 3.) pour rendre les EB plus faciles à observer. Éteignez les autres sources de lumière intérieure pour obtenir l’effet visuel de la lumière douce.
  3. Remplacer par le même volume de milieu frais de formation d’EB tous les jours. Utilisez le flux secondaire pour rassembler les EB au centre et changer le milieu.
    1. Aspirer l’ancien milieu en pipetant lentement jusqu’au bord du puits. Ne pas sucer trop fort; sinon, les EB seront supprimés ensemble. Ensuite, ajoutez un milieu frais pour remettre en suspension les EB.
      NOTE : Le principal écoulement secondaire (Figure 1D). Induire un flux tourbillonnant en faisant pivoter le plat le long d’une orbite circulaire. En raison de l’écoulement tourbillonnant, un écoulement secondaire est induit dirigé vers le centre. Les EB ou organoïdes convergent vers le centre du puits en raison du flux secondaire généré par rotation, après quoi le changement de milieu ou le transfert d’embryides peut être exécuté facilement.

5. Vérification de la pluripotence en étiquetant avec le marqueur de pluripotence OCT4 (jour 4)

REMARQUE: Lorsque le diamètre des EB est supérieur à 300 μm, prenez plusieurs EB pour la coloration par immunofluorescence du marqueur OCT4 afin de détecter leur pluripotence.

  1. Fixer les EB dans 4% de paraformaldéhyde à 4 °C pendant 30 min, puis laver dans 1x PBS 3x pendant 10 min à chaque fois.
  2. Transférer les EB sur pbS à température ambiante contenant 0,3% de Triton X-100 et 3% de BSA pendant 2 h, puis laver dans PBS 3x pendant 10 min à chaque fois.
    REMARQUE: Après avoir été traités avec Triton X-100, les EB flottent sur la surface du liquide et peuvent être facilement aspirés avec le liquide pendant le nettoyage. Le fonctionnement sous stéréomicroscope est recommandé.
  3. Diluer l’anticorps primaire OCT4 (voir tableau des matériaux) avec 1 mL de 1x PBS contenant 1% de BSA dans un rapport de 1:200 et ajouter aux EB pour l’incubation à 4 °C pendant la nuit, puis laver dans PBS 3x pendant 10 min à chaque fois.
  4. Diluer l’anticorps secondaire respectif (voir tableau des matériaux) avec 1x PBS à 1:500 et ajouter 1 mL aux EB.
  5. Après avoir incubé à température ambiante pendant 2 h, lavez les cellules dans 1x PBS 3x pendant 10 min à chaque fois.
  6. Retirer le PBS, ajouter 2 mL de solution 1x PBS contenant 1 μg/mL de DAPI, incuber à température ambiante pendant 10 min, puis laver dans PBS 3x pendant 10 min à chaque fois.
  7. Déplacez l’EB contenant une petite quantité de liquide sur la lame, scellez la lame avec un verre de couverture recouvert de vaseline disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux) sur le bord, puis observez et collectez l’image sous le microscope confocal à fluorescence.
    REMARQUE : L’expression OCT4 représente la pluripotence EB12. Lorsque l’expression de l’OCT4 est inférieure à 90 %, les EB doivent être écartées et les EB doivent être préparées à nouveau.

6. Induction neuronale (jours 5-7)

  1. Préparez une nouvelle plaque de 6 puits à faible adhérence et ajoutez 3 mL de milieu d’induction neuronal (tableau supplémentaire 2) à chaque puits.
  2. Allumez la lumière douce latérale (mentionnée à l’étape 3.) et éteignez les autres sources lumineuses intérieures.
  3. Transférez les EB sur la plaque de 6 puits avec un milieu d’induction neuronal ajouté (~ 100 EB / puits). Ajoutez le moins possible du support d’origine au nouveau puits.
    REMARQUE: Introduisez des compétences simples de transfert organisationnel. Naturellement, sous gravité et avec une densité relativement plus élevée que le milieu, les EB remis en suspension vont progressivement couler en appliquant l’opération illustrée à la figure 1E. Par conséquent, les EB peuvent être facilement transférés. Étant donné que, par rapport aux EB, les cellules libres et les fragments de cellules mortes coulent plus lentement, la plupart des cellules libres et des fragments de cellules mortes peuvent ainsi être éliminés par cette méthode de sédimentation (Figure 1F).
  4. Incuber les échantillons à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
    REMARQUE: Au microscope, le diamètre des EB était d’environ 500 μm et le bord était translucide, ce qui indique qu’une couche neuroépithéliale s’est formée.
  5. Passez à l’étape suivante.

7. Intégration dans la matrice de la membrane basale (jours 7-10)

  1. Placer la matrice membranaire dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 60 minutes à l’avance pour la dissoudre. Calculez à l’avance la quantité de la matrice requise. Environ 100 EB ont été incorporés dans 1,5 mL de la matrice membranaire.
  2. Allumez la lumière douce latérale et éteignez la source lumineuse sur le dessus de la console.
  3. Gardez la matrice membranaire sur la glace pour éviter la solidification.
  4. Transférer une petite quantité d’EB dans un plat de 60 mm contenant un milieu d’expansion frais (tableau supplémentaire 3) à chaque fois. Réduisez le nombre d’EB pour faciliter la suppression d’un seul EB.
  5. Ensuite, utilisez une nouvelle plaque à faible adhérence de 6 puits. Aspirez un seul EB (contenant environ 10 μL de milieu) avec une pointe de pipette à alésage large de 200 μL (voir tableau des matériaux) à chaque fois, puis ajoutez-le au fond de la plaque de 6 puits pour obtenir des gouttelettes. Utilisez cinq gouttelettes par puits.
    REMARQUE: La clé consiste à ajuster la portée du pistolet à pipette à 50 μL et à aspirer un EB, puis à vous référer au fonctionnement de la Figure 1E. Lorsque l’EB se dépose à l’alésage de la pointe de la pipette, la pointe touche rapidement le fond du puits de la plaque et pousse environ 10 μL de liquide pour former une gouttelette.
  6. Ajouter 15 μL de matrice membranaire à chaque goutte contenant de l’EB et mélanger rapidement. Insérez la boule EB au centre de la gouttelette.
    REMARQUE: Les EB ne doivent pas être aspirés avec une pointe de pipette standard, ce qui endommage l’EB. L’embout de pipette à large alésage de 200 μL doit être utilisé à la place.
  7. Placez la plaque à 6 puits dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min et solidifiez les gouttelettes de matrice membranaire contenant des EB.
  8. Ajouter 3 mL du milieu d’expansion à chaque puits et faire sauter doucement les EB intégrés à la matrice pour les suspendre.
  9. Incuber à 37 °C et 5% de CO2 pendant 3 jours.
    REMARQUE: Si l’on observe un bourgeonnement à la surface de l’EB, cela signifie qu’un neuroépithhélium expansé s’est formé16.

8. Maturation organoïde (jours 10-40)

  1. Retirer délicatement le milieu d’origine et ajouter 3 mL de milieu de maturation (tableau supplémentaire 4) à chaque puits.
  2. Placez la plaque organoïde sur un agitateur horizontal dans un incubateur à 37 °C.
  3. Continuez à faire pivoter la culture horizontalement. Réglez le shaker à la vitesse appropriée.
    REMARQUE: Lors de la culture d’organoïdes cérébraux sur une plaque à 6 puits, une force centrifuge relative (FCR) de 0,11808 x g est plus appropriée, selon le fabricant du shaker horizontal (voir tableau des matériaux). Selon la conversion entre la force centrifuge relative et la vitesse de rotation17,18, RCF = 1,118 x 10−5 × R × tr/min2, où RCF = force centrifuge relative (g), rpm = tours par minute (r/min) et R = rayon de rotation (cm), également connu sous le nom de projection d’agitation. Les paramètres de projection d’agitation de différents agitateurs peuvent être différents. Par conséquent, on peut estimer que la vitesse de rotation est de 299 x (RCF/R)1/2.
  4. Changez le milieu de maturation frais tous les 2-3 jours.
  5. Après 20-30 jours, cultivez progressivement les organoïdes cérébraux jusqu’à maturité.
    REMARQUE: Pendant cette période, les organoïdes peuvent être utilisés pour des expériences et des détections, telles que la détection de marqueurs neuronaux et le séquençage du transcriptome 19,20,21.

9. Sections congelées et immunofluorescence des organoïdes cérébraux

  1. Fixez les organoïdes dans 4% de paraformaldéhyde à 4 °C pendant 16 h, puis lavez-les 3x avec 1x PBS pendant 10 min à chaque fois.
  2. Retirez le PBS et immergez les organoïdes dans du saccharose à 30 % à 4 °C pendant la nuit.
  3. Incorporer les organoïdes dans de la gélatine/saccharose à 10 %/7,5 % à 37 °C pendant 1 h, puis les transférer rapidement dans le moule d’encastrement.
  4. Ajouter de la glace carbonique à de l’éthanol à 100 % pour préparer une boue de glace carbonique/éthanol et y placer les échantillons organoïdes pour une congélation rapide.
  5. Conservez les échantillons congelés dans un congélateur à −80 °C. Au besoin, faites des sections congelées d’une épaisseur de 20 μm.
  6. Reportez-vous aux étapes 5.3.-5.5. pour l’immunofluorescence. Utilisez l’anticorps PAX6 pour marquer les cellules progénitrices apicales, l’anticorps TUJ1 (voir Tableau des matériaux) pour marquer les cellules neuronales 22,23,24 et le DAPI pour la coloration de l’ADN nucléaire.

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Representative Results

La présente étude a induit des CSPi (figure 2B) dans des organoïdes cérébraux (figure 2C). Les EB cultivés au stade précoce ont exprimé le marqueur OCT4 (Figure 2A), ce qui indiquait une bonne pluripotence. Dans la dernière étape, les EB se sont développés en organoïdes cérébraux matures (Figure 2D). La recherche a cultivé des CSPi d’individus normaux en bonne santé et de patients atteints de SCA3 en organoïdes cérébraux (Figure 3A). SCA3, également connu sous le nom de maladie de Machado-Joseph (MJD), est une maladie neurodégénérative causée par une expansion de la polyglutamine dans le gène ATXN325. Les données sur l’ARN (téléchargées dans un dépôt public, voir Table des matériaux) ont révélé des différences significatives dans les profils d’expression génique entre le groupe organoïde cérébral normal et le groupe organoïde cérébral SCA3 dans des voies telles que le transport des neurotransmetteurs, la formation de synapses et la régulation (Figure 3B). Le logiciel Cufflinks a été utilisé pour calculer le niveau d’expression des gènes et la différence26. DEseq2 a également été utilisé pour analyser les données27.

Figure 1
Figure 1: Optimisation des opérations de changement et de transfert de milieu des EB. (A) Préparation eb. Les CSPi ont été digérés et ajoutés aux plaques spécialisées de 24 puits (à gauche). Les cellules formaient des EB (à droite). La barre d’échelle est de 400 μm. (B) Diagramme schématique de la lumière douce éclairée latéralement pour aider à observer les organoïdes. (C) Les EB ont été observés avec différentes sources lumineuses. Flèche jaune: lumière éclairée latéralement; flèche rouge: fond sombre; flèches vertes : EB. (D) Un flux tourbillonnant est induit par la rotation de la parabole le long d’une orbite circulaire. En raison de l’écoulement tourbillonnant, un flux secondaire dirigé vers le centre est induit. Les EB convergent vers le centre de la parabole entraînés par le flux secondaire généré par la rotation. Flèches blanches : EB. E) Transfert organoïde. (I) Tout d’abord, une pointe de pipette à large bouche est utilisée pour aspirer la solution du mélange, y compris les EB et le milieu de culture. (II) Ensuite, tout en maintenant la pipette droite, les EB s’enfoncent progressivement sous l’effet de gravité et convergent vers l’embouchure de la pointe de la pipette. (III) Lorsque la bouche de l’embout de la pipette touche à nouveau la surface du liquide (généralement le milieu frais) et qu’en raison de la tension superficielle du liquide, (IV) les EB s’enfoncent rapidement dans le milieu (pas besoin de soufflage supplémentaire par pipetage manuel). Ligne rouge: le niveau de liquide; flèches jaunes : EB. (F) Étant donné que les cellules libres et les fragments de cellules mortes coulent plus lentement que les EB, la plupart des cellules libres et des fragments de cellules mortes peuvent donc être éliminés par la méthode de sédimentation ci-dessus pour faciliter le transfert d’embryides. La boîte rouge dans le coin supérieur droit est une image agrandie. La barre d’échelle est de 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Induction des CSPi dans les organoïdes cérébraux. (A) Coloration par immunofluorescence des EB. OCT4 : facteur de transcription de liaison à l’octamère-4 ; DAPI: Dichlorhydrate de DAPI. La barre d’échelle est de 100 μm. (B) iPSCs. La barre d’échelle est de 400 μm. (C) Organoïdes cérébraux. La barre d’échelle est de 200 μm. (D) Coloration par immunofluorescence des organoïdes cérébraux. PAX6: la boîte appariée 6 est le marqueur des cellules progénitrices apicales; TUJ1 : la β-tubuline de classe III spécifique aux neurones est un marqueur spécifique des neurones. La barre d’échelle est de 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Culture de CSPi d’individus en bonne santé et de patients atteints de SCA3 en organoïdes cérébraux. (A) Différentes étapes couvrant la maturation des organoïdes cérébraux à partir des EB. NC: groupe normal; SCA3 : Groupe SCA3/MJD. Les barres d’échelle des images à faible et à fort grossissement sont respectivement de 400 μm et 200 μm. (B) Tableau d’analyse de l’enrichissement GO des gènes régulés à la baisse et exprimés différentiellement entre les organoïdes normaux et les organoïdes SCA3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Identification des répétitions ATXN3 CAG par électrophorèse capillaire. (A) L’iPSC (SCA3-iPSC) du patient SCA3 a été identifié comme ayant des répétitions CAG 26/78 dans le gène ATXN3. (B) L’iPSC humain normal (NC-iPSC) a été identifié comme ayant 14/14 répétitions CAG dans le gène ATXN3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2: Préparation de la lampe à lumière douce. (A) L’alimentation et les lumières LED ont été installées sur un côté de la carte acrylique (comme indiqué dans la boîte pointillée rouge). La longueur d’onde de diffusion de la lampe à lumière douce LED est de 450-470 nm, le flux lumineux est de 1300-1800 lm et l’indice de rendu des couleurs est de 75-85 Ra. (B) Il a été vérifié si les ampoules LED pouvaient s’allumer normalement (comme indiqué dans la boîte en pointillés rouge). (C) Un tampon blanc a été collé à l’avant et à l’arrière de la plaque acrylique (comme indiqué par les flèches rouges). D) L’aspect général de la lampe à lumière douce. (E) La lampe à lumière douce peut également être remplacée par un tampon lumineux de peinture LED commercial sans cadre, qui est généralement utilisé pour le suivi lors de la copie de croquis. Une couche de film blanc doit être collée directement au-dessus du tampon lumineux de peinture LED. (F) La lampe à lumière douce au travail. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1: Composition du milieu de formation EB. Au stade initial de la formation de l’EB (généralement les 2 premiers jours), Y-27632 (50 μM) et bFGF (4 ng/mL) doivent être ajoutés au milieu de formation de l’EB. Le milieu doit être filtré avec une unité de filtration de 0,2 μm et stocké à −20 °C. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 2 : Composition du milieu d’induction neuronale. Le milieu doit être filtré avec une unité de filtration de 0,2 μm et stocké à −20 °C. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 3 : Composition du milieu d’expansion. Une dilution de 1:100 du 2-mercaptoéthanol a été préparée dans le DMEM-F12, et 87,5 μL de celui-ci ont été ajoutés au milieu d’expansion. B27 ne doit pas contenir de vitamine A. Le milieu doit être filtré avec une unité de filtration de 0,2 μm et stocké à −20 °C. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 4 : Composition du milieu de maturation. Une dilution 1:100 du 2-mercaptoéthanol dans le DMEM-F12 a été préparée et 87,5 μL de celui-ci ont été ajoutés au milieu de maturation. B27 ne doit pas contenir de vitamine A. Le milieu doit être filtré avec une unité de filtration de 0,2 μm et stocké à −20 °C. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Les organoïdes cérébraux ouvrent de nouvelles voies pour la recherche médicale. De nombreuses applications utiles de cette technologie commencent seulement à être explorées28. Cette recherche a révélé que les résultats du séquençage du transcriptome des organoïdes cérébraux génétiquement malades et des organoïdes cérébraux normaux peuvent refléter les différences entre la maladie et la santé. Par exemple, les résultats de l’analyse des données ARN-seq (figure 3B) sont cohérents avec de nombreuses études rapportées sur les maladies SCA3 29,30,31,32. Les opérations expérimentales, telles que le changement de milieu, le transfert d’EB et l’emballage, sont cruciales pour cultiver des organoïdes cérébraux et déterminer si des organoïdes ayant une bonne uniformité peuvent être préparés33,34. Dans cette étude, un protocole organoïde cérébral qui a facilité le changement de milieu et le transfert organoïde est introduit. Une lampe à lumière douce latérale peut grandement aider au fonctionnement de la culture organoïde. Cependant, ce n’est pas difficile à faire, le tampon lumineux de peinture LED et le traitement simple peuvent également le remplacer. La méthode simple d’échange de liquide et l’opération de transfert organoïde facilitent l’ensemble du processus de culture. L’application d’organoïdes cérébraux est souvent affectée par le problème de la mauvaise uniformité35. La plus grande différence entre cette étude et d’autres directives de culture organoïde cérébrale est que l’accent est mis sur l’optimisation de l’opération pour rendre l’expérience plus reproductible.

Il est très important de maintenir la stabilité du système culturel. Si les conditions le permettent, il est suggéré de donner la priorité au milieu organoïde cérébral commercial, ce qui peut réduire efficacement les grandes différences dans les résultats expérimentaux dans différents lots en raison de l’instabilité du milieu. En outre, le stockage du milieu organoïde cérébral à 4 °C ne doit pas durer plus de 2 semaines; sinon, cela affectera la stabilité du système de culture. Bien sûr, il est également important de s’assurer que les CSPi utilisés sont pluripotents plutôt que différenciés. La détection par immunofluorescence OCT4 peut être utilisée. Si les cellules OCT4 positives sont inférieures à 90%, il est recommandé de les remplacer par des CSPi de meilleure qualité et de cultiver à nouveau des organoïdes cérébraux.

Il existe certaines limites dans la technologie de culture organoïde cérébrale introduite dans cette étude. Par exemple, les organoïdes cérébraux ne peuvent pas être cultivés de manière intensive au stade ultérieur du développement, ce qui est un gaspillage de l’espace de culture. C’est aussi un problème urgent à résoudre dans l’application d’organoïdes cérébraux. Si de nombreux organoïdes cérébraux présentent une expansion creuse, le nombre d’organoïdes dans chaque puits est réduit, la fréquence d’échange moyenne augmente et les organoïdes sont dans un état non hypooxique avec suffisamment de nutriments.

Cette étude est un complément opérationnel à de nombreuses méthodes de culture organoïdes cérébrales existantes 12,36,37 et même à d’autres types de méthodes de culture d’organes 38,39. Cela aidera à développer des systèmes automatisés de culture organoïde à l’avenir et à promouvoir la recherche et l’application des organoïdes. Si la technologie d’amélioration de l’effet de réflexion diffuse de la lumière des organoïdes est utilisée dans le système de culture intelligent automatique, elle peut théoriquement remplacer la caméra d’amplification d’image de haute précision, et seul un dispositif de reconnaissance d’image ordinaire doit être installé. En outre, l’échange de milieu et le transfert organoïde par écoulement secondaire généré par la rotation et la sédimentation naturelle sur la tête d’aspiration sont théoriquement plus réalisables que la centrifugation dans les futurs équipements de culture automatique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (subvention n ° 2020A0505100062), le projet de sujets clés de la science et de la technologie de la ville de Guangzhou (subvention n ° 201904020025), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions n ° 31872800, 32070582, 82101937) et le projet de subvention de recherche postdoctorale de la ville de Guangzhou (à Bangzhu Chen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm Filter NEST Biotechnology, China 331001
1000 μL wide-bore pipette tip Thermo Fisher Scientific, USA 9405163
200 μL wide-bore pipette tip Thermo Fisher Scientific, USA 9405020
2-Mercaptoethanol Merck, Germany 8057400005
4% Paraformaldehyde Servicebio, China G1101
6-well low adhesion plate NEST Biotechnology, China 703011 It is used for EBs suspension cultures
Aaccute cell detachment solution STEMCELL Technologies, Canada 07920 It is used to digest iPSC into single cells.
AggreWell800 24-well STEMCELL Technologies, Canada 34811 Microporous culture plate for EBs preparation.
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies, Canada 07010 Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion
B27-vit. A supplement Thermo Fisher Scientific, USA 12587010
bFGF Peprotech, USA GMP100-18B
BSA Beyotime Biotechnology, China ST025
Centrifuge Eppendorf, Germany 5810 R It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.
Cover glass Shitai Laboratory Equipment, China 10212020C
DAPI Beyotime Biotechnology, China C1002 Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific, USA 11330032
ES-quality FBS Thermo Fisher Scientific, USA 10270106
Ficoll Paque General Electric Company, USA 17-5442-02 Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.
Gelatin Sangon Bioteach, China A609764
Glutamax supplement Thermo Fisher Scientific, USA 35050061
Glutamax supplement Thermo Fisher Scientific, USA 17504044
Goat anti-Chicken IgY  secondary antibody Abcam, UK ab150171 Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody Abcam, UK ab150120 Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody Abcam, UK ab150077 Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.
Heparin Merck, Germany H3149
Horizontal shaker Servicebio, China DS-H200 Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).
Insulin Merck, Germany I9278-5ML
KOSR Thermo Fisher Scientific, USA 10828028
Matrigel Corning, USA 354277 Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature.
MEM-NEAA Thermo Fisher Scientific, USA 11140050
mTeSR1 STEMCELL Technologies, Canada 85850 iPSC culture medium
N2 supplement Thermo Fisher Scientific, USA 17502048
Neurobasal Thermo Fisher Scientific, USA 21103049
OCT4 primary antibody Abcam, UK ab19857 Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution.
Pathological frozen slicer Leica, Germany Leica CM1860
PAX6 primary antibody Abcam, UK ab78545 Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.
PBS STEMCELL Technologies, Canada 37350
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific, USA 15140122
PSC dissociation solution Beijing Saibei Biotechnology, China CA3001500 Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.
Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific, USA A16518 Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.
Slide Glass Shitai Laboratory Equipment, China 188105W
Soft light lamp NUT NUT A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.
STEMdiff Cerebral Organoid Kit STEMCELL Technologies, Canada 8570 Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit STEMCELL Technologies, Canada 8571 Maturation Medium
Sucrose Sangon Bioteach, China A502792
Triton X-100 Merck, Germany X100
TUJ1 primary antibody Abcam, UK ab41489 Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.
Vaseline Sangon Bioteach, China A510146
Y-27632 STEMCELL Technologies, Canada 72302 Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS.
Weblink
Raw sequencing data Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences GSA-Human: HRA002430 https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/

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Bioingénierie numéro 184
Faciliter la culture organoïde cérébrale <em>grâce à l’éclairage</em> latéral à lumière douce
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Chen, B., Lin, Q., Liu, N., Chen,… More

Chen, B., Lin, Q., Liu, N., Chen, D., Zhang, Y., Sun, X. Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination. J. Vis. Exp. (184), e63989, doi:10.3791/63989 (2022).

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