Summary
توفر المواد العضوية الدماغية فرصا غير مسبوقة لدراسة تطور الأعضاء وأمراض الأمراض البشرية. على الرغم من تحقيق نجاح كبير مع أنظمة الزراعة العضوية الدماغية ، إلا أنه لا تزال هناك صعوبات تشغيلية في تطبيق هذه التكنولوجيا. يصف هذا البروتوكول إجراء عضوي دماغي يسهل التغيير المتوسط والنقل العضوي.
Abstract
في الوقت الحاضر ، لا تزال تكنولوجيا الزراعة العضوية الدماغية معقدة للعمل ويصعب تطبيقها على نطاق واسع. من الضروري إيجاد حل بسيط وعملي. لذلك ، يقترح بروتوكول عضوي دماغي أكثر جدوى في هذه الدراسة. لحل الإزعاج الذي لا مفر منه في التغيير المتوسط ونقل العضوية في المرحلة المبكرة ، يعمل البحث الحالي على تحسين تقنية التشغيل من خلال تطبيق المبدأ الهندسي. تم اعتماد مصباح ضوئي ناعم لإلقاء الضوء أفقيا على عينات الجسم الجنيني (EB) ، مما يسمح برؤية EBs بالعين المجردة من خلال تأثير الانعكاس المنتشر المحسن. باستخدام مبدأ التدفق الثانوي الناتج عن الدوران ، تتجمع المواد العضوية نحو مركز البئر ، مما يسهل تشغيل التغيير المتوسط أو النقل العضوي. بالمقارنة مع الخلية المشتتة ، يستقر الجسم الجنيني بشكل أسرع في الماصة. باستخدام هذه الظاهرة ، يمكن إزالة معظم الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة بشكل فعال بطريقة بسيطة ، مما يمنع EBs من تكبد أضرار من الطرد المركزي. تسهل هذه الدراسة تشغيل الثقافة العضوية الدماغية وتساعد على تعزيز تطبيق المواد العضوية في الدماغ.
Introduction
بالمقارنة مع أنظمة الاستزراع ثنائية الأبعاد (2D) ، تتمتع أنظمة الاستزراع ثلاثية الأبعاد (3D) بالعديد من المزايا ، بما في ذلك التكرار الحقيقي والاستنساخ الفعال للهياكل المعقدة لبعض الأعضاء1. لذلك ، تعد المواد العضوية الدماغية واحدة من الطرق المساعدة المهمة لمجالات البحث في نمو الدماغ البشري والمرض2 ، وفحص الأدوية ، والعلاج الخلوي.
زراعة المواد العضوية الدماغية عن طريق طريقة التعليق الدوار تفضي إلى تطورها ونضجها3. على الرغم من أن أنظمة الزراعة العضوية الدماغية حققت نجاحا كبيرا ، إلا أنها لا تزال تواجه تحديات حرجة تحد من تطبيقها. على سبيل المثال ، تنطوي الزراعة اليدوية على خطوات معالجة معقدة وتضع عقبات أمام تحقيق تطبيقات واسعة النطاق. بالإضافة إلى ذلك ، في كل مرحلة من مراحل النمو في ثقافة المواد العضوية الدماغية ، هناك حاجة إلى تغييرات في وسائل الإعلام المختلفة والسيتوكينات4. ومع ذلك ، في المرحلة المبكرة ، يكون للعضويات أو EBs أحجام صغيرة (حوالي 200 ميكرومتر إلى 300 ميكرومتر) ولا يمكن الوصول إليها بصريا تقريبا بدون جهاز مناسب. حتما ، يتم مسح كمية معينة من العينات العضوية الثمينة بعيدا عند تغيير الوسط. تم استكشاف العديد من التقنيات للتغلب على هذا في أنواع أخرى من الثقافات العضوية ، وتشمل بعض الأمثلة غمر رقائق العضوية بأكملها في وسط ثقافة لمدة 3 أيام دون تدخل5 ؛ إضافة وسط جديد من خلال الغطاء بعد امتصاص الوسط القديم باستخدام ورق ماص5 ؛ أو تطبيق خطوط أنابيب الموائع الدقيقة المعقدة لتبادل السوائل6،7،8. عقبة أخرى تواجه في المرحلة المبكرة من زراعة المواد العضوية هي صعوبة تحقيق ملاحظات مباشرة بالعين المجردة ، والتي يمكن أن تسبب عمليات سيئة تؤدي إلى تلف عضوي وفقدانه أثناء خطوات نقل المواد العضوية. لذلك ، من الضروري إنشاء بروتوكول أكثر جدوى يسهل التغيير المتوسط ونقل المواد العضوية لتوليد المواد العضوية.
يتم اقتراح عملية محسنة مقابلة تستند إلى المبادئ الهندسية للتغلب على هذه المشاكل ، مما يسهل بشكل كبير ومريح العديد من الإجراءات العضوية. في الطبيعة ، عندما تشرق الشمس في منزل من خلال فجوة نافذة ، يمكن للعين المجردة رؤية الغبار يرقص في شعاع الضوء. بسبب الانعكاس المنتشر لأشعة الشمس على الغبار ، يتم انكسار بعض الضوء في مقلة العين لإنتاج صورة مرئية. مستوحاة من مبدأ هذه الظاهرة 9,10 ، صنعت هذه الدراسة مصباحا ضوئيا ناعما وأضاءت EBs أفقيا. وقد وجد أن EBs يمكن أن تكون واضحة بصريا دون التأثير على نطاق المشاهدة. يتم توليد تدفق ثانوي يشير إلى المركز في السائل عن طريق تدوير لوحة الثقافة بسبب تيارات الدوامة11. تتراكم EBs المنتشرة أصلا في وسط اللوحة. بناء على ذلك ، وظاهرة أن سرعة الترسيب للعضويات أسرع من سرعة الخلايا ، يتم اقتراح طريقة تشغيل سهلة للتغيير المتوسط ونقل المواد العضوية دون الطرد المركزي. يمكن فصل المواد العضوية في وسط المزرعة بشكل فعال عن الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة من خلال عملية النقل هذه.
هنا ، يتم اقتراح بروتوكول سهل التشغيل لتوليد عضويات دماغية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. تم تحسين تقنية التشغيل من خلال تطبيق المبدأ الهندسي ، مما يجعل العمليات في ثقافة 3D بسيطة ومجدية مثل تلك الموجودة في ثقافة 2D. طريقة تبادل السوائل المحسنة وعملية نقل العضوية مفيدة أيضا لأنواع أخرى من ثقافة العضوية وتصميم آلات الزراعة التلقائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجري البروتوكول عقب إعلان هلسنكي. تم منح الموافقة من قبل لجنة الأخلاقيات للمستشفى الثالث التابع لجامعة قوانغتشو الطبية (المراجعة الطبية والأخلاقية [2021] رقم 022). قبل التجربة، تم إعداد كل وسيط وفقا لصيغة يورغن أ. كنوبليش12 (الجداول التكميلية 1-4)، أو تم استخدام مجموعة المواد العضوية الدماغية المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). تم إنشاء iPSCs المستخدمة في هذه الدراسة سابقا من قبل مختبرنا وحصلت على إعفاء مستنير. تم إنشاء SCA3-iPSCs من أنثى تبلغ من العمر 31 عاما من مريض الرنح الشوكي من النوع 3 (SCA3) تم تصنيفه وراثيا على أنه يحتوي على تكرار 26/78 CAG في جين ATXN313 (الشكل التكميلي 1A). تم اختيار iPSCs البشرية العادية المذكورة في مقالة سابقة على أنها NC-iPSCs 14 ، وتم تحديد جين ATXN3 على أنه يحتوي على تكرار CAG 14/14 (الشكل التكميلي 1B).
1. تحضير الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)
- جمع 3 مل من الدم المحيطي عن طريق الوخز بالإبر الوريدية بموافقة مستنيرة من المتطوعين والمرضى.
- عزل خلايا الدم الطرفية أحادية النواة وفقا لطريقة Ficoll-Paque15.
- إنشاء iPSCs وفقا لبروتوكول مجموعة إعادة برمجة Sendai (انظر جدول المواد).
- قم بزراعة iPSCs بوسط mTeSR1 في أطباق بتري 35 مم مغطاة ب Matrigel (مصفوفة غشاء سفلي ، انظر جدول المواد). تغيير الوسط كل يوم. يجب ألا تتجاوز كثافة نمو iPSC 75٪.
- هضم الخلايا باستخدام محلول تفكك PSC (انظر جدول المواد) وزراعتها الفرعية بنسبة 1: 5 كل 3-5 أيام.
تنبيه: يتم استخدام فيروس سينداي هنا. ويجب تشغيله في خزانة السلامة الأحيائية، ويجب اتخاذ تدابير الحماية الذاتية. يجب أن يكون من الواضح ما إذا كان يمكن استخدامه بشكل قانوني في البلد المحلي. ويجب اتباع قوانين ولوائح السلامة الأحيائية المحلية بدقة عند استخدامها.
2. إعداد EB (أيام 0-1)
- قم بإزالة وسط mTeSR1 من iPSCs باستخدام ماصة واغسله 2x مع 1 مل من 1x PBS.
- قم بإزالة PBS باستخدام ماصة ، وأضف 300 ميكرولتر من محلول انفصال الخلايا (انظر جدول المواد) لهضم iPSCs إلى خلايا مفردة لمدة 3-4 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- أعد تعليق الخلايا في 2 مل من وسط تكوين EB (الجدول التكميلي 1) ثم قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 5 دقائق عند 300 × g (درجة حرارة الغرفة).
- عالج اللوحة المتخصصة المكونة من 24 بئرا مسبقا بمحلول شطف مضاد للالتصاق (500 ميكرولتر / بئر) لمدة 5 دقائق (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يعد محلول الشطف المضاد للالتصاق ضروريا لتكوين EB والكروي الأمثل. - أعد تعليق الخلايا في وسط تكوين EB الذي يحتوي على Y-27632 (التركيز النهائي ، 10 ميكرومتر ، انظر جدول المواد) ، بكثافة خلية تبلغ 1.5 × 106 خلايا / مل.
- قم بإزالة محلول الشطف المضاد للالتصاق ، وشطف كل بئر باستخدام 2 مل من وسط تشكيل EB.
- أضف الخلايا إلى الألواح المتخصصة المكونة من 24 بئرا بكثافة 3 × 106 خلايا/بئر (الشكل 1A، إلى اليسار).
ملاحظة: عادة ، يمكن إعداد 300 EBs في كل بئر. يمكن لهذه الطريقة إعداد كميات كبيرة من EBs من نفس الحجم. - جهاز طرد مركزي اللوحة عند 100 × g لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتوزيع الخلايا بشكل موحد في كل غرفة في أسفل اللوحة (الشكل 1A ، على اليمين).
ملاحظة: إذا لم يكن هناك جهاز طرد مركزي مناسب ، فيمكن أيضا وضع اللوحة مباشرة في الحاضنة للثقافة الثابتة ، ولكن وقت تكوين كرة EB سيكون بعد عدة ساعات من ذلك تحت الطرد المركزي العادي. - احتضان العينات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة. إذا لم يتم استخدام الطرد المركزي في الخطوة السابقة ، فقم بالحضانة لمدة 36 ساعة. حافظ على ثبات العينة ، ولا تخرجها من الحاضنة خلال هذه الفترة.
3. إعداد مصباح الضوء الناعم (اليوم 1)
- استخدم لوح أكريليك شفاف بسماكة 0.3-0.5 سم بحجم ورق A5. الصق منصات بيضاء على الجزء الأمامي والخلفي من لوحة الاكريليك.
- قم بتثبيت صف من مصابيح LED البيضاء على حافة اللوحة بحيث يمكن للأضواء الدخول من جانب لوحة الأكريليك ثم إطلاقها بالتوازي (الشكل التكميلي 2A-F ، الشكل 1B).
ملاحظة: نظرا لأن أقطار EBs في المرحلة المبكرة تبلغ حوالي 200 ميكرومتر إلى 300 ميكرومتر ، فمن الصعب ملاحظتها بوضوح بالعين المجردة تحت مصباح الفلورسنت للمقاعد النظيفة. في المقابل ، بسبب تعزيز الانعكاس المنتشر ، يمكننا اكتشاف EBs بوضوح باستخدام ضوء ناعم مضاء أفقيا (الشكل 1B ، C). يوصى باستخدام لوحة من 6 آبار لثقافات EB في التجارب اللاحقة. ومع ذلك ، لإظهار التأثير البصري للضوء الناعم بشكل أفضل ، يتم استخدام الأطباق في بعض الأحيان لالتقاط الصور ومقاطع الفيديو في هذه الدراسة بدلا من الأطباق ، لذا يرجى عدم إساءة الفهم. يمكن أيضا استخدام مصباح الإضاءة الناعم المضاء أفقيا للوحة المكونة من 6 آبار.
- قم بتثبيت صف من مصابيح LED البيضاء على حافة اللوحة بحيث يمكن للأضواء الدخول من جانب لوحة الأكريليك ثم إطلاقها بالتوازي (الشكل التكميلي 2A-F ، الشكل 1B).
4. تحويل EB والاستبدال المتوسط (الأيام 2-5)
- قم بإعداد لوحة جديدة منخفضة الالتصاق من 6 آبار ، وأضف 2 مل من وسط تكوين EB إلى كل بئر.
- قم بإزالة EBs مع الوسط باستخدام طرف ماصة عريض التجويف سعة 1000 ميكرولتر (انظر جدول المواد) وانقلها إلى لوحة الالتصاق المنخفضة ذات 6 آبار (~ 100 EBs / well).
ملاحظة: تعتمد عملية التشغيل على مصباح ضوء ناعم (مذكور في الخطوة 3.) لتسهيل مراقبة EBs. أوقف تشغيل مصادر الإضاءة الداخلية الأخرى للحصول على التأثير البصري للضوء الناعم بشكل أفضل. - استبدله بنفس الحجم من وسيط تشكيل EB الطازج كل يوم. استخدم التدفق الثانوي لجمع EBs إلى المركز وتغيير الوسط.
- استنشاق الوسط القديم عن طريق السحب إلى حافة البئر ببطء. لا تمتص من الصعب جدا. خلاف ذلك ، ستتم إزالة EBs معا. ثم أضف وسيطا جديدا لإعادة تعليق EBs.
ملاحظة: التدفق الثانوي الأساسي (الشكل 1D). حفز تدفق دوامة عن طريق تدوير الطبق على طول مدار دائري. بسبب تدفق الدوامة ، يتم تحفيز تدفق ثانوي موجه نحو المركز. تتلاقى EBs أو المواد العضوية مع مركز البئر بسبب التدفق الثانوي المتولد من خلال الدوران ، وبعد ذلك يمكن تنفيذ التغيير المتوسط أو النقل الجنيني بسهولة.
- استنشاق الوسط القديم عن طريق السحب إلى حافة البئر ببطء. لا تمتص من الصعب جدا. خلاف ذلك ، ستتم إزالة EBs معا. ثم أضف وسيطا جديدا لإعادة تعليق EBs.
5. التحقق من تعدد القدرات عن طريق وضع العلامات مع علامة تعدد القدرات OCT4 (اليوم 4)
ملاحظة: عندما يكون قطر EBs أكبر من 300 ميكرومتر ، خذ العديد من EBs لتلطيخ التألق المناعي لعلامة OCT4 للكشف عن تعدد قدراتها.
- إصلاح EBs في 4٪ paraformaldehyde في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تليها الغسيل في 1x PBS 3x لمدة 10 دقائق في كل مرة.
- انقل EBs إلى PBS في درجة حرارة الغرفة التي تحتوي على 0.3٪ Triton X-100 و 3٪ BSA لمدة 2 ساعة ، تليها الغسيل في PBS 3x لمدة 10 دقائق في كل مرة.
ملاحظة: بعد معالجتها ب Triton X-100 ، تطفو EBs على سطح السائل ويمكن امتصاصها بسهولة مع السائل أثناء التنظيف. يوصى بالتشغيل تحت المجهر المجسم. - قم بتخفيف الجسم المضاد الأولي OCT4 (انظر جدول المواد) مع 1 مل من 1x PBS يحتوي على 1٪ BSA بنسبة 1:200 وأضف إلى EBs للحضانة عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها ، ثم اغسلها في PBS 3x لمدة 10 دقائق في كل مرة.
- قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي المعني (انظر جدول المواد) باستخدام 1x PBS في 1:500 وأضف 1 مل إلى EBs.
- بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة ، اغسل الخلايا في 1x PBS 3x لمدة 10 دقائق في كل مرة.
- قم بإزالة PBS ، وأضف 2 مل من محلول PBS 1x الذي يحتوي على 1 ميكروغرام / مل DAPI ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، ثم اغسله في PBS 3x لمدة 10 دقائق في كل مرة.
- حرك EB الذي يحتوي على كمية صغيرة من السائل على الشريحة ، وأغلق الشريحة بغطاء زجاجي مطلي بالفازلين المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) على الحافة ، ثم راقب الصورة واجمعها تحت المجهر البؤري الفلوري.
ملاحظة: يمثل تعبير OCT4 تعدد القدرات EB12. عندما يكون التعبير عن OCT4 أقل من 90٪ ، يجب التخلص من EBs ، ويجب إعداد EBs مرة أخرى.
6. الحث العصبي (أيام 5-7)
- قم بإعداد صفيحة جديدة من 6 آبار ذات التصاق منخفض ، وأضف 3 مل من وسط الحث العصبي (الجدول التكميلي 2) إلى كل بئر.
- قم بتشغيل الضوء الناعم الجانبي (المذكور في الخطوة 3.) وأوقف تشغيل مصادر الإضاءة الداخلية الأخرى.
- انقل EBs إلى لوحة 6 آبار مع إضافة وسط تحريض عصبي (~ 100 EBs / well). أضف أقل قدر ممكن من الوسط الأصلي إلى البئر الجديد.
ملاحظة: إدخال مهارات بسيطة من نقل العضوية. وبطبيعة الحال، في ظل الجاذبية وبكثافة أعلى نسبيا من المتوسط، ستغرق EBs المعاد تعليقها تدريجيا من خلال تطبيق العملية الموضحة في الشكل 1E. وبالتالي ، يمكن نقل EBs بسهولة. وبما أن الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة تغرق ببطء أكبر، مقارنة بالخلايا EBs، فإن معظم الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة يمكن بالتالي إزالتها من خلال طريقة الترسيب هذه (الشكل 1F). - احتضان العينات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: تحت المجهر ، كان قطر EBs حوالي 500 ميكرومتر ، وكانت الحافة شفافة ، مما يشير إلى تشكل طبقة ظهارية عصبية. - انتقل إلى الخطوة التالية.
7. التضمين في مصفوفة الغشاء السفلي (الأيام 7-10)
- ضع مصفوفة الغشاء في ثلاجة 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة مقدما حتى تذوب. احسب مقدار المصفوفة المطلوبة مقدما. تم تضمين ما يقرب من 100 EBs في 1.5 مل من مصفوفة الغشاء.
- قم بتشغيل الضوء الناعم الجانبي وأطفئ مصدر الضوء الموجود أعلى وحدة التحكم.
- حافظ على مصفوفة الغشاء على الجليد لمنع التصلب.
- انقل كمية صغيرة من EBs إلى طبق 60 مم يحتوي على وسط تمدد طازج (الجدول التكميلي 3) في كل مرة. قلل من عدد EBs لتسهيل إزالة EB واحد.
- ثم ، استخدم لوحة التصاق منخفضة جديدة من 6 آبار. امتص EB واحد (يحتوي على وسط 10 ميكرولتر تقريبا) مع طرف ماصة عريض التجويف 200 ميكرولتر (انظر جدول المواد) في كل مرة ، ثم أضفه إلى أسفل اللوحة المكونة من 6 آبار لصنع قطرات. استخدم خمس قطرات لكل بئر.
ملاحظة: المفتاح هو ضبط نطاق مسدس الماصة إلى 50 ميكرولتر وامتصاص EB ، ثم الرجوع إلى تشغيل الشكل 1E. عندما يستقر EB على تجويف طرف الماصة ، يلمس الطرف بسرعة قاع البئر من اللوحة ويدفع ما يقرب من 10 ميكرولتر من السائل لتشكيل قطرة. - أضف 15 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء إلى كل قطرة تحتوي على EB واخلطها بسرعة. قم بتضمين كرة EB في وسط القطرة.
ملاحظة: يجب عدم شفط EBs بطرف ماصة قياسي، مما يؤدي إلى تلف EB. يجب استخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر عريض التجويف بدلا من ذلك. - ضع الصفيحة المكونة من 6 آبار في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وقم بتصلب قطرات مصفوفة الغشاء التي تحتوي على EBs.
- أضف 3 مل من وسيط التمدد إلى كل بئر وقم بتفجير EBs المضمنة في المصفوفة بلطف لتعليقها.
- احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 لمدة 3 أيام.
ملاحظة: إذا لوحظ ظهور التبرعم على سطح EB ، فهذا يعني أن ظهارة عصبية موسعة قد تشكلت16.
8. النضج العضوي (أيام 10-40)
- قم بإزالة الوسط الأصلي برفق ، وأضف 3 مل من وسط النضج (الجدول التكميلي 4) إلى كل بئر.
- ضع الصفيحة العضوية على شاكر أفقي في حاضنة 37 درجة مئوية.
- استمر في تدوير الثقافة أفقيا. اضبط الخلاط على السرعة المناسبة.
ملاحظة: عند زراعة المواد العضوية الدماغية على صفيحة من 6 آبار ، تكون قوة الطرد المركزي النسبية (RCF) البالغة 0.11808 × g أكثر ملاءمة ، وفقا للشركة المصنعة للشاكر الأفقي (انظر جدول المواد). وفقا للتحويل بين قوة الطرد المركزي النسبية وسرعة الدوران 17,18 ، RCF =1.118 × 10−5 × R × دورة في الدقيقة 2 ، حيث RCF = قوة الطرد المركزي النسبية (g) ، دورة في الدقيقة = دورات في الدقيقة (ص / دقيقة) ، و R = نصف قطر الدوران (سم) ، المعروف أيضا باسم رمي الاهتزاز. قد تكون معلمات رمي الاهتزاز للهزازات المختلفة مختلفة. لذلك ، يمكن تقدير أن سرعة الدوران هي دورة في الدقيقة = 299 × (RCF / R) 1/2. - تغيير وسط النضج الطازج كل 2-3 أيام.
- بعد 20-30 يوما ، قم تدريجيا بزراعة المواد العضوية الدماغية حتى النضج.
ملاحظة: خلال هذه الفترة، يمكن استخدام المواد العضوية للتجارب والكشف، مثل الكشف عن العلامات العصبية وتسلسل النسخ19،20،21.
9. الأقسام المجمدة والتألق المناعي للعضويات الدماغية
- إصلاح المواد العضوية في 4٪ بارافورمالدهيد في 4 درجة مئوية لمدة 16 ساعة ثم غسلها 3x مع 1x PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة.
- قم بإزالة PBS ، واغمر المواد العضوية في 30٪ من السكروز عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- قم بتضمين المواد العضوية في 10٪ / 7.5٪ جيلاتين / سكروز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم نقلها بسرعة إلى قالب التضمين.
- أضف الثلج الجاف إلى الإيثانول بنسبة 100٪ لإعداد ملاط الثلج الجاف / الإيثانول ، وضع العينات العضوية فيه للتجميد السريع.
- قم بتخزين العينات المجمدة في ثلاجة -80 درجة مئوية. عند الحاجة ، قم بعمل أقسام مجمدة بسماكة 20 ميكرومتر.
- راجع الخطوات من 5.3.إلى 5.5. للتألق المناعي. استخدم الجسم المضاد PAX6 لتسمية الخلايا السلفية القمية ، والجسم المضاد TUJ1 (انظر جدول المواد) لتسمية الخلايا العصبية22،23،24 ، و DAPI لتلطيخ الحمض النووي النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد حفزت هذه الدراسة iPSCs (الشكل 2B) على الدخول في عضويات دماغية (الشكل 2C). عبرت EBs المزروعة في المرحلة المبكرة عن علامة OCT4 (الشكل 2A) ، والتي تشير إلى تعدد القدرات الجيد. في المرحلة اللاحقة ، تطورت EBs إلى عضويات دماغية ناضجة (الشكل 2D). قام البحث بزراعة iPSCs من الأفراد الأصحاء العاديين ومرضى SCA3 إلى عضويات دماغية (الشكل 3A). SCA3 ، المعروف أيضا باسم مرض ماتشادو جوزيف (MJD) ، هو اضطراب تنكسي عصبي ناجم عن توسع متعدد الجلوتامين في جين ATXN325. كشفت بيانات RNA-seq (التي تم تحميلها إلى مستودع عام ، انظر جدول المواد) عن اختلافات كبيرة في ملفات تعريف التعبير الجيني بين المجموعة العضوية الدماغية الطبيعية ومجموعة SCA3-الدماغية العضوية في مسارات مثل نقل الناقل العصبي ، وتكوين المشبك ، والتنظيم (الشكل 3B). تم استخدام برنامج روابط الأكمام لحساب مستوى التعبير الجيني والفرق26. تم استخدام DEseq2 أيضا لتحليل البيانات27.
الشكل 1: عمليات التغيير والتحويل المتوسطة المحسنة ل EBs . (A) إعداد EB. تم هضم iPSCs وإضافتها إلى لوحات 24 بئر المتخصصة (يسار). شكلت الخلايا EBs (يمين). شريط المقياس هو 400 ميكرومتر (B) مخطط تخطيطي للضوء الناعم المضاء أفقيا للمساعدة في مراقبة المواد العضوية. (ج) لوحظت المخططات البيئية بمصادر ضوء مختلفة. سهم أصفر: ضوء مضاء جانبيا ؛ سهم أحمر: خلفية داكنة. الأسهم الخضراء: EBs. (د) يحدث تدفق دوامة عن طريق تدوير الطبق على طول مدار دائري. بسبب تدفق الدوامة ، يتم تحفيز تدفق ثانوي موجه نحو المركز. تتلاقى EBs إلى مركز الطبق مدفوعا بالتدفق الثانوي الناتج عن الدوران. الأسهم البيضاء: EBs. (ه) النقل العضوي. (I) أولا ، يتم استخدام طرف ماصة واسع الفم لامتصاص محلول الخليط ، بما في ذلك كل من EBs ووسط الثقافة. (II) ثم، مع الحفاظ على الماصة في وضع مستقيم، تغرق EBs تدريجيا تحت تأثير الجاذبية وتتلاقى نحو فم طرف الماصة. (III) عندما يلمس فم طرف الماصة سطح السائل (عادة ما يكون الوسط الطازج) مرة أخرى ، وبسبب التوتر السطحي السائل ، (IV) تغرق EBs بسرعة في الوسط (لا حاجة إلى نفخ إضافي عن طريق السحب يدويا). الخط الأحمر: مستوى السائل. الأسهم الصفراء: EBs. (و) نظرا لأن الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة تغرق ببطء أكبر من الخلايا الوسيطة ، يمكن بالتالي إزالة معظم الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة من خلال طريقة الترسيب المذكورة أعلاه لتسهيل نقل الجنين. المربع الأحمر في الزاوية العلوية اليمنى هو صورة مكبرة. شريط المقياس هو 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحريض iPSCs في المواد العضوية الدماغية . (أ) تلطيخ التألق المناعي ل EBs. OCT4: عامل النسخ المرتبط بالأوكتامر -4 ؛ DAPI: DAPI ثنائي هيدروكلوريد. شريط المقياس هو 100 ميكرومتر (B) iPSCs. شريط المقياس هو 400 ميكرومتر (C) المواد العضوية الدماغية. شريط المقياس هو 200 ميكرومتر (D) تلطيخ التألق المناعي للعضويات الدماغية. PAX6: المربع 6 المقترن هو علامة الخلايا السلفية القمية. TUJ1: الفئة الثالثة الخاصة بالخلايا العصبية β-tubulin هي علامة خاصة بالخلايا العصبية. شريط المقياس هو 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: زراعة iPSCs من الأفراد الأصحاء ومرضى SCA3 إلى عضويات دماغية. (أ) مراحل مختلفة تغطي نضج المواد العضوية الدماغية بدءا من EBs. NC: مجموعة طبيعية; SCA3: مجموعة SCA3/MJD. أشرطة المقياس للصور منخفضة وعالية التكبير هي 400 ميكرومتر و 200 ميكرومتر ، على التوالي. (ب) مخطط تحليل التخصيب GO للجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي بين المواد العضوية العادية والأعضاء SCA3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: تحديد تكرار ATXN3 CAG بواسطة الرحلان الكهربائي الشعري. (أ) تم تحديد مريض SCA3 iPSC (SCA3-iPSC) على أنه يحتوي على 26/78 CAG يتكرر في جين ATXN3. (ب) تم تحديد iPSC البشري الطبيعي (NC-iPSC) على أنه يحتوي على 14/14 CAG يتكرر في جين ATXN3. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: إعداد مصباح الضوء الناعم. (أ) تم تركيب مصدر الطاقة ومصابيح LED على جانب واحد من لوحة الأكريليك (كما هو موضح في المربع الأحمر المنقط). يبلغ الطول الموجي المبعثر لمصباح الإضاءة الناعمة LED 450-470 نانومتر ، والتدفق الضوئي هو 1300-1800 لومن ، ومؤشر تجسيد اللون هو 75-85 Ra. (B) تم التحقق مما إذا كانت مصابيح LED يمكن أن تضيء بشكل طبيعي (كما هو موضح في المربع الأحمر المنقط). (ج) تم لصق وسادة بيضاء على الجزء الأمامي والخلفي من لوحة الأكريليك (كما هو موضح في الأسهم الحمراء). (د) المظهر العام لمصباح الضوء الناعم. (ه) يمكن أيضا استبدال مصباح الإضاءة الناعم بلوحة إضاءة LED تجارية بدون إطار ، والتي تستخدم عادة للتتبع عند نسخ الرسومات. يجب لصق طبقة من الفيلم الأبيض مباشرة فوق لوحة ضوء الطلاء LED. (و) مصباح الضوء الناعم في العمل. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: تكوين وسيط التكوين EB. في المرحلة الأولى من تكوين EB (عموما أول 2 أيام) ، يجب إضافة Y-27632 (50 ميكرومتر) و bFGF (4 نانوغرام / مل) إلى وسط تكوين EB. يجب تصفية الوسط باستخدام وحدة تصفية 0.2 ميكرومتر وتخزينها عند -20 درجة مئوية .
الجدول التكميلي 2: تكوين وسط الحث العصبي. يجب تصفية الوسط باستخدام وحدة تصفية 0.2 ميكرومتر وتخزينها عند -20 درجة مئوية .
الجدول التكميلي 3: تكوين وسيط التوسع. تم إعداد تخفيف 1:100 من 2-Mercaptoethanol في DMEM-F12 ، وتمت إضافة 87.5 ميكرولتر من هذا إلى وسط التوسع. يجب ألا يحتوي B27 على فيتامين أ. يجب تصفية الوسط باستخدام وحدة تصفية 0.2 ميكرومتر وتخزينها عند -20 درجة مئوية .
الجدول التكميلي 4: تكوين وسط النضج. تم تحضير تخفيف 1:100 من 2-Mercaptoethanol في DMEM-F12 وتمت إضافة 87.5 ميكرولتر من هذا إلى وسط النضج. يجب ألا يحتوي B27 على فيتامين أ. يجب تصفية الوسط باستخدام وحدة تصفية 0.2 ميكرومتر وتخزينها عند -20 درجة مئوية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تفتح المواد العضوية الدماغية آفاقا جديدة للبحوث الطبية. العديد من التطبيقات المفيدة لهذه التكنولوجيا بدأت للتو في استكشافها28. وجد هذا البحث أن نتائج تسلسل النسخ للعضويات الدماغية المريضة وراثيا والمواد العضوية الدماغية الطبيعية يمكن أن تعكس الاختلافات بين المرض والصحة. على سبيل المثال ، تتوافق نتائج تحليل بيانات RNA-seq (الشكل 3B) مع العديد من الدراسات المبلغ عنها حول أمراض SCA3 29,30,31,32. تعد العمليات التجريبية ، مثل التغيير المتوسط ، ونقل EB ، واللف ، حاسمة لزراعة المواد العضوية الدماغية وتحديد ما إذا كان يمكن تحضير المواد العضوية ذات التوحيد الجيد33,34. في هذه الدراسة ، يتم إدخال بروتوكول عضوي دماغي سهل التغيير المتوسط ونقل العضوية. يمكن أن يساعد مصباح الضوء الناعم الجانبي بشكل كبير في تشغيل الثقافة العضوية. ومع ذلك ، ليس من الصعب صنعها ، يمكن أيضا أن تحل محلها لوحة ضوء الطلاء LED والمعالجة البسيطة. طريقة تبادل السوائل البسيطة وعملية نقل العضوية تجعل عملية الزراعة بأكملها أسهل. غالبا ما يتأثر تطبيق المواد العضوية الدماغية بمشكلة ضعف التوحيد35. الفرق الأكبر بين هذه الدراسة وغيرها من المبادئ التوجيهية للزراعة العضوية الدماغية هو أن التركيز ينصب على تحسين العملية لجعل التجربة أكثر قابلية للتكرار.
من المهم جدا الحفاظ على استقرار النظام الثقافي. إذا سمحت الظروف ، يقترح إعطاء الأولوية للوسط العضوي الدماغي التجاري ، والذي يمكن أن يقلل بشكل فعال من الاختلافات الكبيرة في النتائج التجريبية على دفعات مختلفة بسبب عدم استقرار الوسط. بالإضافة إلى ذلك ، يجب ألا يستمر التخزين المتوسط العضوي الدماغي عند 4 درجات مئوية أكثر من 2 أسابيع ؛ خلاف ذلك ، فإنه سيؤثر على استقرار النظام الثقافي. بالطبع ، من المهم أيضا التأكد من أن iPSCs المستخدمة متعددة القدرات بدلا من أن تكون متباينة. يمكن استخدام OCT4 للكشف عن التألق المناعي. إذا كانت الخلايا الإيجابية OCT4 أقل من 90٪ ، فمن المستحسن استبدالها ب iPSCs عالية الجودة وزراعة الأعضاء الدماغية مرة أخرى.
هناك بعض القيود في تكنولوجيا الثقافة العضوية الدماغية التي تم إدخالها في هذه الدراسة. على سبيل المثال ، لا يمكن زراعة المواد العضوية الدماغية بشكل مكثف في المرحلة اللاحقة من التطور ، والتي تعد مضيعة للمساحة الثقافية. هذه أيضا مشكلة ملحة يجب حلها في تطبيق المواد العضوية الدماغية. إذا أظهرت العديد من المواد العضوية الدماغية توسعا مجوفا ، تقليل عدد المواد العضوية في كل بئر ، ويزداد تردد التبادل المتوسط ، وتكون المواد العضوية في حالة غير ناقصة الأكسجة مع ما يكفي من العناصر الغذائية.
هذه الدراسة هي تكملة تشغيلية للعديد من طرق الزراعة العضوية الدماغية الحالية12،36،37وحتى أنواع أخرى من طرق زراعة الأعضاء38،39. سيساعد ذلك على تطوير أنظمة الزراعة العضوية الآلية في المستقبل وتعزيز البحث والتطبيق للعضويات. إذا تم استخدام تقنية تعزيز تأثير انعكاس الضوء المنتشر للعضويات في نظام الزراعة الذكي التلقائي ، فيمكنها نظريا استبدال كاميرا تضخيم الصور عالية الدقة ، ويجب تثبيت جهاز التعرف على الصور العادي فقط. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التبادل المتوسط والنقل العضوي من خلال التدفق الثانوي الناتج عن الدوران والترسيب الطبيعي على رأس الشفط هما نظريا أكثر جدوى من الطرد المركزي في معدات الاستزراع التلقائي المستقبلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ (رقم المنحة 2020A0505100062) ، ومشروع الموضوعات الرئيسية للعلوم والتكنولوجيا في مدينة قوانغتشو (المنحة رقم 201904020025) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 31872800 ، 32070582 ، 82101937) ، ومشروع منحة أبحاث ما بعد الدكتوراه في مدينة قوانغتشو (إلى بانغتشو تشن).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7.1 (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W.
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L.
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, Pt 11 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B.
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
