Summary
Serebral organoidler, organ gelişimini ve insan hastalığı patolojisini incelemek için benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Serebral organoid kültür sistemleri ile büyük başarılar elde edilmiş olsa da, bu teknolojinin uygulanmasında hala operasyonel zorluklar yaşanmaktadır. Mevcut protokol, orta değişim ve organoid transferini kolaylaştıran serebral organoid bir prosedürü tanımlamaktadır.
Abstract
Şu anda, serebral organoid kültür teknolojisinin işletilmesi hala karmaşıktır ve büyük ölçekte uygulanması zordur. Basit ve pratik bir çözüm bulmak gerekiyor. Bu nedenle, bu çalışmada daha uygulanabilir bir serebral organoid protokol önerilmiştir. Orta değişim ve organoid transferindeki kaçınılmaz rahatsızlığı erken aşamada çözmek için, mevcut araştırma mühendislik ilkesini uygulayarak işletme teknolojisini optimize etmektedir. Embriyoid cisim (EB) örneklerini yanal olarak aydınlatmak için yumuşak bir ışık lambası benimsendi ve EB'lerin gelişmiş dağınık yansıma etkisi ile çıplak gözle görülmesini sağladı. Rotasyonla üretilen ikincil akış prensibini kullanarak, organoidler kuyunun merkezine doğru toplanır ve bu da orta değişimin veya organoid transferin çalışmasını kolaylaştırır. Dağılmış hücreye kıyasla, embriyoid vücut pipete daha hızlı yerleşir. Bu fenomeni kullanarak, serbest hücrelerin ve ölü hücre parçalarının çoğu, EB'lerin santrifüjlemeden zarar görmesini önleyerek basit bir şekilde etkili bir şekilde çıkarılabilir. Bu çalışma, serebral organoid kültürünün çalışmasını kolaylaştırır ve beyin organoidlerinin uygulanmasını teşvik etmeye yardımcı olur.
Introduction
İki boyutlu (2B) kültür sistemleriyle karşılaştırıldığında, üç boyutlu (3B) kültür sistemlerinin, gerçek replikasyon ve belirli organların karmaşık yapılarının verimli bir şekilde çoğaltılması gibi çeşitli avantajları vardır1. Bu nedenle, serebral organoidler, insan beyni gelişimi ve hastalığı2, ilaç taraması ve hücre tedavisi araştırma alanları için önemli yardımcı yöntemlerden biridir.
Serebral organoidlerin döner süspansiyon yöntemiyle kültürlenmesi, gelişimlerine ve olgunlaşmalarına elverişlidir3. Serebral organoid kültür sistemleri büyük başarılar elde etmiş olsalar da, uygulamalarını sınırlayan kritik zorluklarla karşı karşıyadırlar. Örneğin, manuel yetiştirme karmaşık manipülasyon adımlarını içerir ve büyük ölçekli uygulamalara ulaşmanın önünde engeller getirir. Ek olarak, serebral organoidlerin kültüründeki her gelişim aşamasında, farklı ortam ve sitokinlerde değişikliklere ihtiyaçvardır4. Bununla birlikte, erken aşamada, organoidler veya EB'ler küçük boyutlara (yaklaşık 200 μm ila 300 μm) sahiptir ve uygun aparatlar olmadan neredeyse görsel olarak erişilemez. Kaçınılmaz olarak, ortam değiştirildiğinde belirli miktarda değerli organoid numune temizlenir. Diğer organoid kültürlerde bunun üstesinden gelmek için birçok teknik araştırılmıştır ve bazı örnekler arasında tüm organoid cipslerin müdahale edilmeden 3 gün boyunca bir kültür ortamına daldırılması5; eski ortam emici kağıt5 kullanılarak emildikten sonra kapak kapağından taze bir ortam eklenmesi; veya sıvı değişimi için karmaşık mikroakışkan boru hatları uygulamak 6,7,8. Organoid yetiştiriciliğinin erken evresinde karşılaşılan bir diğer engel, çıplak gözle doğrudan gözlemler elde etmenin zorluğudur ve bu da organoid transfer adımları sırasında organoid hasarına ve kaybına yol açan zayıf operasyonlara neden olabilir. Bu nedenle, organoidler üretmek için ortam değişimini ve organoid transferini kolaylaştıran daha uygulanabilir bir protokol oluşturmak gerekir.
Birçok organoid prosedürü önemli ölçüde ve uygun bir şekilde kolaylaştıran bu sorunların üstesinden gelmek için mühendislik ilkelerine dayanan karşılık gelen optimize edilmiş bir çalışma önerilmektedir. Doğada, güneş bir pencere boşluğundan bir eve parladığında, çıplak gözle ışık huzmesinde dans eden tozu görebilir. Güneş ışığının toz üzerindeki dağınık yansıması nedeniyle, görsel bir görüntü üretmek için bir miktar ışık göz küresine kırılır. Bu fenomenin 9,10 prensibinden esinlenen bu çalışma, yumuşak bir ışık lambası yaptı ve EB'leri yanal olarak aydınlattı. EB'lerin görüntüleme kapsamını etkilemeden görsel olarak net olabileceği bulunmuştur. Girdap akımları nedeniyle kültür plakası döndürülerek sıvıda merkeze işaret eden ikincil bir akış üretilir11. Başlangıçta dağılmış EB'ler plakanın merkezinde birikir. Buna ve organoidlerin çökelme hızının hücrelerinkinden daha hızlı olduğu olgusuna dayanarak, santrifüjleme olmadan orta değişim ve organoid transferinin kolay bir çalışma yöntemi önerilmektedir. Kültür ortamındaki organoidler, bu transfer işlemi ile serbest hücrelerden ve ölü hücre parçalarından etkili bir şekilde ayrılabilir.
Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden serebral organoidler üretmek için kullanımı kolay bir protokol önerilmektedir. Operasyon teknolojisi, mühendislik ilkesi uygulanarak, 3D kültürdeki işlemleri 2D kültüründekiler kadar basit ve uygulanabilir hale getirerek optimize edildi. Geliştirilmiş sıvı değişim yöntemi ve organoid transfer işlemi, diğer organoid kültür türleri ve otomatik kültür makinelerinin tasarımı için de yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol, Helsinki Deklarasyonu'nun ardından gerçekleştirildi. Guangzhou Tıp Üniversitesi Üçüncü Bağlı Hastanesi Etik Komitesi tarafından onay verilmiştir (Tıbbi ve etik inceleme [2021] No. 022). Deneyden önce, her ortam Juergen A. Knoblich'in formülü12'ye (Ek Tablolar 1-4) göre hazırlandı veya ticari olarak temin edilebilen bir Serebral Organoid Kit kullanıldı (bkz. Bu çalışmada kullanılan iPSC'ler daha önce laboratuvarımız tarafından kurulmuş ve bilgilendirilmiş bir muafiyet elde edilmiştir. SCA3-iPSC'ler, ATXN3 geni 13'te 26/78 CAG tekrarı barındıran genotiplendirilmiş31 yaşındaki dişi spinoserebellar ataksi tip 3 (SCA3) hastasından üretildi (Ek Şekil 1A). Önceki bir makalede bahsedilen normal insan iPSC'leri NC-iPSC'ler 14 olarak seçildi ve ATXN3 geninin14/14 CAG tekrarına sahip olduğu tespit edildi (Ek Şekil 1B).
1. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) hazırlanması
- Gönüllülerin ve hastaların bilgilendirilmiş onamıyla venipunktur yoluyla 3 mL periferik kan toplayın.
- Periferik kan mononükleer hücrelerini Ficoll-Paque yöntemi15'e göre izole edin.
- Sendai Yeniden Programlama Kitinin protokolüne göre iPSC'ler oluşturun (bkz.
- Matrigel ile kaplı 35 mm Petri kaplarında mTeSR1 ortamlı iPSC'leri kültürleyin (bir bazal membran matrisi, bkz. Ortamı her gün değiştirin. iPSC büyüme yoğunluğu% 75'i geçmemelidir.
- PSC ayrışma çözeltisi ile hücreleri sindirin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve her 3-5 günde bir 1: 5 oranında alt kültüre alın.
DİKKAT: Sendai virüsü burada kullanılmaktadır. Biyogüvenlik kabininde çalıştırılmalı ve kendini koruma önlemleri alınmalıdır. Yerel ülkede yasal olarak kullanılıp kullanılamayacağı açık olmalıdır. Yerel biyogüvenlik yasa ve yönetmeliklerine kesinlikle uyulmalıdır.
2. EB hazırlığı (gün 0-1)
- mTeSR1 ortamını iPSC'lerden bir pipetle çıkarın ve 1 mL 1x PBS ile 2 kat yıkayın.
- PBS'yi bir pipetle çıkarın ve iPSC'leri 37 °C'de 3-4 dakika boyunca tek hücrelere sindirmek için 300 μL hücre ayırma çözeltisi ekleyin (bkz.
- Hücreleri 2 mL EB oluşum ortamında (Ek Tablo 1) yeniden askıya alın ve ardından numuneyi 300 x g'de (oda sıcaklığı) 5 dakika boyunca santrifüj edin.
- Özel 24 delikli plakaya 5 dakika boyunca yapışma önleyici durulama çözeltisi (500 μL / kuyu) ile ön işlem uygulayın (bkz.
NOT: Yapışma önleyici durulama çözeltisi, optimum EB ve sferoid oluşumu için gereklidir. - Hücreleri Y-27632 içeren EB oluşum ortamında (son konsantrasyon, 10 μM, bakınız Malzeme Tablosu), hücre yoğunluğu 1.5 x 106 hücre / mL ile yeniden askıya alın.
- Yapışma önleyici durulama çözeltisini çıkarın ve her bir oyuğa 2 mL EB oluşum ortamı ile durulayın.
- Hücreleri, 3 x 106 hücre/kuyu yoğunluğunda uzmanlaşmış 24 kuyucuklu plakalara ekleyin (Şekil 1A, solda).
NOT: Normalde, her kuyucukta 300 EB hazırlanabilir. Bu yöntem, aynı boyutta büyük miktarlarda EB hazırlayabilir. - Plakayı oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 100 x g'da santrifüj yapın. Hücreleri plakanın altındaki her bir odaya eşit olarak dağıtın (Şekil 1A, sağda).
NOT: Uygun bir santrifüj yoksa, plaka statik kültür için doğrudan inkübatöre de yerleştirilebilir, ancak EB bilyesinin oluşum süresi normal santrifüjleme altındakinden birkaç saat sonra olacaktır. - Numuneleri 37 °C'de ve24 saat boyunca% 5 CO 2'de inkübe edin. Önceki adımda santrifüjleme kullanılmadıysa, 36 saat boyunca inkübe edin. Numuneyi sabit tutun ve bu süre zarfında inkübatörden çıkarmayın.
3. Yumuşak ışık lambasının hazırlanması (1. gün)
- A5 kağıt boyutunda 0,3-0,5 cm kalınlığında şeffaf bir akrilik levha kullanın. Beyaz pedleri akrilik plakanın önüne ve arkasına yapıştırın.
- Işıkların akrilik plakanın yanından girebilmesi ve ardından paralel olarak dışarı fırlayabilmesi için plakanın kenarına bir sıra LED beyaz ışık takın (Ek Şekil 2A-F, Şekil 1B).
NOT: EB'lerin erken aşamadaki çapları yaklaşık 200 μm ila 300 μm olduğundan, temiz bankların floresan lambasının altında çıplak gözle onları net bir şekilde gözlemlemek zordur. Buna karşılık, dağınık yansımanın artması nedeniyle, yanal olarak aydınlatılmış yumuşak ışık kullanarak EB'leri net bir şekilde tespit edebiliriz (Şekil 1B, C). Sonraki deneylerde EB kültürleri için 6 delikli bir plaka önerilir. Bununla birlikte, yumuşak ışığın görsel etkisini daha iyi göstermek için, bu çalışmada tabaklar yerine bazen fotoğraf ve video çekmek için bulaşıklar kullanılmaktadır, bu nedenle lütfen yanlış anlamayın. Yanal aydınlatmalı yumuşak ışık lambası, 6 delikli plaka için de kullanılabilir.
- Işıkların akrilik plakanın yanından girebilmesi ve ardından paralel olarak dışarı fırlayabilmesi için plakanın kenarına bir sıra LED beyaz ışık takın (Ek Şekil 2A-F, Şekil 1B).
4. EB transferi ve orta değiştirme (gün 2-5)
- Yeni bir 6 delikli düşük yapışma plakası hazırlayın ve her bir oyuğa 2 mL EB oluşum ortamı ekleyin.
- EB'leri 1000 μL geniş delikli pipet ucu ile ortamla birlikte çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu) ve bunları 6 delikli düşük yapışma plakasına (~100 EB/kuyu) aktarın.
NOT: Çalışma süreci, EB'lerin gözlemlenmesini kolaylaştırmak için yumuşak bir ışık lambası (adım 3'te belirtilmiştir.) kullanır. Yumuşak ışığın görsel efektini daha iyi elde etmek için diğer iç mekan ışık kaynaklarını kapatın. - Her gün aynı hacimde taze EB oluşum ortamı ile değiştirin. EB'leri merkeze toplamak ve ortamı değiştirmek için ikincil akışı kullanın.
- Kuyunun kenarına yavaşça pipetleyerek eski ortamı aspire edin. Çok sert emmeyin; aksi takdirde, EB'ler birlikte kaldırılacaktır. Ardından, EB'leri yeniden askıya almak için yeni bir ortam ekleyin.
NOT: İlke ikincil akış (Şekil 1D). Çanağı dairesel bir yörünge boyunca döndürerek bir girdap akışı indükleyin. Girdap akışı nedeniyle, merkeze doğru yönlendirilmiş ikincil bir akış indüklenir. EB'ler veya organoidler, rotasyon yoluyla üretilen ikincil akış nedeniyle kuyunun merkezine yaklaşır, bundan sonra orta değişim veya embriyoid transferi kolayca gerçekleştirilebilir.
- Kuyunun kenarına yavaşça pipetleyerek eski ortamı aspire edin. Çok sert emmeyin; aksi takdirde, EB'ler birlikte kaldırılacaktır. Ardından, EB'leri yeniden askıya almak için yeni bir ortam ekleyin.
5. Pluripotens belirteci OCT4 ile etiketleyerek pluripotensi kontrol etme (4. gün)
NOT: EB'lerin çapı 300 μm'den büyük olduğunda, pluripotenlerini tespit etmek için OCT4 marker immünofloresan boyama için birkaç EB alın.
- EB'leri 30 dakika boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin, ardından her seferinde 10 dakika boyunca 1x PBS 3x'te yıkayın.
- EB'leri 2 saat boyunca %0,3 Triton X-100 ve %3 BSA içeren oda sıcaklığındaki PBS'ye aktarın, ardından her seferinde 10 dakika boyunca PBS 3x'te yıkayın.
NOT: Triton X-100 ile muamele edildikten sonra, EB'ler sıvı yüzeyinde yüzer ve temizlik sırasında sıvı ile kolayca emilebilir. Bir stereomikroskop altında operasyon önerilir. - OCT4 primer antikorunu ( bakınız Malzeme Tablosu) 1:200 oranında %1 BSA içeren 1 mL 1x PBS ile seyreltin ve gece boyunca 4 °C'de inkübasyon için EB'lere ekleyin, ardından her seferinde 10 dakika boyunca PBS 3x'te yıkayın.
- İlgili ikincil antikoru ( bakınız Malzeme Tablosu) 1:500'de 1x PBS ile seyreltin ve EB'lere 1 mL ekleyin.
- Oda sıcaklığında 2 saat inkübe ettikten sonra, hücreleri her seferinde 10 dakika boyunca 1x PBS 3x'te yıkayın.
- PBS'yi çıkarın, 1 μg/mL DAPI içeren 2 mL 1x PBS çözeltisi ekleyin, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca PBS 3x'te yıkayın.
- Az miktarda sıvı içeren EB'yi slaytın üzerine taşıyın, slaytı kenarda ticari olarak temin edilebilen petrol jölesi ile kaplanmış bir kapak camı ile kapatın ( bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından görüntüyü floresan konfokal mikroskop altında gözlemleyin ve toplayın.
NOT: OCT4 ifadesi EB pluripotens12'yi temsil eder. OCT4 ifadesi %90'ın altında olduğunda, EB'ler atılmalı ve EB'ler tekrar hazırlanmalıdır.
6. Nöral indüksiyon (gün 5-7)
- Düşük yapışma özelliğine sahip yeni bir 6 delikli plaka hazırlayın ve her bir oyuğa 3 mL Nöral indüksiyon ortamı (Ek Tablo 2) ekleyin.
- Yanal yumuşak ışığı açın (3. adımda belirtilmiştir.) ve diğer iç mekan ışık kaynaklarını kapatın.
- EB'leri, Nöral indüksiyon ortamı (~ 100 EB / kuyu) eklenmiş 6 delikli plakaya aktarın. Orijinal ortamdan mümkün olduğunca azını yeni kuyuya ekleyin.
NOT: Organoid transferin basit becerilerini tanıtın. Doğal olarak, yerçekimi altında ve ortamdan nispeten daha yüksek bir yoğunluğa sahip olarak, yeniden askıya alınan EB'ler, Şekil 1E'de gösterilen işlemi uygulayarak kademeli olarak batacaktır. Bu nedenle, EB'ler rahatça aktarılabilir. EB'lere kıyasla, serbest hücreler ve ölü hücre parçaları daha yavaş battığından, serbest hücrelerin ve ölü hücre parçalarının çoğu bu çökeltme yöntemiyle çıkarılabilir (Şekil 1F). - Numuneleri 37 °C'de ve24 saat boyunca% 5 CO 2'de inkübe edin.
NOT: Mikroskop altında, EB'lerin çapı yaklaşık 500 μm idi ve kenar yarı saydamdı, bu da nöroepitelyal bir tabakanın oluştuğunu gösteriyordu. - Sonraki adıma geçin.
7. Bodrum membran matrisine gömme (gün 7-10)
- Membran matrisini çözülmesi için 60 dakika önceden 4 °C'lik bir buzdolabına yerleştirin. Gerekli matrisin miktarını önceden hesaplayın. Membran matrisinin 1,5 mL'sine yaklaşık 100 EB gömüldü.
- Yanal yumuşak ışığı açın ve konsolun üstündeki ışık kaynağını kapatın.
- Katılaşmayı önlemek için membran matrisini buz üzerinde tutun.
- Her seferinde taze Genleşme ortamı (Ek Tablo 3) içeren 60 mm'lik bir kaba az miktarda EB aktarın. Tek bir EB'yi kaldırmayı kolaylaştırmak için EB sayısını azaltın.
- Ardından, yeni bir 6 kuyucuklu düşük yapışma plakası kullanın. Her seferinde 200 μL geniş delikli pipet ucu ile tek bir EB'yi (yaklaşık 10 μL ortam içeren) emmek ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ardından damlacıklar yapmak için 6 delikli plakanın dibine ekleyin. Kuyu başına beş damlacık kullanın.
NOT: Önemli olan, pipet tabancasının aralığını 50 μL'ye ayarlamak ve bir EB'yi emmek ve ardından Şekil 1E'nin çalışmasına başvurmaktır. EB, pipet ucunun deliğine yerleştiğinde, uç hızlı bir şekilde plakanın kuyu tabanına temas eder ve bir damlacık oluşturmak için yaklaşık 10 μL sıvıyı dışarı iter. - EB içeren her damlaya 15 μL membran matrisi ekleyin ve hızlıca karıştırın. EB topunu damlacığın ortasına yerleştirin.
NOT: EB'ler, EB'ye zarar veren standart bir pipet ucu ile aspire edilmemelidir. Bunun yerine 200 μL geniş delikli pipet ucunun kullanılması gerekir. - 6 delikli plakayı 30 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve EB'ler içeren membran matris damlacıklarını katılaştırın.
- Her bir kuyucuğa 3 mL Genişletme ortamı ekleyin ve matrise gömülü EB'leri askıya almak için yavaşça havaya uçurun.
- 3 gün boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
NOT: EB yüzeyinde tomurcuklanma gözlenirse, genişlemiş bir nöroepitelin oluştuğu anlamına gelir16.
8. Organoid olgunlaşma (10-40 gün)
- Orijinal ortamı yavaşça çıkarın ve her bir oyuğa 3 mL Olgunlaşma ortamı (Ek Tablo 4) ekleyin.
- Organoid plakayı 37 °C'lik bir inkübatörde yatay bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- Kültürü yatay olarak döndürmeye devam edin. Çalkalayıcıyı uygun hıza ayarlayın.
NOT: Serebral organoidleri 6 delikli bir plaka üzerinde kültürlendirirken, yatay çalkalayıcının üreticisine göre, 0.11808 x g'lık bir nispi santrifüj kuvveti (RCF) daha uygundur (bkz. Göreceli santrifüj kuvveti ile dönme hızı arasındaki dönüşüme göre17,18, RCF = 1.118 x 10−5 × R × rpm 2, burada RCF = göreceli santrifüj kuvveti (g), rpm = dakikadaki devir sayısı (r / dak) ve R = dönme yarıçapı (cm), sallama atışı olarak da bilinir. Farklı çalkalayıcıların sallama atma parametreleri farklı olabilir. Bu nedenle, dönme hızının rpm = 299 x (RCF / R) 1/2 olduğu tahmin edilebilir. - Yeni olgunlaşma ortamını her 2-3 günde bir değiştirin.
- 20-30 gün sonra, yavaş yavaş serebral organoidleri olgunluğa kadar kültürleyin.
NOT: Bu süre zarfında, organoidler nöral belirteç tespiti ve transkriptom dizilimi 19,20,21 gibi deneyler ve tespitler için kullanılabilir.
9. Dondurulmuş kesitler ve serebral organoidlerin immünofloresansı
- Organoidleri 16 saat boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca 1x PBS ile 3x yıkayın.
- PBS'yi çıkarın ve organoidleri gece boyunca 4 ° C'de% 30 sakkaroza batırın.
- Organoidleri 1 saat boyunca 37 °C'de %10/%7,5 jelatin/sakkaroza gömün ve ardından hızlı bir şekilde gömme kalıbına aktarın.
- Kuru bir buz / etanol bulamacı hazırlamak için% 100 etanol'e kuru buz ekleyin ve hızlı dondurma için organoid numuneleri içine yerleştirin.
- Dondurulmuş numuneleri -80 °C dondurucuda saklayın. Gerektiğinde, 20 μm kalınlığında dondurulmuş bölümler yapın.
- Adım 5.3.-5.5'e bakın. immünofloresan için. Apikal progenitör hücreleri etiketlemek için PAX6 antikorunu, nöronal hücreleri22,23,24 etiketlemek için TUJ1 antikorunu (bakınız Malzeme Tablosu) ve nükleer DNA boyama için DAPI'yi kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada iPSC'ler (Şekil 2B) serebral organoidlere indüklenmiştir (Şekil 2C). Erken aşamada yetiştirilen EB'ler, iyi pluripotensi gösteren OCT4 belirtecini (Şekil 2A) ifade etti. Daha sonraki aşamada, EB'ler olgun serebral organoidlere dönüştü (Şekil 2D). Araştırma, normal sağlıklı bireylerden ve SCA3 hastalarından serebral organoidlere iPSC'ler yetiştirdi (Şekil 3A). Machado-Joseph hastalığı (MJD) olarak da bilinen SCA3, ATXN3 geni25'teki bir poliglutamin genişlemesinin neden olduğu nörodejeneratif bir hastalıktır. RNA-seq verileri (halka açık bir depoya yüklenir, Materyal Tablosuna bakınız), normal serebral organoid grubu ile SCA3-serebral organoid grubu arasındaki nörotransmitter transportu, sinaps oluşumu ve regülasyon gibi yollarda gen ekspresyon profillerinde önemli farklılıklar ortaya koymuştur (Şekil 3B). Kol düğmeleri yazılımı, gen ekspresyon seviyesini ve farkı hesaplamak için kullanıldı26. DEseq2 ayrıca verileri analiz etmek için kullanıldı27.
Şekil 1: EB'lerin optimize edilmiş ortam değişim ve transfer işlemleri . (A) EB hazırlığı. iPSC'ler sindirildi ve özel 24 delikli plakalara eklendi (solda). Hücreler EB'leri oluşturdu (sağda). Ölçek çubuğu 400 μm'dir. (B) Organoidlerin gözlemlenmesine yardımcı olmak için yanal olarak aydınlatılmış yumuşak ışığın şematik diyagramı. (C) EB'ler farklı ışık kaynakları ile gözlemlendi. Sarı ok: yanal aydınlatmalı ışık; kırmızı ok: koyu arka plan; yeşil oklar: EB'ler. (D) Bir girdap akışı, çanağın dairesel bir yörünge boyunca döndürülmesiyle tetiklenir. Girdap akışı nedeniyle, merkeze doğru yönlendirilmiş ikincil bir akış indüklenir. EB'ler, dönme yoluyla üretilen ikincil akış tarafından tahrik edilen çanağın merkezine yaklaşır. Beyaz oklar: EB'ler. (E) Organoid transferi. (I) İlk olarak, hem EB'ler hem de kültür ortamı dahil olmak üzere karışım çözeltisini emmek için geniş ağızlı bir pipet ucu kullanılır. (II) Daha sonra, pipeti dik tutarken, EB'ler yavaş yavaş yerçekimi etkisi altında batar ve pipet ucunun ağzına doğru birleşir. (III) Pipet ucunun ağzı sıvı (genellikle taze ortam) yüzeye tekrar dokunduğunda ve sıvı yüzey gerilimi nedeniyle, (IV) EB'ler hızla ortama batar (manuel olarak pipetleme ile ek üflemeye gerek yoktur). Kırmızı çizgi: sıvı seviyesi; sarı oklar: EB'ler. (F) Serbest hücreler ve ölü hücre parçaları EB'lerden daha yavaş battığından, serbest hücrelerin ve ölü hücre parçalarının çoğu, embriyoid transferini kolaylaştırmak için yukarıdaki çökeltme yöntemiyle çıkarılabilir. Sağ üst köşedeki kırmızı kutu büyütülmüş bir görüntüdür. Ölçek çubuğu 400 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: iPSC'lerin serebral organoidlere indüksiyonu . (A) EB'lerin immünofloresan boyanması. OCT4: oktamer bağlayıcı transkripsiyon faktörü-4; DAPI: DAPI dihidroklorür. Ölçek çubuğu 100 μm. (B) iPSC'lerdir. Ölçek çubuğu 400 μm'dir. (C) Serebral organoidler. Ölçek çubuğu 200 μm'dir. (D) Serebral organoidlerin immünofloresan boyaması. PAX6: eşleştirilmiş kutu 6, apikal progenitör hücrelerin belirtecidir; TUJ1: nörona özgü sınıf III β-tübülin, nörona özgü bir belirteçtir. Ölçek çubuğu 50 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: iPSC'lerin sağlıklı bireylerden ve SCA3 hastalarından serebral organoidlere yetiştirilmesi. (A) EB'lerden başlayarak serebral organoidlerin olgunlaşmasını kapsayan farklı aşamalar. NC: normal grup; SCA3: SCA3/MJD grubu. Düşük ve yüksek büyütmeli görüntülerin ölçek çubukları sırasıyla 400 μm ve 200 μm'dir. (B) Normal organoidler ve SCA3 organoidleri arasında aşağı düzenlenmiş, farklı şekilde eksprese edilmiş genlerin GO zenginleştirme analiz çizelgesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: ATXN3 CAG tekrarlarının kılcal elektroforez ile tanımlanması. (A) SCA3 hastası iPSC'nin (SCA3-iPSC) ATXN3 geninde 26/78 CAG tekrarı olduğu tespit edildi. (B) Normal insan iPSC'sinin (NC-iPSC) ATXN3 geninde 14/14 CAG tekrarına sahip olduğu tespit edildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Yumuşak ışık lambasının hazırlanması. (A) Güç kaynağı ve LED ışıkları akrilik kartın bir tarafına monte edilmiştir (kırmızı noktalı kutuda gösterildiği gibi). LED yumuşak ışık lambasının saçılma dalga boyu 450-470 nm, ışık akısı 1300-1800 lm ve renk oluşturma indeksi 75-85 Ra'dır. (B) LED ampullerin normal şekilde yanıp yanamayacağı kontrol edildi (kırmızı noktalı kutuda gösterildiği gibi). (C) Akrilik plakanın önüne ve arkasına beyaz bir ped yapıştırılmıştır (kırmızı oklarla gösterildiği gibi). (D) Yumuşak ışık lambasının genel görünümü. (E) Yumuşak ışık lambası, genellikle eskizleri kopyalarken izlemek için kullanılan çerçevesiz ticari bir LED boyama ışık pedi ile de değiştirilebilir. Bir beyaz film tabakasının doğrudan LED boyama ışık pedinin üzerine yapıştırılması gerekir. (F) İş yerindeki yumuşak ışık lambası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 1: EB oluşum ortamının bileşimi. EB oluşumunun ilk aşamasında (genellikle ilk 2 gün), EB oluşum ortamına Y-27632 (50 μM) ve bFGF (4 ng / mL) eklenmelidir. Ortamın 0,2 μm filtre ünitesi ile filtrelenmesi ve -20 °C'de saklanması gerekir.
Ek Tablo 2: Nöral indüksiyon ortamının bileşimi. Ortamın 0,2 μm filtre ünitesi ile filtrelenmesi ve -20 °C'de saklanması gerekir.
Ek Tablo 3: Genleşme ortamının bileşimi. DMEM-F12'de 2-Merkaptoetanolün 1:100 seyreltilmesi hazırlandı ve bunun 87.5 μL'si Genleşme ortamına eklendi. B27 A vitamini içermemelidir. Ortamın 0,2 μm filtre ünitesi ile filtrelenmesi ve -20 °C'de saklanması gerekir.
Ek Tablo 4: Olgunlaşma ortamının bileşimi. DMEM-F12'de 2-Merkaptoetanolün 1:100 seyreltilmesi hazırlandı ve bunun 87.5 μL'si Olgunlaşma ortamına eklendi. B27 A vitamini içermemelidir. Ortamın 0,2 μm filtre ünitesi ile filtrelenmesi ve -20 °C'de saklanması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Serebral organoidler tıbbi araştırmalar için yeni yollar açar. Bu teknolojinin birçok yararlı uygulaması henüz keşfedilmeye başlanmıştır28. Bu araştırma, genetik olarak hastalıklı serebral organoidlerin ve normal serebral organoidlerin transkriptom dizileme sonuçlarının hastalık ve sağlık arasındaki farkları yansıtabileceğini bulmuştur. Örneğin, RNA-seq veri analizi sonuçları (Şekil 3B), SCA3 hastalıkları29,30,31,32 üzerinde bildirilen birçok çalışma ile tutarlıdır. Orta değişim, EB transferi ve sarma gibi deneysel işlemler, serebral organoidlerin yetiştirilmesi ve iyi bir homojenliğe sahip organoidlerin hazırlanıp hazırlanamayacağını belirlemek için çok önemlidir33,34. Bu çalışmada, orta değişim ve organoid transferini kolaylaştıran serebral organoid protokol tanıtılmıştır. Yanal yumuşak ışık lambası, organoid kültürün çalışmasına büyük ölçüde yardımcı olabilir. Bununla birlikte, yapımı zor değildir, LED boyama ışık yastığı ve basit işlem de yerini alabilir. Basit sıvı değişim yöntemi ve organoid transfer işlemi tüm kültür sürecini kolaylaştırır. Serebral organoidlerin uygulanması genellikle zayıf tekdüzelik sorunundan etkilenir35. Bu çalışma ve diğer serebral organoid kültür kılavuzları arasındaki en büyük fark, deneyi daha tekrarlanabilir hale getirmek için operasyonu optimize etmeye odaklanılmasıdır.
Kültür sisteminin istikrarını korumak çok önemlidir. Koşullar izin verirse, ortamın dengesizliği nedeniyle farklı partilerdeki deneysel sonuçlardaki büyük farklılıkları etkili bir şekilde azaltabilen ticari serebral organoid ortama öncelik verilmesi önerilmektedir. Ek olarak, 4 ° C'de serebral organoid ortam depolaması 2 haftadan fazla sürmemelidir; aksi takdirde, kültür sisteminin istikrarını etkileyecektir. Tabii ki, kullanılan iPSC'lerin farklılaşmak yerine pluripotent olmasını sağlamak da önemlidir. OCT4 immünofloresan tespiti kullanılabilir. OCT4-pozitif hücreler% 90'dan azsa, bunların tekrar daha yüksek kaliteli iPSC'ler ve kültür serebral organoidleri ile değiştirilmesi önerilir.
Bu çalışmada tanıtılan serebral organoid kültür teknolojisinde bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, serebral organoidler, gelişimin sonraki aşamalarında, kültür alanının israfı olan yoğun bir şekilde kültürlenemez. Bu aynı zamanda serebral organoidlerin uygulanmasında çözülmesi gereken acil bir sorundur. Birçok serebral organoid içi boş genişleme gösterirse, her bir kuyucuktaki organoid sayısı azalır, orta değişim frekansı artar ve organoidler yeterli besin maddesi ile hipoksik olmayan bir durumdadır.
Bu çalışma, mevcut birçok serebral organoid kültür yöntemi 12,36,37 ve hatta diğer organ kültürü yöntemleri 38,39'a operasyonel bir tamamlayıcıdır. Bu, gelecekte otomatik organoid kültür sistemlerinin geliştirilmesine yardımcı olacak ve organoidlerin araştırılmasını ve uygulanmasını teşvik edecektir. Organoidlerin ışık dağınık yansıma etkisini arttırma teknolojisi otomatik akıllı yetiştirme sisteminde kullanılıyorsa, teorik olarak yüksek hassasiyetli görüntü amplifikasyon kamerasının yerini alabilir ve yalnızca sıradan bir görüntü tanıma cihazının kurulması gerekir. Ek olarak, emme kafası üzerinde rotasyon ve doğal çökeltme ile üretilen ikincil akış yoluyla orta değişim ve organoid transferi, gelecekteki otomatik kültür ekipmanlarında santrifüjlemeden teorik olarak daha uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 2020A0505100062), Guangzhou Şehri Bilim ve Teknoloji Anahtar Konular Projesi (Hibe No. 201904020025), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 31872800, 32070582, 82101937) ve Guangzhou Şehri Doktora Sonrası Araştırma Hibe projesi (Bangzhu Chen'e) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7.1 (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W.
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L.
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, Pt 11 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B.
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
