Summary
يحدد هذا البروتوكول بالتفصيل تحضير معقدات النيوكليوسومال باستخدام طريقتين لإعداد العينة لتجميد شبكات TEM.
Abstract
إصلاح الحمض النووي في سياق الكروماتين غير مفهوم بشكل جيد. تظهر الدراسات الكيميائية الحيوية التي تستخدم جزيئات النيوكليوسوم الأساسية ، وهي الوحدة الأساسية المتكررة للكروماتين ، أن معظم إنزيمات إصلاح الحمض النووي تزيل تلف الحمض النووي بمعدلات منخفضة مقارنة بالحمض النووي الحر. لم يتم توضيح التفاصيل الجزيئية حول كيفية تعرف إنزيمات إصلاح استئصال القاعدة (BER) على تلف الحمض النووي في النيوكليوسومات وإزالته. ومع ذلك ، تشير بيانات BER البيوكيميائية للركائز النووية إلى أن النيوكليوسوم يقدم حواجز هيكلية مختلفة تعتمد على موقع آفة الحمض النووي والإنزيم. وهذا يشير إلى أن الآليات التي تستخدمها هذه الإنزيمات لإزالة تلف الحمض النووي (DNA) في الحمض النووي الحر قد تختلف عن الآليات المستخدمة في النيوكليوسومات. بالنظر إلى أن غالبية الحمض النووي الجينومي يتم تجميعها في النيوكليوسومات ، فإن المعلومات التركيبية لهذه المركبات مطلوبة. حتى الآن ، يفتقر المجتمع العلمي إلى بروتوكولات مفصلة لإجراء دراسات هيكلية مجدية تقنيا لهذه المجمعات. هنا ، نقدم طريقتين لإعداد مركب من اثنين من إنزيمات BER المنصهرة وراثيا (Polymerase β و AP Endonuclease1) مرتبطة بفجوة نيوكليوتيد واحدة بالقرب من دخول وخروج النيوكليوسوم للمجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) التحديد الهيكلي. كلتا الطريقتين لتحضير العينة متوافقتان مع شبكات جودة التزجيج عن طريق التجميد الغاطس. يمكن استخدام هذا البروتوكول كنقطة انطلاق لإعداد معقدات نووية أخرى بعوامل BER مختلفة ، وعوامل نسخ رائدة ، وإنزيمات معدلة للكروماتين.
Introduction
يتم تنظيم الحمض النووي حقيقي النواة وضغطه بواسطة بروتينات هيستون ، مكونا الكروماتين. يشكل جسيم النواة الأساسي (NCP) الوحدة الأساسية المتكررة للكروماتين التي تنظم إمكانية الوصول إلى البروتينات المرتبطة بالحمض النووي لإصلاح الحمض النووي ونسخه وتكراره1. على الرغم من أن البنية البلورية الأولى للأشعة السينية ل NCP قد تم حلها لأول مرة منذ أكثر من عقدين منالزمن 2 وتم نشر العديد من هياكل NCP منذ3،4،5،6 ، لم يتم بعد تحديد آليات إصلاح الحمض النووي في الركائز النووية. سيتطلب الكشف عن التفاصيل الجزيئية الكامنة وراء إصلاح الحمض النووي في الكروماتين توصيفا هيكليا للمكونات المشاركة لفهم كيفية تنظيم السمات الهيكلية المحلية ل NCP لأنشطة إصلاح الحمض النووي. هذا مهم بشكل خاص في سياق إصلاح استئصال القاعدة (BER) بالنظر إلى أن الدراسات الكيميائية الحيوية مع إنزيمات BER تشير إلى آليات فريدة لإصلاح الحمض النووي في النيوكليوسومات التي تعتمد على المتطلبات الهيكلية الخاصة بالإنزيم للتحفيز والموقع الهيكلي لآفة الحمض النووي داخل النيوكليوسوم7،8،9،10،11،12،13 . بالنظر إلى أن BER هي عملية إصلاح حيوية للحمض النووي ، فهناك اهتمام كبير بسد هذه الفجوات مع إنشاء نقطة انطلاق يمكن من خلالها إجراء دراسات هيكلية أخرى مجدية تقنيا تتضمن مجمعات نيوكليوسومات ذات صلة.
أصبح Cryo-EM بسرعة الطريقة المفضلة لحل البنية ثلاثية الأبعاد (3D) للمجمعات التي يمثل إعدادها على نطاق واسع لعينة متجانسة تحديا. على الرغم من أن تصميم وتنقية NCPs المعقدة بعامل إصلاح الحمض النووي (NCP-DRF) سيتطلب على الأرجح تحسينا مخصصا ، فإن الإجراء المقدم هنا لتوليد وتجميد مجمع NCP-DRF مستقر يوفر تفاصيل حول كيفية تحسين العينة وإعداد شبكة cryo-EM. هناك سير عمل (غير متعارضين) موضحين في الشكل 1 ، والتفاصيل المحددة في البروتوكول تحدد الخطوات الهامة وتوفر استراتيجيات لتحسين هذه الخطوات. سيدفع هذا العمل مجال إصلاح الكروماتين والحمض النووي في اتجاه يصبح فيه استكمال الكيمياء الحيوية بالدراسات الهيكلية ممكنا تقنيا لفهم الآليات الجزيئية لإصلاح الحمض النووي النووي بشكل أفضل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تجميع جزيئات النيوكليوسوم الأساسية عن طريق غسيل الكلى بالملح
ملاحظة: تم وصف تحضير جزيئات النواة الأساسية باستخدام بروتينات هيستون المؤتلفة للدراسات الهيكلية على نطاق واسع بالتفصيل من قبل الآخرين14،15،16. اتبع تنقية هيستون X. laevis المؤتلف وتجميع أوكتامير هيستون الموصوف من قبل الآخرين14,15 ، وقم بتجميع الركيزة النووية كما هو موضح أدناه.
- قم بشراء ثلاثة قليل النيوكليوتيدات (المدرجة في الجدول 1) بالمقياس المشار إليه: UND-197mer ، 161mer ، 35mer.
- PAGE تنقية الترامرات (197mer و 161mer) كما هو موضح17.
- كميات متساوية التلدين من قليل النيوكليوتيدات في 1x مخزن مؤقت للتلدين (10 mM Tris-Cl ، درجة الحموضة 8.0 ، 50 mM NaCl). على سبيل المثال ، امزج 40 ميكرولتر من 161 مير [166.7 ميكرومتر] ؛ 8 ميكرولتر من 35 مير [292.4 ميكرومتر] ؛ 16.8 ميكرولتر من حبلا شركات 197 مير [408.2 ميكرومتر] ؛ 10 ميكرولتر من 10x مخزن مؤقت صلب و 10.9 ميكرولتر من dH2O.
ملاحظة: من الأهمية بمكان التحكم في تفاعل التلدين بتدرج درجة الحرارة. انظر الجدول 2 للحصول على تفاصيل حول تدرج درجة الحرارة.
- كميات متساوية التلدين من قليل النيوكليوتيدات في 1x مخزن مؤقت للتلدين (10 mM Tris-Cl ، درجة الحموضة 8.0 ، 50 mM NaCl). على سبيل المثال ، امزج 40 ميكرولتر من 161 مير [166.7 ميكرومتر] ؛ 8 ميكرولتر من 35 مير [292.4 ميكرومتر] ؛ 16.8 ميكرولتر من حبلا شركات 197 مير [408.2 ميكرومتر] ؛ 10 ميكرولتر من 10x مخزن مؤقت صلب و 10.9 ميكرولتر من dH2O.
- PAGE تنقية الترامرات (197mer و 161mer) كما هو موضح17.
- إجراء عمليات إعادة تكوين على نطاق صغير (مقياس بعامل 1/57 من المثال الموضح أدناه لحجم نهائي قدره 50 ميكرولتر) لتحديد نسبة الحمض النووي إلى أوكتامير هيستون (نسب البدء النموذجية للحمض النووي: أوكتامير هي كما يلي: 1: 0.9 ، 1: 1.1 ، 1: 1.2 ، 1: 2 ؛ كما هو موضح في الشكل 2 أ) ؛ من الأهمية بمكان تحديد هذه النسبة تجريبيا من خلال عمليات إعادة التشكيل على نطاق صغير.
- بعد تحديد هذه النسبة ، قم بإعداد إعادة تشكيل واسعة النطاق. على سبيل المثال ، امزج 32.9 ميكرولتر من DNA-197 bp [99.4 μM] ؛ 1647.1 ميكرولتر من TE (1x) ؛ 1120 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم ، و 62.3 ميكرولتر من أوكتامير هيستون WT [2.56 ميكرومتر].
- جعل مخازن غسيل الكلى:RB منخفضة و RBعالية كما هو موضح في الجدول 3 والجدول 4 ، على التوالي ؛ إعداد عمليات إعادة التشكيل كما هو موضح سابقا14.
- انقل أنبوب غسيل الكلى إلى الكأس الزجاجية التي تحتوي علىارتفاع RB ، واسمح بمواصلة غسيل الكلى ، مع التحريك اللطيف ، لمدة 16 ساعة أو حتى يتم نقل 2 LRB منخفض إلى دورق النفايات.
- انقل أنبوب غسيل الكلى إلى دورق سعة 1 لتر يحتوي على محلول RB50mM (الجدول 5) واسمح للعينة بغسيل الكلى لمدة 3 ساعات على الأقل أو طوال الليل.
- تقييم كفاءة إعادة التكوين على جل بولي أكريلاميد غير مسخ بنسبة 6٪ ، مما يضمن وجود أقل من 10٪ من الحمض النووي الحر وشريط NCP واحد ؛ يخزن نقاط الاتصال الوطنية في درجة حرارة 4 درجات مئوية. انظر الشكل 2 أ (الحارة 5) والشكل 2 ب للحصول على نتائج إعادة التكوين المثلى التمثيلية.
2. إعداد مركب عامل إصلاح NCP-DNA (NCP-DRF)
- تنقية عن طريق الكهربائي هلام التحضير
ملاحظة: هذه الطريقة هي الأكثر كثافة في العمل (من بين الطريقتين الموصوفتين) ، وعلى الرغم من أنها فعالة في إزالة الأنواع عالية الوزن الجزيئي (HMW) (الشكل 6 أ) بسبب عامل التخفيف العالي ، يمكن أن يؤدي إلى بعض التفكيك كما هو موضح في الشكل 7 أ (NCP الإعدادية خلية خارج الحارة) ، والإفراج عن الحمض النووي. ومع ذلك ، لا يزال ما يصل إلى 25٪ من الحمض النووي الحر متوافقا مع دراسات cryo-EM. بسبب التخفيف العالي ، استخدم هذه الطريقة لتنقية NCP فقط ، بدلا من المجمع بأكمله.- تحضير 70 مل من محلول جل بولي أكريلاميد غير مسخ 6٪ في 0.2x TBE ، باستخدام محلول جل بولي أكريلاميد 37.5: 1 ، أكريلاميد: بيساكريلاميد. صب هلام أسطواني مع نصف قطر خارجي من 28 ملم والبلمرة بين عشية وضحاها.
- قم بتجميع جهاز تشغيل الجل التحضيري ، باستخدام غشاء غسيل الكلى مع قطع 6-8 كيلو دالتون ميجاوات. استخدم 0.25x TBE كمخزن مؤقت قيد التشغيل ومخزن مؤقت للشطف 1x (50 mM KCl ، 10 mM HEPES ، pH 7.5). قم بتشغيل الجل الأسطواني مسبقا عند 12 واط ثابت لمدة 1 ساعة ، واجمع الكسور التي تشغل المضخة التمعجية بمعدل تدفق يبلغ حوالي 1 مل / دقيقة.
ملاحظة: إذا لم يكن كاشف الأشعة فوق البنفسجية متاحا لتحديد الكسور التي تحتوي على الحمض النووي ، فيمكن إجراء تجربة فحص باستخدام 32P-NCP لتحديد الأجزاء المهمة. مع الحفاظ على جميع الظروف كما هي ، يمكن بعد ذلك تنقية NCPs غير المسماة بدون كاشف للأشعة فوق البنفسجية. - قم بتركيز 2.8 مل من NCP إلى 250 ميكرولتر باستخدام مرشح طرد مركزي (قطع MW 30 kDa) ، وقم بتحميله على الجل التحضيري والرحلان الكهربائي لمدة 6 ساعات. في 2 ساعة ، عندما ينفد السيانول زيلين من الجل ، ابدأ في جمع 1.5 مل من الكسور.
ملاحظة: عند 2.5 ساعة ، ستكون الكسور خالية من زيلين سيانول. الحمض النووي (197mer) يذوب في حوالي 3-3.5 ساعة ، ومن المتوقع أن يتلاشى NCP عند علامة 4.5-5 ساعة. - تحليل كسور الفائدة على 6٪ هلام بولي أكريلاميد غير مسخ. تجمع الكسور التي تحتوي على NCP ، وتركز على الفور مع مرشح الطرد المركزي (قطع MW 30 كيلو دالتون) إلى 1 ملغ / مل. في اليوم التالي ، قم بتقييم جودة NCP على جل بولي أكريلاميد 6٪ غير مسخ قبل التعقيد مع عامل إصلاح الحمض النووي (DRF) محل الاهتمام.
- احتضان NCP و DRF من الاهتمام على الجليد لمدة 15 دقيقة باستخدام المخزن المؤقت الأمثل للمجمع المحدد. على سبيل المثال ، امزج 1000 ميكرولتر من NCP [1.2 ميكرومتر] ؛ 260 ميكرولتر من مخزن مؤقت ربط 5x (250 mM HEPES ، درجة الحموضة 8 ، 500 mM KCl ، 25 mM MgCl2) ، 22 ميكرولتر من 3 M KCl ، و 18 ميكرولتر من MBP- Pol β-APE1 [338 ميكرومتر].
ملاحظة: قد تحتاج درجة الحرارة والقوة الأيونية التي يتكون بها المجمع إلى تحسين المجمعات المختلفة. - أضف الجلوتارالدهيد (مفتوح حديثا ؛ درجة EM) إلى تركيز نهائي قدره 0.005٪. لذلك ، لهذا التفاعل ، أضف 26.8 ميكرولتر من 0.25٪ جلوتارالدهيد مع 13.2 ميكرولتر من dH2O. تخلط جيدا ، وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 13 دقيقة.
- إخماد مع 1 M Tris-Cl ، الرقم الهيدروجيني 7.5 ، إلى تركيز نهائي قدره 20 mM Tris-Cl ، الرقم الهيدروجيني 7.5. ركز على ~ 50 ميكرولتر واستبدل المخزن المؤقت بمخزن تجميد 1x: 50 mM KCl ، 10 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.5 باستخدام عمود تحلية.
تحذير: الجلوتارالدهيد يمكن أن يسبب حروق جلدية شديدة وتلف العين. إنه ضار إذا ابتلع ، وهو سام إذا تم استنشاقه. ارتد معطف المختبر ، ونظارات واقية ، وقفازات ، وتعامل مع الجلوتارالدهيد في غطاء دخان وارتد قناعا.
ملاحظة: من الأهمية بمكان إجراء تفاعل التشابك بكميات كبيرة مع NCP عند هذا التركيز المنخفض. أدت المحاولات السابقة للتشابك ، حتى عند هذا التركيز من الجلوتارالدهيد ، ولكن عند تركيز NCP أعلى بمقدار 10 أضعاف إلى تجميع العينة والإفراط في التشابك كما هو موضح بواسطة SDS PAGE وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. لم يكن لهذه الشبكات جسيمات يمكن تمييزها مع كتل فقط (الشكل 5D ، E). - تحديد الامتصاص عند OD 280 و OD 260 والتركيز أكثر إذا لزم الأمر للوصول إلى 1.3-3 مجم / مل ، بناء على OD 280 (النسبة النموذجية ل OD260 / OD 280 = 1.7-2 تنتج جزيئات جيدة). بالنسبة لهذا الحجم الصغير البالغ 50 ميكرولتر ، فإن أفضل طريقة لتقليل فقد العينة هي عمل زر غسيل الكلى بغطاء أنبوب سعة 1.7 مل مغطى بغشاء غسيل الكلى (قطع 6-8 كيلو دالتون ميجاوات) ، وقطع الجزء السفلي من الأنبوب واستخدام حافة الأنبوب لإغلاق الغشاء أعلى الغطاء.
- ضع زر غسيل الكلى الذي يحتوي على العينة فوق طبقة البولي إيثيلين جلايكول ، مع توجيه الغشاء لأسفل (تحقق من التقدم كل 2 دقيقة). تفضل هذه الطريقة عندما يكون التركيز المطلوب أقل من أو يساوي 2.5 ضعف لتجنب تخفيف أو فقدان العينة في المكثف. من الأهمية بمكان إعداد شبكات cryo-EM للمجمع على الفور بعد هذه الخطوة.
- تنقية بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم
- في اليوم السابق للتجميد ، اغسل ووازن عمود استبعاد الحجم ب 60 مل من dH2O ، متبوعا ب 80 مل من المخزن المؤقت للتجميد (50 mM KCl ، 10 mM HEPES ، pH 8) بين عشية وضحاها بمعدل 0.4 مل / دقيقة. باستخدام نقاط الاتصال الوطنية مباشرة بعد إعادة التكوين ، قم بإعداد نفس المركب باستخدام كميات أكبر بمقدار 2.5 مرة على النحو التالي: خلط 2500 ميكرولتر من NCP [1.2 ميكرومتر] ؛ 650 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 5x ؛ 45 ميكرولتر من MBP-Pol β-APE1 [338 ميكرومتر] و 55 ميكرولتر من 3M KCl.
- احتضان الخليط على الجليد دون crosslinker لمدة 15 دقيقة. ثم أضف الجلوتارالدهيد إلى تركيز نهائي قدره 0.005٪ كما هو موضح في طريقة الجل التحضيري. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، ركز المجمع في مرشح طرد مركزي متوازن مسبقا (مع مخزن مؤقت للتجميد) إلى حوالي 120 ميكرولتر.
- قم على الفور بتحليل كسور الذروة وتركيز تلك الكسور التي تحتوي على الهستونات و MBP-Pol β-APE1 كما هو موضح سابقا. انظر الشكل 5A و B و C للحصول على نتائج ناجحة باستخدام طريقة استبعاد الحجم والشكل 7 باستخدام كلتا الطريقتين.
3. تجميد مجمع النواة
- بعد تشغيل الفريزر المغرق وملء المرطب ب 50 مل من dH2O ، اضبط درجة حرارة الغرفة على 22 درجة مئوية و HR (الرطوبة) على 98٪. ضع كوب الإيثان وكوب النيتروجين السائل (الذي يحتوي على صندوق شبكي مصنف) في حاملات المساحة الخاصة بكل منهما.
- قم بتغطية كوب الإيثان بموزع غطاء الإيثان ، واسكب النيتروجين السائل (LN2) فوقه بعناية ، مع ملء كوب LN 2 أيضا ب LN2. عندما يستقر مستوى LN2 ويصل إلى 100٪ ودرجة حرارة -180 درجة مئوية ، افتح صمام الإيثان بعناية واملأ كوب الإيثان حتى يشكل فقاعة على الغطاء الشفاف. قم بإزالة موزع الإيثان.
- ضع ورقتي ترشيح على جهاز النشاف وثبتهما بحلقة معدنية. انتقل إلى الإعداد واستخدم المعلمات التالية للنشاف: 0 لطخة مسبقة ، 3 لطخة ، 0 بعد اللطخة ؛ حدد A-plunge وانقر على موافق.
- على الشاشة الرئيسية ، انقر فوق Load Scrapps ، وقم بتحميلها بشبكة بحيث يكون جانب الكربون / التطبيق متجها نحو اليسار (تم إعداده كما كان من قبل). قم بمعايرة الملقط بضبط المحور Z لضمان وجود بقعة صلبة. انقر فوق الغرفة السفلية وقم بتطبيق 3 ميكرولتر من المركب (1.3-3 مجم / مل ؛ OD280). انقر على لطخة / A-الغطس. سيؤدي ذلك إلى تدوير الشبكة لطخة من الأمام وسيغرق تجميدها.
- نقل وتخزين الشبكة في مربع الشبكة في غرفة LN2 . عندما يتم تجميد جميع الشبكات الأربع ووضعها في صندوق الشبكة ، قم بتدوير الغطاء إلى الوضع المحايد ، حيث يتم تغطية جميع الشبكات بالغطاء ، وشد المسمار. يمكن تخزين الشبكات في LN2 حتى يبدأ الفحص.
4. شبكات الشاشة
- قبل تحميل العينات في المجهر ، ضع الشبكات المزججة على حلقة وقم بتثبيتها باستخدام مشبك C. قم بإجراء عملية القص هذه تحت LN2 في غرفة يتم التحكم فيها بالرطوبة ، لتجنب تلوث الجليد.
- عند تحميل المجهر ، أدخل الشبكات في شريط كاسيت مكون من 12 فتحة. قم بنقل الكاسيت إلى كبسولة nanocab وقم بتحميله في أداة التحميل التلقائي. تبدأ الآلية الروبوتية للمحمل التلقائي العملية.
- نقل الشبكة من الكاسيت إلى مرحلة المجهر. اضبط المرحلة على ارتفاع eucentric عن طريق تذبذب المرحلة 10 درجات وتحريك ارتفاع Z في نفس الوقت حتى يتم ملاحظة الحد الأدنى من الإزاحة المستوية في الصور.
- بمجرد الوصول إلى ارتفاع eucentric ، ابدأ التصوير. أولا ، احصل على الأطلس عن طريق التقاط صورة مونتاج 3 × 3 للشبكة ، حيث يتم التقاط كل مونتاج بتكبير 62x. اختر ثلاثة مربعات بأحجام مختلفة ؛ خذ الارتفاع المركزي ، ثم الصورة بتكبير 210x.
- بمجرد تصوير مربع ، اختر ثقبا واحدا من كل من الحافة والوسط وما بين المربعات. صور كل ثقب بتكبير 2600x.
- قبل التقاط هذه الصورة عالية التكبير، يحدث التركيز البؤري التلقائي عند إزاحة منطقة التصوير. التقط صورة التكبير العالي من مركز الفتحة عند تكبير 36000 مرة ووقت تعريض 7.1 ثانية و 60 إطارا وحجم 1.18 بكسل وإلغاء تركيز بؤري 3 ميكرومتر. انظر الصور التمثيلية للفحص في الشكل 5 والشكل 6 والشكل 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام NCPs المجمعة بشكل صحيح (الشكل 2) لصنع مركب مع بروتين اندماج مؤتلف من MBP-Polβ-APE1 (الشكل 3). لتحديد نسبة NCP إلى MBP-Polβ-APE1 لتشكيل مجمع مستقر ، أجرينا مقايسات تحول الحركة الكهربية (EMSA) (الشكل 4) ، والتي أظهرت نطاقا متغيرا منفردا من NCP مع زيادة مولية بمقدار 5 أضعاف من MBP-Polβ-APE1. أثناء تحسين صنع هذا المركب ، كان التشابك مع الجلوتارالدهيد أمرا بالغ الأهمية لمنع NCP من الانهيار. في البداية ، تم إجراء تجميع مجمع NCP-Polβ-APE1 بحجم أصغر ، عند حوالي 10 ميكرومتر NCP ، باستخدام تركيز الجلوتارالدهيد النهائي 0.005٪. في ظل هذه الظروف ، كانت العينة متشابكة بشكل مفرط (الشكل 5D-E) وأسفرت عن مجاميع بدون مجمعات فردية يمكن تمييزها. أدى التشابك عند نقاط الاتصال الوطنية المخففة بمقدار 10 أضعاف تقريبا (1.2 ميكرومتر NCP) إلى انخفاض كبير في التجميع وتحسين استقرار الجسيمات (الشكل 5A-C). يوضح الشكل 6 أنه يمكن دمج كلتا الطريقتين المبينتين في الشكل 1 مع الجل التحضيري لتحسين جودة NCPs عندما يحتوي NCP على كمية كبيرة من المجاميع عالية الوزن الجزيئي (HMW) (الشكل 6A) ، متبوعا بتنقية المركب عن طريق استبعاد الحجم. على الرغم من أن هذا أظهر نجاحا كبيرا في إعداد العينة (الشكل 5B-C) والشبكات ، مما أسفر عن جزيئات مستقرة (الشكل 6D) ، إلا أن التكوين دون المستوى الأمثل للمجمع (الشكل 6A) أسفر عن خريطة ثلاثية الأبعاد ل NCP وحدها (البيانات غير معروضة). تظهر هذه النتائج أنه يمكن استخدام كلتا الطريقتين (استبعاد الحجم والهلام التحضيري) بشكل مستقل لتوليد معقدات مستقرة (الشكل 7A-C). في الواقع ، تم جمع البيانات من كلتا الشبكتين وتظهر فئتين متطابقتين تقريبا (الشكل 7D) وخرائط ثلاثية الأبعاد (الشكل 7E) بدقة 3.2 Å تقريبا.
الشكل 1: سير عمل الطريقتين المعروضتين في هذا البروتوكول لإعداد وتجميد مركب NCP-Polβ-APE1 عبر 1) هلام تحضيري و 2) استبعاد الحجم. على الرغم من عدم ظهورها هنا ، يمكن دمج هذه الطرق (الشكل 6) ، بدءا من (1) وتنقية المركب المركز من (1) باستخدام عمود التحجيم. وسيتطلب ذلك مضاعفة المواد الأولية لنقاط الاتصال الوطنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعادة تشكيل حزب المؤتمر الوطني التمثيلي. (أ) تمت معايرة الحمض النووي بكميات متزايدة من أوكتامير الهستون بنسب 1: 0.9 ، 1: 1.1 ، 1: 1.2 ، 1: 2 ، DNA: أوكتامير. (ب) تكرار نقاط الاتصال الوطنية المجمعة على نطاق واسع (1: 2 ، الحمض النووي: أوكتامير). تم إعادة التشكيل كهربائيا في هلام بولي أكريلاميد غير مسخ بنسبة 6٪ ، متبوعا بتلطيخ sybr green I. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: رسم تخطيطي ل Polβ-APE1 المنصهر وراثيا مع MBP في طرفه N. تم تمييز بروتين الاندماج MBP-Polβ-APE1 إنزيميا لكلا النشاطين (البيانات غير معروضة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: ربط MBP-Polβ-APE1 بنقاط الاتصال الوطنية. تم تحضين الركيزة النووية (100 نانومتر) بكميات متزايدة من MBP-Polβ-APE1 لمدة 15 دقيقة على الجليد. تم فصل NCP المربوط وغير المنضم في هلام بولي أكريلاميد غير مسخ بنسبة 6٪ ، متبوعا بتلطيخ sybr green I. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل نتائج التشابك الناجحة وغير الناجحة. يظهر ملف تعريف الشطف للمجمع في (A) مع تسمية ذروة الاهتمام. تم تحليل الكسور ، المشار إليها ب "F" ، التي تم جمعها من هذا الشطف في هلام بولي أكريلاميد تريسين 16٪ والموضحة في (B). (ج) جمدت العينة من (ب) باستخدام شبكات دعامة كربونية هولية وصورت باستخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد للانبعاث الميداني 200 kV. التجارب غير الناجحة المقابلة موضحة في (د) و(ه) و(و). لاحظ أن هذه التجارب غير الناجحة تحتوي على بروتين الاندماج بدون MBP. يشير HOc و HOD إلى أوكتامير هيستون المركز والمخفف ، على التوالي ؛ RT يدل على درجة حرارة الغرفة ؛ "X" يتوافق مع التشابك مع الجلوتارالدهيد. أشرطة المقياس = 100 نانومتر (C ، F). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تحضير مركب NCP-Polβ-APE1 باستخدام الطريقتين جنبا إلى جنب. (أ) تم تحليل غير المنضم والمقيد (1: 1 ، NCP- Polβ-APE1) في 6٪ بولي أكريلاميد غير مسخ جل (لاحظ أنه عند هذه النسبة يتم ربط 50٪ فقط). (ب) ملف تعريف الشطف لمجمع NCP-Polβ-APE1 من عمود التحجيم. (ج) تحليل الكسور المستخلصة في هلام بولي أكريلاميد تريسين 16٪ ؛ تم تجميع الكسور وتركيزها ، كما هو مبين. (د) تم تجميد العينة وتصويرها كما هو موضح في الشكل 5 ب. لم تظهر معالجة البيانات كثافة إضافية تتوافق مع Polβ-APE1 (غير معروض). يشير الحرف "X" في الممرات 5 و 6 إلى التشابك مع الجلوتارالدهيد كما هو موضح في البروتوكول. شريط المقياس = 100 نانومتر (D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تحليل مركب NCP-MBP-Polβ-APE1. (أ) تم إرسال عينات من الخطوات المختلفة في الطرق الموضحة في الشكل 1 بالكهرباء في مادة هلامية غير مسورة من مادة البولي أكريلاميد بنسبة 6٪. لاحظ أن التكوين المعقد قابل للتكرار بالطريقتين. (ب، ج) صور شبكة دعم الكربون التمثيلية التي تم التقاطها باستخدام مجهر إلكتروني ناقل 300 كيلو فولت حيث تبرز المربعات الحمراء اتجاهات مختلفة للمجمع (بعضها يتوافق مع فئات 2D الموضحة في (D). (ه) تظهر البيانات المعالجة من (C) خريطة ثلاثية الأبعاد بدقة 3.2 Å لمجمع NCP-MBP-Polβ-APE1.). أشرطة المقياس = 100 نانومتر (B ، C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم قليل النوكليوتيد | التسلسل (5'-->3') | مقياس تنقية | طريقة التنقية | عدد القوارير المطلوبة | ||
| فرع UND التكميلي | TGATGGACCCTATACGCGGCCCCCCCTGGAGAAT CCCGGTGCCGGGGCCGCTCAATTGGTCGTAGA CAGCTCTAGCACCGCTTAAACGCACGTACGCGC TGTCCCCCGCGTTTTAACCGCCAAGGGGATTAC TCCCTAGTCTCCAGGCACGTCAGATATCAAC ATCCTGTGCATGTATTGAACAGCGACCTTGCCG |
20 نمول | صفحة منقاة | 6 | ||
| 161 مر | /5فوس/غاتاكتغاكاكغكتغاغاتاجاغ GAGTAATCCCCTTGGCGGTTAAAACGCGGGGG ACAGCGCGTACGTGCGTTTAAGCGGTGCTAGA GCTGTCTACGACCATTGAGCGGCCTCGGCA CCGGGATTCTCCAGGGCGGCGCGTATAGGG TCCATCA |
20 نمول | صفحة منقاة | 4 | ||
| 35 مر | CGGCAAGGTCGCTTCAATACATGCACAGG ايه تي جي تي |
250 نمول | هبلك | 1 | ||
الجدول 1: ركيزة الحمض النووي. تم تلدين ثلاثة قليل النوكليوتيدات لتوليد ركيزة dsDNA. المقاطع التي تحتها خط هي 25 نقطة أساس من الحمض النووي الرابط يحيط بتسلسل تحديد موضع الحمض النووي 147 bp 601 الذي يحتوي على فجوة نيوكليوتيدات واحدة.
| درج | درجة الحرارة (°C) | الوقت (دقيقة) / خطوة |
| 1 | 95 | 10 |
| 2-5 | 90, 85, 80, 75 | 5 |
| 6-41 | 69 انخفاض بنسبة 1 | 3 |
| 42 | 4 | مسك |
الجدول 2: تدرج درجة حرارة التلدين. تم تحضين Oligos في دورة حرارية في درجات الحرارة هذه لتوليد ركيزة dsDNA.
| المكونات (المخزون) | الحجم/الكمية | التركيز النهائي |
| 3 م كيلوجرام | 167 مل | 0.250 م |
| 1 M HEPES ، درجة الحموضة 8.0 | 20 مل | 10 مللي متر |
| 0.5 متر EDTA | 4 مل | 1 مللي متر |
| 1 م DTT | 2 مل | 1 مللي متر |
| الفصول | 2 غرام | 1.6 مللي متر |
| QS مع dH 2 O لصنع2لتر | ||
الجدول 3: المخزن المؤقتلإعادة التكوين المنخفض RB. تمت إضافة تعليمات لجعل 2 لتر كما تم الإبلاغ عنه سابقا14 ، باستثناء 1.6 mM CHAPS.
| المكونات (المخزون) | الحجم/الكمية | التركيز النهائي |
| 3 م كيلوجرام | 267 مل | 2 م |
| 1 M HEPES ، درجة الحموضة 8.0 | 4 مل | 10 مللي متر |
| 0.5 متر EDTA | 800 ميكرولتر | 1 مللي متر |
| 1 م DTT | 400 ميكرولتر | 1 مللي متر |
| الفصول | 0.4 غ | 1.6 مللي متر |
| QS مع dH2O لجعل 400 مل | ||
الجدول 4: RBارتفاع إعادة تشكيل العازلة. تمت إضافة تعليمات لجعل 400 مل كما تم الإبلاغ عنه سابقا14 ، باستثناء 1.6 mM CHAPS.
| المكونات (المخزون) | حجم | التركيز النهائي |
| 3 م كيلوجرام | 16.7 مل | 50 مللي متر |
| 1 M HEPES ، درجة الحموضة 8.0 | 10 مل | 10 مللي متر |
| 0.5 متر EDTA | 2 مل | 1 مللي متر |
| 1 م DTT | 1 مل | 1 مللي متر |
| QS مع dH2O لصنع 1 لتر | ||
الجدول 5: المخزن المؤقت لإعادة تكوين RB50mM . تعليمات لجعل 1 لتر من المخزن المؤقت لإعادة التكوين متوافقا مع التجميد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعتمد بروتوكول محدد لتنقية عامل إصلاح الحمض النووي على الإنزيم محل الاهتمام. ومع ذلك ، هناك بعض التوصيات العامة ، بما في ذلك استخدام الطرق المؤتلفة للتعبير عن البروتين وتنقيته18 ؛ إذا كان البروتين محل الاهتمام صغيرا جدا (<50 كيلو دالتون) ، فإن تحديد الهيكل بواسطة cryo-EM كان شبه مستحيل حتى وقت قريب من خلال استخدام أنظمة الاندماج19 ، والسقالات الملزمة للجسم النانوي20 ، وتحسين استراتيجيات التصوير21.
من الشائع جدا الحصول على شبكات ذات جودة رديئة في المراحل الأولية. أظهرت المحاولات الأولية لتحديد تجانس واستقرار NCP دون أي رابط متشابك ، باستخدام أسيتات اليورانيل وشبكات النحاس المطلية بالكربون للتلطيخ السلبي ، استقرار NCPs وانتشارها بشكل جيد مع الحد الأدنى من التجميع. ومع ذلك ، بمجرد تزجيج هذه العينة (بتركيز أعلى 20 مرة) في شبكات cryo-EM ، لم يتم اكتشاف أي جسيمات. وكان تحسين العينة لمنع نقاط الاتصال الوطنية من الانهيار أو التجميع أكبر عقبة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف طريقتين للتحضير بشكل منفصل ؛ ومع ذلك ، فهي ليست حصرية بشكل متبادل ويمكن استخدامها بشكل متتالي عن طريق تنقية NCP أولا عبر هلام تحضيري ، وتعقيده بعامل الإصلاح ، وتنقية المركب بعمود استبعاد الحجم. يتطلب هذا ضعف كمية المواد للخطوة الأولية ، كما أنه يستغرق وقتا أطول ، ولكنه مفيد للعينات الصعبة (الشكل 6).
كان من الصعب العثور على نقطة انطلاق لتركيز crosslinker بسبب عدم الاتساق في طرق الربط المتشابك وكميات التشابك المستخدمة من قبل الآخرين22,23. فشلت محاولات تكرار رد الفعل المتشابك الأقل تحكما على سطح المقعد الذي وصفه أندرسون وآخرون في إعطاء نتائج إيجابية ، وكان المجمع متشابكا بشكل مفرط. من المحتمل أن يكون هذا بسبب مصدر الجلوتارالدهيد (أمبولة مفتوحة حديثا مقارنة بالجلوتارالدهيد المخزن على المدى الطويل). نظرا لأن هذا المستوى من التفاصيل غالبا ما يتم حذفه في المقالات البحثية غير المنهجية ، فمن الصعب تكرار الظروف الدقيقة كنقطة بداية. تم الحصول على النتائج المثلى عندما تم ربط المركب بتركيز 1.2 ميكرومتر في 150 mM KCl مقاومة أيونية مقارنة بربط المركب عند 10 ميكرومتر NCP ، بنفس تركيز الجلوتارالدهيد 0.005٪ لمدة 13 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. من المحتمل أيضا أن تعتمد كفاءة التشابك على المركب الذي يتم تشكيله لأن بعض العوامل المتفاعلة مع الكروماتين قد تحفز / تتطلب زعزعة استقرار أكبر تؤثر على مكان حدوث التشابك والتأثير الكلي على استقرار NCP. لذلك ، في حين أن تحسين هذه الظروف أمر لا مفر منه ، فإن إيجاد خطوات حاسمة مثل NCP الأمثل وتركيز الملح أثناء تفاعلات التشابك سيكون أمرا بالغ الأهمية.
معلمة مهمة أخرى كانت نسبة NCP: DRF التي أسفرت عن جزيئات كافية على الشبكة التي تحتوي على DRF مرتبطة ب NCP. في الواقع ، تم تحديد هذه المعلمة أيضا من قبل الآخرين على أنها معلمة حاسمة لتحسين الدراسات الهيكلية16 بالنظر إلى أنه حتى بالنسبة للتجانس المبرد EM للطريقة التي يرتبط بها DRF ب NCP مهم لخريطة 3D. قد يؤدي عدم تحسين هذا إلى ربط غير منضم أو غير متجانس وغير محدد. عندما تم استخدام نسبة مولار 1: 1 ، مما أدى إلى 50٪ فقط من NCP المرتبط ب DRF (الشكل 6) ، لم تظهر الخريطة ثلاثية الأبعاد أي كثافة إضافية تتوافق مع DRF. لذلك ، من المهم تحديد النسبة التي تنتج نطاقا واحدا في نفس الموقع على EMSA وتظهر قمة واحدة على الرسم البياني لعمود التحجيم ، المقابلة للمجمع. أضافت العديد من المعلمات لتجميد الشبكات ، بما في ذلك وقت اللطخة ، عدة جولات من التحسين.
يوفر هذا البروتوكول معا تعليمات مفصلة لأول مرة حول طريقتين مختلفتين لإعداد معقدات النيوكليوسومال للتحديد الهيكلي cryo-EM. يمكن استخدام معلمات خط الأساس لإعداد الشبكة المقدمة كنقطة بداية. وعلى الرغم من عدم وجود طريقة واحدة تعمل بشكل جيد على قدم المساواة مع جميع المجمعات الجزيئية الكبيرة ، فإن التركيز على تحسين المعلمات الموصوفة في هذا البروتوكول سيؤدي إلى تضييق استراتيجية التحسين المخصص للمجمعات النووية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
نشكر الدكتور ماريو بورجنيا من نواة cryo-EM في المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية والدكتور جوشوا شتراوس من جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل على إرشادهم وتدريبهم في إعداد شبكة cryo-EM. كما نشكر الدكتورة جوليانا ميلو دا فونسيكا ريزيندي على المساعدة التقنية في المراحل الأولية من هذا المشروع. نحن نقدر المساهمة والدعم الرئيسيين للراحل الدكتور صموئيل ويلسون وأعضاء مختبره ، وخاصة الدكتور راجندرا براساد والدكتور جوناس جامسن لتنقية مركب APE1-Polβ المنصهر وراثيا. تم دعم البحث من قبل برنامج البحوث الداخلية للمعاهد الوطنية للصحة ، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية [أرقام المنح Z01ES050158 و Z01ES050159 و K99ES031662-01].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640--6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S.
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. Guide to Protein Purification. 463, Academic Press. (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
