Summary
Questo protocollo delinea in dettaglio la preparazione di complessi nucleosomiali utilizzando due metodi di preparazione del campione per il congelamento delle griglie TEM.
Abstract
La riparazione del DNA nel contesto della cromatina è poco conosciuta. Studi biochimici che utilizzano particelle nucleosomiche del nucleosoma, l'unità ripetitiva fondamentale della cromatina, mostrano che la maggior parte degli enzimi di riparazione del DNA rimuove il danno al DNA a tassi ridotti rispetto al DNA libero. I dettagli molecolari su come gli enzimi di riparazione dell'escissione di base (BER) riconoscono e rimuovono il danno al DNA nei nucleosomi non sono stati chiariti. Tuttavia, i dati biochimici BER dei substrati nucleosomiali suggeriscono che il nucleosoma presenta diverse barriere strutturali a seconda della posizione della lesione del DNA e dell'enzima. Ciò indica che i meccanismi impiegati da questi enzimi per rimuovere il danno al DNA nel DNA libero possono essere diversi da quelli impiegati nei nucleosomi. Dato che la maggior parte del DNA genomico è assemblato in nucleosomi, sono necessarie informazioni strutturali di questi complessi. Ad oggi, la comunità scientifica manca di protocolli dettagliati per eseguire studi strutturali tecnicamente fattibili di questi complessi. Qui, forniamo due metodi per preparare un complesso di due enzimi BER geneticamente fusi (polimerasi β e AP Endonucleasi1) legati a un gap a singolo nucleotide vicino all'entrata-uscita del nucleosoma per la determinazione strutturale della crio-microscopia elettronica (crio-EM). Entrambi i metodi di preparazione del campione sono compatibili per la vetrificazione di griglie di qualità tramite congelamento a tuffo. Questo protocollo può essere utilizzato come punto di partenza per preparare altri complessi nucleosomiali con diversi fattori BER, fattori di trascrizione pionieristici ed enzimi modificanti la cromatina.
Introduction
Il DNA eucariotico è organizzato e compattato dalle proteine istoniche, formando la cromatina. La particella nucleosomica (NCP) costituisce l'unità ripetitiva fondamentale della cromatina che regola l'accessibilità alle proteine leganti il DNA per la riparazione, la trascrizione e la replicazione del DNA1. Sebbene la prima struttura cristallina a raggi X del PCN sia stata risolta per la prima volta più di due decenni fa2 e molte altre strutture del PCN siano state pubblicate da 3,4,5,6, i meccanismi di riparazione del DNA nei substrati nucleosomiali non sono ancora stati delineati. Scoprire i dettagli molecolari alla base della riparazione del DNA nella cromatina richiederà la caratterizzazione strutturale dei componenti partecipanti per comprendere come le caratteristiche strutturali locali del PCN regolano le attività di riparazione del DNA. Ciò è particolarmente importante nel contesto della riparazione per escissione di base (BER), dato che gli studi biochimici con enzimi BER suggeriscono meccanismi unici di riparazione del DNA nei nucleosomi che dipendono dai requisiti strutturali enzimatici specifici per la catalisi e dalla posizione strutturale della lesione del DNA all'interno del nucleosoma 7,8,9,10,11,12,13 . Dato che il BER è un processo vitale di riparazione del DNA, vi è un notevole interesse a colmare queste lacune, stabilendo al contempo un punto di partenza da cui possono essere condotti altri studi strutturali tecnicamente fattibili che coinvolgono complessi nucleosomiali rilevanti.
Cryo-EM sta rapidamente diventando il metodo di scelta per risolvere la struttura tridimensionale (3D) di complessi la cui preparazione su larga scala di campioni omogenei è impegnativa. Sebbene la progettazione e la purificazione di NCP complessati con un fattore di riparazione del DNA (NCP-DRF) richiedano probabilmente un'ottimizzazione su misura, la procedura qui presentata per generare e congelare un complesso NCP-DRF stabile fornisce dettagli su come ottimizzare il campione e la preparazione della griglia crio-EM. Due flussi di lavoro (non mutuamente esclusivi) illustrati nella Figura 1 e i dettagli specifici nel protocollo identificano i passaggi critici e forniscono strategie per l'ottimizzazione di tali passaggi. Questo lavoro spingerà il campo della cromatina e della riparazione del DNA in una direzione in cui l'integrazione degli studi biochimici con quelli strutturali diventa tecnicamente fattibile per comprendere meglio i meccanismi molecolari della riparazione nucleosomica del DNA.
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Protocol
1. Assemblare le particelle del nucleo del nucleosoma tramite dialisi salina
NOTA: La preparazione di particelle nucleosomiche utilizzando proteine istoniche ricombinanti per studi strutturali è stata ampiamente descritta in dettaglio da altri14,15,16. Seguire la purificazione degli istoni ricombinanti di X. laevis e dell'assemblaggio di ottameri istonici descritti da altri14,15 e assemblare il substrato nucleosomico come descritto di seguito.
- Acquistare tre oligonucleotidi (elencati nella Tabella 1) alla scala indicata: UND-197mer, 161mer, 35mer.
- PAGE purifica gli ultrameri (197mer e 161mer) come descritto17.
- Quantità equimolari di ricottura di oligonucleotidi in tampone di ricottura 1x (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Ad esempio, mescolare 40 μL di 161-mer [166,7 μM]; 8 μL di 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL di filamento comp 197-mer [408,2 μM]; 10 μL di tampone di ricottura 10x e 10,9 μL di dH2O.
NOTA: è fondamentale controllare la reazione di ricottura con un gradiente di temperatura. Vedere la Tabella 2 per i dettagli sul gradiente di temperatura.
- Quantità equimolari di ricottura di oligonucleotidi in tampone di ricottura 1x (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Ad esempio, mescolare 40 μL di 161-mer [166,7 μM]; 8 μL di 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL di filamento comp 197-mer [408,2 μM]; 10 μL di tampone di ricottura 10x e 10,9 μL di dH2O.
- PAGE purifica gli ultrameri (197mer e 161mer) come descritto17.
- Eseguire ricostituzioni su piccola scala (scala di un fattore di 1/57 dell'esempio mostrato di seguito per un volume finale di 50 μL) per determinare il rapporto tra DNA e ottamero istonico (i rapporti di partenza tipici di DNA:ottamero sono i seguenti: 1:0.9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2; mostrato in Figura 2A); È fondamentale determinare empiricamente questo rapporto con ricostituzioni su piccola scala.
- Dopo aver determinato questo rapporto, preparare una ricostituzione su larga scala. Ad esempio, mescolare 32,9 μL di DNA-197 bp [99,4 μM]; 1647,1 μL di TE (1x); 1120 μL di 5 M NaCl e 62,3 μL di ottamero istonico WT [2,56 μM].
- Effettuare tamponi per dialisi: RBbasso e RBalto come descritto rispettivamente nella Tabella 3 e nella Tabella 4; impostare le ricostituzioni come descritto in precedenza14.
- Trasferire il tubo di dialisi nel becher contenente RBalto e lasciare che la dialisi proceda, agitando delicatamente, per 16 ore o fino a quando 2 L RBbasso non sia stato trasferito nel becher di scarico.
- Trasferire il tubo di dialisi in un becher da 1 L contenente tampone RB50mM (Tabella 5) e lasciare che il campione dializzi per almeno 3 ore o durante la notte.
- Valutare l'efficienza di ricostituzione su un gel non denaturante in poliacrilammide al 6%, assicurandosi che ci sia meno del 10% di DNA libero e una singola banda NCP; conservare i PCN a 4 °C. Vedere la Figura 2A (corsia 5) e la Figura 2B per i risultati rappresentativi ottimali della ricostituzione.
2. Preparare il complesso del fattore di riparazione NCP-NA (NCP-DRF)
- Purificazione mediante elettroforesi su gel preparativo
NOTA: Questo metodo è il più laborioso (dei due descritti) e, sebbene sia efficace nel rimuovere le specie ad alto peso molecolare (HMW) (Figura 6A) a causa dell'elevato fattore di diluizione, può portare ad un certo smontaggio, come mostrato nella Figura 7A (NCP prep cell out lane), rilasciando DNA. Tuttavia, fino al 25% di DNA libero è ancora compatibile con gli studi crio-EM. A causa dell'elevata diluizione, utilizzare questo metodo per purificare solo il PCN, piuttosto che l'intero complesso.- Preparare 70 ml di soluzione di gel di poliacrilammide non denaturante al 6% in 0,2x TBE, utilizzando soluzione di gel di poliacrilammide 37,5: 1, acrilammide: bisacrilammide. Versare un gel cilindrico con raggio esterno di 28 mm e polimerizzare durante la notte.
- Assemblare l'apparecchio di funzionamento del gel preparativo, utilizzando una membrana per dialisi con un cutoff di 6-8 kDa MW. Utilizzare 0,25x TBE come buffer di corsa e 1x buffer di eluizione (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Pre-eseguire il gel cilindrico a una costante di 12 W per 1 ora e raccogliere le frazioni che fanno funzionare la pompa peristaltica ad una portata di circa 1 mL/min.
NOTA: Se non è disponibile un rivelatore UV per identificare le frazioni contenenti DNA, è possibile eseguire un esperimento di screening con 32P-NCP per identificare le frazioni di interesse. Mantenendo tutte le condizioni uguali, gli NCP non etichettati possono quindi essere purificati senza un rilevatore UV. - Concentrare i 2,8 mL di NCP a 250 μL utilizzando un filtro centrifugo (cutoff MW 30 kDa) e caricare sul gel preparativo ed elettroforeso per un totale di 6 ore. A 2 ore, quando lo xilene cianolo ha esaurito il gel, iniziare a raccogliere 1,5 mL di frazioni.
NOTA: A 2,5 ore, le frazioni saranno libere dallo xilene cianolo; il DNA (197mer) eluisce a circa 3-3,5 ore, e ci si aspetta che il NCP eluisca a 4,5-5 h. - Analizzare le frazioni di interesse su un gel di poliacrilammide non denaturante al 6%. Raggruppare le frazioni contenenti il PCN e concentrare immediatamente con un filtro centrifugo (cutoff MW 30 kDa) a 1 mg/ml. Il giorno successivo, valutare la qualità del PCN su un gel non denaturante in poliacrilammide al 6% prima di complessare con il fattore di riparazione del DNA (DRF) di interesse.
- Incubare il PCN e il DRF di interesse sul ghiaccio per 15 minuti utilizzando un buffer ottimale per il complesso specifico. Ad esempio, miscelare 1.000 μL di NCP [1,2 μM]; 260 μL di tampone legante 5x (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL di 3 M KCl e 18 μL di MBP- Pol β-APE1 [338 μM].
NOTA: La temperatura e la forza ionica a cui è realizzato il complesso potrebbero richiedere un'ottimizzazione per diversi complessi. - Aggiungere glutaraldeide (appena aperta; EM) ad una concentrazione finale dello 0,005%. Pertanto, a questa reazione, aggiungere 26,8 μL di glutaraldeide allo 0,25% con 13,2 μL di dH2O. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 13 minuti.
- Tempra con 1 M Tris-Cl, pH 7,5, fino ad una concentrazione finale di 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Concentrare a ~50 μL e sostituire il tampone con 1x tampone di congelamento: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 utilizzando una colonna di dissalazione.
ATTENZIONE: La glutaraldeide può causare gravi ustioni cutanee e danni agli occhi; È dannoso se ingerito ed è tossico se inalato. Indossare un camice da laboratorio, occhiali, guanti e maneggiare la glutaraldeide in una cappa aspirante e indossare una maschera.
NOTA: È fondamentale eseguire la reazione di reticolazione in un grande volume con il PCN a questa concentrazione inferiore. Precedenti tentativi di reticolazione, anche a questa concentrazione di glutaraldeide, ma ad un NCP concentrato 10 volte superiore, hanno portato all'aggregazione del campione e alla sovra-reticolazione come indicato dalla SDS PAGE e dalla cromatografia ad esclusione dimensionale. Queste griglie non avevano particelle distinguibili con solo grumi (Figura 5D,E). - Determinare le assorbanze a OD 280 e OD 260 e concentrarsi ulteriormente se necessario per raggiungere 1,3-3 mg / ml, sulla base di OD 280 (rapporto tipico di OD260 / OD 280 = 1,7-2 produce particelle buone). Per questo piccolo volume di 50 μL, il metodo migliore per ridurre la perdita di campione è quello di creare un pulsante di dialisi con un coperchio di un tubo da 1,7 mL coperto da una membrana di dialisi (cutoff di 6-8 kDa MW), tagliando il fondo del tubo e utilizzando il bordo del tubo per sigillare la membrana sulla parte superiore del coperchio.
- Posizionare il pulsante di dialisi contenente il campione sopra un letto di glicole polietilenico, con la membrana rivolta verso il basso (controllare i progressi ogni 2 minuti). Questo metodo è preferibile quando la concentrazione necessaria è inferiore o uguale a 2,5 volte per evitare di diluire o perdere il campione nel concentratore. È fondamentale preparare immediatamente le griglie crio-EM del complesso dopo questo passaggio.
- Cromatografia di purificazione mediante esclusione dimensionale
- Il giorno prima del congelamento, lavare ed equilibrare una colonna di esclusione dimensionale con 60 mL di dH2O, seguita da 80 mL di tampone congelante (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) per una notte ad una velocità di 0,4 mL/min. Utilizzando i PCN subito dopo la ricostituzione, preparare lo stesso complesso utilizzando quantità 2,5 volte maggiori come segue: miscelare 2.500 μL di NCP [1,2 μM]; 650 μL di tampone legante 5x; 45 μL di MBP-Pol β-APE1 [338 μM] e 55 μL di 3M KCl.
- Incubare la miscela su ghiaccio senza reticolante per 15 min. Quindi, aggiungere glutaraldeide a una concentrazione finale dello 0,005% come descritto nel metodo del gel preparativo. In questo caso, tuttavia, concentrare il complesso in un filtro centrifugo pre-equilibrato (con tampone di congelamento) a circa 120 μL.
- Analizzare immediatamente le frazioni di picco e concentrare quelle contenenti gli istoni e MBP-Pol β-APE1 come indicato in precedenza. Vedere la Figura 5A,B,C per ottenere risultati positivi utilizzando il metodo di esclusione delle dimensioni e la Figura 7 utilizzando entrambi i metodi.
3. Congelare il complesso nucleosomico
- Dopo aver acceso il congelatore e riempito l'umidificatore con 50 ml di dH2O, impostare la temperatura della camera a 22 °C e HR (umidità) al 98%. Posizionare la tazza di etano e la tazza di azoto liquido (contenente una scatola di griglia etichettata) nei rispettivi supporti di spazio.
- Coprire la tazza di etano con il dosatore del coperchio di etano e versare con attenzione l'azoto liquido (LN2) su di essa, riempiendo anche la tazza LN 2 con LN2. Quando il livello di LN2 si è stabilizzato e raggiunge il 100% e una temperatura di -180 °C, aprire con attenzione la valvola di etano e riempire la tazza di etano fino a formare una bolla sul coperchio trasparente. Rimuovere il dosatore di etano.
- Posizionare due carte da filtro sul dispositivo assorbente e fissarle con un anello metallico. Vai alla configurazione e utilizza i seguenti parametri per il blotting: 0 pre-blot, 3 s blot, 0 post-blot; selezionare A-plunge e fare clic su OK.
- Nella schermata principale, fai clic su Carica pinze e caricale con una griglia con il lato carbonio / applicazione rivolto verso sinistra (preparato come prima). Calibrare la pinza regolando l'asse Z per garantire una macchia solida. Fare clic su Camera inferiore e applicare 3 μL del complesso (1,3-3 mg/ml; OD280). Fare clic su Macchia/A-plunge. Questo ruoterà la griglia per cancellare dalla parte anteriore e immergerà congelarla.
- Trasferire e conservare la griglia nella scatola della griglia nella camera LN2 . Quando tutte e quattro le griglie sono state congelate e posizionate nella scatola della griglia, ruotare il coperchio in posizione neutra, dove tutte le griglie sono coperte dal coperchio, e serrare la vite. Le griglie possono essere memorizzate in LN2 fino all'avvio dello screening.
4. Griglie dello schermo
- Prima di caricare i campioni al microscopio, posizionare le griglie vetrificate su un anello e fissarle usando una clip a C. Eseguire questo processo di clipping sotto LN2 in una stanza con umidità controllata, per evitare la contaminazione da ghiaccio.
- Quando si carica il microscopio, inserire le griglie in una cassetta a 12 slot. Spostare la cassetta in una capsula nanocab e caricarla nell'autoloader. Il meccanismo robotico del caricatore automatico avvia il processo.
- Trasferire la griglia dalla cassetta allo stadio del microscopio. Regolare lo stadio all'altezza eucentrica oscillando lo stadio di 10° e contemporaneamente spostando l'altezza Z fino a quando non si osserva uno spostamento planare minimo nelle immagini.
- Una volta raggiunta l'altezza eucentrica, inizia l'imaging. Innanzitutto, ottieni l'atlante scattando un'immagine di montaggio 3 x 3 della griglia, in cui ogni montaggio viene effettuato con un ingrandimento di 62x. Scegli tre quadrati di varie dimensioni; Prendi l'altezza eucentrica e poi l'immagine con ingrandimento 210x.
- Una volta creata l'immagine di un quadrato, scegliete un foro ciascuno dal bordo, dal centro e tra i quadrati. Immagina ogni foro con un ingrandimento di 2600x.
- Prima di acquisire questa immagine ad alto ingrandimento, la messa a fuoco automatica avviene con uno scostamento dell'area di imaging. Scatta l'immagine ad alto ingrandimento dal centro del foro con un ingrandimento di 36.000x e un tempo di esposizione di 7,1 s, 60 fotogrammi, dimensioni di 1,18 pixel e sfocatura di 3 μm. Vedere le immagini rappresentative dello screening nella Figura 5, nella Figura 6 e nella Figura 7.
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Representative Results
NCP correttamente assemblati (Figura 2) sono stati utilizzati per creare un complesso con una proteina di fusione ricombinante di MBP-Polβ-APE1 (Figura 3). Per determinare il rapporto tra NCP e MBP-Polβ-APE1 per formare un complesso stabile, abbiamo eseguito saggi di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) (Figura 4), che hanno mostrato una banda spostata singolarmente del NCP con un eccesso molare di 5 volte di MBP-Polβ-APE1. Durante l'ottimizzazione della realizzazione di questo complesso, la reticolazione con glutaraldeide è stata fondamentale per evitare che il PCN si disgreghi. Inizialmente, l'assemblaggio del complesso di NCP-Polβ-APE1 è stato eseguito in un volume più piccolo, a circa 10 μM di NCP, utilizzando una concentrazione finale di glutaraldeide dello 0,005%. In queste condizioni, il campione era eccessivamente reticolato (Figura 5D-E) e risultava in aggregati senza complessi individuali distinguibili. La reticolazione a circa 10 volte gli NCP diluiti (1,2 μM NCP) ha determinato un'aggregazione significativamente ridotta e una migliore stabilità delle particelle (Figura 5A-C). La Figura 6 illustra che entrambi i metodi mostrati nella Figura 1 possono essere combinati con il gel preparativo migliorando la qualità dei PCN quando l'NCP contiene una quantità significativa di aggregati ad alto peso molecolare (HMW) (Figura 6A), seguita dalla purificazione del complesso attraverso l'esclusione dimensionale. Sebbene ciò abbia mostrato un grande successo nella preparazione del campione (Figura 5B-C) e delle griglie, producendo particelle stabili (Figura 6D), la formazione subottimale del complesso (Figura 6A) ha prodotto una mappa 3D del solo NCP (dati non mostrati). Questi risultati mostrano che entrambi i metodi (esclusione dimensionale e gel preparativo) possono essere utilizzati indipendentemente per generare complessi stabili (Figura 7A-C). In effetti, i dati sono stati raccolti da entrambe le griglie e mostrano classi 2D quasi identiche (Figura 7D) e mappe 3D (Figura 7E) con una risoluzione di circa 3,2 Å.
Figura 1: Flusso di lavoro dei due metodi presentati in questo protocollo per preparare e congelare un complesso NCP-Polβ-APE1 tramite 1) gel preparativo e 2) esclusione dimensionale. Sebbene non mostrati qui, questi metodi possono essere combinati (Figura 6), iniziando con (1) e purificando il complesso concentrato da (1) usando una colonna di dimensionamento. Ciò richiederà il raddoppio del materiale di partenza dei PCN. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Ricostituzioni rappresentative dei PCN. (A) Il DNA è stato titolato con quantità crescenti di ottamero istonico in rapporti di 1:0,9, 1:1,1, 1:1,2, 1:2, DNA:ottamero. (B) Duplicare PCN assemblati su larga scala (1:2, DNA:ottamero). Le ricostituzioni sono state elettroforate in un gel di poliacrilammide non denaturante al 6%, seguito da una colorazione verde sibr I. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Schema di Polβ-APE1 geneticamente fuso con MBP al suo N-terminale. La proteina di fusione MBP-Polβ-APE1 è stata caratterizzata enzimaticamente per entrambe le attività (dati non mostrati). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Legame MBP-Polβ-APE1 ai PCN. Il substrato nucleosomico (100 nM) è stato incubato con quantità crescenti di MBP-Polβ-APE1 per 15 minuti su ghiaccio. L'NCP legato e non legato è stato separato in un gel non denaturante di poliacrilammide al 6%, seguito da una colorazione verde sibr I. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Analisi dei risultati di reticolazione riusciti e non riusciti. Il profilo di eluizione del complesso è mostrato in (A) con il picco di interesse etichettato. Le frazioni, indicate con "F", raccolte da questa eluizione sono state analizzate in un gel di poliacrilammide tricina al 16% e mostrate in (B). (C) Il campione di (B) è stato congelato utilizzando griglie di supporto del carbonio holey e ripreso utilizzando il microscopio elettronico a emissione di campo 200 kV. I corrispondenti esperimenti infruttuosi sono mostrati in (D), (E) e (F). Si noti che questi esperimenti infruttuosi contengono la proteina di fusione senza MBP. HOc e HOD indicano rispettivamente l'ottamero istonico concentrato e diluito; RT indica la temperatura ambiente; "X" corrisponde alla reticolazione con glutaraldeide. Barre della scala = 100 nm (C, F). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Preparazione del complesso NCP-Polβ-APE1 utilizzando i due metodi in tandem. (A) Unbound e bound (1:1, NCP- Polβ-APE1) sono stati analizzati in gel non denaturante di poliacrilammide al 6% (si noti che a questo rapporto solo il 50% è legato). (B) Profilo di eluizione del complesso NCP-Polβ-APE1 da una colonna di dimensionamento. (C) Analisi delle frazioni eluite in un gel di poliacrilammide tricina al 16%; Le frazioni sono state raggruppate e concentrate, come indicato. (D) Il campione è stato congelato e fotografato come descritto nella figura 5B. L'elaborazione dei dati non ha mostrato una densità aggiuntiva corrispondente a Polβ-APE1 (non mostrata). "X" nelle corsie 5 e 6 indica la reticolazione con glutaraldeide come indicato nel protocollo. Barra di scala = 100 nm (D). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Analisi del complesso NCP-MBP-Polβ-APE1. (A) I campioni delle diverse fasi dei metodi illustrati nella figura 1 sono stati elettroforati in un gel non denaturante di poliacrilammide al 6%. Si noti che la formazione complessa è riproducibile con i due metodi. (B,C) Le immagini rappresentative della griglia di supporto del carbonio holey scattate utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione da 300 kV in cui le caselle rosse evidenziano diversi orientamenti del complesso (alcuni dei quali corrispondono alle classi 2D mostrate in (D). (E) I dati elaborati da (C) mostrano una mappa 3D con risoluzione di 3,2 Å del complesso NCP-MBP-Polβ-APE1.). Barre di scala = 100 nm (B, C). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Nome oligonucleotide | Sequenza (5'-->3') | Scala di purificazione | Metodo di purificazione | Numero di flaconcini ordinati | ||
| Sezione complementare UND | TGATGGACCCTATACGCGGCCGCCCTGGAGAAT CCCGGTGCCGAGGCCGCTCAATTGGTCGTAGA CAGCTCTAGCACCGCTTAAACGCACGTACGGGC TGTCCCCCGCGTTTTAACCGCCAAGGGGATTAC TCCCTAGTCTCCAGGCACGTGTCAGATATCAAC ATCCTGTGCATGTATTGAACAGCGACCTTGCCG |
20 nmole | PAGINA purificata | 6 | ||
| 161mero | /5Phos/GATATCTGACACGTGCCTGGAGACTAGG GAGTAATCCCCTTGGCGGTTAAAACGCGGGGG ACAGCGCGTACGTGCGTTTAAGCGGTGCTAGA GCTGTCTACGACCAATTGAGCGGCCTCGGCA CCGGGATTCTCCAGGGCGGCCGCGTATAGGG TCCATCA |
20 nmole | PAGINA purificata | 4 | ||
| 35mer | CGGCAAGGTCGCTGTTCAATACATGCACAGG ATGT |
250 nmole | HPLC | 1 | ||
Tabella 1: Substrato del DNA. Tre oligonucleotidi sono stati ricotti per generare il substrato del dsDNA. Le sezioni sottolineate sono 25 bp di DNA linker che fiancheggiano la sequenza di posizionamento del DNA 147 bp 601 contenente un singolo gap nucleotidico.
| Passo | Temperatura (°C) | Tempo (min)/passo |
| 1 | 95 | 10 |
| 2-5 | 90, 85, 80, 75 | 5 |
| 6-41 | 69 diminuzione di 1 | 3 |
| 42 | 4 | tenere |
Tabella 2: Gradiente di temperatura di ricottura. Gli oligo sono stati incubati in un termociclatore a queste temperature per generare il substrato del dsDNA.
| Componenti (stock) | Volume/importo | Concentrazione finale |
| 3M KCl | 167 ml | 0,250 m |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 20 ml | 10 mM |
| 0,5 M EDTA | 4 ml | 1 mM |
| 1 M DTT | 2 ml | 1 mM |
| CHAPS | 2 g | 1,6 mM |
| QS con dH2O per fare 2L | ||
Tabella 3: Bufferdi ricostituzione RB basso . Le istruzioni per fare 2 L come precedentemente riportato14, tranne 1,6 mM CHAPS è stato aggiunto.
| Componenti (stock) | Volume/importo | Concentrazione finale |
| 3M KCl | 267 ml | 2 m |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 4 ml | 10 mM |
| 0,5 M EDTA | 800 μL | 1 mM |
| 1 M DTT | 400 μL | 1 mM |
| CHAPS | 0,4 g | 1,6 mM |
| QS con dH2O per fare 400 mL | ||
Tabella 4: Bufferad alta ricostituzione RB . Le istruzioni per produrre 400 mL come precedentemente riportato14, ad eccezione di 1,6 mM CHAPS è stato aggiunto.
| Componenti (stock) | Volume | Concentrazione finale |
| 3M KCl | 16,7 ml | 50 mM |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 10 ml | 10 mM |
| 0,5 M EDTA | 2 ml | 1 mM |
| 1 M DTT | 1 mL | 1 mM |
| QS con dH2O per fare 1L | ||
Tabella 5: Tampone di ricostituzione RB50mM . Istruzioni per rendere compatibile 1 L di tampone di ricostituzione per il congelamento.
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Discussion
Un protocollo specifico per purificare il fattore di riparazione del DNA dipenderà dall'enzima di interesse. Tuttavia, ci sono alcune raccomandazioni generali, tra cui l'uso di metodi ricombinanti per l'espressione e la purificazione delle proteine18; se la proteina di interesse è troppo piccola (<50 kDa), la determinazione della struttura da parte della crio-EM era stata quasi impossibile fino a tempi più recenti attraverso l'uso di sistemi di fusione19, scaffold leganti i nanocorpi20 e strategie di imaging ottimizzate21.
È abbastanza comune ottenere griglie di scarsa qualità nelle fasi iniziali. I tentativi iniziali di determinare l'omogeneità e la stabilità degli NCP senza alcun reticolante, utilizzando acetato di uranile e griglie di rame rivestite di carbonio per la colorazione negativa, hanno mostrato NCP stabili e ben dispersi con un'aggregazione minima. Tuttavia, una volta che questo campione è stato vetrificato (a una concentrazione 20 volte superiore) nelle griglie crio-EM, non sono state rilevate particelle. L'ottimizzazione dei campioni per evitare che i PCN cadessero a pezzi o si aggregassero era l'ostacolo maggiore. Inoltre, due metodi di preparazione sono descritti separatamente; tuttavia, non si escludono a vicenda e possono essere utilizzati back-to-back purificando prima l'NCP tramite un gel preparativo, complessandolo con il fattore di riparazione e purificando il complesso con una colonna di esclusione dimensionale. Ciò richiede il doppio del materiale per la fase iniziale ed è anche più dispendioso in termini di tempo, ma utile per campioni difficili (Figura 6).
Trovare un punto di partenza per la concentrazione di reticolanti è stato difficile a causa della mancanza di coerenza nei metodi di reticolazione e delle quantità di reticolante utilizzate da altri22,23. I tentativi di replicare la reazione di reticolazione meno controllata sul banco descritta da Anderson et al. non hanno dato risultati positivi e il complesso è stato eccessivamente reticolato. Ciò è probabilmente dovuto alla fonte di glutaraldeide (fiala appena aperta rispetto alla glutaraldeide immagazzinata a lungo termine). Poiché questo livello di dettaglio è spesso omesso in articoli di ricerca non metodici, è difficile replicare le condizioni esatte come punto di partenza. Risultati ottimali sono stati ottenuti quando il complesso è stato reticolato ad una concentrazione di 1,2 μM in 150 mM di forza ionica KCl rispetto alla reticolazione del complesso a 10 μM NCP, alla stessa concentrazione di glutaraldeide dello 0,005% per 13 minuti a temperatura ambiente. L'efficienza di reticolazione dipende probabilmente anche dal complesso che si sta formando poiché alcuni fattori che interagiscono con la cromatina possono indurre / richiedere una maggiore destabilizzazione influenzando dove si verificherà la reticolazione e l'effetto complessivo sulla stabilità del PCN. Pertanto, mentre l'ottimizzazione di queste condizioni è inevitabile, trovare passaggi critici come NCP ottimale e concentrazione salina durante le reazioni di reticolazione sarà fondamentale.
Un altro parametro importante era il rapporto NCP:DRF che produceva abbastanza molecole sulla griglia contenente il DRF legato all'NCP. In effetti, questo parametro è stato anche identificato da altri come uno che è fondamentale per ottimizzare per gli studi strutturali16 dato che anche per l'omogeneità crio-EM del modo in cui il DRF si lega al NCP è importante per la mappa 3D. La mancata ottimizzazione di questo può produrre unbound o eterogenei, binding non specifici. Quando è stato utilizzato un rapporto molare 1:1, ottenendo solo il 50% dell'NCP vincolato dal DRF (Figura 6), la mappa 3D non ha mostrato alcuna densità aggiuntiva corrispondente al DRF. Pertanto, è importante determinare il rapporto che produce una singola banda nella stessa posizione su un EMSA e mostra un singolo picco sul cromatogramma di una colonna di dimensionamento, corrispondente al complesso. Diversi parametri per il congelamento delle griglie, incluso il tempo di macchia, hanno aggiunto diversi cicli di ottimizzazione.
Nel loro insieme, questo protocollo fornisce per la prima volta istruzioni dettagliate su due diversi metodi per preparare complessi nucleosomiali per la determinazione strutturale crio-EM. I parametri di base per la preparazione della griglia forniti possono essere utilizzati come punto di partenza. E mentre non un singolo metodo funziona ugualmente bene per tutti i complessi macromolecolari, concentrarsi sull'ottimizzazione dei parametri descritti in questo protocollo restringerà la strategia per l'ottimizzazione su misura di altri complessi nucleosomiali.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Mario Borgnia del nucleo crio-EM presso il National Institute of Environmental Health Sciences e il Dr. Joshua Strauss dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill per il loro tutoraggio e formazione nella preparazione della griglia crio-EM. Ringraziamo anche la Dott.ssa Juliana Mello Da Fonseca Rezende per l'assistenza tecnica nelle fasi iniziali di questo progetto. Apprezziamo il contributo chiave e il supporto del defunto Dr. Samuel H. Wilson e dei suoi membri del laboratorio, in particolare il Dr. Rajendra Prasad e il Dr. Joonas Jamsen per la purificazione del complesso APE1-Polβ geneticamente fuso. La ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [numeri di sovvenzione Z01ES050158, Z01ES050159 e K99ES031662-01].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640--6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
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