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Biochemistry

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संरचनात्मक निर्धारण के लिए डीएनए मरम्मत कारकों के साथ जटिल न्यूक्लियोसोम कोर कणों की तैयारी

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64061
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, 1
1Genome Integrity and Structural Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल फ्रीजिंग टीईएम ग्रिड के लिए नमूना तैयारी के दो तरीकों का उपयोग करके न्यूक्लियोसोमल कॉम्प्लेक्स की तैयारी को विस्तार से रेखांकित करता है।

Abstract

क्रोमैटिन के संदर्भ में डीएनए की मरम्मत को खराब तरीके से समझा जाता है। न्यूक्लियोसोम कोर कणों का उपयोग करने वाले जैव रासायनिक अध्ययन, क्रोमैटिन की मौलिक दोहराई जाने वाली इकाई, दिखाते हैं कि अधिकांश डीएनए मरम्मत एंजाइम मुक्त डीएनए की तुलना में कम दरों पर डीएनए क्षति को हटाते हैं। न्यूक्लियोसोम में डीएनए क्षति को कैसे पहचानते हैं और हटाते हैं, इस पर आणविक विवरण स्पष्ट नहीं किया गया है। हालांकि, न्यूक्लियोसोमल सब्सट्रेट्स के जैव रासायनिक बीईआर डेटा से पता चलता है कि न्यूक्लियोसोम डीएनए घाव और एंजाइम के स्थान पर निर्भर विभिन्न संरचनात्मक बाधाओं को प्रस्तुत करता है। यह इंगित करता है कि मुक्त डीएनए में डीएनए क्षति को हटाने के लिए इन एंजाइमों द्वारा नियोजित तंत्र न्यूक्लियोसोम में नियोजित लोगों की तुलना में अलग हो सकते हैं। यह देखते हुए कि अधिकांश जीनोमिक डीएनए न्यूक्लियोसोम में इकट्ठा होते हैं, इन परिसरों की संरचनात्मक जानकारी की आवश्यकता होती है। आज तक, वैज्ञानिक समुदाय में इन परिसरों के तकनीकी रूप से व्यवहार्य संरचनात्मक अध्ययन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का अभाव है। यहां, हम क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) संरचनात्मक निर्धारण के लिए न्यूक्लियोसोम के प्रवेश-निकास के पास एकल-न्यूक्लियोटाइड अंतर से बंधे दो आनुवंशिक रूप से फ्यूज्ड बीईआर एंजाइमों (पोलीमरेज़ β और एपी एंडोन्यूक्लिज़ 1) के एक परिसर को तैयार करने के लिए दो तरीके प्रदान करते हैं। नमूना तैयार करने के दोनों तरीके ठंड के माध्यम से गुणवत्ता ग्रिड को मजबूत करने के लिए संगत हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न बीईआर कारकों, अग्रणी प्रतिलेखन कारकों और क्रोमैटिन-संशोधित एंजाइमों के साथ अन्य न्यूक्लियोसोमल परिसरों को तैयार करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में किया जा सकता है।

Introduction

यूकेरियोटिक डीएनए हिस्टोन प्रोटीन द्वारा व्यवस्थित और कॉम्पैक्ट होता है, जिससे क्रोमैटिन बनता है। न्यूक्लियोसोम कोर कण (एनसीपी) क्रोमैटिन की मौलिक दोहराई जाने वाली इकाई का गठन करता है जो डीएनए की मरम्मत, प्रतिलेखन और प्रतिकृति1 के लिए डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन तक पहुंच को नियंत्रित करता है। यद्यपि एनसीपी की पहली एक्स-रे क्रिस्टल संरचना को पहली बार दो दशक पहले हल किया गया था2 और एनसीपी की कई और संरचनाएं 3,4,5,6 के बाद से प्रकाशित हुई हैं, न्यूक्लियोसोमल सब्सट्रेट्स में डीएनए मरम्मत तंत्र अभी तक चित्रित नहीं किए गए हैं। क्रोमैटिन में डीएनए मरम्मत के अंतर्निहित आणविक विवरणों को उजागर करने के लिए भाग लेने वाले घटकों के संरचनात्मक लक्षण वर्णन की आवश्यकता होगी ताकि यह समझा जा सके कि एनसीपी की स्थानीय संरचनात्मक विशेषताएं डीएनए मरम्मत गतिविधियों को कैसे नियंत्रित करती हैं। यह बेस एक्सिशन रिपेयर (बीईआर) के संदर्भ में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, यह देखते हुए कि बीईआर एंजाइमों के साथ जैव रासायनिक अध्ययन न्यूक्लियोसोम में अद्वितीय डीएनए मरम्मत तंत्र का सुझाव देते हैं जो उत्प्रेरण के लिए एंजाइम-विशिष्ट संरचनात्मक आवश्यकताओं और न्यूक्लियोसोम 7,8,9,10,11,12,13 के भीतर डीएनए घाव की संरचनात्मक स्थिति पर निर्भर हैं। . यह देखते हुए कि बीईआर एक महत्वपूर्ण डीएनए मरम्मत प्रक्रिया है, इन अंतरालों को भरने के लिए काफी रुचि है, जबकि एक प्रारंभिक बिंदु भी स्थापित किया गया है जहां से प्रासंगिक न्यूक्लियोसोमल परिसरों से जुड़े अन्य तकनीकी रूप से व्यवहार्य संरचनात्मक अध्ययन किए जा सकते हैं।

क्रायो-ईएम तेजी से परिसरों की त्रि-आयामी (3 डी) संरचना को हल करने के लिए पसंद की विधि बन रहा है, जिनके सजातीय नमूने की बड़े पैमाने पर तैयारी चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, डीएनए मरम्मत कारक (एनसीपी-डीआरएफ) के साथ जटिल एनसीपी के डिजाइन और शुद्धिकरण के लिए अनुरूप अनुकूलन की आवश्यकता होगी, एक स्थिर एनसीपी-डीआरएफ कॉम्प्लेक्स उत्पन्न करने और फ्रीज करने के लिए यहां प्रस्तुत प्रक्रिया नमूना और क्रायो-ईएम ग्रिड तैयारी को अनुकूलित करने के तरीके पर विवरण प्रदान करती है। चित्रा 1 में दिखाए गए दो वर्कफ़्लो (पारस्परिक रूप से अनन्य नहीं) और प्रोटोकॉल में विशिष्ट विवरण महत्वपूर्ण चरणों की पहचान करते हैं और इन चरणों को अनुकूलित करने के लिए रणनीतिप्रदान करते हैं। यह काम क्रोमैटिन और डीएनए मरम्मत क्षेत्र को एक दिशा में आगे बढ़ाएगा जहां संरचनात्मक अध्ययन के साथ जैव रासायनिक पूरक न्यूक्लियोसोमल डीएनए मरम्मत के आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए तकनीकी रूप से संभव हो जाता है।

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Protocol

1. नमक-गार्डिएंट डायलिसिस के माध्यम से न्यूक्लियोसोम कोर कणों को इकट्ठा करें

नोट: संरचनात्मक अध्ययन के लिए पुनः संयोजक हिस्टोन प्रोटीन का उपयोग करके न्यूक्लियोसोम कोर कणों की तैयारी को 14,15,16 अन्य लोगों द्वारा विस्तार से वर्णित किया गया है। लेविस हिस्टोन और हिस्टोन ऑक्टेमर असेंबली के शुद्धिकरण का पालन करें, जो दूसरों द्वारा वर्णित 14,15 है, और नीचे वर्णित न्यूक्लियोसोमल सब्सट्रेट को इकट्ठा करें।

  1. संकेतित पैमाने पर तीन ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स ( तालिका 1 में सूचीबद्ध) खरीदें: यूएनडी -197मर, 161मर, 35मर।
    1. पृष्ठ अल्ट्रामर्स (197mer और 161mer) को शुद्ध करता है जैसा कि17 वर्णित है।
      1. 1x एनीलिंग बफर (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl) में ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की एनील इक्विमोलर मात्रा। उदाहरण के लिए, 161-mer [166.7 μM] के 40 μL मिलाएं; 35-मेर का 8 μL [292.4 μM]; 197-मेर कॉम्प स्ट्रैंड का 16.8 μL [408.2 μM]; 10 x एनील बफर का 10 μL और dH2O का 10.9 μL।
        नोट: तापमान ढाल के साथ एनीलिंग प्रतिक्रिया को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है। तापमान प्रवणता के विवरण के लिए तालिका 2 देखें।
  2. डीएनए और हिस्टोन ऑक्टेमर के अनुपात को निर्धारित करने के लिए छोटे पैमाने पर पुनर्गठन करें (50 μL के अंतिम आयतन के लिए नीचे दिखाए गए उदाहरण के 1/57 के कारक द्वारा पैमाना) (डीएनए: ऑक्टेमर के विशिष्ट प्रारंभिक अनुपात निम्नानुसार हैं: 1: 0.9, 1: 1.1, 1: 1.2, 1: 2; चित्रा 2 ए में दिखाया गया है); छोटे पैमाने पर पुनर्गठन के साथ अनुभवजन्य रूप से इस अनुपात को निर्धारित करना महत्वपूर्ण है।
    1. इस अनुपात को निर्धारित करने के बाद, बड़े पैमाने पर पुनर्गठन तैयार करें। उदाहरण के लिए, डीएनए -197 बीपी [99.4 μM] के 32.9 μL मिश्रण; 1647.1 μL का TE (1x); 5 M NaCl का 1120 μL, और WT हिस्टोन ऑक्टेमर का 62.3 μL [2.56 μM]।
  3. डायलिसिस बफर बनाएं: आरबीकम और आरबीउच्च जैसा कि क्रमशः तालिका 3 और तालिका 4 में वर्णित है; पहले वर्णित14 के अनुसार पुनर्गठन स्थापित करें।
    1. डायलिसिस ट्यूब को आरबीउच्च वाले बीकर में स्थानांतरित करें, और डायलिसिस को 16 घंटे के लिए सौम्य सरगर्मी के साथ आगे बढ़ने की अनुमति दें या जब तक कि 2 एल आरबीकम अपशिष्ट बीकर में स्थानांतरित नहीं हो जाता।
  4. डायलिसिस ट्यूब को आरबी50 एमएम बफर (तालिका 5) युक्त 1 एल बीकर में स्थानांतरित करें और नमूने को कम से कम 3 घंटे या रात भर के लिए डायलाइज़ करने की अनुमति दें।
    1. 6% पॉलीक्रिलामाइड नॉनडिनेचरिंग जेल पर पुनर्गठन दक्षता का मूल्यांकन करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि 10% से कम मुक्त डीएनए और एक एकल एनसीपी बैंड है; 4 डिग्री सेल्सियस पर NCPs स्टोर करें। प्रतिनिधि इष्टतम पुनर्गठन परिणामों के लिए चित्रा 2 ए (लेन 5) और चित्रा 2 बी देखें।

2. एनसीपी-डीएनए मरम्मत कारक परिसर (एनसीपी-डीआरएफ) तैयार करें

  1. प्रीपेरेटिव-जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा शुद्धिकरण
    नोट: यह विधि सबसे अधिक श्रम-गहन (वर्णित दो में से) है, और जबकि यह उच्च आणविक भार (एचएमडब्ल्यू) प्रजातियों को हटाने में प्रभावी है (चित्र 6A) उच्च कमजोर पड़ने वाले कारक के कारण, यह कुछ विघटन का कारण बन सकता है जैसा कि नीचे दिखाया गया है चित्र 7A (एनसीपी सेल को बाहर निकालता है), डीएनए जारी करता है। हालांकि, 25% तक मुक्त डीएनए अभी भी क्रायो-ईएम अध्ययनों के साथ संगत है। उच्च कमजोर पड़ने के कारण, पूरे परिसर के बजाय केवल एनसीपी को शुद्ध करने के लिए इस विधि का उपयोग करें।
    1. पॉलीक्रिलामाइड जेल समाधान 37.5: 1, एक्रिलामाइड: बिसाक्रिलामाइड का उपयोग करके 0.2 एक्स टीबीई में 6% नॉनडेनैचुरिंग पॉलीक्रिलामाइड जेल समाधान का 70 एमएल तैयार करें। 28 मिमी की बाहरी त्रिज्या के साथ एक बेलनाकार जेल डालें और रात भर पॉलीमराइज करें।
    2. 6-8 केडीए एमडब्ल्यू कटऑफ के साथ डायलिसिस झिल्ली का उपयोग करके, प्रीपेरेटिव जेल रनिंग उपकरण को इकट्ठा करें। रनिंग बफर और 1x एल्युशन बफर (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7.5) के रूप में 0.25x TBE का उपयोग करें। बेलनाकार जेल को 1 घंटे के लिए स्थिर 12 डब्ल्यू पर प्री-रन करें, और लगभग 1 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर पेरिस्टालिक पंप चलाने वाले अंशों को इकट्ठा करें।
      नोट: यदि डीएनए युक्त अंशों की पहचान करने के लिए एक यूवी डिटेक्टर उपलब्ध नहीं है, तो ब्याज के अंशों की पहचान करने के लिए 32पी-एनसीपी के साथ एक स्क्रीनिंग प्रयोग किया जा सकता है। सभी स्थितियों को समान रखते हुए, अनलेबल किए गए एनसीपी को यूवी डिटेक्टर के बिना शुद्ध किया जा सकता है।
    3. एक केन्द्रापसारक फिल्टर (एमडब्ल्यू कटऑफ 30 केडीए) का उपयोग करके एनसीपी के 2.8 एमएल को 250 μL पर केंद्रित करें, और कुल 6 घंटे के लिए प्रीपैरेटिव जेल और वैद्युतकणसंचलन पर लोड करें। 2 घंटे में, जब जाइलीन साइनोल जेल से बाहर निकल गया है, तो 1.5 एमएल अंश एकत्र करना शुरू करें।
      नोट: 2.5 घंटे पर, अंश जाइलिन साइनोल से स्पष्ट होंगे; डीएनए (197mer) लगभग 3-3.5 घंटे पर होता है, और एनसीपी को 4.5-5 घंटे के निशान पर एल्यूट करने की उम्मीद है।
    4. 6% नॉनडिनेचरिंग पॉलीक्रिलामाइड जेल पर ब्याज के अंशों का विश्लेषण करें। एनसीपी युक्त पूल अंश, और तुरंत एक केन्द्रापसारक फिल्टर (मेगावाट कटऑफ 30 केडीए) के साथ 1 मिलीग्राम / एमएल तक ध्यान केंद्रित करें। अगले दिन, रुचि के डीएनए मरम्मत कारक (डीआरएफ) के साथ जटिल होने से पहले 6% पॉलीक्रिलामाइड नॉनडिनेचरिंग जेल पर एनसीपी की गुणवत्ता का मूल्यांकन करें।
    5. विशिष्ट परिसर के लिए एक इष्टतम बफर का उपयोग करके 15 मिनट के लिए बर्फ पर रुचि के एनसीपी और डीआरएफ को इनक्यूबेट करें। उदाहरण के लिए, एनसीपी के 1,000 μL [1.2 μM] को मिलाएं; 5x बाइंडिंग बफर का 260 μL (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl,25 mM MgCl 2), 3 M KCl का 22 μL, और MBP-Pol β-APE1 का 18 μL [338 μM]।
      नोट: तापमान और आयनिक शक्ति जिस पर कॉम्प्लेक्स बनाया जाता है, उसे विभिन्न परिसरों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
    6. ग्लूटारल्डिहाइड जोड़ें (ताजा खोला गया; ईएम ग्रेड) 0.005% की अंतिम एकाग्रता के लिए। इसलिए, इस प्रतिक्रिया के लिए, 13.2 μLdH 2O के साथ 0.25% ग्लूटारल्डिहाइड का 26.8 μL जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं, और 13 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    7. 1 M Tris-Cl, pH 7.5 के साथ 20 mM Tris-Cl, pH 7.5 की अंतिम सांद्रता के साथ बुझाएं। ~ 50 μL पर ध्यान केंद्रित करें और 1x फ्रीजिंग बफर के साथ बफर का आदान-प्रदान करें: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7.5 एक डीसाल्टिंग कॉलम का उपयोग करके।
      सावधानी: ग्लूटार्ल्डिहाइड गंभीर त्वचा जलने और आंखों की क्षति का कारण बन सकता है; निगलने पर यह हानिकारक है, और यदि साँस ली जाए तो यह विषाक्त है। एक लैब कोट, चश्मे, दस्ताने पहनें, और फ्यूम हुड में ग्लूटारल्डिहाइड को संभालें और मास्क पहनें।
      नोट: इस कम एकाग्रता पर एनसीपी के साथ बड़ी मात्रा में क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया करना महत्वपूर्ण है। क्रॉसलिंकिंग के पिछले प्रयासों में, यहां तक कि ग्लूटारल्डिहाइड की इस एकाग्रता पर भी, लेकिन 10 गुना अधिक केंद्रित एनसीपी पर नमूना का एकत्रीकरण और ओवर-क्रॉसलिंकिंग हुआ जैसा कि एसडीएस पेज और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा इंगित किया गया है। इन ग्रिडों में केवल झुरमुट के साथ कोई समझदार कण नहीं थे (चित्रा 5 डी, ई)।
    8. OD280 और OD 260 पर अवशोषण निर्धारित करें औरOD 280 (OD260/OD 280 = 1.7-2 का विशिष्ट अनुपात अच्छे कण उत्पन्न करता है) के आधार पर 1.3-3 mg/mL तक पहुंचने के लिए आवश्यक होने पर आगे ध्यान केंद्रित करें। 50 μL की इस छोटी मात्रा के लिए, नमूना हानि को कम करने का सबसे अच्छा तरीका डायलिसिस झिल्ली (6-8 kDA MW कटऑफ) द्वारा कवर किए गए 1.7 एमएल ट्यूब के ढक्कन के साथ डायलिसिस बटन बनाना है, ट्यूब के निचले हिस्से को काटना और ढक्कन के शीर्ष पर झिल्ली को सील करने के लिए ट्यूब के रिम का उपयोग करना है।
    9. पॉलीथीन ग्लाइकोल बेड के शीर्ष पर नमूने वाले डायलिसिस बटन को रखें, झिल्ली को नीचे की ओर रखें (हर 2 मिनट में प्रगति की जांच करें)। इस विधि को वहां पसंद किया जाता है जहां आवश्यक एकाग्रता 2.5 गुना से कम या उसके बराबर होती है ताकि कंसंट्रेटर में नमूने को पतला करने या खोने से बचा जा सके। इस चरण के बाद परिसर के क्रायो-ईएम ग्रिड को तुरंत तैयार करना महत्वपूर्ण है।
  2. आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्धिकरण
    1. ठंड से एक दिन पहले, 60 एमएल डीएच2ओ के साथ एक आकार बहिष्करण कॉलम को धोएं और बराबर करें, इसके बाद 80 एमएल फ्रीजिंग बफर (50 एमएम केसीएल, 10 एमएम एचईपीईएस, पीएच 8) को रात भर 0.4 एमएल / मिनट की दर से बराबर करें। पुनर्गठन के बाद सीधे एनसीपी का उपयोग करके, 2.5 गुना अधिक मात्रा का उपयोग करके उसी परिसर को निम्नानुसार तैयार करें: एनसीपी के 2,500 μL [1.2 μM] को मिलाएं; 5x बाइंडिंग बफर का 650 μL; एमबीपी-पोल β-एपीई 1 का 45 μL और 3M KCl का 55 μL।
    2. मिश्रण को 15 मिनट के लिए क्रॉसलिंकर के बिना बर्फ पर इनक्यूबेट करें। फिर, प्रीपैरेटिव जेल विधि में वर्णित 0.005% की अंतिम एकाग्रता में ग्लूटारल्डिहाइड जोड़ें। इस मामले में, हालांकि, कॉम्प्लेक्स को पूर्व-समतुल्य (फ्रीजिंग बफर के साथ) केन्द्रापसारक फिल्टर में लगभग 120 μL तक केंद्रित करें।
    3. तुरंत चरम अंशों का विश्लेषण करें और हिस्टोन और एमबीपी-पोल β-एपीई 1 युक्त उन अंशों पर ध्यान केंद्रित करें जैसा कि पहले संकेत दिया गया था। आकार बहिष्करण विधि का उपयोग करके सफल परिणामों के लिए चित्रा 5 ए, बी, सी और दोनों विधियों का उपयोग करके चित्रा 7 देखें।

3. फ्रीज न्यूक्लियोसोमल कॉम्प्लेक्स

  1. प्लंप फ्रीजर को चालू करने और 50 एमएल डीएच2ओ के साथ ह्यूमिडिफायर भरने के बाद, कक्ष का तापमान 22 डिग्री सेल्सियसऔर एचआर ( आर्द्रता) को 98% तक सेट करें। ईथेन कप और तरल नाइट्रोजन कप (एक लेबल ग्रिड बॉक्स युक्त) को उनके संबंधित अंतरिक्ष धारकों में रखें।
  2. ईथेन कप को इथेन ढक्कन डिस्पेंसर के साथ कवर करें, और सावधानी से इसके ऊपर तरल नाइट्रोजन (एलएन 2) डालें, जबकि एलएन2 कप को एलएन2 के साथ भी भरें। जब एलएन2 स्तर स्थिर हो जाता है और 100% और -180 डिग्री सेल्सियस के तापमान तक पहुंच जाता है, तो ईथेन वाल्व को सावधानीपूर्वक खोलें और ईथेन कप को भरें जब तक कि यह स्पष्ट ढक्कन पर बुलबुला न बन जाए। ईथेन डिस्पेंसर को हटा दें।
  3. ब्लोटिंग डिवाइस पर दो फिल्टर पेपर रखें और उन्हें धातु की अंगूठी के साथ सुरक्षित करें। सेट अप पर जाएं और सोख्ता के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: 0 प्री-ब्लॉट, 3 एस ब्लॉट, 0 पोस्ट-ब्लॉट; ए-प्लांक का चयन करें और ओके पर क्लिक करें।
  4. मुख्य स्क्रीन पर, लोड फोर्स पर क्लिक करें, और उन्हें बाईं ओर कार्बन / एप्लिकेशन साइड के साथ ग्रिड के साथ लोड करें (पहले की तरह तैयार)। एक ठोस धब्बा सुनिश्चित करने के लिए जेड-अक्ष को समायोजित करने वाले बल को कैलिब्रेट करें। लोअर चैंबर पर क्लिक करें और कॉम्प्लेक्स के 3 μL (1.3-3 mg / mL; ओडी280)। ब्लोट/ए-प्लंप पर क्लिक करें। यह ग्रिड को सामने से धब्बा करने के लिए घुमाएगा और इसे फ्रीज कर देगा।
  5. एलएन2 कक्ष में ग्रिड बॉक्स में ग्रिड को स्थानांतरित और संग्रहीत करें। जब सभी चार ग्रिड जमे हुए हैं और ग्रिड बॉक्स में रखे गए हैं, तो ढक्कन को तटस्थ स्थिति में घुमाएं, जहां सभी ग्रिड ढक्कन द्वारा कवर किए जाते हैं, और शिकंजा कसते हैं। स्क्रीनिंग शुरू होने तक ग्रिड को एलएन2 में संग्रहीत किया जा सकता है।

4. स्क्रीन ग्रिड

  1. माइक्रोस्कोप में नमूने लोड करने से पहले, विट्रीफाइड ग्रिड को एक रिंग पर रखें और उन्हें सी-क्लिप का उपयोग करके सुरक्षित करें। बर्फ संदूषण से बचने के लिए,आर्द्रता-नियंत्रित कमरे में एलएन 2 के तहत इस क्लिपिंग प्रक्रिया को करें।
  2. माइक्रोस्कोप लोड करते समय, ग्रिड को 12-स्लॉट कैसेट में डालें। कैसेट को एक नैनोकैब कैप्सूल में शटल करें और इसे ऑटोलोडर में लोड करें। ऑटोलोडर रोबोटिक तंत्र प्रक्रिया शुरू करता है।
  3. ग्रिड को कैसेट से माइक्रोस्कोप चरण में स्थानांतरित करें। चरण को 10° लड़खड़ाकर और साथ ही जेड-ऊंचाई को स्थानांतरित करके मंच को यूसेंट्रिक ऊंचाई में समायोजित करें जब तक कि छवियों में न्यूनतम प्लानर शिफ्ट नहीं देखा जाता है।
  4. एक बार यूसेंट्रिक ऊंचाई तक पहुंचने के बाद, इमेजिंग शुरू करें। सबसे पहले, ग्रिड की 3 x 3 मोंटेज छवि लेकर एटलस प्राप्त करें, जिसमें प्रत्येक मोंटेज को 62x आवर्धन पर लिया जाता है। अलग-अलग आकार के तीन वर्ग चुनें; यूसेंट्रिक ऊंचाई लें, और फिर 210x आवर्धन पर छवि लें।
  5. एक बार जब एक वर्ग की छवि बनाई जाती है, तो किनारे, केंद्र और वर्गों के बीच से प्रत्येक में एक छेद चुनें। 2600x आवर्धन पर प्रत्येक छेद को चित्रित करें।
  6. इस उच्च आवर्धन छवि को लेने से पहले, ऑटोफोकसिंग इमेजिंग क्षेत्र के ऑफसेट पर होती है। छेद के केंद्र से 36,000x आवर्धन और 7.1 सेकंड एक्सपोजर समय, 60 फ्रेम, 1.18-पिक्सेल आकार और 3 μm डीफोकस पर उच्च आवर्धन छवि लें। चित्रा 5, चित्रा 6 और चित्रा 7 में स्क्रीनिंग की प्रतिनिधि छवियां देखें।

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Representative Results

ठीक से इकट्ठे किए गए NCPs (चित्रा 2) का उपयोग MBP-Polé-APE1 (चित्रा 3) के पुनः संयोजक संलयन प्रोटीन के साथ एक परिसर बनाने के लिए किया गया था। एक स्थिर परिसर बनाने के लिए एनसीपी और एमबीपी-पोल-एपीई 1 के अनुपात को निर्धारित करने के लिए, हमने इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटी शिफ्ट एसेस (ईएमएसए) (चित्रा 4) का प्रदर्शन किया, जिसमें एमबीपी-पोल-एपीई 1 के 5 गुना मोलर अधिकता के साथ एनसीपी का एक एकल स्थानांतरित बैंड दिखाया गया। इस परिसर को बनाने के अनुकूलन के दौरान, एनसीपी को अलग होने से रोकने के लिए ग्लूटारल्डिहाइड के साथ क्रॉसलिंकिंग महत्वपूर्ण थी। प्रारंभ में, एनसीपी-पोल-एपीई 1 के परिसर की असेंबली 0.005% अंतिम ग्लूटारल्डिहाइड एकाग्रता का उपयोग करके लगभग 10 एसएम एनसीपी पर एक छोटी मात्रा में की गई थी। इन शर्तों के तहत, नमूना अत्यधिक क्रॉसलिंक किया गया था (चित्रा 5 डी-ई) और इसके परिणामस्वरूप समझ में आने वाले व्यक्तिगत परिसरों के बिना समुच्चय थे। लगभग 10 गुना पतला NCPs (1.2 μM NCP) पर क्रॉसलिंकिंग के परिणामस्वरूप एकत्रीकरण में काफी कमी आई और कण स्थिरता में सुधार हुआ (चित्रा 5A-C)। चित्रा 6 दिखाता है कि चित्रा 1 में दिखाए गए दोनों तरीकों को एनसीपी की गुणवत्ता में सुधार करने वाले प्रारंभिक जेल के साथ जोड़ा जा सकता है जब एनसीपी में उच्च आणविक भार (एचएमडब्ल्यू) समुच्चय (चित्रा 6 ए) की एक महत्वपूर्ण मात्रा होती है, इसके बाद आकार बहिष्करण के माध्यम से परिसर का शुद्धिकरण होता है। यद्यपि इसने नमूना (चित्रा 5 बी-सी) और ग्रिड की तैयारी में बड़ी सफलता दिखाई, स्थिर कणों (चित्रा 6 डी) का उत्पादन किया, परिसर के उप-मानक गठन (चित्रा 6 ए) ने अकेले एनसीपी का 3 डी नक्शा प्राप्त किया (डेटा नहीं दिखाया गया)। इन परिणामों से पता चलता है कि स्थिर परिसरों (चित्रा 7 ए-सी) उत्पन्न करने के लिए दोनों विधियों (आकार बहिष्करण और प्रीपेरेटिव जेल) का स्वतंत्र रूप से उपयोग किया जा सकता है। दरअसल, डेटा दोनों ग्रिडों से एकत्र किया गया है और लगभग समान 2 डी वर्ग (चित्रा 7 डी) और 3 डी मानचित्र (चित्रा 7 ई) लगभग 3.2 ए रिज़ॉल्यूशन पर दिखाता है।

Figure 1
चित्रा 1: इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत दो विधियों का वर्कफ़्लो 1) प्रीपेरेटिव जेल और 2) आकार बहिष्करण के माध्यम से एनसीपी-पोलो-एपीई 1 कॉम्प्लेक्स को तैयार करने और फ्रीज करने के लिए। यद्यपि यहां नहीं दिखाया गया है, इन विधियों को जोड़ा जा सकता है (चित्रा 6), (1) से शुरू होता है और एक आकार कॉलम का उपयोग करके (1) से केंद्रित परिसर को शुद्ध करता है। इसके लिए NCPs की प्रारंभिक सामग्री को दोगुना करने की आवश्यकता होगी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि एनसीपी पुनर्गठन। (ए) डीएनए को हिस्टोन ऑक्टामर की बढ़ती मात्रा के साथ 1: 0.9, 1: 1.1, 1: 1.2, डीएनए: ऑक्टेमर के अनुपात में टाइट किया गया था। (बी) बड़े पैमाने पर इकट्ठे एनसीपी (1: 2, डीएनए: ऑक्टेमर)। पुनर्गठन को 6% नॉनडिनेचरिंग पॉलीक्रिलामाइड जेल में वैद्युतकणसंचलन किया गया था, इसके बाद सिब्र ग्रीन आई धुंधला था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: अपने एन-टर्मिनल पर एमबीपी के साथ आनुवंशिक रूप से जुड़े पोल-एपीई 1 का योजनाबद्ध। एमबीपी-पोल-एपीई 1 संलयन प्रोटीन को दोनों गतिविधियों (डेटा नहीं दिखाया गया) के लिए एंजाइमेटिक रूप से विशेषता थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एमबीपी-पोल-एपीई 1 एनसीपी के लिए बाध्यकारी है। न्यूक्लियोसोमल सब्सट्रेट (100 एनएम) को बर्फ पर 15 मिनट के लिए एमबीपी-पोल-एपीई 1 की बढ़ती मात्रा के साथ इनक्यूबेट किया गया था। बाध्य और अनबाउंड एनसीपी को 6% पॉलीक्रिलामाइड नॉनडिनेचरिंग जेल में अलग किया गया था, इसके बाद सिबर ग्रीन आई धुंधला हो गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: सफल और असफल क्रॉसलिंकिंग परिणामों का विश्लेषण। कॉम्प्लेक्स की क्षालन प्रोफ़ाइल (ए) में दिखाई गई है जिसमें ब्याज का शिखर लेबल किया गया है। इस क्षालन से एकत्र किए गए "एफ" द्वारा चिह्नित अंशों का विश्लेषण 16% ट्राइसिन पॉलीक्रिलामाइड जेल में किया गया था और (बी) में दिखाया गया था। (सी) (बी) से नमूना होले कार्बन सपोर्ट ग्रिड का उपयोग करके फ्रीज किया गया था और 200 केवी फील्ड उत्सर्जन क्रायो-ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। संबंधित असफल प्रयोगों को (डी), (ई), और (एफ) में दिखाया गया है। ध्यान दें कि इन असफल प्रयोगों में एमबीपी के बिना संलयन प्रोटीन होता है। एचओसी और एचओडी क्रमशः हिस्टोन ऑक्टामर केंद्रित और पतला को दर्शाते हैं; आरटी कमरे के तापमान को दर्शाता है; "एक्स" ग्लूटारल्डिहाइड के साथ क्रॉसलिंकिंग से मेल खाती है। स्केल सलाखों = 100 एनएम (सी, एफ)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: एनसीपी-पोल-एपीई 1 कॉम्प्लेक्स की तैयारी दो विधियों का एक साथ उपयोग करके। (ए) अनबाउंड और बाउंड (1: 1, एनसीपी- पोलो-एपीई 1) का विश्लेषण 6% पॉलीक्रिलामाइड नॉनडिनेचरिंग जेल में किया गया था (ध्यान दें कि इस अनुपात में केवल 50% बाध्य है)। (बी) एक आकार स्तंभ से एनसीपी-पोल-एपीई 1 कॉम्प्लेक्स का क्षालन प्रोफाइल। (सी) 16% ट्राइसिन पॉलीक्रिलामाइड जेल में इल्यूटेड अंशों का विश्लेषण; जैसा कि संकेत दिया गया है, अंशों को पूल और केंद्रित किया गया था। (डी) नमूना जमे हुए थे और चित्र 5 बी में वर्णित के रूप में चित्रित किया गया था। डेटा प्रोसेसिंग ने पोल-एपीई 1 (नहीं दिखाया गया) के अनुरूप एक अतिरिक्त घनत्व नहीं दिखाया। लेन 5 और 6 में "एक्स" प्रोटोकॉल में इंगित ग्लूटारल्डिहाइड के साथ क्रॉसलिंकिंग को दर्शाता है। स्केल बार = 100 एनएम (डी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7: एनसीपी-एमबीपी-पोल-एपीई 1 कॉम्प्लेक्स का विश्लेषण। (ए) चित्रा 1 में चित्रित विधियों में विभिन्न चरणों के नमूने 6% पॉलीएक्रिलामाइड नॉनडिनेचरिंग जेल में वैद्युतकणसंचलन थे। ध्यान दें कि जटिल गठन दो तरीकों से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। (बी, सी) प्रतिनिधि ग्रिड होले कार्बन सपोर्ट ग्रिड छवियों को 300 केवी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लिया गया है जहां लाल बक्से कॉम्प्लेक्स के विभिन्न झुकावों को उजागर करते हैं (जिनमें से कुछ (डी) में दिखाए गए 2 डी वर्गों के अनुरूप हैं। (ई) (सी) से संसाधित डेटा एनसीपी-एमबीपी-पोल-एपीई 1 कॉम्प्लेक्स के 3.2 ए रिज़ॉल्यूशन पर एक 3 डी मानचित्र दिखाता है। स्केल बार = 100 एनएम (बी, सी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का नाम अनुक्रम (5'-->3') शुद्धिकरण पैमाना शुद्धता की विधि ऑर्डर की गई शीशियों की संख्या
UND पूरक स्ट्रैंड TGATGGACCCTATACGCCCCCCCCCTGGAGAAT
CCCGGTGCCGAGGCCCCCCCAATTGGTCGTAGA
CAGCTCTAGCACCGCTTAAACACCCGTACGCGC
TGTCCCCCGGTTTTAACCCCAAGGGGATTAC
TCCCTAGTCCAGGCACGTGTCAGATATCAAC
ATCCTGTGCATGTATTGAACAGCGACCTTGCCG		 20 nmole पृष्ठ शुद्ध 6
161mer 5फोस/GATATCTGACACGTGCCTGGAGACTAGG
GAGTAATCCTTGGGGTAAAACGCGGGGG
ACAGCGCGTACGTGCTTAAGCGGTGCTAGA
GCTGTCTACGACCAATTGAGCGGCCTCGGCA
CCGGGATTCCGGGGCCGCCGTATAGGG
TCCATCA		 20 nmole पृष्ठ शुद्ध 4
35mer CGGCAAGGTCGCTGTTCAATACATGCACAGG
ATGT		 250 nmole एचपीएलसी 1

तालिका 1: डीएनए सब्सट्रेट। डीएसडीएनए सब्सट्रेट उत्पन्न करने के लिए तीन ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को नष्ट कर दिया गया था। रेखांकित खंड लिंकर डीएनए के 25 बीपी हैं जो 147 बीपी 601 डीएनए पोजिशनिंग अनुक्रम को फ्लैंक करते हैं जिसमें एक एकल न्यूक्लियोटाइड अंतर होता है।

क़दम तापमान (°C) समय (न्यूनतम)/चरण
1 95 10
2-5 90, 85, 80, 75 5
6-41 69 की कमी 3
42 4 पकड

तालिका 2: एनीलिंग तापमान ढाल। डीएसडीएनए सब्सट्रेट उत्पन्न करने के लिए इन तापमानों पर ओलिगोस को थर्मोसाइक्लर में इनक्यूबेट किया गया था।

घटक (स्टॉक) मात्रा/राशि अंतिम एकाग्रता
3M KCl 167 mL 0.250 M
1 एम एचईपीईएस, पीएच 8.0 20 mL 10 mM
0.5 एम ईडीटीए 4 mL 1 mM
1 एम डी टी टी 2 mL 1 mM
CHAPS 2 ग्राम 1.6 mM
2Lबनाने के लिए dH 2 O के साथ QS

तालिका 3: आरबीकम पुनर्गठन बफर। 1.6 एमएम चैप्स को छोड़कर, 2 एल बनाने के निर्देश, जैसा कि पहले बताया गया था।

घटक (स्टॉक) मात्रा/राशि अंतिम एकाग्रता
3M KCl 267 mL 2 M
1 एम एचईपीईएस, पीएच 8.0 4 mL 10 mM
0.5 एम ईडीटीए 800 μL 1 mM
1 एम डी टी टी 400 μL 1 mM
CHAPS 0.4 ग्राम 1.6 mM
400 एमएल बनाने के लिए dH2O के साथ QS

तालिका 4: आरबीउच्च पुनर्गठन बफर। 1.6 एमएम चैप्स को छोड़कर,400 एमएल बनाने के निर्देश, जैसा कि पहले बताया गया था।

घटक (स्टॉक) आयतन अंतिम एकाग्रता
3M KCl 16.7 mL 50 mM
1 एम एचईपीईएस, पीएच 8.0 10 mL 10 mM
0.5 एम ईडीटीए 2 mL 1 mM
1 एम डी टी टी 1 mL 1 mM
1L बनाने के लिए dH2O के साथ QS

तालिका 5: आरबी50 एमएम पुनर्गठन बफर। 1 एल पुनर्गठन बफर को फ्रीजिंग के लिए संगत बनाने के निर्देश।

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Discussion

डीएनए मरम्मत कारक को शुद्ध करने के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल ब्याज के एंजाइम पर निर्भर होगा। हालांकि, कुछ सामान्य सिफारिशें हैं, जिनमें प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण के लिए पुनः संयोजक तरीकों का उपयोगशामिल है; यदि रुचि का प्रोटीन बहुत छोटा है (<50 केडीए), तो क्रायो-ईएम द्वारा संरचना निर्धारण हाल ही में संलयन प्रणाली19, नैनोबॉडी-बाइंडिंग स्काफोल्ड्स20 और इमेजिंग रणनीतियों को अनुकूलित करनेके माध्यम से लगभग असंभव था।

प्रारंभिक चरणों में खराब गुणवत्ता वाले ग्रिड प्राप्त करना काफी आम है। नकारात्मक धुंधलापन के लिए यूरिनिल एसीटेट और कार्बन-लेपित तांबा ग्रिड का उपयोग करके, बिना किसी क्रॉसलिंकर के एनसीपी समरूपता और स्थिरता निर्धारित करने के प्रारंभिक प्रयासों ने न्यूनतम एकत्रीकरण के साथ स्थिर, अच्छी तरह से बिखरे हुए एनसीपी दिखाए। हालांकि, एक बार जब इस नमूने को क्रायो-ईएम ग्रिड में विट्रीफाइड (20 गुना अधिक सांद्रता पर) किया गया था, तो किसी भी कण का पता नहीं चला था। एनसीपी को टूटने या एकत्र होने से बचाने के लिए नमूना अनुकूलन सबसे बड़ी बाधा थी। इसके अतिरिक्त, तैयारी के दो तरीकों को अलग से वर्णित किया गया है; हालांकि, वे पारस्परिक रूप से अनन्य नहीं हैं और पहले एनसीपी को एक प्रीपैरेटिव जेल के माध्यम से शुद्ध करके, इसे मरम्मत कारक के साथ जटिल करके और आकार बहिष्करण कॉलम के साथ परिसर को शुद्ध करके बैक-टू-बैक उपयोग किया जा सकता है। इसे प्रारंभिक चरण के लिए दोगुनी सामग्री की आवश्यकता होती है, और यह अधिक समय लेने वाला भी है, लेकिन कठिन नमूनों के लिए सहायक है (चित्रा 6)।

क्रॉसलिंकिंग के तरीकों में स्थिरता की कमी और दूसरों द्वारा उपयोग किए जाने वाले क्रॉसलिंकर की मात्रा22,23 के कारण क्रॉसलिंकर की एकाग्रता के लिए एक प्रारंभिक बिंदु ढूंढना मुश्किल था। एंडरसन एट अल द्वारा वर्णित बेंच टॉप पर कम-नियंत्रित क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया को दोहराने के प्रयास सकारात्मक परिणाम देने में विफल रहे, और परिसर को अत्यधिक क्रॉसलिंक किया गया था। यह ग्लूटारल्डिहाइड (लंबे समय तक संग्रहीत ग्लूटारल्डिहाइड की तुलना में ताजा खोला गया एम्प्यूल) के स्रोत के कारण होने की संभावना है। क्योंकि विस्तार का यह स्तर अक्सर गैर-विधियों, शोध लेखों में छोड़ दिया जाता है, इसलिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में सटीक स्थितियों को दोहराना मुश्किल है। इष्टतम परिणाम तब प्राप्त किए गए जब कॉम्प्लेक्स को कमरे के तापमान पर 13 मिनट के लिए 0.005% की ग्लूटारल्डिहाइड एकाग्रता पर 10 μM एनसीपी पर कॉम्प्लेक्स को क्रॉसलिंक करने की तुलना में 150 mM KCl आयनिक ताकत में 1.2 μM की एकाग्रता पर क्रॉसलिंक किया गया था। क्रॉसलिंकिंग दक्षता भी उस परिसर पर निर्भर है जो बन रहा है क्योंकि कुछ क्रोमैटिन-इंटरैक्शन कारक अधिक अस्थिरता को प्रभावित कर सकते हैं जहां क्रॉसलिंकिंग होगी और एनसीपी स्थिरता पर समग्र प्रभाव पड़ेगा। इसलिए, जबकि इन स्थितियों का अनुकूलन अपरिहार्य है, क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रियाओं के दौरान इष्टतम एनसीपी और नमक एकाग्रता जैसे महत्वपूर्ण कदम खोजना महत्वपूर्ण होगा।

एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर एनसीपी: डीआरएफ का अनुपात था जिसने एनसीपी से बंधे डीआरएफ वाले ग्रिड पर पर्याप्त अणु उत्पन्न किए। दरअसल, इस पैरामीटर को दूसरों द्वारा भी पहचाना गया है जो संरचनात्मकअध्ययनों के लिए अनुकूलित करने के लिए महत्वपूर्ण है, यह देखते हुए कि डीआरएफ जिस तरह से एनसीपी को बांधता है, उसकी क्रायो-ईएम समरूपता के लिए भी 3 डी मानचित्र के लिए महत्वपूर्ण है। इसे अनुकूलित नहीं करने से अनबाउंड या हेटरोजेनस, गैर-विशिष्ट बंधन उत्पन्न हो सकता है। जब 1: 1 मोलर अनुपात का उपयोग किया गया था, जो डीआरएफ (चित्रा 6) से बंधे एनसीपी का केवल 50% था, तो 3 डी मानचित्र ने डीआरएफ के अनुरूप कोई अतिरिक्त घनत्व नहीं दिखाया। इसलिए, उस अनुपात को निर्धारित करना महत्वपूर्ण है जो ईएमएसए पर एक ही स्थान पर एक एकल बैंड उत्पन्न करता है और कॉम्प्लेक्स के अनुरूप एक साइजिंग कॉलम के क्रोमैटोग्राम पर एक एकल शिखर दिखाता है। ब्लॉट टाइम सहित ग्रिड के फ्रीजिंग के लिए कई मापदंडों ने अनुकूलन के कई दौर जोड़े।

एक साथ लिया गया, यह प्रोटोकॉल क्रायो-ईएम संरचनात्मक निर्धारण के लिए न्यूक्लियोसोमल कॉम्प्लेक्स तैयार करने के लिए दो अलग-अलग तरीकों पर पहली बार विस्तृत निर्देश प्रदान करता है। प्रदान किए गए ग्रिड तैयारी के लिए आधारभूत मापदंडों को प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। और जबकि एक भी विधि सभी मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम नहीं करती है, इस प्रोटोकॉल में वर्णित मापदंडों को अनुकूलित करने पर ध्यान केंद्रित करने से अन्य न्यूक्लियोसोमल कॉम्प्लेक्स के अनुरूप अनुकूलन के लिए रणनीति कम हो जाएगी।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

हम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एनवायरनमेंटल हेल्थ साइंसेज में क्रायो-ईएम कोर से डॉ मारियो बोर्गनिया और चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय के डॉ जोशुआ स्ट्रॉस को क्रायो-ईएम ग्रिड तैयारी में उनके परामर्श और प्रशिक्षण के लिए धन्यवाद देते हैं। हम इस परियोजना के प्रारंभिक चरणों में तकनीकी सहायता के लिए डॉ जूलियाना मेलो दा फोंसेका रेजेंडे को भी धन्यवाद देते हैं। हम आनुवंशिक रूप से जुड़े एपीई 1-पोलो कॉम्प्लेक्स के शुद्धिकरण के लिए स्वर्गीय डॉ सैमुअल एच विल्सन और उनके प्रयोगशाला सदस्यों, विशेष रूप से डॉ राजेंद्र प्रसाद और डॉ जूनास जैमसेन के महत्वपूर्ण योगदान और समर्थन की सराहना करते हैं। अनुसंधान को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एनवायरनमेंटल हेल्थ साइंसेज [अनुदान संख्या Z01ES050158, Z01ES050159, और K99ES031662-01] के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M HEPES; pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15630080
1 M MgCl2 Thermo Fisher Scientific AM9530G
10x TBE Bio-rad 1610733
25% glutaraldehyde Fisher Scientific 50-262-23
3 M KCl Thermo Fisher Scientific 043398.K2
491 prep cell Bio-rad 1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) Millipore Sigma Z717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) Millipore Sigma UFC8030
AutoGrid Tweezers Ted Pella 47000-600
Automatic Plunge Freezer Leica Leica EM GP
C-1000 touch thermocycler Bio-rad 1851148
C-clips and rings Thermo Fisher 6640--6640
Clipping station SubAngostrom SCT08
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) Fisher Scientific 15370752
Diamond Tweezers Techni-Pro 758TW0010
dsDNA Integrated DNA techonologies N/A
FEI Titan Krios Thermo Fisher KRIOSG4TEM
FPLC purification system AKTA Pure 29018224
Fraction collector Model 2110 Bio-rad 7318122
Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000S
Grid Boxes SubAngostrom PB-E
Grid Storage Accessory Pack SubAngostrom GSAX
Liquid Ethane N/A N/A
Liquid Nitrogen N/A N/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pump Gilson F155008
Nanodrop Thermo Fisher Scientific ND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels Thermo Fisher Scientific EC6695BOX
Pipetman Gilson FA10002M
Pipette tips (VWR) Low Retention VWR 76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1) Bio-rad 1610158
polyethylene glycol (PEG) Millipore Sigma P4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500 Millipore Sigma PURX35050
Purified recombinant DNA repair factor N/A N/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids Quantifoil N1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamer N/A N/A
Spring clipping tools SubAngostrom CSA-01
Superdex 200 column 10/300 Millipore Sigma GE28-9909-44
Transmission Electron Microscope Thermo Fisher Talos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I Ted Pella 47000-500
UltraPure Glycerol Thermo Fisher Scientific 15514011
Vitrobot Thermo Fisher Mark IV System
Whatman Filter paper (55 mM) Cytiva 1005-055
Xylene cyanol Thermo Fisher Scientific 440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL Thermo Fisher Scientific 89877

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References

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Rodriguez, Y., Butay, K. J., Sharma, K., Viverette, E., Wilson, S. H. Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination. J. Vis. Exp. (186), e64061, doi:10.3791/64061 (2022).

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