Summary
Bu protokol, TEM ızgaralarının dondurulması için iki numune hazırlama yöntemi kullanılarak nükleozomal komplekslerin hazırlanmasını ayrıntılı olarak özetlemektedir.
Abstract
Kromatin bağlamında DNA onarımı tam olarak anlaşılamamıştır. Kromatinin temel tekrarlayan birimi olan nükleozom çekirdek parçacıklarını kullanan biyokimyasal çalışmalar, çoğu DNA onarım enziminin DNA hasarını serbest DNA'ya kıyasla daha düşük oranlarda giderdiğini göstermektedir. Baz eksizyon onarımı (BER) enzimlerinin nükleozomlardaki DNA hasarını nasıl tanıdığı ve giderdiğine dair moleküler detaylar açıklığa kavuşturulmamıştır. Bununla birlikte, nükleozomal substratların biyokimyasal BER verileri, nükleozomun DNA lezyonunun ve enzimin konumuna bağlı olarak farklı yapısal bariyerler sunduğunu göstermektedir. Bu, serbest DNA'daki DNA hasarını gidermek için bu enzimler tarafından kullanılan mekanizmaların, nükleozomlarda kullanılanlardan farklı olabileceğini göstermektedir. Genomik DNA'nın çoğunluğunun nükleozomlara monte edildiği göz önüne alındığında, bu komplekslerin yapısal bilgisine ihtiyaç vardır. Bugüne kadar, bilimsel topluluk, bu komplekslerin teknik olarak uygulanabilir yapısal çalışmalarını gerçekleştirmek için ayrıntılı protokollerden yoksundur. Burada, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) yapısal tayini için nükleozomun giriş-çıkışına yakın tek bir nükleotid boşluğuna bağlı iki genetik olarak kaynaşmış BER enziminden (Polimeraz β ve AP Endonükleaz1) oluşan bir kompleks hazırlamak için iki yöntem sunuyoruz. Her iki numune hazırlama yöntemi de daldırma dondurma yoluyla kaliteli ızgaraları vitrifiye etmek için uyumludur. Bu protokol, farklı BER faktörleri, öncü transkripsiyon faktörleri ve kromatin modifiye edici enzimlere sahip diğer nükleozomal kompleksleri hazırlamak için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir.
Introduction
Ökaryotik DNA, histon proteinleri tarafından organize edilir ve sıkıştırılır ve kromatin oluşturur. Nükleozom çekirdek parçacığı (NCP), DNA onarımı, transkripsiyon ve replikasyon1 için DNA bağlayıcı proteinlere erişilebilirliği düzenleyen kromatinin temel tekrarlayan birimini oluşturur. NCP'nin ilk X-ışını kristal yapısı ilk olarak yirmi yıldan daha uzun bir süre önce çözülmüş olmasına rağmen2 ve NCP'nin daha birçok yapısı 3,4,5,6'dan beri yayınlanmış olmasına rağmen, nükleozomal substratlardaki DNA onarım mekanizmaları henüz tanımlanmamıştır. Kromatinde DNA onarımının altında yatan moleküler detayların ortaya çıkarılması, NCP'nin yerel yapısal özelliklerinin DNA onarım aktivitelerini nasıl düzenlediğini anlamak için katılımcı bileşenlerin yapısal karakterizasyonunu gerektirecektir. Bu, baz eksizyon onarımı (BER) bağlamında özellikle önemlidir, çünkü BER enzimleri ile yapılan biyokimyasal çalışmalar, kataliz için enzime özgü yapısal gereksinimlere ve DNA lezyonunun nükleozom içindeki yapısal konumuna bağlı olan nükleozomlarda benzersiz DNA onarım mekanizmaları önermektedir 7,8,9,10,11,12,13 . BER'in hayati bir DNA onarım süreci olduğu göz önüne alındığında, bu boşlukları doldurmaya ve aynı zamanda ilgili nükleozomal kompleksleri içeren diğer teknik olarak uygulanabilir yapısal çalışmaların gerçekleştirilebileceği bir başlangıç noktası oluşturmaya büyük ilgi vardır.
Cryo-EM, homojen numunenin büyük ölçekli hazırlanması zor olan komplekslerin üç boyutlu (3D) yapısını çözmek için hızla tercih edilen yöntem haline gelmektedir. Bir DNA onarım faktörü (NCP-DRF) ile kompleksleştirilmiş NCP'lerin tasarımı ve saflaştırılması muhtemelen özel optimizasyon gerektirecek olsa da, kararlı bir NCP-DRF kompleksi oluşturmak ve dondurmak için burada sunulan prosedür, numunenin ve kriyo-EM ızgara hazırlığının nasıl optimize edileceği hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Şekil 1'de gösterilen iki iş akışı (birbirini dışlamayan) ve protokoldeki belirli ayrıntılar kritik adımları tanımlar ve bu adımları optimize etmek için stratejiler sağlar. Bu çalışma, kromatin ve DNA onarım alanını, nükleozomal DNA onarımının moleküler mekanizmalarını daha iyi anlamak için biyokimyasalın yapısal çalışmalarla tamamlanmasının teknik olarak mümkün olduğu bir yönde ilerletecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nükleozom çekirdek parçacıklarını tuz-gardient diyalizi yoluyla birleştirin
NOT: Yapısal çalışmalar için rekombinant histon proteinleri kullanılarak nükleozom çekirdek parçacıklarının hazırlanması, diğerleri tarafından ayrıntılı olarak tanımlanmıştır14,15,16. Diğerleri tarafından tanımlanan rekombinant X. laevis histonlarının ve histon oktamer düzeneğinin saflaştırılmasını takip edin14,15 ve nükleozomal substratı aşağıda açıklandığı gibi birleştirin.
- Belirtilen ölçekte üç oligonükleotid ( Tablo 1'de listelenmiştir) satın alın: UND-197mer, 161mer, 35mer.
- PAGE,17'i açıklandığı gibi ultramerleri (197mer ve 161mer) saflaştırır.
- 1x tavlama tamponunda tavsal equimolar oligonükleotid miktarları (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl). Örneğin, 40 μL 161-mer [166,7 μM]; 8 μL 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL 197-mer comp ipliği [408,2 μM]; 10 μL 10x tavlama tamponu ve 10,9 μL dH2O.
NOT: Tavlama reaksiyonunu bir sıcaklık gradyanı ile kontrol etmek çok önemlidir. Sıcaklık gradyanı ile ilgili ayrıntılar için Tablo 2'ye bakın.
- 1x tavlama tamponunda tavsal equimolar oligonükleotid miktarları (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl). Örneğin, 40 μL 161-mer [166,7 μM]; 8 μL 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL 197-mer comp ipliği [408,2 μM]; 10 μL 10x tavlama tamponu ve 10,9 μL dH2O.
- PAGE,17'i açıklandığı gibi ultramerleri (197mer ve 161mer) saflaştırır.
- DNA'nın histon oktamerine oranını belirlemek için küçük ölçekli sulandırmalar (50 μL'lik son hacim için aşağıda gösterilen örneğin 1/57'si ile ölçeklendirin) uygulayın (DNA: oktamer'in tipik başlangıç oranları aşağıdaki gibidir: 1: 0.9, 1: 1.1, 1: 1.2, 1: 1: 2, 1: 2; Şekil 2A'da gösterilmiştir); Bu oranın küçük ölçekli yeniden yapılanmalarla ampirik olarak belirlenmesi kritik öneme sahiptir.
- Bu oran belirlendikten sonra, büyük ölçekli bir yeniden yapılanma hazırlayın. Örneğin, 32.9 μL DNA-197 bp [99.4 μM] karıştırın; 1647,1 μL TE (1x); 1120 μL 5 M NaCl ve 62.3 μL WT histon oktamer [2.56 μM].
- Diyaliz tamponlarını yapın: RBsırasıyla Tablo 3 ve Tablo 4'te açıklandığı gibi düşük ve RByüksek; daha önce açıklandığı gibi yeniden yapılanmaları kurmak14.
- Diyaliz tüpünü RByüksekliği içeren beherin içine aktarın ve diyalizin hafifçe karıştırarak 16 saat boyunca veya 2 L RBdüşük atık kabına aktarılana kadar devam etmesine izin verin.
- Diyaliz tüpünü RB50mM tampon içeren 1 L'lik bir behere aktarın (Tablo 5) ve numunenin en az 3 saat veya gece boyunca diyalize girmesine izin verin.
- %6'lık bir poliakrilamid denatüre olmayan jel üzerinde sulandırma verimliliğini değerlendirerek,% 10'dan az serbest DNA ve tek bir NCP bandı olmasını sağlamak; NCP'leri 4 °C'de saklayın. Temsili optimal sulandırma sonuçları için Şekil 2A (şerit 5) ve Şekil 2B'ye bakınız.
2. NCP-DNA onarım faktörü kompleksi (NCP-DRF) hazırlayın
- Hazırlayıcı jel elektroforezi ile saflaştırma
NOT: Bu yöntem en emek yoğun olanıdır (tarif edilen ikisinden) ve yüksek moleküler ağırlıklı (HMW) türlerin (Şekil 6A) yüksek seyreltme faktörü nedeniyle, aşağıda gösterildiği gibi bazı sökülmelere neden olabilir. Şekil 7A (NCP hazırlık hücresi çıkış şeridi), DNA'yı serbest bırakır. Bununla birlikte,% 25'e kadar serbest DNA hala kriyo-EM çalışmaları ile uyumludur. Yüksek seyreltme nedeniyle, tüm kompleks yerine yalnızca NCP'yi saflaştırmak için bu yöntemi kullanın.- Poliakrilamid jel çözeltisi 37.5: 1, akrilamid: bisakrilamid kullanarak, 0.2x TBE'de% 6 denatüre edici olmayan poliakrilamid jel çözeltisinin 70 mL'sini hazırlayın. Dış yarıçapı 28 mm olan silindirik bir jel dökün ve gece boyunca polimerize edin.
- Hazırlayıcı jel çalıştırma aparatını, 6-8 kDa MW kesimli bir diyaliz membranı kullanarak monte edin. Çalışan arabellek olarak 0,25x TBE ve 1x elüsyon arabelleği (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5) kullanın. Silindirik jeli 1 saat boyunca sabit bir 12 W'ta önceden çalıştırın ve peristaltik pompayı yaklaşık 1 mL / dak akış hızında çalıştıran fraksiyonları toplayın.
NOT: DNA içeren fraksiyonları tanımlamak için bir UV dedektörü mevcut değilse, ilgilenilen fraksiyonları tanımlamak için 32P-NCP ile bir tarama deneyi yapılabilir. Tüm koşulları aynı tutarak, etiketsiz NCP'ler daha sonra bir UV dedektörü olmadan saflaştırılabilir. - Bir santrifüj filtre kullanarak 2,8 mL NCP'yi 250 μL'ye konsantre edin (MW kesme 30 kDa) ve toplam 6 saat boyunca hazırlayıcı jel ve elektrofore üzerine yükleyin. 2 saatte, ksilen siyanol jelden tükendiğinde, 1.5 mL fraksiyonları toplamaya başlayın.
NOT: 2.5 saatte, fraksiyonlar ksilen siyanolden temizlenecektir; DNA (197mer) yaklaşık 3-3.5 saatte ortaya çıkar ve NCP'nin 4.5-5 saat işaretinde ortaya çıkması beklenir. - % 6'lık bir denatüre edici olmayan poliakrilamid jel üzerindeki ilgi fraksiyonlarını analiz edin. NCP içeren havuz fraksiyonları ve hemen bir santrifüj filtre (MW kesme 30 kDa) ile 1 mg / mL'ye konsantre edin. Ertesi gün, ilgilenilen DNA onarım faktörü (DRF) ile kompleksleşmeden önce% 6 poliakrilamid denatüre olmayan jel üzerinde NCP'nin kalitesini değerlendirin.
- NCP'yi ve DRF'yi buz üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin, spesifik kompleks için en uygun tamponu kullanın. Örneğin, 1.000 μL NCP [1,2 μM] karıştırın; 260 μL 5x bağlama tamponu (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL 3 M KCl ve 18 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM].
NOT: Kompleksin yapıldığı sıcaklık ve iyonik mukavemet, farklı kompleksler için optimizasyona ihtiyaç duyabilir. - Glutaraldehit ekleyin (taze açılmış; EM notu)% 0.005'lik bir nihai konsantrasyona. Bu nedenle, bu reaksiyona, 13.2 μLdH2O ile 26.8 μL% 0.25 glutaraldehit ekleyin İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 13 dakika boyunca inkübe edin.
- 1 M Tris-Cl, pH 7.5 ile 20 mM Tris-Cl, pH 7.5'lik nihai konsantrasyona kadar söndürün. ~50 μL'ye kadar konsantre edin ve tamponu 1x dondurma tamponu ile değiştirin: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 tuzdan arındırma sütunu kullanarak.
DİKKAT: Glutaraldehit ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir; Yutulması halinde zararlıdır ve solunması halinde toksiktir. Bir laboratuvar önlüğü, gözlük, eldiven giyin ve glutaraldehiti duman başlığında tutun ve maske takın.
NOT: Çapraz bağlama reaksiyonunu NCP ile bu düşük konsantrasyonda büyük bir hacimde gerçekleştirmek çok önemlidir. Bu glutaraldehit konsantrasyonunda bile, ancak 10 kat daha yüksek konsantre NCP'de bile, önceki çapraz bağlama girişimleri, numunenin toplanmasına ve SDS PAGE ve boyut dışlama kromatografisinde belirtildiği gibi aşırı çapraz bağlanmaya yol açmıştır. Bu ızgaraların sadece kümelere sahip ayırt edilebilir parçacıkları yoktu (Şekil 5D, E). - OD280 ve OD 260'taki absorbansları belirleyin ve OD 280'e dayanarak 1.3-3 mg / mL'ye ulaşmak için gerekirse daha fazla konsantre edin (OD260 / OD 280 = 1.7-2'nin tipik oranı iyi parçacıklar verir). 50 μL'lik bu küçük hacim için, numune kaybını azaltmanın en iyi yöntemi, bir diyaliz membranı ile kaplı 1,7 mL'lik bir tüpün kapağına sahip bir diyaliz düğmesi yapmak (6-8 kDa MW kesme), tüpün tabanını kesmek ve zarı kapağın üstüne kapatmak için tüpün kenarını kullanmaktır.
- Numuneyi içeren diyaliz düğmesini, membran aşağı bakacak şekilde bir polietilen glikol yatağının üzerine yerleştirin (her 2 dakikada bir ilerlemeyi kontrol edin). Bu yöntem, konsantratördeki numunenin seyreltilmesini veya kaybolmasını önlemek için ihtiyaç duyulan konsantrasyonun 2,5 kattan az veya 2,5 kata eşit olduğu durumlarda tercih edilir. Bu adımdan sonra kompleksin kriyo-EM ızgaralarını hemen hazırlamak çok önemlidir.
- Boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırma
- Donmadan önceki gün, bir boyut dışlama kolonunu 60 mL dH2O ile yıkayın ve dengeleyin, ardından 80 mL dondurma tamponu (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) gece boyunca 0,4 mL / dak hızında yıkayın ve dengeleyin. NCP'leri sulandırmadan hemen sonra kullanarak, aynı kompleksi aşağıdaki gibi 2,5 kat daha fazla miktarda kullanarak hazırlayın: 2.500 μL NCP [1.2 μM] karıştırın; 650 μL 5x bağlama arabelleği; 45 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM] ve 55 μL 3M KCl.
- Karışımı çapraz bağlayıcı olmadan buz üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, preparatif jel yönteminde tarif edildiği gibi% 0.005'lik bir nihai konsantrasyona glutaraldehit ekleyin. Bununla birlikte, bu durumda, kompleksi yaklaşık 120 μL'ye kadar önceden dengelenmiş (dondurucu tamponlu) bir santrifüj filtrede yoğunlaştırın.
- Tepe fraksiyonlarını hemen analiz edin ve daha önce belirtildiği gibi histonları ve MBP-Pol β-APE1'i içeren fraksiyonları konsantre edin. Boyut dışlama yöntemini kullanarak başarılı sonuçlar için Şekil 5A,B,C'ye ve her iki yöntemi kullanarak Şekil 7'ye bakın.
3. Nükleozomal kompleksi dondurun
- Daldırma dondurucuyu açtıktan ve nemlendiriciyi 50 mL dH2 O ile doldurduktan sonra, oda sıcaklığını22° C'ye ve HR'yi (nem)% 98'e ayarlayın. Etan kabını ve sıvı azot kabını (etiketli bir ızgara kutusu içeren) ilgili alan tutucularına yerleştirin.
- Etan kabını etan kapağı dağıtıcısı ile örtün ve üzerine dikkatlice sıvı azot (LN2) dökün, aynı zamanda LN 2 kabını LN2 ile doldurun. LN2 seviyesi stabilize olduğunda ve% 100'e ve -180 ° C'lik bir sıcaklığa ulaştığında, etan valfini dikkatlice açın ve etan kabını şeffaf kapakta bir kabarcık oluşturana kadar doldurun. Etan dağıtıcıyı çıkarın.
- Kurutma cihazına iki filtre kağıdı yerleştirin ve bunları metal bir halka ile sabitleyin. Kuruluma gidin ve lekeleme için aşağıdaki parametreleri kullanın: 0 leke öncesi, 3 s leke, 0 leke sonrası; A-plunge'u seçin ve Tamam'a tıklayın.
- Ana ekranda, Forseps Yükle'ye tıklayın ve bunları karbon / uygulama tarafı sola bakacak şekilde (daha önce olduğu gibi hazırlanmış) bir ızgara ile yükleyin. Forsepsleri kalibre edin, katı bir leke sağlamak için Z eksenini ayarlayın. Alt Odacık'a tıklayın ve kompleksin 3 μL'sini (1.3-3 mg / mL; OD280). Blot/A-plunge'a tıklayın. Bu, ızgarayı önden lekelenmek üzere döndürecek ve donduracaktır.
- Izgarayı LN2 odasındaki ızgara kutusuna aktarın ve saklayın. Dört ızgaranın tümü dondurulduğunda ve ızgara kutusuna yerleştirildiğinde, kapağı tüm ızgaraların kapakla kaplandığı nötr konuma döndürün ve vidayı sıkın. Izgaralar, tarama başlatılana kadar LN2'de saklanabilir.
4. Ekran ızgaraları
- Numuneleri mikroskopa yüklemeden önce, vitrifiye ızgaraları bir halka üzerine yerleştirin ve bir C-klipsi kullanarak sabitleyin. Buz kontaminasyonunu önlemek için bu kırpma işlemini LN2 altında nem kontrollü bir odada gerçekleştirin.
- Mikroskopu yüklerken, ızgaraları 12 yuvalı bir kasete yerleştirin. Kaseti bir nanocab kapsülüne yerleştirin ve otomatik yükleyiciye yükleyin. Otomatik yükleyici robotik mekanizması işlemi başlatır.
- Izgarayı kasetten mikroskop aşamasına aktarın. Sahneyi 10° sallayarak ve aynı anda görüntülerde minimum düzlemsel kayma gözlenene kadar Z yüksekliğini hareket ettirerek sahne alanını ösentrik yüksekliğe ayarlayın.
- Ösentrik yüksekliğe ulaşıldığında, görüntülemeye başlayın. İlk olarak, her montajın 62x büyütmede çekildiği ızgaranın 3 x 3 montaj görüntüsünü alarak atlası elde edin. Farklı boyutlarda üç kare seçin; Ösentrik yüksekliği alın ve ardından 210x büyütmede görüntü alın.
- Bir kare görüntülendikten sonra, karelerin kenarından, ortasından ve aralarından birer delik seçin. Her deliği 2600x büyütmede görüntüleyin.
- Bu yüksek büyütmeli görüntüyü çekmeden önce, otomatik odaklama görüntüleme alanının bir ofsetinde gerçekleşir. Yüksek büyütmeli görüntüyü deliğin merkezinden 36.000x büyütme ve 7,1 s pozlama süresinde, 60 karede, 1,18 piksel boyutunda ve 3 μm bulanıklaştırmada çekin. Şekil 5, Şekil 6 ve Şekil 7'deki temsili tarama görüntülerine bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MBP-Polβ-APE1'in rekombinant füzyon proteini ile bir kompleks yapmak için uygun şekilde monte edilmiş NCP'ler (Şekil 2) kullanıldı (Şekil 3). NCP'nin MBP-Polβ-APE1'e oranını kararlı bir kompleks oluşturmak için belirlemek için, NCP'nin MBP-Polβ-APE1'in 5 kat azı dişi fazlalığı ile tek başına kaymış bir bandını gösteren elektroforetik hareketlilik kayma testleri (EMSA) (Şekil 4) gerçekleştirdik. Bu kompleksin optimizasyonu sırasında, glutaraldehit ile çapraz bağlanma, NCP'nin parçalanmasını önlemek için kritik öneme sahipti. Başlangıçta, NCP-Polβ-APE1 kompleksinin montajı,% 0.005 nihai glutaraldehit konsantrasyonu kullanılarak, yaklaşık 10 μM NCP'de daha küçük bir hacimde gerçekleştirildi. Bu koşullar altında, numune aşırı çapraz bağlanmıştır (Şekil 5D-E) ve ayırt edilebilir bireysel kompleksleri olmayan agregalarla sonuçlanmıştır. Yaklaşık 10 kat seyreltilmiş NCP'lerde (1.2 μM NCP) çapraz bağlama, agregasyonun önemli ölçüde azalmasına ve parçacık stabilitesinin iyileşmesine neden olmuştur (Şekil 5A-C). Şekil 6, Şekil 1'de gösterilen her iki yöntemin, NCP önemli miktarda yüksek moleküler ağırlıklı (HMW) agrega içerdiğinde (Şekil 6A) NCP'lerin kalitesini artıran preparatif jel ile birleştirilebileceğini ve ardından kompleksin boyut dışlama yoluyla saflaştırılabileceğini göstermektedir. Bu, numunenin (Şekil 5B-C) ve ızgaraların hazırlanmasında büyük başarı göstermesine rağmen, kararlı parçacıklar elde etmesine rağmen (Şekil 6D), kompleksin optimal olmayan oluşumu (Şekil 6A), yalnızca NCP'nin 3D haritasını vermiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu sonuçlar, her iki yöntemin de (boyut dışlama ve hazırlayıcı jel) kararlı kompleksler oluşturmak için bağımsız olarak kullanılabileceğini göstermektedir (Şekil 7A-C). Gerçekten de, veriler her iki ızgaradan da toplanmıştır ve yaklaşık 3.2 şçözünürlükte neredeyse aynı 2D sınıfları (Şekil 7D) ve 3D haritaları (Şekil 7E) göstermektedir.
Şekil 1: Bir NCP-Polβ-APE1 kompleksini 1) hazırlayıcı jel ve 2) boyut dışlama yoluyla hazırlamak ve dondurmak için bu protokolde sunulan iki yöntemin iş akışı. Burada gösterilmese de, bu yöntemler (1) ile başlayarak ve konsantre kompleksi (1) 'den bir boyutlandırma sütunu kullanarak saflaştırarak birleştirilebilir (Şekil 6). Bu, NCP'lerin başlangıç malzemesinin iki katına çıkarılmasını gerektirecektir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Temsili NCP sulandırmaları. (A) DNA, 1:0.9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2, DNA:oktamer oranlarında artan miktarda histon oktamer ile titre edildi. (B) Büyük ölçekli monte edilmiş NCP'leri çoğaltın (1:2, DNA:oktamer). Rekonstrüksiyonlar% 6'lık bir denatüre edici olmayan poliakrilamid jelde elektroforez edildi, bunu sybr yeşili I boyama izledi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Genetik olarak kaynaşmış Polβ-APE1'in N-terminalinde MBP ile şematiği. MBP-Polβ-APE1 füzyon proteini her iki aktivite için enzimatik olarak karakterize edildi (veriler gösterilmedi). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: MBP-Polβ-APE1 radarının NCP'lere bağlanması. Nükleozomal substrat (100 nM), buz üzerinde 15 dakika boyunca artan miktarda MBP-Polβ-APE1 ile inkübe edildi. Bağlı ve bağlanmamış NCP,% 6'lık bir poliakrilamid denatüre olmayan jelde ayrıldı, ardından sybr yeşil I boyama yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Başarılı ve başarısız çapraz bağlama sonuçlarının analizi. Kompleksin elüsyon profili, (A) 'da, ilgi zirvesi etiketlenmiş olarak gösterilir. Bu elüsyondan toplanan "F" ile gösterilen fraksiyonlar,% 16'lık bir trisin poliakrilamid jelde analiz edildi ve (B) 'de gösterildi. (C) (B)'den alınan numune, delikli karbon destek ızgaraları kullanılarak dondurulmuş ve 200 kV alan emisyonlu kriyo-transmisyonlu elektron mikroskobu kullanılarak görüntülenmiştir. İlgili başarısız deneyler (D), (E) ve (F) bölümlerinde gösterilmiştir. Bu başarısız deneylerin MBP olmadan füzyon proteinini içerdiğini unutmayın. HOc veHO D , sırasıyla konsantre ve seyreltilmiş histon oktameri gösterir; RT oda sıcaklığını gösterir; "X", glutaraldehit ile çapraz bağlanmaya karşılık gelir. Ölçek çubukları = 100 nm (C, F). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: NCP-Polβ-APE1 kompleksinin iki yöntemi birlikte kullanarak hazırlanması. (A) Bağlanmamış ve bağlı (1: 1, NCP-Polβ-APE1)% 6 poliakrilamid denatüre edici olmayan jelde analiz edildi (bu oranda sadece% 50'sinin bağlı olduğunu unutmayın). (B) NCP-Polβ-APE1 kompleksinin bir boyutlandırma sütunundan elüsyon profili. (C) %16'lık bir trisin poliakrilamid jel içinde salınan fraksiyonların analizi; fraksiyonlar belirtildiği gibi toplandı ve konsantre edildi. (D) Numune dondurulmuş ve Şekil 5B'de açıklandığı gibi görüntülenmiştir. Veri işleme, Polβ-APE1'e karşılık gelen ek bir yoğunluk göstermedi (gösterilmedi). 5. ve 6. şeritlerdeki "X", protokolde belirtildiği gibi glutaraldehit ile çapraz bağlanmayı ifade eder. Ölçek çubuğu = 100 nm (D). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: NCP-MBP-Polβ-APE1 kompleksinin analizi . (A) Şekil 1'de gösterilen yöntemlerdeki farklı adımlardan alınan numuneler,% 6'lık bir poliakrilamid denatüre edici olmayan jel içinde elektroforez edildi. Karmaşık oluşumun iki yöntemle tekrarlanabilir olduğuna dikkat edin. (B,C) Kırmızı kutuların kompleksin farklı yönlerini vurguladığı 300 kV iletim elektron mikroskobu kullanılarak çekilen temsili ızgara deliği karbon destek ızgarası görüntüleri (bazıları (D) de gösterilen 2D sınıflarına karşılık gelir). (E) (C)'den işlenen veriler, NCP-MBP-Polβ-APE1 kompleksinin 3,2 şçözünürlüğünde bir 3B harita gösterir.) Ölçek çubukları = 100 nm (B, C). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Oligonükleotid adı | Sıra (5'-->3') | Saflaştırma ölçeği | Purificaiton yöntemi | Sipariş edilen şişe sayısı | ||
| UND tamamlayıcı ipliği | TGATGGACCCTATACGCGGCCGCCCTGGAGAAT CCCGGTGCCGAGGCCGCTCAATTGGTCGTAGA CAGCTCTAGCACCGCTTAAACGCACGTACGCGCC TGTCCCCCGCGTTTTAACCGCCAAGGGGATTAC TCCCTAGTCTCCAGGCACGTGTCAGATATCAAC ATCCTGTGCATGTATTGAACAGCGACCTTGCCG |
20 nmole | SAYFA arındırılmış | 6 | ||
| 161mer | /5Phos/GATATCTGACACGTGCCTGGAGACTAGG GAGTAATCCCCTTGGCGGTTAAAACGCGGGGG ACAGCGCGTACGTGCGTTTAAGCGGTGCTAGA GCTGTCTACGACCAATTGAGCGGCCTCGGCA CCGGGATTCTCCAGGGCGGCCGCGTATAGGG TCCATCA |
20 nmole | SAYFA arındırılmış | 4 | ||
| 35mer | CGGCAAGGTCGCTGTTCAATACATGCACAGG cesaret |
250 nmole | cesaret | 1 | ||
Tablo 1: DNA substratı. DsDNA substratını oluşturmak için üç oligonükleotid tavlandı. Altı çizili bölümler, tek bir nükleotid boşluğu içeren 147 bp 601 DNA konumlandırma dizisini çevreleyen 25 bp bağlayıcı DNA'dır.
| Adım | Sıcaklık (°C) | Zaman (min)/adım |
| 1 | 95 | 10 |
| 2-5 | 90, 85, 80, 75 | 5 |
| 6-41 | 69 1 azalma | 3 |
| 42 | 4 | tutmak |
Tablo 2: Tavlama sıcaklığı gradyanı. Oligolar, dsDNA substratını üretmek için bu sıcaklıklarda bir termosiklin içinde inkübe edildi.
| Bileşenler (stok) | Hacim/miktar | Son konsantrasyon |
| 3M KCl | 167 mL | 0.250 milyon |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 20 mL | 10 mM |
| 0,5 M EDTA | 4 mL | 1 mM |
| 1 M DTT | 2 mL | 1 mM |
| ÇELİK | 2 gr | 1,6 milyon |
| 2L yapmak için dH2O ile QS | ||
Tablo 3: RBdüşük sulandırma tamponu. Daha önce bildirildiği gibi 2 L'yi14 yapmak için talimatlar, 1.6 mM CHAPS hariç.
| Bileşenler (stok) | Hacim/miktar | Son konsantrasyon |
| 3M KCl | 267 mL | 2 milyon |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 4 mL | 10 mM |
| 0,5 M EDTA | 800 μL | 1 mM |
| 1 M DTT | 400 μL | 1 mM |
| ÇELİK | 0.4 gr | 1,6 milyon |
| 400 mL yapmak için dH2O ile QS | ||
Tablo 4: RByüksek sulandırma tamponu. Daha önce bildirildiği gibi 400 mL yapma talimatları,1.6 mM CHAPS hariç, 14 eklendi.
| Bileşenler (stok) | Hacim | Son konsantrasyon |
| 3M KCl | 16,7 milyon L | 50 mM |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 10 mL | 10 mM |
| 0,5 M EDTA | 2 mL | 1 mM |
| 1 M DTT | 1 mL | 1 mM |
| 1L yapmak için dH2O ile QS | ||
Tablo 5: RB50mM sulandırma tamponu. 1 L sulandırma tamponunu dondurma için uyumlu hale getirme talimatları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA onarım faktörünü saflaştırmak için özel bir protokol, ilgilenilen enzime bağlı olacaktır. Bununla birlikte, protein ekspresyonu ve saflaştırma için rekombinant yöntemlerin kullanılması da dahil olmak üzere bazı genel öneriler vardır18; İlgilenilen protein çok küçükse (<50 kDa), kriyo-EM ile yapı tayini, füzyon sistemleri19, nanogövde bağlayıcı iskeleler20 ve görüntüleme stratejilerinin optimize edilmesi21 ile daha yakın zamana kadar neredeyse imkansızdı.
İlk aşamalarda düşük kaliteli ızgaralar elde etmek oldukça yaygındır. Negatif boyama için uranil asetat ve karbon kaplı bakır ızgaralar kullanarak, herhangi bir çapraz bağlayıcı olmadan NCP homojenliğini ve stabilitesini belirlemeye yönelik ilk girişimler, minimum agregasyonla kararlı, güzel dağılmış NCP'ler gösterdi. Bununla birlikte, bu numune kriyo-EM ızgaralarında vitrifiye edildikten sonra (20 kat daha yüksek konsantrasyonda), hiçbir parçacık tespit edilmedi. NCP'lerin parçalanmasını veya toplanmasını önlemek için numune optimizasyonu en büyük engeldi. Ek olarak, iki hazırlama yöntemi ayrı ayrı açıklanmaktadır; Bununla birlikte, karşılıklı olarak münhasır değildirler ve NCP'yi önce bir hazırlayıcı jel aracılığıyla saflaştırarak, onarım faktörü ile kompleksleştirerek ve kompleksi bir boyut dışlama sütunu ile saflaştırarak arka arkaya kullanılabilirler. Bu, ilk adım için iki kat daha fazla malzeme gerektirir ve aynı zamanda daha fazla zaman alıcıdır, ancak zor numuneler için yararlıdır (Şekil 6).
Çapraz bağlayıcı konsantrasyonu için bir başlangıç noktası bulmak, çapraz bağlama yöntemlerindeki tutarlılık eksikliği ve başkaları tarafından kullanılan çapraz bağlayıcı miktarları nedeniyle zordu22,23. Anderson ve ark. tarafından tanımlanan tezgah üstündeki daha az kontrollü çapraz bağlama reaksiyonunu çoğaltma girişimleri olumlu sonuçlar vermedi ve kompleks aşırı derecede çapraz bağlandı. Bu muhtemelen glutaraldehit kaynağından kaynaklanmaktadır (uzun süreli depolanmış glutaraldehit ile karşılaştırıldığında yeni açılmış ampul). Bu ayrıntı seviyesi genellikle yöntem olmayan, araştırma makalelerinde ihmal edildiğinden, kesin koşulları bir başlangıç noktası olarak çoğaltmak zordur. Kompleks, 150 mM KCl iyonik mukavemette 1.2 μM'lik bir konsantrasyonda çapraz bağlandığında, kompleksin 10 μM NCP'de çapraz bağlanmasına kıyasla, oda sıcaklığında 13 dakika boyunca% 0.005'lik aynı glutaraldehit konsantrasyonunda çapraz bağlandığında optimal sonuçlar elde edildi. Çapraz bağlama verimliliği, bazı kromatin etkileşimli faktörlerin, çapraz bağlamanın nerede gerçekleşeceğini ve NCP stabilitesi üzerindeki genel etkiyi etkileyen daha fazla istikrarsızlaştırmaya neden olabileceği / gerektirebileceği için oluşmakta olan komplekse de bağlıdır. Bu nedenle, bu koşulların optimizasyonu kaçınılmaz olsa da, çapraz bağlanma reaksiyonları sırasında optimal NCP ve tuz konsantrasyonu gibi kritik adımların bulunması kritik olacaktır.
Bir diğer önemli parametre, NCP'ye bağlı DRF'yi içeren ızgarada yeterli molekül veren NCP: DRF oranıydı. Gerçekten de, bu parametre başkaları tarafından yapısal çalışmalar için optimize etmek için kritik olan bir parametre olarak tanımlanmıştır16 DRF'nin NCP'ye bağlanma şeklinin kriyo-EM homojenliği için bile 3D harita için önemlidir. Bunu optimize etmemek, bağlanmamış veya heterojen, spesifik olmayan bağlanmaya neden olabilir. DRF tarafından bağlanan NCP'nin sadece% 50'sini veren 1: 1 molar oran kullanıldığında (Şekil 6), 3D harita DRF'ye karşılık gelen herhangi bir ek yoğunluk göstermedi. Bu nedenle, bir EMSA üzerinde aynı yerde tek bir bant veren ve komplekse karşılık gelen bir boyutlandırma sütununun kromatogramında tek bir tepe noktası gösteren oranı belirlemek önemlidir. Lekelenme süresi de dahil olmak üzere ızgaraların dondurulması için çeşitli parametreler, birkaç optimizasyon turu ekledi.
Birlikte ele alındığında, bu protokol ilk kez kriyo-EM yapısal tayini için nükleozomal kompleksler hazırlamak için iki farklı yöntem hakkında ayrıntılı talimatlar sağlar. Sağlanan ızgara hazırlığı için temel parametreler başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Ve tek bir yöntem tüm makromoleküler kompleksler için eşit derecede iyi çalışmasa da, bu protokolde açıklanan parametreleri optimize etmeye odaklanmak, diğer nükleozomal komplekslerin özel optimizasyonu için stratejiyi daraltacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü'ndeki cryo-EM çekirdeğinden Dr. Mario Borgnia'ya ve Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'nden Dr. Joshua Strauss'a kriyo-EM ızgara hazırlığındaki mentorlukları ve eğitimleri için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende'ye bu projenin ilk aşamalarındaki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Merhum Dr. Samuel H. Wilson ve laboratuvar üyelerinin, özellikle de Dr. Rajendra Prasad ve Dr. Joonas Jamsen'in genetik olarak kaynaşmış APE1-Polβ kompleksinin saflaştırılması için kilit katkılarını ve desteklerini takdir ediyoruz. Araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir [hibe numaraları Z01ES050158, Z01ES050159 ve K99ES031662-01].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640--6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S.
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. Guide to Protein Purification. 463, Academic Press. (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
