Summary
Dit protocol schetst in detail de voorbereiding van nucleosomale complexen met behulp van twee methoden voor monstervoorbereiding voor het bevriezen van TEM-roosters.
Abstract
DNA-reparatie in de context van chromatine is slecht begrepen. Biochemische studies met nucleosoomkerndeeltjes, de fundamentele herhalende eenheid van chromatine, tonen aan dat de meeste DNA-reparatie-enzymen DNA-schade verwijderen met verminderde snelheden in vergelijking met vrij DNA. De moleculaire details over hoe base excision repair (BER) enzymen DNA-schade in nucleosomen herkennen en verwijderen, zijn niet opgehelderd. Biochemische BER-gegevens van nucleosomale substraten suggereren echter dat het nucleosoom verschillende structurele barrières vertoont, afhankelijk van de locatie van de DNA-laesie en het enzym. Dit geeft aan dat de mechanismen die door deze enzymen worden gebruikt om DNA-schade in vrij DNA te verwijderen, anders kunnen zijn dan die welke in nucleosomen worden gebruikt. Aangezien het grootste deel van het genomische DNA is geassembleerd tot nucleosomen, is structurele informatie van deze complexen nodig. Tot op heden ontbreekt het de wetenschappelijke gemeenschap aan gedetailleerde protocollen om technisch haalbare structurele studies van deze complexen uit te voeren. Hier bieden we twee methoden om een complex van twee genetisch gefuseerde BER-enzymen (Polymerase β en AP Endonuclease1) te bereiden die gebonden zijn aan een single-nucleotide-gap nabij de entry-exit van het nucleosoom voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) structurele bepaling. Beide methoden voor monstervoorbereiding zijn compatibel voor het vitrificeren van kwaliteitsroosters via ondervriezen. Dit protocol kan worden gebruikt als uitgangspunt om andere nucleosomale complexen te bereiden met verschillende BER-factoren, pioniertranscriptiefactoren en chromatine-modificerende enzymen.
Introduction
Eukaryote DNA wordt georganiseerd en verdicht door histoneiwitten, die chromatine vormen. Het nucleosoomkerndeeltje (NCP) vormt de fundamentele herhalende eenheid van chromatine die de toegankelijkheid tot DNA-bindende eiwitten reguleert voor DNA-reparatie, transcriptie en replicatie1. Hoewel de eerste röntgenkristalstructuur van het NCP meer dan twee decennia geleden voor het eerst werd opgelost2 en er sinds 3,4,5,6 nog veel meer structuren van het NCP zijn gepubliceerd, zijn DNA-reparatiemechanismen in nucleosomale substraten nog niet afgebakend. Het blootleggen van de moleculaire details die ten grondslag liggen aan DNA-reparatie in chromatine vereist structurele karakterisering van de deelnemende componenten om te begrijpen hoe lokale structurele kenmerken van het NCP DNA-reparatieactiviteiten reguleren. Dit is met name belangrijk in de context van base-excisieherstel (BER), aangezien biochemische studies met BER-enzymen unieke DNA-reparatiemechanismen in nucleosomen suggereren die afhankelijk zijn van enzymspecifieke structurele vereisten voor katalyse en de structurele positie van de DNA-laesie binnen het nucleosoom 7,8,9,10,11,12,13 . Aangezien BER een essentieel DNA-reparatieproces is, is er veel belangstelling om deze lacunes op te vullen en tegelijkertijd een startpunt vast te stellen van waaruit andere technisch haalbare structurele studies met relevante nucleosomale complexen kunnen worden uitgevoerd.
Cryo-EM wordt snel de voorkeursmethode voor het oplossen van de driedimensionale (3D) structuur van complexen waarvan de grootschalige voorbereiding van homogene monsters een uitdaging is. Hoewel het ontwerp en de zuivering van NCP's gecomplexeerd met een DNA-reparatiefactor (NCP-DRF) waarschijnlijk op maat gemaakte optimalisatie vereist, biedt de hier gepresenteerde procedure om een stabiel NCP-DRF-complex te genereren en te bevriezen details over hoe het monster en de cryo-EM-netwerkvoorbereiding kunnen worden geoptimaliseerd. Twee workflows (die elkaar niet uitsluiten) in figuur 1 en de specifieke details in het protocol identificeren kritieke stappen en bieden strategieën voor het optimaliseren van deze stappen. Dit werk zal het chromatine- en DNA-reparatieveld voortstuwen in een richting waarin het aanvullen van biochemische met structurele studies technisch haalbaar wordt om de moleculaire mechanismen van nucleosomaal DNA-herstel beter te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Assembleer nucleosoomkerndeeltjes via zout-gariëntdialyse
OPMERKING: De bereiding van nucleosoomkerndeeltjes met behulp van recombinante histoneiwitten voor structurele studies is uitgebreid in detail beschreven door anderen14,15,16. Volg de zuivering van recombinant X. laevis histonen en histon octameer assemblage beschreven door anderen14,15, en monteer het nucleosomale substraat zoals hieronder beschreven.
- Koop drie oligonucleotiden (vermeld in tabel 1) op de aangegeven schaal: UND-197mer, 161mer, 35mer.
- PAGE zuivert ultrameren (197mer en 161mer) zoals beschreven17.
- Anneale equimolaire hoeveelheden oligonucleotiden in 1x gloeibuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Meng bijvoorbeeld 40 μL van 161-mer [166,7 μM]; 8 μL van 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL van 197-mer comp streng [408,2 μM]; 10 μL 10x gloeibuffer en 10,9 μL dH2O.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de gloeireactie met een temperatuurgradiënt te regelen. Zie tabel 2 voor de details over het temperatuurverloop.
- Anneale equimolaire hoeveelheden oligonucleotiden in 1x gloeibuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Meng bijvoorbeeld 40 μL van 161-mer [166,7 μM]; 8 μL van 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL van 197-mer comp streng [408,2 μM]; 10 μL 10x gloeibuffer en 10,9 μL dH2O.
- PAGE zuivert ultrameren (197mer en 161mer) zoals beschreven17.
- Voer kleinschalige reconstituties uit (schaal met een factor 1/57 van het onderstaande voorbeeld voor een eindvolume van 50 μL) om de verhouding tussen DNA en histonoctameer te bepalen (typische beginverhoudingen van DNA:octameer zijn als volgt: 1:0,9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2; weergegeven in figuur 2A); Het is van cruciaal belang om deze verhouding empirisch te bepalen met kleinschalige reconstituties.
- Nadat deze verhouding is bepaald, bereidt u een grootschalige reconstitutie voor. Meng bijvoorbeeld 32,9 μL DNA-197 bp [99,4 μM]; 1647,1 μL TE (1x); 1120 μL van 5 M NaCl en 62,3 μL WT histon octameer [2,56 μM].
- Dialysebuffers maken: RBlaag en RBhoog zoals beschreven in respectievelijk tabel 3 en tabel 4; Stel de reconstituties in zoals eerder beschreven14.
- Breng de dialysebuis over in het bekerglas met RBhoog en laat de dialyse onder zacht roeren gedurende 16 uur doorgaan of totdat 2 L RBlaag in het afvalbeker is overgebracht.
- Breng de dialysebuis over in een bekerglas van 1 L met RB50mM-buffer (tabel 5) en laat het monster gedurende ten minste 3 uur of een nacht dialyseren.
- Evalueer de reconstitutie-efficiëntie op een 6% polyacrylamide niet-denaturerende gel, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er minder dan 10% vrij DNA en een enkele NCP-band is; bewaar NCP's bij 4 °C. Zie figuur 2A (baan 5) en figuur 2B voor representatieve optimale reconstitutieresultaten.
2. Bereid NCP-DNA reparatiefactor complex (NCP-DRF) voor
- Zuivering door preparatieve gel-elektroforese
OPMERKING: Deze methode is de meest arbeidsintensieve (van de twee beschreven), en hoewel het effectief is in het verwijderen van soorten met een hoog moleculair gewicht (HMW) (Figuur 6A) vanwege de hoge verdunningsfactor kan dit leiden tot enige demontage zoals weergegeven in Figuur 7A (NCP prep cell out lane), waarbij DNA vrijkomt. Tot 25% vrij DNA is echter nog steeds compatibel met cryo-EM-studies. Vanwege de hoge verdunning, gebruik deze methode om alleen het NCP te zuiveren, in plaats van het hele complex.- Bereid 70 ml 6% niet-denaturerende polyacrylamide-geloplossing in 0,2x TBE, met polyacrylamide-geloplossing 37,5:1, acrylamide:bisacrylamide. Giet een cilindrische gel met een buitenradius van 28 mm en polymeriseer 's nachts.
- Monteer het preparatieve gelloopapparaat met behulp van een dialysemembraan met een 6-8 kDa MW-afsnijding. Gebruik 0,25x TBE als loopbuffer en 1x elutiebuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Laat de cilindrische gel gedurende 1 uur op een constante 12 W lopen en verzamel fracties die de peristaltische pomp laten draaien met een stroomsnelheid van ongeveer 1 ml / min.
OPMERKING: Als er geen UV-detector beschikbaar is om fracties met DNA te identificeren, kan een screeningsexperiment met 32P-NCP worden uitgevoerd om de fracties van belang te identificeren. Door alle omstandigheden hetzelfde te houden, kunnen ongelabelde NCP's vervolgens worden gezuiverd zonder een UV-detector. - Concentreer de 2,8 ml NCP tot 250 μL met behulp van een centrifugaalfilter (MW-afsnijding 30 kDa) en laad gedurende in totaal 6 uur op de preparatieve gel en elektroforese. Na 2 uur, wanneer de xyleencyanol de gel op heeft, begint u met het verzamelen van fracties van 1,5 ml.
OPMERKING: Na 2,5 uur zijn fracties vrij van xyleencyanol; het DNA (197mer) elueert op ongeveer 3-3,5 h, en het NCP zal naar verwachting elueren bij 4,5-5 h mark. - Analyseer fracties van belang op een 6% niet-denaturerende polyacrylamidegel. Poolfracties die de NCP bevatten en concentreer onmiddellijk met een centrifugaalfilter (MW-afsnijding 30 kDa) tot 1 mg / ml. Evalueer de volgende dag de kwaliteit van de NCP op een 6% polyacrylamide niet-denaturerende gel voordat u complexeert met de DNA-reparatiefactor (DRF) van belang.
- Incubeer het NCP en de DRF van belang op ijs gedurende 15 minuten met behulp van een optimale buffer voor het specifieke complex. Meng bijvoorbeeld 1.000 μL NCP [1,2 μM]; 260 μL 5x bindingsbuffer (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL 3 M KCl en 18 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM].
OPMERKING: De temperatuur en ionische sterkte waarbij het complex is gemaakt, moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende complexen. - Voeg glutaaraldehyde (vers geopend; EM-graad) tot een eindconcentratie van 0,005%. Voeg daarom aan deze reactie 26,8 μL 0,25% glutaaraldehyde toe met 13,2 μL dH2O. Meng goed en incubeer gedurende 13 minuten bij kamertemperatuur.
- Blus met 1 M Tris-Cl, pH 7,5, tot een eindconcentratie van 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Concentraat tot ~50 μL en vervang de buffer met 1x vriesbuffer: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 met behulp van een ontzoutingskolom.
LET OP: Glutaaraldehyde kan ernstige brandwonden en oogbeschadiging veroorzaken; Het is schadelijk als het wordt ingeslikt en het is giftig als het wordt ingeademd. Draag een laboratoriumjas, bril, handschoenen en hanteer glutaaraldehyde in een zuurkast en draag een masker.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de crosslinkingreactie in een groot volume uit te voeren met de NCP bij deze lagere concentratie. Eerdere pogingen tot crosslinking, zelfs bij deze concentratie van glutaaraldehyde, maar bij een 10x hogere geconcentreerde NCP leidden tot aggregatie van het monster en over-crosslinking zoals aangegeven door SDS PAGE en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze roosters hadden geen waarneembare deeltjes met alleen klonten (figuur 5D,E). - Bepaal de absorpties bij OD 280 en OD 260 en concentreer indien nodig verder om 1,3-3 mg / ml te bereiken, op basis van OD 280 (typische verhouding van OD260 / OD 280 = 1,7-2 levert goede deeltjes op). Voor dit kleine volume van 50 μL is de beste methode om monsterverlies te verminderen het maken van een dialyseknop met een deksel van een buis van 1,7 ml bedekt met een dialysemembraan (6-8 kDa MW afsnijding), het snijden van de onderkant van de buis en het gebruik van de rand van de buis om het membraan bovenop het deksel af te dichten.
- Plaats de dialyseknop met het monster bovenop een polyethyleenglycolbed, met het membraan naar beneden gericht (controleer de voortgang elke 2 minuten). Deze methode heeft de voorkeur wanneer de benodigde concentratie kleiner is dan of gelijk is aan 2,5-voudig om te voorkomen dat het monster in de concentrator wordt verdund of verloren. Het is van cruciaal belang om na deze stap onmiddellijk cryo-EM-roosters van het complex voor te bereiden.
- Zuivering door grootte-uitsluitingschromatografie
- De dag voor het invriezen, was en balanceer een grootte uitsluitingskolom met 60 ml dH2O, gevolgd door 80 ml vriesbuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) 's nachts met een snelheid van 0,4 ml / min. Gebruik NCP's direct na reconstitutie en bereid hetzelfde complex met 2,5x grotere hoeveelheden als volgt: meng 2.500 μL NCP [1,2 μM]; 650 μL 5x bindingsbuffer; 45 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM] en 55 μL 3M KCl.
- Incubeer het mengsel op ijs zonder crosslinker gedurende 15 min. Voeg vervolgens glutaaraldehyde toe tot een uiteindelijke concentratie van 0,005% zoals beschreven in de preparatieve gelmethode. Concentreer het complex in dit geval echter in een vooraf gebalanceerd (met vriesbuffer) centrifugaalfilter tot ongeveer 120 μL.
- Analyseer onmiddellijk de piekfracties en concentreer die fracties die de histonen en MBP-Pol β-APE1 bevatten, zoals eerder aangegeven. Zie figuur 5A,B,C voor succesvolle resultaten met behulp van de grootte-uitsluitingsmethode en figuur 7 met beide methoden.
3. Bevries nucleosomaal complex
- Nadat u de diepvries hebt ingeschakeld en de luchtbevochtiger hebt gevuld met 50 ml dH2O, stelt u de kamertemperatuur in op 22 °C en HR (vochtigheid) op 98%. Plaats de ethaanbeker en de beker met vloeibare stikstof (met een gelabelde rasterdoos) in hun respectievelijke ruimtehouders.
- Bedek de ethaanbeker met de ethaandekseldispenser en giet er voorzichtig vloeibare stikstof (LN2) overheen, terwijl u ook de LN 2-beker vult met LN2. Wanneer het LN2-niveau is gestabiliseerd en 100% en een temperatuur van -180 °C bereikt, opent u voorzichtig de ethaanklep en vult u de ethaanbeker totdat deze een bel vormt op het heldere deksel. Verwijder de ethaandispenser.
- Plaats twee filterpapieren op de opberginrichting en zet ze vast met een metalen ring. Ga naar de set-up en gebruik de volgende parameters voor blotting: 0 pre-blot, 3 s blot, 0 post-blot; selecteer A-plunge en klik op OK.
- Klik in het hoofdscherm op Load Forceps en laad ze met een raster met de koolstof- / applicatiezijde naar links gericht (voorbereid zoals voorheen). Kalibreer de tang en stel de Z-as in om een stevige vlek te garanderen. Klik op de Tweede Kamer en breng 3 μL van het complex aan (1,3-3 mg / ml; OD280). Klik op Blot/A-plunge. Dit zal het rooster draaien om van de voorkant te vegen en zal het bevriezen.
- Breng het raster over en bewaar het in de rasterdoos in de LN2-kamer . Wanneer alle vier de roosters zijn bevroren en in de roosterdoos zijn geplaatst, draait u het deksel naar de neutrale positie, waar alle roosters door het deksel worden bedekt, en draait u de schroef vast. Rasters kunnen worden opgeslagen in LN2 totdat de screening wordt gestart.
4. Schermrasters
- Voordat u de monsters in de microscoop laadt, plaatst u de verglaasde roosters op een ring en zet u ze vast met een C-clip. Voer dit knipproces onder LN2 uit in een ruimte met een vochtige omgeving, om ijsverontreiniging te voorkomen.
- Plaats bij het laden van de microscoop de roosters in een cassette met 12 sleuven. Breng de cassette in een nanocab-capsule en laad deze in de autoloader. Het robotmechanisme van de autoloader initieert het proces.
- Breng het rooster over van de cassette naar het microscoopstadium. Pas het podium aan op eucentrische hoogte door het podium 10° te wiebelen en tegelijkertijd de Z-hoogte te bewegen totdat er een minimale vlakke verschuiving in de beelden wordt waargenomen.
- Zodra de eucentrische hoogte is bereikt, begint u met beeldvorming. Verkrijg eerst de atlas door een 3 x 3 montageafbeelding van het raster te maken, waarin elke montage wordt genomen met een vergroting van 62x. Kies drie vierkanten van verschillende grootte; Neem de eucentrische hoogte en maak vervolgens een afbeelding met een vergroting van 210x.
- Zodra een vierkant is afgebeeld, kiest u elk een gat van de rand, het midden en daartussen binnen de vierkanten. Beeld elk gat af bij een vergroting van 2600x.
- Voordat deze hoge vergrotingsfoto wordt gemaakt, vindt de autofocus plaats op een offset van het beeldgebied. Neem het hoge vergrotingsbeeld vanuit het midden van het gat bij een vergroting van 36.000x en bij een belichtingstijd van 7,1 s, 60 frames, een grootte van 1,18 pixels en een onscherpte van 3 μm. Zie representatieve beelden van screening in figuur 5, figuur 6 en figuur 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Goed geassembleerde NCP's (figuur 2) werden gebruikt om een complex te maken met een recombinant fusie-eiwit van MBP-Polβ-APE1 (figuur 3). Om de verhouding van NCP tot MBP-Polβ-APE1 te bepalen om een stabiel complex te vormen, voerden we elektroforetische mobiliteitsverschuivingstests (EMSA) uit (figuur 4), die een afzonderlijk verschoven band van de NCP toonden met 5-voudige molaire overmaat van MBP-Polβ-APE1. Tijdens de optimalisatie van het maken van dit complex was crosslinking met glutaaraldehyde van cruciaal belang om te voorkomen dat het NCP uit elkaar zou vallen. Aanvankelijk werd de assemblage van het complex van NCP-Polβ-APE1 uitgevoerd in een kleiner volume, bij ongeveer 10 μM NCP, met behulp van 0,005% uiteindelijke glutaaraldehydeconcentratie. Onder deze omstandigheden was het monster overdreven verknoopt (figuur 5D-E) en resulteerde het in aggregaten zonder waarneembare individuele complexen. Crosslinking bij ongeveer 10-voudig verdunde NCP's (1,2 μM NCP) resulteerde in aanzienlijk verminderde aggregatie en verbeterde deeltjesstabiliteit (figuur 5A-C). Figuur 6 illustreert dat beide methoden in figuur 1 kunnen worden gecombineerd met de preparatieve gel die de kwaliteit van de NCP's verbetert wanneer het NCP een aanzienlijke hoeveelheid aggregaten met een hoog molecuulgewicht (HMW) bevat (figuur 6A), gevolgd door de zuivering van het complex via grootte-uitsluiting. Hoewel dit een groot succes toonde bij de voorbereiding van het monster (figuur 5B-C) en roosters, wat stabiele deeltjes opleverde (figuur 6D), leverde de suboptimale vorming van het complex (figuur 6A) een 3D-kaart op van het NCP alleen (gegevens niet getoond). Deze resultaten laten zien dat beide methoden (grootte-uitsluiting en preparatieve gel) onafhankelijk kunnen worden gebruikt om stabiele complexen te genereren (figuur 7A-C). Inderdaad, gegevens zijn verzameld van beide rasters en tonen bijna identieke 2D-klassen (figuur 7D) en 3D-kaarten (figuur 7E) met een resolutie van ongeveer 3,2 Å.
Figuur 1: Workflow van de twee methoden die in dit protocol worden gepresenteerd om een NCP-Polβ-APE1-complex te bereiden en in te vriezen via 1) preparatieve gel en 2) uitsluiting van de grootte. Hoewel hier niet weergegeven, kunnen deze methoden worden gecombineerd (figuur 6), beginnend met (1) en het geconcentreerde complex zuiveren van (1) met behulp van een maatkolom. Dit vereist een verdubbeling van het uitgangsmateriaal van NCP's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve NCP-reconstituties. (A) DNA werd getitreerd met toenemende hoeveelheden histonoctameer in verhoudingen van 1:0,9, 1:1,1, 1:1,2, 1:2, DNA:octameer. (B) Dupliceren van grootschalige geassembleerde NCP's (1:2, DNA:octameer). Reconstituties werden geëlektroforeerd in een 6% niet-denaturerende polyacrylamidegel, gevolgd door sybr green I-kleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schematische weergave van genetisch gefuseerde Polβ-APE1 met MBP op de N-terminal. MBP-Polβ-APE1 fusie-eiwit werd enzymatisch gekarakteriseerd voor beide activiteiten (gegevens niet getoond). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: MBP-Polβ-APE1 binding aan NCP's. Nucleosomaal substraat (100 nM) werd geïncubeerd met toenemende hoeveelheden MBP-Polβ-APE1 gedurende 15 minuten op ijs. Gebonden en ongebonden NCP werden gescheiden in een 6% polyacrylamide niet-denaturerende gel, gevolgd door sybr groene I-kleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Analyse van succesvolle en mislukte crosslinking resultaten. Het elutieprofiel van het complex wordt weergegeven in (A) met de piek van interesse gelabeld. Fracties, aangeduid met "F", verzameld uit deze elutie werden geanalyseerd in een 16% tricine polyacrylamide gel en getoond in (B). (C) Het monster van (B) werd ingevroren met behulp van holey carbon support grids en in beeld gebracht met behulp van de 200 kV field emission cryo-transmission elektronenmicroscoop. Overeenkomstige mislukte experimenten worden weergegeven in (D), (E) en (F). Merk op dat deze mislukte experimenten het fusie-eiwit zonder MBP bevatten. HOc en HOD duiden respectievelijk histon octameer geconcentreerd en verdund aan; RT geeft kamertemperatuur aan; "X" komt overeen met crosslinking met glutaaraldehyde. Schaalbalken = 100 nm (C, F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Bereiding van het NCP-Polβ-APE1-complex met behulp van de twee methoden tegelijk. (A) Ongebonden en gebonden (1:1, NCP- Polβ-APE1) werden geanalyseerd in 6% polyacrylamide niet-denaturerende gel (merk op dat bij deze verhouding slechts 50% gebonden is). (B) Elutieprofiel van NCP-Polβ-APE1-complex van een maatkolom. (C) Analyse van geëlueerde fracties in een 16% tricine polyacrylamide gel; fracties werden samengevoegd en geconcentreerd, zoals aangegeven. (D) Het monster werd ingevroren en in beeld gebracht zoals beschreven in figuur 5B. De gegevensverwerking vertoonde geen extra dichtheid die overeenkomt met Polβ-APE1 (niet weergegeven). "X" in de banen 5 en 6 duidt op crosslinking met glutaaraldehyde zoals aangegeven in het protocol. Schaalbalk = 100 nm (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Analyse van het NCP-MBP-Polβ-APE1-complex . (A) Monsters van de verschillende stappen in de in figuur 1 afgebeelde methoden werden geëlektroforeerd in een niet-denaturerende gel van 6% polyacrylamide. Merk op dat complexe formatie reproduceerbaar is door de twee methoden. (B,C) Representatieve raster-koolstofondersteuningsrasterbeelden gemaakt met een 300 kV-transmissie-elektronenmicroscoop, waarbij de rode dozen verschillende oriëntaties van het complex markeren (waarvan sommige overeenkomen met de 2D-klassen weergegeven in (D). (E) Gegevens verwerkt vanaf (C) tonen een 3D-kaart met een resolutie van 3,2 Å van het NCP-MBP-Polβ-APE1-complex.). Schaalbalken = 100 nm (B, C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oligonucleotide naam | Volgorde (5'-->3') | Zuiveringsschaal | Methode van zuivering | Aantal bestelde injectieflacons | ||
| UND complementair onderdeel | TGATGGACCCTATACGCGGCCGCCGCCCTGGAGAAT CCCGGTGCCGAGGCCGCTCAATTGGTCGTAGA CAGCTCTAGCACCGCTTAAACGCACGTACGCGC TGTCCCCCGCGTTTTAACCGCCAAGGGGATTAC TCCCTAGTCTCCAGGCACGTGTCAGATATCAAC ATCCTGTGCATGTATTGAACAGCGACCTTGCCG |
20 nmole | PAGINA gezuiverd | 6 | ||
| 161mer | /5Phos/GATATCTGACACGTGCCTGGAGACTAGG GAGTAATCCCCTTGGCGGTTAAAACGCGGGGG ACAGCGCGTACGTGCGTTTAAGCGGTGCTAGA GCTGTCTACGACCAATTGAGCGGCCTCGGCA CCGGGATTCTCCAGGGCGGCCGCGTATAGGG TCCATCA |
20 nmole | PAGINA gezuiverd | 4 | ||
| 35mer | CGGCAAGGTCGCTGTTCAATACATGCACAGG ATGT |
250 nmole | HPLC | 1 | ||
Tabel 1: DNA-substraat. Drie oligonucleotiden werden gegloeid om het dsDNA-substraat te genereren. De onderstreepte secties zijn 25 bp linker-DNA dat de 147 bp 601 DNA-positioneringssequentie flankeert die een enkele nucleotidekloof bevat.
| Stap | Temperatuur (°C) | Tijd (min)/stap |
| 1 | 95 | 10 |
| 2-5 | 90, 85, 80, 75 | 5 |
| 6-41 | 69 daling met 1 | 3 |
| 42 | 4 | houden |
Tabel 2: Gradiënt van de gloeitemperatuur. Oligo's werden bij deze temperaturen geïncubeerd in een thermocycler om het dsDNA-substraat te genereren.
| Componenten (voorraad) | Volume/hoeveelheid | Eindconcentratie |
| 3m KCl | 167 ml | 0,250 m |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 20 ml | 10 mM |
| 0,5 m EDTA | 4 ml | 1 mM |
| 1 m DTT | 2 ml | 1 mM |
| CHAPS | 2 gr | 1,6 mM |
| QS met dH2O om 2L te maken | ||
Tabel 3: RBlage reconstitutiebuffer. Instructies om 2 L te maken zoals eerder gemeld14, behalve 1,6 mM CHAPS werd toegevoegd.
| Componenten (voorraad) | Volume/hoeveelheid | Eindconcentratie |
| 3m KCl | 267 ml | 2 m |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 4 ml | 10 mM |
| 0,5 m EDTA | 800 μL | 1 mM |
| 1 m DTT | 400 μL | 1 mM |
| CHAPS | 0,4 g | 1,6 mM |
| QS met dH2O om 400 ml te maken | ||
Tabel 4: RBhoge reconstitutiebuffer. Instructies om 400 ml te maken zoals eerder gemeld14, behalve 1,6 mM CHAPS werd toegevoegd.
| Componenten (voorraad) | Volume | Eindconcentratie |
| 3m KCl | 16,7 ml | 50 mM |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 10 ml | 10 mM |
| 0,5 m EDTA | 2 ml | 1 mM |
| 1 m DTT | 1 ml | 1 mM |
| QS met dH2O om 1L te maken | ||
Tabel 5: RB50mM reconstitutiebuffer. Instructies om 1 L reconstitutiebuffer compatibel te maken voor invriezen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een specifiek protocol voor het zuiveren van de DNA-reparatiefactor zal afhankelijk zijn van het enzym van belang. Er zijn echter enkele algemene aanbevelingen, waaronder het gebruik van recombinante methoden voor eiwitexpressie en -zuivering18; als het eiwit van belang te klein is (<50 kDa), was structuurbepaling door cryo-EM tot voor kort bijna onmogelijk door het gebruik van fusiesystemen19, nanobody-bindende steigers20 en het optimaliseren van beeldvormingsstrategieën21.
Het is vrij gebruikelijk om in de beginfase rasters van slechte kwaliteit te verkrijgen. De eerste pogingen om NCP-homogeniteit en stabiliteit te bepalen zonder enige crosslinker, met behulp van uranylacetaat en met koolstof gecoate koperen roosters voor negatieve kleuring, toonden stabiele, mooi gedispergeerde NCP's met minimale aggregatie. Echter, nadat dit monster was verglaasd (bij 20x hogere concentratie) in cryo-EM-roosters, werden er geen deeltjes gedetecteerd. Steekproefoptimalisatie om te voorkomen dat de NCP's uit elkaar vallen of aggregeren was de grootste hindernis. Bovendien worden twee bereidingsmethoden afzonderlijk beschreven; ze sluiten elkaar echter niet uit en kunnen back-to-back worden gebruikt door eerst het NCP te zuiveren via een preparatieve gel, het te complexeren met de reparatiefactor en het complex te zuiveren met een grootte-uitsluitingskolom. Dit vereist twee keer zoveel materiaal voor de eerste stap en het is ook tijdrovender, maar nuttig voor moeilijke monsters (figuur 6).
Het vinden van een startpunt voor de concentratie van crosslinker was moeilijk vanwege het gebrek aan consistentie in methoden van crosslinking en de hoeveelheden crosslinker die door anderen werden gebruikt22,23. Pogingen om de minder gecontroleerde crosslinkingreactie op de door Anderson et al. beschreven benchtop te repliceren, leverden geen positieve resultaten op en het complex was overdreven crosslinked. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de bron van glutaaraldehyde (vers geopende ampul in vergelijking met langdurig opgeslagen glutaaraldehyde). Omdat dit detailniveau vaak wordt weggelaten in niet-methoden, onderzoeksartikelen, is het moeilijk om de exacte omstandigheden als uitgangspunt te repliceren. Optimale resultaten werden verkregen wanneer het complex werd verknoopt met een concentratie van 1,2 μM in 150 mM KCl ionische sterkte in vergelijking met crosslinking van het complex bij 10 μM NCP, bij dezelfde glutaaraldehydeconcentratie van 0,005% gedurende 13 minuten bij kamertemperatuur. De crosslinking-efficiëntie is waarschijnlijk ook afhankelijk van het complex dat wordt gevormd, omdat sommige chromatine-interagerende factoren een grotere destabilisatie kunnen veroorzaken / vereisen, waardoor wordt beïnvloed waar de crosslinking zal optreden en het algehele effect op de NCP-stabiliteit. Daarom, hoewel optimalisatie van deze omstandigheden onvermijdelijk is, zal het vinden van kritieke stappen zoals optimale NCP en zoutconcentratie tijdens de crosslinking-reacties van cruciaal belang zijn.
Een andere belangrijke parameter was de verhouding van NCP:DRF die voldoende moleculen op het rooster opleverde die de DRF bevatten die gebonden is aan de NCP. Inderdaad, deze parameter is ook door anderen geïdentificeerd als een parameter die van cruciaal belang is om te optimaliseren voor structurele studies16 , aangezien zelfs voor cryo-EM homogeniteit van de manier waarop de DRF bindt aan de NCP belangrijk is voor de 3D-kaart. Het niet optimaliseren hiervan kan ongebonden of heterogene, niet-specifieke binding opleveren. Wanneer een molaire verhouding van 1:1 werd gebruikt, die slechts 50% van de NCP opleverde die door de DRF werd gebonden (figuur 6), toonde de 3D-kaart geen extra dichtheid die overeenkomt met de DRF. Daarom is het belangrijk om de verhouding te bepalen die een enkele band op dezelfde locatie op een EMSA oplevert en een enkele piek op het chromatogram van een maatkolom toont, overeenkomend met het complex. Verschillende parameters voor het bevriezen van de roosters, waaronder de vlektijd, voegden verschillende optimalisatierondes toe.
Alles bij elkaar geeft dit protocol voor het eerst gedetailleerde instructies over twee verschillende methoden om nucleosomale complexen voor te bereiden op cryo-EM structurele bepaling. De basisparameters voor de verstrekte netvoorbereiding kunnen als uitgangspunt worden gebruikt. En hoewel geen enkele methode even goed werkt voor alle macromoleculaire complexen, zal de focus op het optimaliseren van de parameters die in dit protocol worden beschreven, de strategie voor op maat gemaakte optimalisatie van andere nucleosomale complexen beperken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We bedanken Dr. Mario Borgnia van de cryo-EM-kern van het National Institute of Environmental Health Sciences en Dr. Joshua Strauss van de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill voor hun mentorschap en training in de cryo-EM-netwerkvoorbereiding. We danken ook Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende voor de technische assistentie in de beginfase van dit project. We waarderen de belangrijke bijdrage en steun van wijlen Dr. Samuel H. Wilson en zijn laboratoriumleden, in het bijzonder Dr. Rajendra Prasad en Dr. Joonas Jamsen voor de zuivering van het genetisch gefuseerde APE1-Polβ-complex. Onderzoek is ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van de National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [subsidienummers Z01ES050158, Z01ES050159 en K99ES031662-01].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640--6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S.
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. Guide to Protein Purification. 463, Academic Press. (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
