Summary
이 프로토콜은 TEM 그리드 동결을 위한 두 가지 샘플 준비 방법을 사용하여 뉴클레오솜 복합체의 준비를 자세히 설명합니다.
Abstract
염색질의 맥락에서 DNA 복구는 잘 알려져 있지 않습니다. 염색질의 기본 반복 단위인 뉴클레오솜 코어 입자를 사용한 생화학적 연구에 따르면 대부분의 DNA 복구 효소는 유리 DNA에 비해 감소된 속도로 DNA 손상을 제거합니다. 염기 절제 복구(BER) 효소가 뉴클레오솜에서 DNA 손상을 인식하고 제거하는 방법에 대한 분자적 세부 사항은 밝혀지지 않았습니다. 그러나 뉴클레오솜 기질의 생화학적 BER 데이터는 뉴클레오솜이 DNA 병변의 위치와 효소에 따라 다른 구조적 장벽을 제시함을 시사합니다. 이것은 유리 DNA에서 DNA 손상을 제거하기 위해 이러한 효소가 사용하는 메커니즘이 뉴클레오솜에 사용되는 메커니즘과 다를 수 있음을 나타냅니다. 대부분의 게놈 DNA가 뉴클레오솜으로 조립된다는 점을 감안할 때 이러한 복합체의 구조적 정보가 필요합니다. 현재까지 과학계는 이러한 복합체에 대해 기술적으로 실현 가능한 구조 연구를 수행하기위한 상세한 프로토콜이 부족합니다. 여기에서는 초저온 전자 현미경(Cryo-EM) 구조 결정을 위해 뉴클레오솜의 입구-출구 근처의 단일 뉴클레오티드 갭에 결합된 두 개의 유전적으로 융합된 BER 효소(중합효소 β 및 AP 엔도뉴클레아제1)의 복합체를 제조하는 두 가지 방법을 제공합니다. 두 가지 시료 전처리 방법 모두 플런지 냉동을 통해 품질 그리드를 유리화하는 데 적합합니다. 이 프로토콜은 다른 BER 인자, 선구자 전사 인자 및 염색질 변형 효소를 가진 다른 뉴클레오솜 복합체를 준비하기 위한 출발점으로 사용할 수 있습니다.
Introduction
진핵 생물 DNA는 히스톤 단백질에 의해 조직되고 압축되어 염색질을 형성합니다. 뉴클레오솜 코어 입자(NCP)는 DNA 복구, 전사 및 복제를 위한 DNA 결합 단백질에 대한 접근성을 조절하는 염색질의 기본 반복 단위를 구성합니다1. NCP의 첫 번째 X선 결정 구조가 20여 년 전에 처음 해결되었지만2 3,4,5,6 이후 NCP의 더 많은 구조가 발표되었지만 뉴클레오솜 기질의 DNA 복구 메커니즘은 아직 설명되지 않았습니다. 염색질에서 DNA 복구의 기본 분자 세부 사항을 밝히려면 NCP의 국소 구조적 특징이 DNA 복구 활동을 조절하는 방법을 이해하기 위해 참여 구성 요소의 구조적 특성화가 필요합니다. 이것은 BER 효소를 사용한 생화학적 연구가 촉매 작용에 대한 효소 특이적 구조 요구 사항 및 뉴클레오솜 내 DNA 병변의 구조적 위치에 의존하는 뉴클레오솜의 고유한 DNA 복구 메커니즘을 제안한다는 점을 감안할 때 염기 절제 복구(BER)의 맥락에서 특히 중요합니다 7,8,9,10,11,12,13 . BER이 중요한 DNA 복구 과정이라는 점을 감안할 때, 이러한 격차를 메우는 동시에 관련 뉴클레오솜 복합체와 관련된 기술적으로 실현 가능한 다른 구조 연구를 수행할 수 있는 출발점을 설정하는 데 상당한 관심이 있습니다.
Cryo-EM은 균질 시료의 대규모 전처리가 어려운 복합체의 3차원 (3D) 구조를 해결하기 위한 방법으로 빠르게 자리잡고 있습니다. DNA 복구 인자(NCP-DRF)와 복합체를 이루는 NCP의 설계 및 정제에는 맞춤형 최적화가 필요할 수 있지만, 안정적인 NCP-DRF 복합체를 생성 및 동결하기 위해 여기에 제시된 절차는 시료 및 Cryo-EM 그리드 준비를 최적화하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 그림 1에 표시된 두 개의 워크플로(상호 배타적이지 않음)와 프로토콜의 특정 세부 정보는 중요한 단계를 식별하고 이러한 단계를 최적화하기 위한 전략을 제공합니다. 이 연구는 뉴클레오솜 DNA 복구의 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 생화학적과 구조적 연구를 보완하는 것이 기술적으로 실현 가능한 방향으로 염색질 및 DNA 복구 분야를 추진할 것입니다.
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Protocol
1. 염 투석을 통해 뉴클레오솜 코어 입자 조립
참고: 구조 연구를 위해 재조합 히스톤 단백질을 사용하는 뉴클레오솜 코어 입자의 제조는 다른 사람들에 의해 광범위하게 상세히 기술되었다14,15,16. 다른14,15에 의해 기술된 재조합 X. laevis 히스톤 및 히스톤 옥타머 조립체의 정제를 따르고, 아래에 기술된 바와 같이 뉴클레오솜 기질을 조립한다.
- 표시된 척도로 3 개의 올리고 뉴클레오티드 ( 표 1에 나열됨)를 구입하십시오 : UND-197mer, 161mer, 35mer.
- PAGE는 설명된 대로 울트라머(197mer 및 161mer)를17로 정제합니다.
- 1x 어닐링 완충액(10mM Tris-Cl, pH 8.0, 50mM NaCl) 중 올리고뉴클레오티드의 등몰량을 어닐링합니다. 예를 들어, 40 μL의 161-mer [166.7 μM]; 8μL의 35-mer[292.4μM]; 16.8μL의 197-mer comp 가닥[408.2μM]; 10 μL의 10x 어닐링 완충액 및 10.9 μL의dH2O.
알림: 온도 구배로 어닐링 반응을 제어하는 것이 중요합니다. 온도 구배에 대한 자세한 내용은 표 2 를 참조하십시오.
- 1x 어닐링 완충액(10mM Tris-Cl, pH 8.0, 50mM NaCl) 중 올리고뉴클레오티드의 등몰량을 어닐링합니다. 예를 들어, 40 μL의 161-mer [166.7 μM]; 8μL의 35-mer[292.4μM]; 16.8μL의 197-mer comp 가닥[408.2μM]; 10 μL의 10x 어닐링 완충액 및 10.9 μL의dH2O.
- PAGE는 설명된 대로 울트라머(197mer 및 161mer)를17로 정제합니다.
- DNA와 히스톤 옥타머의 비율을 결정하기 위해 소규모 재구성(50μL의 최종 부피에 대해 아래 표시된 예의 1/57 계수로 스케일)을 수행합니다(DNA:옥타머의 일반적인 시작 비율은 다음과 같습니다: 1:0.9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2, 그림 2A에 표시됨). 소규모 재구성을 통해 이 비율을 경험적으로 결정하는 것이 중요합니다.
- 이 비율이 결정되면 대규모 재구성을 준비하십시오. 예를 들어, 32.9μL의 DNA-197bp[99.4μM]를 혼합합니다. 1647.1 μL의 TE(1x); 1120μL의 5M NaCl 및 62.3μL의 WT 히스톤 옥타머[2.56μM].
- 투석 완충액 만들기: 표 3 및 표 4에 각각 기재된 바와 같이 RB낮음 및 RB높음; 앞서 설명한 대로 재구성을 설정합니다14.
- 투석 튜브를 RBhigh가 들어 있는 비커로 옮기고 16시간 동안 또는 2L RBlow 가 폐 비커로 옮겨질 때까지 부드럽게 저으면서 투석을 진행합니다.
- 투석 튜브를 RB50mM 완충액(표 5)이 들어 있는 1L 비커로 옮기고 샘플을 최소 3시간 또는 하룻밤 동안 투석합니다.
- 6% 폴리아크릴아미드 비변성 겔에서 재구성 효율을 평가하여 10% 미만의 유리 DNA와 단일 NCP 밴드가 있는지 확인합니다. NCP를 4°C에서 보관하십시오. 그림 2A (레인 5) 및 그림 2B 를 참조하여 최적의 재구성 결과를 확인하십시오.
2. NCP-DNA 복구 인자 복합체(NCP-DRF) 준비
- 분취용 겔 전기영동에 의한 정제
참고: 이 방법은 가장 노동 집약적이며(설명된 두 가지 방법 중) 고분자량(HMW) 종을 제거하는 데 효과적이지만(그림 6A) 희석 계수가 높기 때문에 그림과 같이 약간의 분해가 발생할 수 있습니다. 그림 7A (NCP prep cell out lane), DNA 방출. 그러나 최대 25%의 유리 DNA는 여전히 Cryo-EM 연구와 호환됩니다. 희석률이 높기 때문에 이 방법을 사용하여 전체 복합체가 아닌 NCP만 정제하십시오.- 폴리아크릴아미드 겔 용액 37.5:1, 아크릴아미드:비스아크릴아미드를 사용하여 0.2x TBE에 6% 비변성 폴리아크릴아미드 겔 용액 70mL를 준비합니다. 바깥 쪽 반경이 28mm 인 원통형 겔을 붓고 밤새 중합합니다.
- 6-8 kDa MW 컷오프가있는 투석 멤브레인을 사용하여 분취 젤 실행 장치를 조립합니다. 실행 완충액으로 0.25x TBE와 1x 용출 완충액(50mM KCl, 10mM HEPES, pH 7.5)을 사용합니다. 원통형 젤을 일정한 12W에서 1시간 동안 사전 실행하고 약 1mL/분의 유속으로 연동 펌프를 작동시켜 분획을 수집합니다.
참고: UV 검출기를 사용하여 DNA를 포함하는 분획을 식별할 수 없는 경우 32P-NCP를 사용한 스크리닝 실험을 수행하여 관심 분획을 식별할 수 있습니다. 모든 조건을 동일하게 유지하면 UV 검출기 없이 표지되지 않은 NCP를 정제할 수 있습니다. - 원심 필터(MW 컷오프 30 kDa)를 사용하여 250 μL의 NCP 2.8 mL를 농축하고, 분취용 겔 상에 로딩하고 총 6시간 동안 전기영동을 가한다. 2시간에서 자일렌 시아놀의 겔이 소진되면 1.5mL 분획 수집을 시작합니다.
참고: 2.5시간에서 분획은 크실렌 시안올이 제거됩니다. DNA(197mer)는 약 3-3.5 h에서 용리되고, NCP는 4.5-5 h 표시에서 용리될 것으로 예상됩니다. - 6% 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 관심 분획을 분석합니다. NCP를 함유하는 분획을 풀링하고, 즉시 1 mg/mL의 원심 필터(MW 컷오프 30 kDa)로 농축한다. 다음날, 관심 있는 DNA 복구 인자(DRF)와 복합체화하기 전에 6% 폴리아크릴아미드 비변성 겔에서 NCP의 품질을 평가합니다.
- 특정 복합체에 대한 최적의 완충액을 사용하여 15분 동안 얼음 위에서 관심 있는 NCP와 DRF를 배양합니다. 예를 들어, 1,000μL의 NCP[1.2μM]를 혼합합니다. 260 μL의 5x 결합 완충액 (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2),22 μL의 3 M KCl, 및 18 μL의 MBP-Pol β-APE1 [338 μM].
참고: 복합체가 만들어지는 온도와 이온 강도는 다른 복합체에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. - 글루타르알데히드(갓 개봉한 것; EM grade)를 최종 농도 0.005%로 한다. 따라서이 반응에 26.8 μL의 0.25 % 글루 타르 알데히드와 13.2 μL의 dH2O를 첨가하고 잘 혼합하고 실온에서 13 분 동안 배양한다.
- 1M Tris-Cl, pH 7.5로 최종 농도 20mM Tris-Cl, pH 7.5로 급냉합니다. ~50μL로 농축하고 완충액을 탈염 컬럼을 사용하여 1x 동결 완충액(50mM KCl, 10mM HEPES, pH 7.5)으로 교환합니다.
주의: 글루타르알데히드는 심각한 피부 화상과 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 삼키면 해롭고 흡입하면 유독합니다. 실험복, 고글, 장갑을 착용하고 흄 후드에 글루타르알데히드를 처리하고 마스크를 착용하십시오.
참고: 이 낮은 농도의 NCP를 사용하여 대량으로 가교 반응을 수행하는 것이 중요합니다. 이러한 농도의 글루타르알데히드에서도 10배 더 높은 농도의 NCP에서 가교결합을 시도한 이전의 시도는 SDS PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 표시된 바와 같이 샘플의 응집 및 과잉 가교를 초래했습니다. 이 그리드에는 덩어리만 있는 식별 가능한 입자가 없었습니다(그림 5D, E). - OD280 및 OD 260에서 흡광도를 결정하고 OD280을 기준으로 1.3-3 mg / mL에 도달하기 위해 필요한 경우 추가로 농축합니다 (OD260 / OD 280 = 1.7-2는 좋은 입자를 산출합니다). 50μL의 이 작은 부피의 경우 샘플 손실을 줄이는 가장 좋은 방법은 투석 멤브레인(6-8kDa MW 컷오프)으로 덮인 1.7mL 튜브 뚜껑이 있는 투석 버튼을 만들고 튜브 바닥을 절단하고 튜브 테두리를 사용하여 멤브레인을 뚜껑 상단의 밀봉하는 것입니다.
- 멤브레인이 아래를 향하도록 하여 s가 들어 있는 투석 버튼을 폴리에틸렌 글리콜 베드 위에 놓습니다(2분마다 진행 상황 확인). 이 방법은 농축기에서 샘플이 희석되거나 손실되는 것을 방지하기 위해 필요한 농도가 2.5배 이하인 경우에 선호됩니다. 이 단계 후에 복합체의 Cryo-EM 그리드를 즉시 준비하는 것이 중요합니다.
- 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제
- 동결 전날, 크기 배제 컬럼을 60mL의dH2O로 세척하고 평형화한 다음, 80mL의 동결 완충액(50mM KCl, 10mM HEPES, pH 8)을 0.4mL/분의 속도로 밤새 평형화합니다. 재구성 직후 NCP를 사용하여 다음과 같이 2.5배 더 많은 양을 사용하여 동일한 복합체를 준비합니다: 2,500μL의 NCP[1.2μM]를 혼합합니다. 650 μL의 5x 결합 완충액; 45μL의 MBP-Pol β-APE1[338μM] 및 55μL의 3M KCl.
- 가교제 없이 얼음 위에서 15분 동안 혼합물을 배양합니다. 그런 다음 제조용 겔 방법에 설명된 대로 글루타르알데히드를 최종 농도 0.005%로 첨가합니다. 그러나 이 경우 복합체를 약 120 μL로 사전 평형화된(동결 완충액 포함) 원심 필터에 농축합니다.
- 피크 분획을 즉시 분석하고 이전에 표시된 대로 히스톤 및 MBP-Pol β-APE1을 포함하는 분획을 농축합니다. 크기 제외 방법을 사용한 성공적인 결과는 그림 5A, B, C 를 참조하고 두 방법을 모두 사용한 그림 7을 참조하십시오.
3. 뉴클레오솜 복합체 동결
- 플런지 냉동고를 켜고 가습기에 50 mL의 dH2O를 채운 후, 챔버 온도를22°C로 설정하고,HR (습도)을 98%로 설정한다. 에탄 컵과 액체 질소 컵(라벨이 붙은 그리드 상자 포함)을 각각의 공간 홀더에 놓습니다.
- 에탄 뚜껑 디스펜서로 에탄 컵을 덮고 그 위에 액체 질소(LN2)를 조심스럽게 붓고 LN 2 컵에 LN2를 채웁니다. LN2 레벨이 안정화되고 100%에 도달하고 온도가 -180°C에 도달하면 에탄 밸브를 조심스럽게 열고 투명한 뚜껑에 기포가 형성될 때까지 에탄 컵을 채웁니다. 에탄 디스펜서를 제거합니다.
- 두 개의 여과지를 블로팅 장치에 놓고 금속 링으로 고정합니다. 설정으로 이동하여 블로팅을 위해 다음 매개변수를 사용합니다: 0 사전 블롯, 3 s 블롯, 0 포스트 블롯; A-plunge 를 선택하고 OK를 클릭합니다.
- 메인 화면에서 Load Forceps를 클릭하고 탄소/도포 면이 왼쪽을 향하도록 그리드를 로드합니다(이전과 같이 준비). 단단한 얼룩을 보장하기 위해 Z축을 조정하는 집게를 보정합니다. Lower Chamber 를 클릭하고 3 μL의 복합체(1.3-3 mg/mL; OD280)을 참조하십시오. Blot/A-plunge를 클릭합니다. 이렇게 하면 그리드가 회전하여 전면에서 얼룩이 생기고 급락하여 고정됩니다.
- 그리드를 LN2 챔버의 그리드 박스에 옮겨 보관한다. 4개의 그리드가 모두 고정되어 그리드 상자에 배치되면 모든 그리드가 뚜껑으로 덮인 중립 위치로 뚜껑을 돌리고 나사를 조입니다. 그리드는 스크리닝이 개시될 때까지LN2 에 저장될 수 있다.
4. 스크린 그리드
- 현미경에 샘플을 로드하기 전에 유리화된 그리드를 링에 놓고 C-클립을 사용하여 고정합니다. 얼음 오염을 방지하기 위해 습도가 조절되는 방의 LN2 에서 이 클리핑 프로세스를 수행하십시오.
- 현미경을 로드할 때 그리드를 12슬롯 카세트에 삽입합니다. 카세트를 나노캡 캡슐에 싣고 오토로더에 싣습니다. 오토로더 로봇 메커니즘이 프로세스를 시작합니다.
- 그리드를 카세트에서 현미경으로 옮깁니다.tage. s를 조정하십시오tage를 10° 흔들어 유센트릭 높이로 조정하고 이미지에서 최소한의 평면 이동이 관찰될 때까지 Z 높이를 동시에 이동합니다.
- 유센트릭 높이에 도달하면 이미징을 시작합니다. 먼저, 그리드의 3 x 3 몽타주 이미지를 촬영하여 아틀라스를 얻으며, 각 몽타주는 62x 배율로 촬영됩니다. 다양한 크기의 세 개의 사각형을 선택하십시오. Eucentric 높이를 취한 다음 210x 배율로 이미지를 만듭니다.
- 정사각형이 이미지화되면 정사각형 내의 가장자리, 중앙 및 그 사이에서 각각 하나의 구멍을 선택합니다. 각 구멍을 2600x 배율로 이미지화합니다.
- 이 고배율 이미지를 촬영하기 전에 이미징 영역의 오프셋에서 자동 초점이 발생합니다. 36,000x 배율과 7.1초의 노출 시간, 60프레임, 1.18픽셀 크기 및 3μm 디포커스로 구멍 중앙에서 고배율 이미지를 촬영합니다. 그림 5, 그림 6 및 그림 7에서 스크리닝의 대표 이미지를 참조하십시오.
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Representative Results
적절하게 조립된 NCP(그림 2)를 사용하여 MBP-Polβ-APE1의 재조합 융합 단백질과 복합체를 만들었습니다(그림 3). 안정적인 복합체를 형성하기 위해 MBP-Polβ-APE1에 대한 NCP의 비율을 결정하기 위해 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA)을 수행했으며(그림 4), MBP-Polβ-APE1의 5배 몰 초과로 NCP의 단일 이동 밴드를 보여주었습니다. 이 복합체를 만드는 최적화하는 동안 글루타르알데히드와의 가교결합은 NCP가 분리되는 것을 방지하는 데 중요했습니다. 초기에, NCP-Polβ-APE1의 복합체의 조립은 0.005% 최종 글루타르알데히드 농도를 사용하여 약 10μM NCP에서 더 작은 부피로 수행되었다. 이러한 조건 하에서, 샘플은 과도하게 가교되었고(그림 5D-E) 식별 가능한 개별 복합체가 없는 응집체가 생성되었습니다. 약 10배 희석된 NCP(1.2μM NCP)에서 가교결합은 응집을 현저히 감소시키고 입자 안정성을 개선했습니다(그림 5A-C). 그림 6은 NCP가 상당한 양의 고분자량(HMW) 응집체를 포함할 때(그림 6A) 분취용 겔과 결합하여 NCP의 품질을 개선할 수 있으며, 그 후 크기 배제를 통해 복합체를 정제할 수 있음을 보여줍니다. 이것은 샘플(그림 5B-C) 및 그리드의 준비에서 큰 성공을 보였고 안정적인 입자를 생성했지만(그림 6D), 복합체의 최적이 아닌 형성(그림 6A)은 NCP 단독의 3D 맵을 생성했습니다(데이터는 표시되지 않음). 이러한 결과는 두 가지 방법(크기 배제 및 분취용 겔)을 독립적으로 사용하여 안정적인 복합체를 생성할 수 있음을 보여줍니다(그림 7A-C). 실제로 데이터는 두 그리드에서 수집되었으며 약 3.2Å 해상도에서 거의 동일한 2D 클래스(그림 7D) 및 3D 맵(그림 7E)을 보여줍니다.
그림 1: 1) 분취 젤 및 2) 크기 배제를 통해 NCP-Polβ-APE1 복합체를 준비하고 동결하기 위해 이 프로토콜에 제시된 두 가지 방법의 워크플로. 여기에 도시되지는 않았지만, 이러한 방법은 (1)부터 시작하여 사이징 컬럼을 사용하여 (1)에서 농축된 복합체를 정제하는 것(그림 6)을 결합할 수 있습니다. 이를 위해서는 NCP의 출발 물질을 두 배로 늘려야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 대표적인 NCP 재구성. (A) DNA는 1:0.9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2, DNA:옥타머의 비율로 히스톤 옥타머의 양이 증가함에 따라 적정되었습니다. (B) 복제된 대규모 조립 NCP(1:2, DNA:octamer). 재구성을 6% 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 후, sybr green I 염색하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유전적으로 융합된 Polβ-APE1과 N-말단에 MBP가 있는 개략도. MBP-Polβ-APE1 융합 단백질은 두 활성 모두에 대해 효소적으로 특성화되었다 (데이터는 나타내지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: NCP에 대한 MBP-Polβ-APE1 결합. 뉴클레오솜 기질(100nM)을 얼음 위에서 15분 동안 증가하는 양의 MBP-Polβ-APE1과 함께 배양했습니다. 결합된 NCP와 결합되지 않은 NCP를 6% 폴리아크릴아미드 비변성 겔에서 분리한 후 sybr green I 염색했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 가교 성공 및 실패 결과 분석. 복합체의 용출 프로파일은 관심 피크가 표시된 (A)에 나와 있습니다. 이 용출로부터 수집된 "F"로 표시된 분획을 16% 트리신 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하고, (B)에 나타내었다. (C) (B)로부터의 샘플을 구멍이 뚫린 탄소 지지 그리드를 사용하여 동결시키고, 200 kV 전계 방출 극저온 투과 전자 현미경을 사용하여 이미지화하였다. 대응하는 실패한 실험은 (D), (E) 및 (F)에 도시되어 있다. 이러한 실패한 실험에는 MBP가 없는 융합 단백질이 포함되어 있습니다. HOc 및HOD 는 각각 농축 및 희석된 히스톤 옥타머를 나타내고; RT는 실온을 나타냅니다. "X"는 글루타르알데히드와의 가교결합에 해당한다. 스케일 바 = 100nm(C, F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 두 가지 방법을 동시에 사용한 NCP-Polβ-APE1 복합체의 제조. (A) 결합되지 않은 및 결합된(1:1, NCP-Polβ-APE1) 6% 폴리아크릴아미드 비변성 겔에서 분석되었다(이 비율에서는 50%만이 결합됨). (B) 사이징 컬럼에서 NCP-Polβ-APE1 복합체의 용출 프로파일. (c) 16% 트리신 폴리아크릴아미드 겔에서 용출된 분획의 분석; 표시된 대로 분획을 합산하고 농축했습니다. (D) 샘플을 동결시키고, 도 5B에 기재된 바와 같이 이미지화하였다. 데이터 처리는 Polβ-APE1에 상응하는 추가적인 밀도를 나타내지 않았다 (도시되지 않음). 레인 5 및 6의 "X"는 프로토콜에 표시된 바와 같이 글루타르알데히드로 가교결합을 나타낸다. 스케일 바 = 100nm(D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: NCP-MBP-Polβ-APE1 복합체 분석. (A) 그림 1에 예시된 방법의 상이한 단계로부터의 샘플을 6% 폴리아크릴아미드 비변성 겔에서 전기영동하였다. 복잡한 형성은 두 가지 방법으로 재현할 수 있습니다. (나,씨) 300kV 투과 전자 현미경을 사용하여 촬영한 대표적인 그리드 구멍이 뚫린 탄소 지지 그리드 이미지로, 빨간색 상자는 복합체의 다양한 방향을 강조 표시합니다(일부는 (D)에 표시된 2D 클래스에 해당). (E) (C)로부터 처리된 데이터는 NCP-MBP-Polβ-APE1 복합체의 3.2 Å 해상도에서 3D 지도를 보여준다.) 스케일 바 = 100nm(B, C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 올리고뉴클레오티드 이름 | 시퀀스 (5'-->3') | 정화 규모 | purificaiton의 방법 | 주문한 바이알 수 | ||
| UND 상보적 가닥 | TGATGGACCCTATACGCGGCCGCCCTGGAGAAT CCCGGTGCCGAGGCCGCTCAATTGGTCGTAGA CAGCTCTAGCACCGCTTAAACGCACGTACGCGC TGTCCCCCGCGTTTTAACCGCCAAGGGGATTAC TCCCTAGTCTCCAGGCACGTGTCAGATATCAAC ATCCTGTGCATGTATTGAACAGCGACCTTGCCG |
20n몰 | PAGE 정제 | 6 | ||
| 161머 | /5Phos/GATATCTGACACGTGCCTGGAGACTAGG GAGTAATCCCCTTGGCGGTTAAAACGCGGGGG ACAGCGCGTACGTGCGTTTAAGCGGTGCTAGA GCTGTCTACGACCAATTGAGCGGCCTCGGCA CCGGGATTCTCCAGGGCGGCCGCGTATAGGG TCCATCA (티캣카) |
20n몰 | PAGE 정제 | 4 | ||
| 35머 | CGGCAAGGTCGCTGTTCAATACATGCACAGG 증권 시세 표시기 |
250n몰 | HPLC (액수) | 1 | ||
표 1: DNA 기질. 3개의 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 dsDNA 기질을 생성하였다. 밑줄이 그어진 섹션은 단일 뉴클레오티드 갭을 포함하는 147 bp 601 DNA 위치 결정 서열 옆에 있는 25bp의 링커 DNA입니다.
| 걸음 | 온도(°C) | 시간(분)/스텝 |
| 1 | 95 | 10 |
| 2-5 | 90, 85, 80, 75 | 5 |
| 6-41 | 69 1 감소 | 3 |
| 42 | 4 | 들다 |
표 2: 어닐링 온도 구배. 올리고를 이러한 온도에서 열순환기에서 인큐베이션하여 dsDNA 기질을 생성하였다.
| 구성품(재고) | 볼륨/금액 | 최종 농도 |
| 3M 케이씨엘 | 167 mL의 | 0.250 미터 |
| 1M 헤페스, pH 8.0 | 20 밀리리터 | 10 밀리엠 |
| 0.5 M EDTA | 4 밀리리터 | 1 밀리엠 |
| 1 M DTT | 2 밀리리터 | 1 밀리엠 |
| 챕 스 | 2 그램 | 1.6 밀리엠 |
| 2L을 만들기 위해 dH2O를 가진 QS | ||
표 3: RB낮은 재구성 버퍼. 14 mM CHAPS를 제외하고는 이전에 보고된바와 같이 2 L를 만드는 지시가 추가되었다.
| 구성품(재고) | 볼륨/금액 | 최종 농도 |
| 3M 케이씨엘 | 267 mL의 | 2 미터 |
| 1M 헤페스, pH 8.0 | 4 밀리리터 | 10 밀리엠 |
| 0.5 M EDTA | 800 μL | 1 밀리엠 |
| 1 M DTT | 400 μL | 1 밀리엠 |
| 챕 스 | 0.4 그램 | 1.6 밀리엠 |
| QS와dH2O로 400 mL 만들기 | ||
표 4: RB고재구성 완충액. 14 mM CHAPS를 제외하고는 이전에 보고된 바와 같이 400 mL를 만들기 위한 지시가 첨가되었다.
| 구성품(재고) | 음량 | 최종 농도 |
| 3M 케이씨엘 | 16.7 mL의 | 50 밀리엠 |
| 1M 헤페스, pH 8.0 | 10 mL | 10 밀리엠 |
| 0.5 M EDTA | 2 밀리리터 | 1 밀리엠 |
| 1 M DTT | 1 mL | 1 밀리엠 |
| 1L을 만들기 위해 dH2O를 가진 QS | ||
표 5: RB50mM 재구성 완충액. 1L의 재구성 버퍼를 동결에 사용할 수 있도록 하는 지침.
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Discussion
DNA 복구 인자를 정제하기 위한 특정 프로토콜은 관심 효소에 따라 달라집니다. 그러나, 단백질 발현 및 정제를 위한 재조합 방법의 사용을 포함하여 몇 가지 일반적인 권장 사항이 있다18; 관심 단백질이 너무 작으면(<50kDa), Cryo-EM에 의한 구조 결정은 융합 시스템(19), 나노바디 결합 스캐폴드(nanobody-binding scaffolds)20 및 이미징 전략최적화(21)를 사용하여 최근까지 거의 불가능했습니다.
초기 단계에서 품질이 좋지 않은 그리드를 얻는 것은 매우 일반적입니다. 음성 염색을 위해 우라닐 아세테이트 및 탄소 코팅 구리 그리드를 사용하여 가교제 없이 NCP 균질성 및 안정성을 결정하려는 초기 시도는 최소한의 응집으로 안정적이고 잘 분산된 NCP를 보여주었습니다. 그러나 이 샘플이 Cryo-EM 그리드에서 유리화되면(20배 더 높은 농도로) 입자가 검출되지 않았습니다. NCP가 분리되거나 응집되는 것을 방지하기 위한 샘플 최적화가 가장 큰 장애물이었습니다. 추가로, 두 가지 제조 방법이 별도로 설명된다; 그러나 상호 배타적이지 않으며 먼저 분취용 젤을 통해 NCP를 정제하고, 복구 인자와 복합체를 합성하고, 크기 배제 컬럼으로 복합체를 정제하여 연속적으로 사용할 수 있습니다. 이를 위해서는 초기 단계에 두 배의 재료가 필요하고 시간이 더 많이 걸리지만 까다로운 샘플에 유용합니다(그림 6).
가교제의 농도에 대한 출발점을 찾는 것은 가교 방법의 일관성 부족과 다른 사람들이 사용하는 가교제의 양으로 인해 어려웠다22,23. Anderson et al.에 의해 기술된 벤치 탑에서 덜 제어된 가교 반응을 복제하려는 시도는 긍정적인 결과를 제공하지 못했고, 복합체는 지나치게 가교되었다. 이것은 글루타르알데히드(장기간 보관된 글루타르알데히드에 비해 갓 열린 앰플)의 공급원 때문일 수 있습니다. 이 수준의 세부 사항은 비방법, 연구 논문에서 생략되는 경우가 많기 때문에 정확한 조건을 시작점으로 복제하기가 어렵습니다. 복합체를 150 mM KCl 이온 세기에서 1.2 μM의 농도로 가교시킨 경우와 비교하여, 동일한 글루타르알데히드 농도 0.005%에서 실온에서 13분 동안 가교하였을 때 최적의 결과를 얻었다. 가교 효율은 또한 일부 염색질 상호 작용 인자가 가교가 발생하는 위치와 NCP 안정성에 대한 전반적인 영향에 영향을 미치는 더 큰 불안정화를 유도/요구할 수 있기 때문에 형성되는 복합체에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서 이러한 조건의 최적화는 불가피하지만 가교 반응 중 최적의 NCP 및 염 농도와 같은 중요한 단계를 찾는 것이 중요합니다.
또 다른 중요한 매개변수는 NCP에 결합된 DRF를 포함하는 그리드에서 충분한 분자를 생성하는 NCP:DRF의 비율이었습니다. 실제로, 이 파라미터는 DRF가 NCP에 결합하는 방식의 Cryo-EM 균질성의 경우에도 3D 맵에서 중요하다는 점을 감안할 때 구조 연구16 에 최적화하는 데 중요한 파라미터로 다른 사람들에 의해 확인되었습니다. 이를 최적화하지 않으면 결합되지 않거나 이질적이며 비특이적인 결합이 생성될 수 있습니다. 1:1 몰비를 사용하여 DRF에 의해 결합된 NCP가 50%만 생성되었을 때(그림 6) 3D 맵에는 DRF에 해당하는 추가 밀도가 표시되지 않았습니다. 따라서 EMSA의 동일한 위치에서 단일 밴드를 생성하고 복합체에 해당하는 사이징 컬럼의 크로마토그램에 단일 피크를 표시하는 비율을 결정하는 것이 중요합니다. 블롯 시간을 포함하여 그리드 동결을 위한 몇 가지 매개변수는 여러 차례의 최적화를 추가했습니다.
종합하면, 이 프로토콜은 Cryo-EM 구조 측정을 위한 뉴클레오솜 복합체를 준비하는 두 가지 다른 방법에 대한 자세한 지침을 처음으로 제공합니다. 제공된 그리드 준비에 대한 기준 매개 변수를 시작점으로 사용할 수 있습니다. 그리고 단일 방법이 모든 거대분자 복합체에 대해 똑같이 잘 작동하는 것은 아니지만, 이 프로토콜에 설명된 매개변수를 최적화하는 데 초점을 맞추면 다른 뉴클레오솜 복합체의 맞춤형 최적화를 위한 전략의 범위를 좁힐 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
미국 국립환경보건과학연구소(National Institute of Environmental Health Sciences)의 Cryo-EM 코어의 Mario Borgnia 박사와 채플힐에 있는 노스캐롤라이나 대학교(University of North Carolina at Chapel Hill)의 Joshua Strauss 박사에게 Cryo-EM 그리드 준비에 대한 멘토링과 교육에 감사드립니다. 또한 이 프로젝트의 초기 단계에서 기술 지원을 해주신 Juliana Mello Da Fonseca Rezende 박사에게도 감사드립니다. 우리는 고(故) Samuel H. Wilson 박사와 그의 연구실 구성원, 특히 유전적으로 융합된 APE1-Polβ 복합체의 정제를 위해 Dr. Rajendra Prasad와 Dr. Joonas Jamsen의 주요 공헌과 지원에 감사드립니다. 연구는 국립 보건원, 국립 환경 보건 과학 연구소의 교내 연구 프로그램[보조금 번호 Z01ES050158, Z01ES050159 및 K99ES031662-01]의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640--6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S.
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. Guide to Protein Purification. 463, Academic Press. (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
