Summary
Ce protocole décrit en détail la préparation des complexes nucléosomiques à l’aide de deux méthodes de préparation des échantillons pour la congélation des grilles TEM.
Abstract
La réparation de l’ADN dans le contexte de la chromatine est mal comprise. Des études biochimiques utilisant des particules de noyau de nucléosome, l’unité répétitive fondamentale de la chromatine, montrent que la plupart des enzymes de réparation de l’ADN éliminent les dommages à l’ADN à des taux réduits par rapport à l’ADN libre. Les détails moléculaires sur la façon dont les enzymes de réparation par excision de base (BER) reconnaissent et éliminent les dommages à l’ADN dans les nucléosomes n’ont pas été élucidés. Cependant, les données biochimiques BER des substrats nucléosomales suggèrent que le nucléosome présente différentes barrières structurelles en fonction de l’emplacement de la lésion de l’ADN et de l’enzyme. Cela indique que les mécanismes employés par ces enzymes pour éliminer les dommages à l’ADN dans l’ADN libre peuvent être différents de ceux employés dans les nucléosomes. Étant donné que la majorité de l’ADN génomique est assemblée en nucléosomes, des informations structurelles sur ces complexes sont nécessaires. À ce jour, la communauté scientifique ne dispose pas de protocoles détaillés pour réaliser des études structurelles techniquement réalisables de ces complexes. Ici, nous fournissons deux méthodes pour préparer un complexe de deux enzymes BER génétiquement fusionnées (polymérase β et endonucléase AP1) liées à un espace mononucléotidique près de l’entrée-sortie du nucléosome pour la détermination structurelle de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Les deux méthodes de préparation des échantillons sont compatibles pour vitrifier les grilles de qualité par congélation. Ce protocole peut être utilisé comme point de départ pour préparer d’autres complexes nucléosomiques avec différents facteurs BER, facteurs de transcription pionniers et enzymes modifiant la chromatine.
Introduction
L’ADN eucaryote est organisé et compacté par les protéines histones, formant de la chromatine. La particule centrale du nucléosome (NCP) constitue l’unité répétitive fondamentale de la chromatine qui régule l’accessibilité aux protéines de liaison à l’ADN pour la réparation, la transcription et la réplication de l’ADN1. Bien que la première structure cristalline en rayons X du NCP ait été résolue pour la première fois il y a plus de deux décennies2 et que de nombreuses autres structures du NCP aient été publiées depuis 3,4,5,6, les mécanismes de réparation de l’ADN dans les substrats nucléosomaux n’ont pas encore été délimités. La découverte des détails moléculaires sous-jacents à la réparation de l’ADN dans la chromatine nécessitera une caractérisation structurale des composants participants afin de comprendre comment les caractéristiques structurelles locales du PCN régulent les activités de réparation de l’ADN. Ceci est particulièrement important dans le contexte de la réparation par excision de base (BER) étant donné que les études biochimiques avec des enzymes BER suggèrent des mécanismes uniques de réparation de l’ADN dans les nucléosomes qui dépendent des exigences structurelles spécifiques à l’enzyme pour la catalyse et de la position structurelle de la lésion de l’ADN dans le nucléosome 7,8,9,10,11,12,13 . Étant donné que le BER est un processus vital de réparation de l’ADN, il existe un intérêt considérable à combler ces lacunes tout en établissant un point de départ à partir duquel d’autres études structurelles techniquement réalisables impliquant des complexes nucléosomaux pertinents peuvent être réalisées.
Cryo-EM devient rapidement la méthode de choix pour résoudre la structure tridimensionnelle (3D) de complexes dont la préparation à grande échelle d’échantillons homogènes est difficile. Bien que la conception et la purification de NCP complexés avec un facteur de réparation de l’ADN (NCP-DRF) nécessiteront probablement une optimisation sur mesure, la procédure présentée ici pour générer et congeler un complexe NCP-DRF stable fournit des détails sur la façon d’optimiser la préparation de l’échantillon et de la grille cryo-EM. Deux workflows (non mutuellement exclusifs) illustrés à la figure 1 et les détails spécifiques du protocole identifient les étapes critiques et fournissent des stratégies pour optimiser ces étapes. Ce travail propulsera le domaine de la chromatine et de la réparation de l’ADN dans une direction où il devient techniquement possible de compléter les études biochimiques par des études structurales pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la réparation de l’ADN nucléosomique.
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Protocol
1. Assembler les particules du noyau du nucléosome par dialyse sel-gardient
NOTE: La préparation de particules de noyau de nucléosome à l’aide de protéines histones recombinantes pour des études structurales a été décrite en détail par d’autres 14,15,16. Suivre la purification des histones recombinantes de X. laevis et de l’assemblage octomère d’histones décrites par d’autres14,15, et assembler le substrat nucléosomique comme décrit ci-dessous.
- Achetez trois oligonucléotides (énumérés dans le tableau 1) à l’échelle indiquée : UND-197mer, 161mer, 35mer.
- PAGE purifie les ultramères (197mer et 161mer) comme décrit17.
- Quantités équimolaires recuites d’oligonucléotides dans 1x tampon de recuit (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Par exemple, mélanger 40 μL de 161-mer [166,7 μM]; 8 μL de 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL de brin de composition 197-mer [408,2 μM]; 10 μL de tampon recuit 10x et 10,9 μL dedH2O.
REMARQUE: Il est essentiel de contrôler la réaction de recuit avec un gradient de température. Voir le tableau 2 pour les détails sur le gradient de température.
- Quantités équimolaires recuites d’oligonucléotides dans 1x tampon de recuit (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Par exemple, mélanger 40 μL de 161-mer [166,7 μM]; 8 μL de 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL de brin de composition 197-mer [408,2 μM]; 10 μL de tampon recuit 10x et 10,9 μL dedH2O.
- PAGE purifie les ultramères (197mer et 161mer) comme décrit17.
- Effectuer des reconstitutions à petite échelle (échelle d’un facteur de 1/57 de l’exemple ci-dessous pour un volume final de 50 μL) pour déterminer le rapport de l’ADN à l’octamère d’histones (les rapports de départ typiques de l’ADN:octamère sont les suivants : 1:0,9, 1:1,1, 1:1,2, 1:2; illustré à la figure 2A); Il est essentiel de déterminer ce ratio empiriquement avec des reconstitutions à petite échelle.
- Une fois ce rapport déterminé, préparez une reconstitution à grande échelle. Par exemple, mélanger 32,9 μL d’ADN 197 pb [99,4 μM]; 1647,1 μL de TE (1x); 1120 μL de NaCl 5 M et 62,3 μL d’octamère d’histones WT [2,56 μM].
- Fabriquer des tampons de dialyse : RBfaible etRB élevé comme décrit dans les tableaux 3 et 4, respectivement; mettre en place les reconstitutions comme décrit précédemment14.
- Transférer le tube de dialyse dans le bécher contenant RBhigh, et permettre à la dialyse de se dérouler, en agitant doucement, pendant 16 h ou jusqu’à ce que 2 LRB low aient été transférés dans le bécher à déchets.
- Transférer le tube de dialyse dans un bécher de 1 L contenant un tampon RB50mM (tableau 5) et laisser l’échantillon dialyser pendant au moins 3 heures ou toute la nuit.
- Évaluer l’efficacité de la reconstitution sur un gel non dénaturant de polyacrylamide à 6 %, en s’assurant qu’il y a moins de 10 % d’ADN libre et une seule bande NCP; conserver les PCN à 4 °C. Voir la figure 2A (voie 5) et la figure 2B pour des résultats de reconstitution optimaux représentatifs.
2. Préparer le complexe NCP-facteur de réparation de l’ADN (NCP-DRF)
- Purification par électrophorèse sur gel préparatif
REMARQUE : Cette méthode est la plus exigeante en main-d’œuvre (des deux décrites) et, bien qu’elle soit efficace pour éliminer les espèces de poids moléculaire élevé (HMW) (Graphique 6A) en raison du facteur de dilution élevé, il peut entraîner un certain désassemblage, comme le montre la section Graphique 7A (NCP prep cell out lane), libérant de l’ADN. Cependant, jusqu’à 25% d’ADN libre est toujours compatible avec les études cryo-EM. En raison de la dilution élevée, utilisez cette méthode pour purifier uniquement le PCN, plutôt que l’ensemble du complexe.- Préparer 70 mL de solution de gel de polyacrylamide non dénaturant à 6 % dans 0,2x TBE, en utilisant la solution de gel de polyacrylamide 37,5:1, acrylamide:bisacrylamide. Versez un gel cylindrique d’un rayon extérieur de 28 mm et polymérisez pendant la nuit.
- Assembler l’appareil de fonctionnement en gel préparatif, à l’aide d’une membrane de dialyse avec une coupure de 6 à 8 kDa MW. Utiliser 0,25x TBE comme tampon courant et 1x tampon d’élution (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Pré-faire fonctionner le gel cylindrique à une vitesse constante de 12 W pendant 1 h et recueillir les fractions faisant fonctionner la pompe péristaltique à un débit d’environ 1 mL/min.
REMARQUE : Si aucun détecteur UV n’est disponible pour identifier les fractions contenant de l’ADN, une expérience de dépistage avec 32P-NCP peut être effectuée pour identifier les fractions d’intérêt. En gardant toutes les conditions identiques, les PCN non étiquetés peuvent ensuite être purifiés sans détecteur UV. - Concentrer les 2,8 mL de NCP à 250 μL à l’aide d’un filtre centrifuge (coupure MW 30 kDa) et charger sur le gel de préparation et l’électrophorèse pendant un total de 6 h. À 2 h, lorsque le xylène cyanol n’a plus de gel, commencez à recueillir 1,5 mL de fractions.
NOTE: À 2,5 h, les fractions seront exemptes de xylène cyanol; l’ADN (197mer) élue à environ 3-3,5 h, et le PCN devrait éluer à 4,5-5 h. - Analyser les fractions d’intérêt sur un gel de polyacrylamide non dénaturant à 6%. Fractions de pool contenant le NCP et concentrer immédiatement avec un filtre centrifuge (coupure MW 30 kDa) à 1 mg/mL. Le lendemain, évaluer la qualité du PCN sur un gel non dénaturant polyacrylamide à 6 % avant de se complexer avec le facteur de réparation de l’ADN (DRF) d’intérêt.
- Incuber le PLCN et le DRF d’intérêt sur la glace pendant 15 minutes en utilisant un tampon optimal pour le complexe spécifique. Par exemple, mélanger 1 000 μL de NCP [1,2 μM]; 260 μL de tampon de liaison 5x (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL de 3 M KCl et 18 μL de MBP- Pol β-APE1 [338 μM].
REMARQUE: La température et la force ionique auxquelles le complexe est fabriqué peuvent nécessiter une optimisation pour différents complexes. - Ajouter le glutaraldéhyde (fraîchement ouvert; EM) jusqu’à une concentration finale de 0,005 %. Par conséquent, à cette réaction, ajoutez 26,8 μL de glutaraldéhyde à 0,25% avec 13,2 μL dedH2O. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 13 min.
- Tremper avec 1 M Tris-Cl, pH 7,5, jusqu’à une concentration finale de 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Concentrer à ~50 μL et remplacer le tampon avec 1x tampon de congélation : 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 à l’aide d’une colonne de dessalage.
ATTENTION: Le glutaraldéhyde peut causer de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires; Il est nocif s’il est avalé, et il est toxique s’il est inhalé. Portez une blouse de laboratoire, des lunettes de protection, des gants et manipulez du glutaraldéhyde dans une hotte et portez un masque.
REMARQUE : Il est essentiel d’effectuer la réaction de réticulation dans un grand volume avec le PCN à cette concentration plus faible. Les tentatives précédentes de réticulation, même à cette concentration de glutaraldéhyde, mais à une concentration de NCP 10 fois plus élevée, ont conduit à l’agrégation de l’échantillon et à la surréticulation comme indiqué par SDS PAGE et chromatographie d’exclusion de taille. Ces grilles n’avaient pas de particules discernables avec seulement des amas (Figure 5D,E). - Déterminer les absorbances à OD 280 et OD 260 et concentrer davantage si nécessaire pour atteindre 1,3-3 mg/mL, sur la base de DO 280 (rapport typique de DO260/DO 280= 1,7-2 donne de bonnes particules). Pour ce petit volume de 50 μL, la meilleure méthode pour réduire la perte d’échantillon consiste à fabriquer un bouton de dialyse avec un couvercle d’un tube de 1,7 mL recouvert d’une membrane de dialyse (coupure de 6 à 8 kDa MW), en coupant le fond du tube et en utilisant le bord du tube pour sceller la membrane sur le dessus du couvercle.
- Placez le bouton de dialyse contenant l’échantillon sur un lit de polyéthylène glycol, avec la membrane vers le bas (vérifiez les progrès toutes les 2 minutes). Cette méthode est préférable lorsque la concentration nécessaire est inférieure ou égale à 2,5 fois pour éviter de diluer ou de perdre l’échantillon dans le concentrateur. Il est essentiel de préparer immédiatement les grilles cryo-EM du complexe après cette étape.
- Purification par chromatographie d’exclusion granulométrique
- La veille de la congélation, laver et équilibrer une colonne d’exclusion granulométrique avec 60 mL dedH2O, suivie de 80 mL de tampon de congélation (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) pendant une nuit à raison de 0,4 mL/min. À l’aide de NCP immédiatement après la reconstitution, préparer le même complexe en utilisant des quantités 2,5 fois plus élevées comme suit : mélanger 2 500 μL de NCP [1,2 μM]; 650 μL de tampon de liaison 5x; 45 μL de MBP-Pol β-APE1 [338 μM] et 55 μL de 3M KCl.
- Incuber le mélange sur de la glace sans agent de réticulation pendant 15 min. Ensuite, ajouter du glutaraldéhyde à une concentration finale de 0,005% comme décrit dans la méthode du gel préparatif. Dans ce cas, cependant, concentrer le complexe dans un filtre centrifuge pré-équilibré (avec tampon de congélation) à environ 120 μL.
- Analyser immédiatement les fractions de pic et concentrer les fractions contenant les histones et MBP-Pol β-APE1 comme indiqué précédemment. Voir la figure 5A, B et C pour les résultats positifs en utilisant la méthode d’exclusion de taille et la figure 7 en utilisant les deux méthodes.
3. Congeler le complexe nucléosomique
- Après avoir allumé le congélateur et rempli l’humidificateur de 50 ml dedH2O, réglez la température de la chambre à 22 °C et HR (humidité) à 98 %. Placez la tasse d’éthane et la tasse d’azote liquide (contenant une boîte de grille étiquetée) dans leurs supports d’espace respectifs.
- Couvrez le gobelet d’éthane avec le distributeur de couvercle d’éthane et versez soigneusement de l’azote liquide (LN2) dessus, tout en remplissant la tasse LN 2 avec LN2. Lorsque le niveau LN2 s’est stabilisé et atteint 100% et une température de -180 °C, ouvrez soigneusement la vanne d’éthane et remplissez le gobelet d’éthane jusqu’à ce qu’il forme une bulle sur le couvercle transparent. Retirez le distributeur d’éthane.
- Placez deux papiers filtres sur le buvardeur et fixez-les avec un anneau métallique. Accédez à la configuration et utilisez les paramètres suivants pour le buvardage: 0 pré-blot, 3 s blot, 0 post-blot; sélectionnez A-plunge et cliquez sur OK.
- Sur l’écran principal, cliquez sur Pinces de charge et chargez-les avec une grille avec le côté carbone / application orienté vers la gauche (préparé comme précédemment). Calibrez les pinces en ajustant l’axe Z pour assurer une tache solide. Cliquez sur la chambre inférieure et appliquez 3 μL du complexe (1,3-3 mg / mL; OD280). Cliquez sur Blot/A-plunge. Cela fera pivoter la grille pour l’éponger de l’avant et la gelera plonger.
- Transférer et stocker la grille dans la boîte à grille de la chambre LN2 . Lorsque les quatre grilles ont été congelées et placées dans la boîte de grille, tournez le couvercle en position neutre, où toutes les grilles sont couvertes par le couvercle, et serrez la vis. Les grilles peuvent être stockées dans LN2 jusqu’à ce que le criblage soit lancé.
4. Grilles d’écran
- Avant de charger les échantillons au microscope, placez les grilles vitrifiées sur un anneau et fixez-les à l’aide d’un clip C. Effectuez ce processus de coupure sous LN2 dans une pièce à humidité contrôlée, afin d’éviter la contamination par la glace.
- Lors du chargement du microscope, insérez les grilles dans une cassette à 12 fentes. Transférez la cassette dans une capsule nanocab et chargez-la dans le chargeur automatique. Le mécanisme robotique du chargeur automatique lance le processus.
- Transférez la grille de la cassette à l’étage du microscope. Ajustez la scène à la hauteur eucentrique en faisant osciller la scène de 10° et en déplaçant simultanément la hauteur Z jusqu’à ce qu’un décalage planaire minimal soit observé dans les images.
- Une fois la hauteur eucentrique atteinte, commencez l’imagerie. Tout d’abord, obtenez l’atlas en prenant une image de montage 3 x 3 de la grille, dans laquelle chaque montage est pris à un grossissement de 62x. Choisissez trois carrés de tailles variables; Prenez la hauteur eucentrique, puis l’image à un grossissement de 210x.
- Une fois qu’un carré est imagée, choisissez un trou chacun du bord, du centre et entre les carrés. Imagez chaque trou à un grossissement de 2600x.
- Avant de prendre cette image à fort grossissement, la mise au point automatique se produit à un décalage de la zone d’imagerie. Prenez l’image à fort grossissement à partir du centre du trou à un grossissement de 36 000x et à un temps d’exposition de 7,1 s, 60 images, une taille de 1,18 pixel et une mise au point de 3 μm. Voir les images représentatives du dépistage à la figure 5, à la figure 6 et à la figure 7.
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Representative Results
Des NCP correctement assemblés (Figure 2) ont été utilisés pour fabriquer un complexe avec une protéine de fusion recombinante de MBP-Polβ-APE1 (Figure 3). Pour déterminer le rapport NCP / MBP-Polβ-APE1 pour former un complexe stable, nous avons effectué des tests de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) (Figure 4), qui ont montré une bande décalée individuellement du NCP avec un excès molaire 5 fois de MBP-Polβ-APE1. Au cours de l’optimisation de la fabrication de ce complexe, la réticulation avec le glutaraldéhyde était essentielle pour empêcher le PCN de s’effondrer. Initialement, l’assemblage du complexe de NCP-Polβ-APE1 a été réalisé dans un plus petit volume, à environ 10 μM de NCP, en utilisant une concentration finale de glutaraldéhyde de 0,005%. Dans ces conditions, l’échantillon était trop réticulé (figure 5D-E) et a donné des agrégats sans complexes individuels discernables. La réticulation à des NCP dilués d’environ 10 fois (1,2 μM de NCP) a permis de réduire considérablement l’agrégation et d’améliorer la stabilité des particules (figure 5A-C). La figure 6 montre que les deux méthodes présentées à la figure 1 peuvent être combinées avec le gel préparatif améliorant la qualité des PCN lorsque le PCN contient une quantité importante d’agrégats de poids moléculaire élevé (HMW) (figure 6A), suivie de la purification du complexe par exclusion de taille. Bien que cela ait montré un grand succès dans la préparation de l’échantillon (Figure 5B-C) et des grilles, donnant des particules stables (Figure 6D), la formation sous-optimale du complexe (Figure 6A) a produit une carte 3D du NCP seul (données non présentées). Ces résultats montrent que les deux méthodes (exclusion granulométrique et gel préparatif) peuvent être utilisées indépendamment pour générer des complexes stables (Figure 7A-C). En effet, les données ont été recueillies à partir des deux grilles et montrent des classes 2D (Figure 7D) et des cartes 3D (Figure 7E) presque identiques à une résolution d’environ 3,2 Å.
Figure 1 : Déroulement des deux méthodes présentées dans ce protocole pour préparer et congeler un complexe NCP-Polβ-APE1 via 1) gel préparatif et 2) exclusion de taille. Bien qu’elles ne soient pas présentées ici, ces méthodes peuvent être combinées (Figure 6), en commençant par (1) et en purifiant le complexe concentré à partir de (1) à l’aide d’une colonne de calibrage. Pour ce faire, il faudra doubler le matériel de départ des PCN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Reconstitutions représentatives du PCN. (A) L’ADN a été titré avec des quantités croissantes d’octamère d’histones à des ratios de 1:0,9, 1:1,1, 1:1,2, 1:2, ADN:octamère. (B) Dupliquer des PCN assemblés à grande échelle (1:2, ADN:octamère). Les reconstitutions ont été électrophorées dans un gel de polyacrylamide non dénaturant à 6%, suivies d’une coloration au vert sybr I. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Schéma de Polβ-APE1 génétiquement fusionné avec MBP à son terminal N. La protéine de fusion MBP-Polβ-APE1 a été caractérisée enzymatiquement pour les deux activités (données non présentées). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Liaison MBP-Polβ-APE1 aux PCN. Le substrat nucléosomique (100 nM) a été incubé avec des quantités croissantes de MBP-Polβ-APE1 pendant 15 minutes sur glace. Le NCP lié et non lié a été séparé dans un gel non dénaturant de polyacrylamide à 6%, suivi d’une coloration au vert sybr I. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Analyse des résultats de réticulation réussie et infructueuse. Le profil d’élution du complexe est indiqué en (A) avec le pic d’intérêt étiqueté. Les fractions, notées « F », recueillies à partir de cette élution ont été analysées dans un gel de polyacrylamide tricine à 16 % et représentées en (B). (C) L’échantillon de (B) a été congelé à l’aide de grilles de support de carbone trouées et imagé à l’aide du microscope électronique cryotransmission à émission de champ de 200 kV. Les expériences infructueuses correspondantes sont présentées aux points (D), (E) et (F). Notez que ces expériences infructueuses contiennent la protéine de fusion sans MBP. HOc et HOD désignent respectivement l’octamère d’histones concentré et dilué; RT indique la température ambiante; « X » correspond à la réticulation avec le glutaraldéhyde. Barres d’échelle = 100 nm (C, F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Préparation du complexe NCP-Polβ-APE1 en utilisant les deux méthodes en tandem. (A) Non lié et lié (1:1, NCP-Polβ-APE1) ont été analysés dans du gel non dénaturant de polyacrylamide à 6% (notez qu’à ce rapport seulement 50% est lié). (B) Profil d’élution du complexe NCP-Polβ-APE1 à partir d’une colonne de calibrage. C) Analyse des fractions éluées dans un gel de polyacrylamide tricine à 16 %; Les fractions ont été regroupées et concentrées, comme indiqué. (D) L’échantillon a été congelé et imagé comme décrit à la figure 5B. Le traitement des données n’a pas montré de densité supplémentaire correspondant à Polβ-APE1 (non représenté). « X » dans les voies 5 et 6 indique la réticulation avec le glutaraldéhyde comme indiqué dans le protocole. Barre d’échelle = 100 nm (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Analyse du complexe NCP-MBP-Polβ-APE1. (A) Des échantillons provenant des différentes étapes des méthodes illustrées à la figure 1 ont été électrophorés dans un gel non dénaturant de polyacrylamide à 6%. Notez que la formation complexe est reproductible par les deux méthodes. (B,C) Images représentatives de la grille de support de carbone de trou de grille prises à l’aide d’un microscope électronique à transmission de 300 kV où les boîtes rouges mettent en évidence différentes orientations du complexe (dont certaines correspondent aux classes 2D indiquées en (D). (E) Les données traitées à partir de (C) montrent une carte 3D à une résolution de 3,2 Å du complexe NCP-MBP-Polβ-APE1.). Barres d’échelle = 100 nm (B, C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nom de l’oligonucléotide | Séquence (5'-->3') | Échelle de purification | Méthode de purification | Nombre de flacons commandés | ||
| Volet complémentaire UND | TGATGGACCCTATACGCGGCCGCCCTGGAGAAT CCCGGTGCCGAGGCCGCTCAATTGGTCGTAGA CAGCTCTAGCACCGCTTAAACGCACGTACGCGCGCGC TGTCCCCCGCGTTTTAACCGCCAAGGGGATTAC TCCCTAGTCTCCAGGCACGTGTCAGATATCAAC ATCCTGTGCATGTATTGAACAGCGACCTTGCCG |
20 nmole | PAGE purifié | 6 | ||
| 161mer | /5Phos/GATATCTGACACGTGCCTGGAGACTAGG GAGTAATCCCCTTGGCGGTTAAAACGCGGGGGGG ACAGCGCGTACGTGCGTTTAAGCGGTGCTAGA GCTGTCTACGACCAATTGAGCGGCCTCGGCA CCGGGATTCTCCAGGGCGGCCGCGTATAGGG TCCATCA |
20 nmole | PAGE purifié | 4 | ||
| 35mer | CGGCAAGGTCGCTGTTCAATACATGCACAGG ATGT |
250 nmole | CLHP | 1 | ||
Tableau 1 : Substrat d’ADN. Trois oligonucléotides ont été recuits pour générer le substrat de l’ADNds. Les sections soulignées sont 25 pb d’ADN de liaison flanquant la séquence de positionnement de l’ADN 601 de 147 bp contenant un seul espace nucléotidique.
| Pas | Température (°C) | Temps (min)/pas |
| 1 | 95 | 10 |
| 2-5 | 90, 85, 80, 75 | 5 |
| 6-41 | 69 diminution de 1 | 3 |
| 42 | 4 | tenir |
Tableau 2 : Gradient de température de recuit. Les oligos ont été incubés dans un thermocycleur à ces températures pour générer le substrat de l’ADNds.
| Composants (stock) | Volume/quantité | Concentration finale |
| 3M KCl | 167 mL | 0,250 M |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 20 mL | 10 mM |
| 0,5 M d’EDTA | 4 mL | 1 mM |
| 1 M TNT | 2 mL | 1 mM |
| GARS | 2 g | 1,6 mM |
| QS avecdH2Opour faire 2L | ||
Tableau 3 : Coussin de reconstitutionRB faible . Instructions pour faire 2 L comme indiqué précédemment14, sauf 1,6 mM CHAPS a été ajouté.
| Composants (stock) | Volume/quantité | Concentration finale |
| 3M KCl | 267 mL | 2 M |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 4 mL | 10 mM |
| 0,5 M d’EDTA | 800 μL | 1 mM |
| 1 M TNT | 400 μL | 1 mM |
| GARS | 0,4 g | 1,6 mM |
| QS avecdH2Opour faire 400 mL | ||
Tableau 4 : Coussinde reconstitution élevé RB. Instructions pour faire 400 mL comme indiqué précédemment14, sauf 1,6 mM CHAPS a été ajouté.
| Composants (stock) | Volume | Concentration finale |
| 3M KCl | 16,7 mL | 50 mM |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 10 mL | 10 mM |
| 0,5 M d’EDTA | 2 mL | 1 mM |
| 1 M TNT | 1 mL | 1 mM |
| QS avecdH2Opour faire 1L | ||
Tableau 5 : Tampon de reconstitution RB50mM . Instructions pour rendre 1 L de tampon de reconstitution compatible avec la congélation.
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Discussion
Un protocole spécifique pour purifier le facteur de réparation de l’ADN dépendra de l’enzyme d’intérêt. Cependant, il existe certaines recommandations générales, notamment l’utilisation de méthodes recombinantes pour l’expression et la purification des protéines18; si la protéine d’intérêt est trop petite (<50 kDa), la détermination de la structure par cryo-EM était presque impossible jusqu’à plus récemment grâce à l’utilisation de systèmes de fusion19, d’échafaudages de liaison aux nanocorps20 et d’optimisation des stratégies d’imagerie21.
Il est assez courant d’obtenir des grilles de mauvaise qualité dans les phases initiales. Les premières tentatives pour déterminer l’homogénéité et la stabilité des NCP sans aucun agent de réticulation, en utilisant de l’acétate d’uranyle et des grilles de cuivre revêtues de carbone pour la coloration négative, ont montré des NCP stables, bien dispersés avec une agrégation minimale. Cependant, une fois cet échantillon vitrifié (à une concentration 20x plus élevée) dans des grilles cryo-EM, aucune particule n’a été détectée. L’optimisation des échantillons pour empêcher les PCN de s’effondrer ou de s’agréger était le plus grand obstacle. En outre, deux méthodes de préparation sont décrites séparément; cependant, ils ne s’excluent pas mutuellement et peuvent être utilisés l’un à la suite de l’autre en purifiant d’abord le PCN au moyen d’un gel préparatif, en le complexifiant avec le facteur de réparation et en purifiant le complexe avec une colonne d’exclusion de taille. Cela nécessite deux fois plus de matériel pour l’étape initiale, et cela prend également plus de temps, mais utile pour les échantillons difficiles (Figure 6).
Il a été difficile de trouver un point de départ pour la concentration de réticulation en raison du manque de cohérence des méthodes de réticulation et des quantités de réticulation utilisées par d’autres22,23. Les tentatives de reproduire la réaction de réticulation moins contrôlée sur le banc décrite par Anderson et al. n’ont pas donné de résultats positifs, et le complexe était trop réticulé. Cela est probablement dû à la source de glutaraldéhyde (ampoule fraîchement ouverte par rapport au glutaraldéhyde stocké à long terme). Parce que ce niveau de détail est souvent omis dans les articles de recherche non méthodologiques, il est difficile de reproduire les conditions exactes comme point de départ. Des résultats optimaux ont été obtenus lorsque le complexe a été réticulé à une concentration de 1,2 μM dans une force ionique KCl de 150 mM par rapport à la réticulation du complexe à 10 μM NCP, à la même concentration de glutaraldéhyde de 0,005% pendant 13 min à température ambiante. L’efficacité de la réticulation dépend aussi probablement du complexe qui se forme, car certains facteurs interagissant avec la chromatine peuvent induire/nécessiter une plus grande déstabilisation, influençant l’endroit où la réticulation se produira et l’effet global sur la stabilité du NCP. Par conséquent, bien que l’optimisation de ces conditions soit inévitable, il sera essentiel de trouver des étapes critiques telles que la concentration optimale de NCP et de sel pendant les réactions de réticulation.
Un autre paramètre important était le rapport NCP:DRF qui a produit suffisamment de molécules sur la grille contenant le DRF lié au NCP. En effet, ce paramètre a également été identifié par d’autres comme étant essentiel à optimiser pour les études structurelles16 , étant donné que même pour la cryo-EM, l’homogénéité de la façon dont le DRF se lie au PCN est importante pour la carte 3D. Ne pas optimiser cela peut donner une liaison non liée ou hétérogène et non spécifique. Lorsqu’un rapport molaire de 1:1 a été utilisé, ne donnant que 50 % du PCN lié par le DRF (Figure 6), la carte 3D n’a montré aucune densité supplémentaire correspondant au DRF. Par conséquent, il est important de déterminer le rapport qui donne une seule bande au même endroit sur une EMSA et montre un seul pic sur le chromatogramme d’une colonne de dimensionnement, correspondant au complexe. Plusieurs paramètres de gel des grilles, dont le temps de transfert, ont ajouté plusieurs tours d’optimisation.
Pris ensemble, ce protocole fournit pour la première fois des instructions détaillées sur deux méthodes différentes de préparation des complexes nucléosomales pour la détermination structurelle cryo-EM. Les paramètres de base pour la préparation de la grille fournis peuvent être utilisés comme point de départ. Et bien qu’aucune méthode ne fonctionne aussi bien pour tous les complexes macromoléculaires, se concentrer sur l’optimisation des paramètres décrits dans ce protocole réduira la stratégie d’optimisation sur mesure d’autres complexes nucléosomales.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Mario Borgnia du noyau cryo-EM de l’Institut national des sciences de la santé environnementale et le Dr Joshua Strauss de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill pour leur mentorat et leur formation à la préparation de la grille cryo-EM. Nous remercions également le Dr Juliana Mello Da Fonseca Rezende pour son assistance technique dans les premières étapes de ce projet. Nous apprécions la contribution et le soutien clés du regretté Dr Samuel H. Wilson et des membres de son laboratoire, en particulier le Dr Rajendra Prasad et le Dr Joonas Jamsen pour la purification du complexe APE1-Polβ génétiquement fusionné. La recherche a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [numéros de subvention Z01ES050158, Z01ES050159 et K99ES031662-01].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640--6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
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