Summary
Detta protokoll beskriver i detalj beredningen av nukleosomala komplex med användning av två metoder för provberedning för frysning av TEM-galler.
Abstract
DNA-reparation i samband med kromatin är dåligt förstådd. Biokemiska studier med nukleosomkärnpartiklar, den grundläggande upprepande enheten av kromatin, visar att de flesta DNA-reparationsenzymer tar bort DNA-skador med reducerade hastigheter jämfört med fritt DNA. De molekylära detaljerna om hur basexcisionsreparationsenzymer (BER) känner igen och tar bort DNA-skador i nukleosomer har inte klarlagts. Biokemiska BER-data för nukleosomala substrat tyder emellertid på att nukleosomen uppvisar olika strukturella barriärer beroende på platsen för DNA-lesionen och enzymet. Detta indikerar att mekanismerna som används av dessa enzymer för att avlägsna DNA-skador i fritt DNA kan vara annorlunda än de som används i nukleosomer. Med tanke på att majoriteten av genomiskt DNA monteras i nukleosomer behövs strukturell information om dessa komplex. Hittills saknar det vetenskapliga samfundet detaljerade protokoll för att utföra tekniskt genomförbara strukturella studier av dessa komplex. Här tillhandahåller vi två metoder för att förbereda ett komplex av två genetiskt smälta BER-enzymer (polymeras β och AP Endonuclease1) bundna till ett enda nukleotidgap nära nukleosomens inträde-utgång för kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) strukturbestämning. Båda metoderna för provberedning är kompatibla för förglasning av kvalitetsgaller via doppfrysning. Detta protokoll kan användas som utgångspunkt för att förbereda andra nukleosomala komplex med olika BER-faktorer, pionjärtranskriptionsfaktorer och kromatinmodifierande enzymer.
Introduction
Eukaryot DNA organiseras och komprimeras av histonproteiner och bildar kromatin. Nukleosomkärnpartikeln (NCP) utgör den grundläggande upprepande enheten av kromatin som reglerar tillgängligheten till DNA-bindande proteiner för DNA-reparation, transkription och replikation1. Även om den första röntgenkristallstrukturen i NCP först löstes för mer än två decennier sedan2 och många fler strukturer av NCP har publicerats sedan 3,4,5,6, har DNA-reparationsmekanismer i nukleosomala substrat ännu inte avgränsats. Att avslöja de molekylära detaljerna som ligger till grund för DNA-reparation i kromatin kommer att kräva strukturell karakterisering av de deltagande komponenterna för att förstå hur lokala strukturella egenskaper hos NCP reglerar DNA-reparationsaktiviteter. Detta är särskilt viktigt i samband med reparation av basexcision (BER) med tanke på att biokemiska studier med BER-enzymer tyder på unika DNA-reparationsmekanismer i nukleosomer som är beroende av enzymspecifika strukturella krav för katalys och DNA-lesionens strukturella position inom nukleosomen 7,8,9,10,11,12,13 . Med tanke på att BER är en viktig DNA-reparationsprocess finns det ett stort intresse för att fylla i dessa luckor och samtidigt fastställa en utgångspunkt från vilken andra tekniskt genomförbara strukturstudier med relevanta nukleosomkomplex kan utföras.
Cryo-EM blir snabbt den valda metoden för att lösa den tredimensionella (3D) strukturen hos komplex vars storskaliga beredning av homogent prov är utmanande. Även om design och rening av NCP: er komplexerade med en DNA-reparationsfaktor (NCP-DRF) sannolikt kommer att kräva skräddarsydd optimering, ger proceduren som presenteras här för att generera och frysa ett stabilt NCP-DRF-komplex detaljer om hur man optimerar provet och kryo-EM-nätberedningen. Två arbetsflöden (inte ömsesidigt uteslutande) som visas i figur 1 och den specifika informationen i protokollet identifierar kritiska steg och tillhandahåller strategier för att optimera dessa steg. Detta arbete kommer att driva kromatin- och DNA-reparationsfältet i en riktning där komplementering av biokemiska med strukturella studier blir tekniskt genomförbart för att bättre förstå de molekylära mekanismerna för nukleosomal DNA-reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montera nukleosomkärnpartiklar via saltgardient dialys
OBS: Beredningen av nukleosomkärnpartiklar med användning av rekombinanta histonproteiner för strukturella studier har beskrivits utförligt i detalj av andra14,15,16. Följ reningen av rekombinant X. laevis histoner och histonokemerenhet som beskrivs av andra14,15 och montera nukleosomsubstratet enligt beskrivningen nedan.
- Köp tre oligonukleotider (listade i tabell 1) i angiven skala: UND-197mer, 161mer, 35mer.
- SIDA renar ultramerer (197mer och 161mer) enligt beskrivningen17.
- Anneala ekvimolära mängder oligonukleotider i 1x glödgningsbuffert (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Blanda till exempel 40 μL 161-mer [166,7 μM]; 8 μL 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL 197-mer kompsträng [408,2 μM]; 10 μL 10x glödgbuffert och 10,9 μLdH2O.
OBS: Det är viktigt att kontrollera glödgningsreaktionen med en temperaturgradient. Se tabell 2 för närmare uppgifter om temperaturgradienten.
- Anneala ekvimolära mängder oligonukleotider i 1x glödgningsbuffert (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Blanda till exempel 40 μL 161-mer [166,7 μM]; 8 μL 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL 197-mer kompsträng [408,2 μM]; 10 μL 10x glödgbuffert och 10,9 μLdH2O.
- SIDA renar ultramerer (197mer och 161mer) enligt beskrivningen17.
- Utför småskaliga rekonstitueringar (skala med en faktor 1/57 i exemplet nedan för en slutlig volym på 50 μl) för att bestämma förhållandet mellan DNA och histonokromamer (typiska startförhållanden för DNA:oktamer är följande: 1:0.9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2; visas i figur 2A); Det är viktigt att bestämma detta förhållande empiriskt med småskaliga rekonstitutioner.
- Efter att detta förhållande har bestämts, förbered en storskalig rekonstituering. Blanda till exempel 32,9 μL DNA-197 bp [99,4 μM]; 1647,1 μL TE (1x); 1120 μL 5 M NaCl och 62,3 μL WT histonooktamer [2,56 μM].
- Gör dialysbuffertar: RBlåg och RBhög enligt beskrivningen i tabell 3 respektive tabell 4; upprätta rekonstituerande åtgärder enligt tidigare beskrivits14.
- Överför dialysröret till bägaren som innehåller RBhög och låt dialysen fortsätta under försiktig omrörning i 16 timmar eller tills 2 L RBlåg har överförts till avfallsbägaren.
- Överför dialysröret till en 1 L-bägare innehållande RB50 mM buffert (tabell 5) och låt provet dialysera i minst 3 timmar eller över natten.
- Utvärdera rekonstitueringseffektiviteten på en 6% polyakrylamid icke-denaturerande gel, säkerställa att det finns mindre än 10% fritt DNA och ett enda NCP-band; lagra NCP vid 4 °C. Se figur 2A (körfält 5) och figur 2B för representativa optimala beredningsresultat.
2. Förbered NCP-DNA-reparationsfaktorkomplex (NCP-DRF)
- Rening genom preparativ gelelektrofores
OBS: Denna metod är den mest arbetsintensiva (av de två beskrivna), och även om den är effektiv för att avlägsna arter med hög molekylvikt (HMW) (Figur 6A) på grund av den höga utspädningsfaktorn kan det leda till viss demontering, såsom visas i Figur 7A (NCP prep cell ut körfält), frigör DNA. Upp till 25% fritt DNA är dock fortfarande kompatibelt med kryo-EM-studier. På grund av den höga utspädningen, använd denna metod för att rena NCP endast, snarare än hela komplexet.- Bered 70 ml 6% icke-denaturerande polyakrylamidgellösning i 0,2x TBE med polyakrylamidgellösning 37,5: 1, akrylamid: bisakrylamid. Häll en cylindrisk gel med en yttre radie på 28 mm och polymerisera över natten.
- Montera den preparativa gelkörningsapparaten med ett dialysmembran med en 6-8 kDa MW cutoff. Använd 0,25x TBE som löpbuffert och 1x elueringsbuffert (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Förkör den cylindriska gelen vid konstant 12 W i 1 timme och samla fraktioner som driver den peristaltiska pumpen med en flödeshastighet på cirka 1 ml/min.
OBS: Om en UV-detektor inte är tillgänglig för att identifiera fraktioner som innehåller DNA, kan ett screeningexperiment med 32P-NCP utföras för att identifiera fraktionerna av intresse. Genom att hålla alla förhållanden desamma kan omärkta NCP: er sedan renas utan UV-detektor. - Koncentrera 2,8 ml NCP till 250 μL med ett centrifugalfilter (MW cutoff 30 kDa) och fyll på den preparativa gelen och elektroforesen i totalt 6 timmar. Vid 2 timmar, när xylencyanolen har slut på gelén, börja samla 1,5 ml fraktioner.
OBS: Vid 2,5 h kommer fraktionerna att vara fria från xylencyanol; DNA (197mer) eluerar vid cirka 3-3,5 timmar, och NCP förväntas eluera vid 4,5-5 timmar. - Analysera fraktioner av intresse på en 6% icke-denaturerande polyakrylamidgel. Poolfraktioner som innehåller NCP och koncentreras omedelbart med ett centrifugalfilter (MW cutoff 30 kDa) till 1 mg/ml. Nästa dag, utvärdera kvaliteten på NCP på en 6% polyakrylamid icke-denaturerande gel innan komplexbildning med DNA-reparationsfaktorn (DRF) av intresse.
- Inkubera NCP och DRF av intresse på is i 15 minuter med en optimal buffert för det specifika komplexet. Blanda till exempel 1 000 μL NCP [1,2 μM]; 260 μL 5x bindningsbuffert (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL 3 M KCl och 18 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM].
OBS: Temperaturen och jonstyrkan vid vilken komplexet tillverkas kan behöva optimeras för olika komplex. - Tillsätt glutaraldehyd (nyöppnad; EM-kvalitet) till en slutlig koncentration av 0,005%. Tillsätt därför till denna reaktion 26,8 μL 0,25% glutaraldehyd med 13,2 μLdH2O. Blanda väl och inkubera vid rumstemperatur i 13 minuter.
- Utsläckning med 1 M Tris-Cl, pH 7,5, till en slutlig koncentration av 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Koncentrera till ~ 50 μL och byt bufferten mot 1x frysbuffert: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 med en avsaltningskolonn.
VARNING: Glutaraldehyd kan orsaka allvarliga hudbrännskador och ögonskador; Det är skadligt vid förtäring och det är giftigt vid inandning. Använd en labbrock, skyddsglasögon, handskar och hantera glutaraldehyd i en dragskåpa och bära en mask.
OBS: Det är viktigt att utföra tvärbindningsreaktionen i stor volym med NCP vid denna lägre koncentration. Tidigare försök till tvärbindning, även vid denna koncentration av glutaraldehyd, men vid en 10x högre koncentrerad NCP ledde till aggregering av provet och övertvärbindning som indikeras av SDS PAGE och storleksuteslutningskromatografi. Dessa galler hade inga urskiljbara partiklar med bara klumpar (figur 5D, E). - Bestäm absorbanserna vid OD 280 och OD 260 och koncentrera ytterligare om det behövs för att nå 1,3-3 mg/ml, baserat på OD 280 (typiskt förhållande OD260/OD 280= 1,7-2 ger bra partiklar). För denna lilla volym på 50 μl är den bästa metoden för att minska provförlusten att göra en dialysknapp med ett lock på ett 1,7 ml rör täckt av ett dialysmembran (6-8 kDa MW cutoff), skära rörets botten och använda rörets kant för att täta membranet ovanpå locket.
- Placera dialysknappen som innehåller provet ovanpå en polyetylenglykolbädd, med membranet nedåt (kontrollera förloppet var 2:e minut). Denna metod rekommenderas om den koncentration som behövs är mindre än eller lika med 2,5 gånger för att undvika utspädning eller förlust av provet i anrikningsverket. Det är viktigt att omedelbart förbereda kryo-EM-galler i komplexet efter detta steg.
- Rening genom storleksuteslutningskromatografi
- Dagen före frysning, tvätta och balansera en storleksuteslutningskolonn med 60 ml dH2O, följt av 80 ml frysbuffert (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) över natten med en hastighet av 0,4 ml / min. Bered samma komplex med 2,5 gånger större mängder med hjälp av NCP direkt efter beredning: blanda 2 500 μL NCP [1,2 μM]; 650 μL 5x bindningsbuffert; 45 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM] och 55 μL 3M KCl.
- Inkubera blandningen på is utan tvärbindare i 15 minuter. Tillsätt sedan glutaraldehyd till en slutlig koncentration av 0,005% enligt beskrivningen i den preparativa gelmetoden. I detta fall koncentreras emellertid komplexet i ett förjämviktat (med frysbuffert) centrifugalfilter till cirka 120 μl.
- Analysera omedelbart toppfraktionerna och koncentrera de fraktioner som innehåller histonerna och MBP-Pol β-APE1 enligt tidigare angivelse. Se figur 5A, B, C för framgångsrika resultat med hjälp av storleksuteslutningsmetoden och figur 7 med båda metoderna.
3. Frys nukleosomalt komplex
- När du har slagit på dykfrysen och fyllt luftfuktaren med 50 ml dH2O, ställ in kammartemperaturen på 22 ° C och HR (fuktighet) till 98%. Placera etankoppen och vätskekvävkoppen (som innehåller en märkt rutnätslåda) i sina respektive utrymmeshållare.
- Täck etankoppen med etanlocksdispensern och häll försiktigt flytande kväve (LN2) över den, samtidigt som LN 2-koppen fylls med LN2. När LN2-nivån har stabiliserats och når 100% och en temperatur på -180 °C, öppna försiktigt etanventilen och fyll etankoppen tills den bildar en bubbla på det klara locket. Ta bort etandispensern.
- Placera två filterpapper på blottinganordningen och säkra dem med en metallring. Gå till inställningen och använd följande parametrar för blotting: 0 pre-blot, 3 s blot, 0 post-blot; välj A-steg och klicka på OK.
- På huvudskärmen klickar du på Ladda pincett och laddar dem med ett rutnät med kol / applikationssidan vänd mot vänster (förberedd som tidigare). Kalibrera pincetten och justera Z-axeln för att säkerställa en fast fläck. Klicka på Nedre kammaren och applicera 3 μL av komplexet (1,3-3 mg / ml; OD280). Klicka på Blot/A-plunge. Detta kommer att rotera gallret för att blotta framifrån och kommer att frysa det.
- Överför och lagra gallret i gallerboxen i LN2-kammaren . När alla fyra galler har frusit och placerats i gallerlådan, vrid locket till neutralläge, där alla galler är täckta av locket, och dra åt skruven. Rutnät kan lagras i LN2 tills screening initieras.
4. Skärm galler
- Innan proverna laddas i mikroskopet, placera de förglasade gallren på en ring och säkra dem med en C-klämma. Utför denna urklippsprocess under LN2 i ett fuktkontrollerat rum för att undvika iskontaminering.
- När du laddar mikroskopet, sätt in gallret i en kassett med 12 slitsar. Flytta kassetten till en nanocab-kapsel och ladda den i autoladdaren. Autoloader-robotmekanismen initierar processen.
- Överför rutnätet från kassetten till mikroskopsteget. Justera scenen till eucentrisk höjd genom att vingla scenen 10° och samtidigt flytta Z-höjden tills minimal plan förskjutning observeras i bilderna.
- När den eucentriska höjden har uppnåtts, börja avbilda. Hämta först atlasen genom att ta en 3 x 3 montagebild av rutnätet, där varje montage tas med 62x förstoring. Välj tre rutor av varierande storlek; Ta den eucentriska höjden och sedan bilden med 210x förstoring.
- När en fyrkant har avbildats väljer du ett hål vardera från kanten, mitten och däremellan inom rutorna. Avbilda varje hål med 2600x förstoring.
- Innan du tar den här bilden med hög förstoring sker autofokuseringen vid en förskjutning av bildområdet. Ta bilden med hög förstoring från hålets mitt med 36 000x förstoring och med 7,1 s exponeringstid, 60 bilder, 1,18 pixlar och 3 μm oskärpa. Se representativa bilder av screening i figur 5, figur 6 och figur 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Korrekt monterade NCP (figur 2) användes för att göra ett komplex med ett rekombinant fusionsprotein av MBP-Polβ-APE1 (figur 3). För att bestämma förhållandet mellan NCP och MBP-Polβ-APE1 för att bilda ett stabilt komplex utförde vi elektroforetiska mobilitetsskiftanalyser (EMSA) (figur 4), som visade ett enstaka skiftat band av NCP med 5-faldigt molärt överskott av MBP-Polβ-APE1. Under optimeringen av att göra detta komplex var tvärbindning med glutaraldehyd avgörande för att förhindra att NCP föll isär. Initialt utfördes montering av komplexet av NCP-Polβ-APE1 i en mindre volym, vid cirka 10 μM NCP, med användning av 0,005% slutlig glutaraldehydkoncentration. Under dessa förhållanden var provet alltför tvärbundet (figur 5D-E) och resulterade i aggregat utan urskiljbara enskilda komplex. Tvärbindning vid cirka 10-faldigt utspädda NCP (1,2 μM NCP) resulterade i signifikant minskad aggregering och förbättrad partikelstabilitet (figur 5A-C). Figur 6 illustrerar att båda metoderna som visas i figur 1 kan kombineras med den preparativa gelen som förbättrar kvaliteten på de nationella kontaktpunkterna när den nationella kontaktpunkten innehåller en betydande mängd aggregat med hög molekylvikt (figur 6A), följt av rening av komplexet genom storleksuteslutning. Även om detta visade stor framgång vid beredningen av provet (figur 5B-C) och galler, vilket gav stabila partiklar (figur 6D), gav den suboptimala bildningen av komplexet (figur 6A) en 3D-karta över NCP ensam (data visas inte). Dessa resultat visar att båda metoderna (storleksuteslutning och preparativ gel) kan användas oberoende av varandra för att generera stabila komplex (figur 7A-C). Data har samlats in från båda rutnäten och visar nästan identiska 2D-klasser (figur 7D) och 3D-kartor (figur 7E) med ungefär 3,2 Å upplösning.
Figur 1: Arbetsflöde för de två metoderna som presenteras i detta protokoll för att förbereda och frysa ett NCP-Polβ-APE1-komplex via 1) preparativ gel och 2) storleksuteslutning. Även om de inte visas här kan dessa metoder kombineras (figur 6), börja med (1) och rena det koncentrerade komplexet från (1) med hjälp av en storlekskolonn. Detta kommer att kräva en fördubbling av utgångsmaterialet för de nationella kontaktpunkterna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa NCP-rekonstitueringar. (A) DNA titrerades med ökande mängder histonokromer vid förhållandena 1:0.9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2, DNA:oktamer. (B) Duplicera storskaligt monterade NCP (1:2, DNA:oktamer). Rekonstituering elektrofores i en 6% icke-denaturerande polyakrylamidgel, följt av sybrgrön I-färgning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Schematisk bild av genetiskt smält Polβ-APE1 med MBP vid dess N-terminal. MBP-Polβ-APE1 fusionsprotein karakteriserades enzymatiskt för båda aktiviteterna (data visas inte). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: MBP-Polβ-APE1-bindning till nationella kontaktpunkter. Nukleosomalt substrat (100 nM) inkuberades med ökande mängder MBP-Polβ-APE1 under 15 minuter på is. Bundet och obundet NCP separerades i en 6% polyakrylamid icke-denaturerande gel, följt av sybrgrön I-färgning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Analys av lyckade och misslyckade tvärbindningsresultat. Elueringsprofilen för komplexet visas i (A) med toppen av intresse märkt. Fraktioner, betecknade med "F", uppsamlade från denna eluering analyserades i en 16% tricinpolyakrylamidgel och visades i (B). (C) Provet från (B) frystes med håliga kolstödgaller och avbildades med hjälp av 200 kV fältemission kryotransmissionselektronmikroskop. Motsvarande misslyckade experiment visas i (D), (E) och (F). Observera att dessa misslyckade experiment innehåller fusionsproteinet utan MBP. HOC och HOD betecknar histonoktamer koncentrerad respektive utspädd; RT betecknar rumstemperatur; "X" motsvarar tvärbindning med glutaraldehyd. Skalstänger = 100 nm (C, F). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Beredning av NCP-Polβ-APE1-komplexet med användning av de två metoderna samtidigt. (A) Obundet och bundet (1:1, NCP-Polβ-APE1) analyserades i 6% polyakrylamid icke-denaturerande gel (observera att vid detta förhållande är endast 50% bunden). (B) Elutionsprofil för NCP-Polβ-APE1-komplexet från en storlekskolonn. c) Analys av eluerade fraktioner i en 16-procentig tricinpolyakrylamidgel. fraktioner poolades och koncentrerades, enligt vad som anges. (D) Provet frystes och avbildades enligt beskrivningen i figur 5B. Databehandlingen visade inte en ytterligare densitet motsvarande Polβ-APE1 (visas inte). "X" i banorna 5 och 6 betecknar tvärbindning med glutaraldehyd enligt protokollet. Skalstång = 100 nm (D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Analys av NCP-MBP-Polβ-APE1-komplexet . (A) Prover från de olika stegen i de metoder som illustreras i figur 1 elektrofores i en 6% polyakrylamid icke-denaturerande gel. Observera att komplex bildning är reproducerbar med de två metoderna. (B,C) Representativa rutnätsbilder tagna med hjälp av ett 300 kV transmissionselektronmikroskop där de röda rutorna markerar olika orienteringar av komplexet (av vilka vissa motsvarar de 2D-klasser som visas i (D). (E) Data bearbetade från (C) visar en 3D-karta med 3,2 Å upplösning av NCP-MBP-Polβ-APE1-komplexet.). Skalstänger = 100 nm (B, C). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Oligonukleotidnamn | Sekvens (5'-->3') | Reningsskala | Metod för rening | Antal beställda injektionsflaskor | ||
| Kompletterande programområde för UND | TGATGGACCCTATACGCGGCCGCCCTGGAGAAT CCCGGTGCCGAGGCCGCTCAATTGGTCGTAGA CAGCTCTAGCACCGCTTAAACGCACGTACGCGC TGTCCCCCGCGTTTTAACCGCCAAGGGGATTAC TCCCTAGTCTCCAGGCACGTGTCAGATATCAAC ATCCTGTGCATGTATTGAACAGCGACCTTGCCG |
20 nmol | SIDA renad | 6 | ||
| 161mer | /5Phos/GATATCTGACACGTGCCTGGAGACTAGG GAGTAATCCCCTTGGCGGTTAAAACGCGGGGG ACAGCGCGTACGTGCGTTTAAGCGGTGCTAGA GCTGTCTACGACCAATTGAGCGGCCTCGGCA CCGGGATTCTCCAGGGGCGGCCGCGTATAGGG TCCATCA |
20 nmol | SIDA renad | 4 | ||
| 35mer | CGGCAAGGTCGCTGTTCAATACATGCACAGG ATGT |
250 nmol | HPLC | 1 | ||
Tabell 1: DNA-substrat. Tre oligonukleotider glödgades för att generera dsDNA-substratet. De understrukna sektionerna är 25 bp länk-DNA som flankerar DNA-positioneringssekvensen 147 bp 601 innehållande ett enda nukleotidgap.
| Steg | Temperatur (°C) | Tid (min)/steg |
| 1 | 95 | 10 |
| 2-5 | 90, 85, 80, 75 | 5 |
| 6-41 | 69 minskning med 1 | 3 |
| 42 | 4 | hålla |
Tabell 2: Glödgning av temperaturgradient. Oligos inkuberades i en termocykler vid dessa temperaturer för att generera dsDNA-substratet.
| Komponenter (lager) | Volym/belopp | Slutlig koncentration |
| 3M KCl | 167 ml | 0.250 meter |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 20 ml | 10 mM |
| 0,5 meter EDTA | 4 ml | 1 mM |
| 1 M DTT | 2 ml | 1 mM |
| KÄKAR | 2 g | 1,6 mM |
| QS med dH2O för att göra 2L | ||
Tabell 3: RBlåg rekonstitueringsbuffert. Instruktioner för att göra 2 L som tidigare rapporterats14, förutom 1,6 mM CHAPS lades till.
| Komponenter (lager) | Volym/belopp | Slutlig koncentration |
| 3M KCl | 267 ml | 2 meter |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 4 ml | 10 mM |
| 0,5 meter EDTA | 800 μL | 1 mM |
| 1 M DTT | 400 μL | 1 mM |
| KÄKAR | 0,4 gr | 1,6 mM |
| QS med dH2O för att göra 400 ml | ||
Tabell 4: RBhög rekonstitueringsbuffert. Instruktioner för att göra 400 ml som tidigare rapporterats14, förutom 1,6 mM CHAPS lades till.
| Komponenter (lager) | Volym | Slutlig koncentration |
| 3M KCl | 16,7 ml | 50 mM |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 10 ml | 10 mM |
| 0,5 meter EDTA | 2 ml | 1 mM |
| 1 M DTT | 1 ml | 1 mM |
| QS med dH2O för att göra 1L | ||
Tabell 5: RB50mM beredningsbuffert. Anvisningar för att göra 1 l beredningsbuffert kompatibel för frysning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett specifikt protokoll för rening av DNA-reparationsfaktorn kommer att vara beroende av enzymet av intresse. Det finns emellertid några allmänna rekommendationer, inklusive användning av rekombinanta metoder för proteinuttryck och rening18; om proteinet av intresse är för litet (<50 kDa) hade strukturbestämning med kryo-EM varit nästan omöjligt tills nyligen genom användning av fusionssystem19, nanokroppsbindande byggnadsställningar20 och optimering av avbildningsstrategier21.
Det är ganska vanligt att få nät av dålig kvalitet i början. Inledande försök att bestämma NCP-homogenitet och stabilitet utan tvärbindare, med användning av uranylacetat och kolbelagda kopparnät för negativ färgning, visade stabila, snyggt spridda NCP med minimal aggregering. Men när detta prov förglasades (vid 20x högre koncentration) i kryo-EM-galler detekterades inga partiklar. Provoptimering för att förhindra att NCP: erna faller sönder eller aggregeras var det största hindret. Dessutom beskrivs två beredningsmetoder separat; De utesluter dock inte varandra och kan användas rygg mot rygg genom att först rena NCP via en preparativ gel, komplexisera den med reparationsfaktorn och rena komplexet med en storleksuteslutningskolonn. Detta kräver dubbelt så mycket material för det första steget, och det är också mer tidskrävande, men användbart för svåra prover (figur 6).
Att hitta en utgångspunkt för koncentrationen av tvärbindare var svårt på grund av bristen på konsekvens i metoderna för tvärbindning och mängden tvärbindare som används av andra22,23. Försök att replikera den mindre kontrollerade tvärbindningsreaktionen på bänkskivan som beskrivs av Anderson et al. misslyckades med att ge positiva resultat, och komplexet var alltför tvärbundet. Detta beror sannolikt på källan till glutaraldehyd (nyöppnad ampull jämfört med långvarig lagrad glutaraldehyd). Eftersom denna detaljnivå ofta utelämnas i icke-metoder, forskningsartiklar, är det svårt att replikera de exakta villkoren som utgångspunkt. Optimala resultat erhölls när komplexet tvärfästes i en koncentration av 1,2 μM i 150 mM KCl jonstyrka jämfört med tvärbindning av komplexet vid 10 μM NCP, vid samma glutaraldehydkoncentration på 0,005% i 13 min vid rumstemperatur. Tvärbindningseffektiviteten är sannolikt också beroende av det komplex som bildas eftersom vissa kromatininteragerande faktorer kan inducera/kräva större destabilisering, vilket påverkar var tvärbindningen kommer att ske och den totala effekten på NCP-stabiliteten. Därför, även om optimering av dessa förhållanden är oundviklig, kommer det att vara avgörande att hitta kritiska steg som optimal NCP och saltkoncentration under tvärbindningsreaktionerna.
En annan viktig parameter var förhållandet mellan NCP:DRF som gav tillräckligt många molekyler på nätet innehållande DRF bundet till NCP. Faktum är att denna parameter också har identifierats av andra som en som är avgörande för att optimera för strukturstudier16 med tanke på att även för kryo-EM är homogeniteten i hur DRF binder till NCP viktig för 3D-kartan. Att inte optimera detta kan ge obunden eller heterogen, icke-specifik bindning. När ett molförhållande på 1: 1 användes, vilket endast gav 50% NCP bunden av DRF (figur 6), visade 3D-kartan ingen ytterligare densitet som motsvarade DRF. Därför är det viktigt att bestämma förhållandet som ger ett enda band på samma plats på en EMSA och visar en enda topp på kromatogrammet i en storlekskolonn, motsvarande komplexet. Flera parametrar för frysning av gallren, inklusive fläcktiden, lade till flera optimeringsomgångar.
Sammantaget ger detta protokoll detaljerade instruktioner för första gången om två olika metoder för att förbereda nukleosomala komplex för kryo-EM-strukturbestämning. Baslinjeparametrarna för den angivna nätberedningen kan användas som utgångspunkt. Och även om inte en enda metod fungerar lika bra för alla makromolekylära komplex, kommer fokus på att optimera parametrarna som beskrivs i detta protokoll att begränsa strategin för skräddarsydd optimering av andra nukleosomala komplex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Mario Borgnia från cryo-EM-kärnan vid National Institute of Environmental Health Sciences och Dr. Joshua Strauss från University of North Carolina at Chapel Hill för deras mentorskap och utbildning i kryo-EM-nätberedningen. Vi tackar också Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende för teknisk hjälp i de inledande stadierna av detta projekt. Vi uppskattar det viktiga bidraget och stödet från den avlidne Dr. Samuel H. Wilson och hans laboratoriemedlemmar, särskilt Dr. Rajendra Prasad och Dr. Joonas Jamsen för rening av det genetiskt smälta APE1-Polβ-komplexet. Forskning har fått stöd av det intramurala forskningsprogrammet vid National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [bidragsnummer Z01ES050158, Z01ES050159 och K99ES031662-01].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640--6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S.
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. Guide to Protein Purification. 463, Academic Press. (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
