Summary
Este protocolo describe en detalle la preparación de complejos nucleosómicos utilizando dos métodos de preparación de muestras para congelar rejillas TEM.
Abstract
La reparación del ADN en el contexto de la cromatina es poco conocida. Los estudios bioquímicos que utilizan partículas de núcleo de nucleosomas, la unidad de repetición fundamental de la cromatina, muestran que la mayoría de las enzimas de reparación del ADN eliminan el daño del ADN a tasas reducidas en comparación con el ADN libre. Los detalles moleculares sobre cómo las enzimas de reparación por escisión de bases (BER) reconocen y eliminan el daño del ADN en los nucleosomas no se han dilucidado. Sin embargo, los datos bioquímicos de BER de sustratos nucleosómicos sugieren que el nucleosoma presenta diferentes barreras estructurales dependiendo de la ubicación de la lesión de ADN y la enzima. Esto indica que los mecanismos empleados por estas enzimas para eliminar el daño del ADN en el ADN libre pueden ser diferentes a los empleados en los nucleosomas. Dado que la mayoría del ADN genómico se ensambla en nucleosomas, se necesita información estructural de estos complejos. Hasta la fecha, la comunidad científica carece de protocolos detallados para realizar estudios estructurales técnicamente viables de estos complejos. Aquí, proporcionamos dos métodos para preparar un complejo de dos enzimas BER genéticamente fusionadas (polimerasa β y endonucleasa AP1) unidas a un espacio de un solo nucleótido cerca de la entrada-salida del nucleosoma para la determinación estructural de la criomicroscopía electrónica (crio-EM). Ambos métodos de preparación de muestras son compatibles para vitrificar rejillas de calidad mediante congelación por inmersión. Este protocolo se puede utilizar como punto de partida para preparar otros complejos nucleosómicos con diferentes factores BER, factores de transcripción pioneros y enzimas modificadoras de la cromatina.
Introduction
El ADN eucariota es organizado y compactado por proteínas histonas, formando cromatina. La partícula del núcleo del nucleosoma (NCP) constituye la unidad de repetición fundamental de la cromatina que regula la accesibilidad a las proteínas de unión al ADN para la reparación, transcripción y replicación del ADN1. Aunque la primera estructura cristalina de rayos X del NCP se resolvió por primera vez hace más de dos décadas2 y se han publicado muchas más estructuras del NCPdesde 3,4,5,6, los mecanismos de reparación del ADN en sustratos nucleosómicos aún no se han delineado. Descubrir los detalles moleculares subyacentes a la reparación del ADN en la cromatina requerirá la caracterización estructural de los componentes participantes para comprender cómo las características estructurales locales del NCP regulan las actividades de reparación del ADN. Esto es particularmente importante en el contexto de la reparación por escisión de bases (BER) dado que los estudios bioquímicos con enzimas BER sugieren mecanismos únicos de reparación del ADN en nucleosomas que dependen de los requisitos estructurales específicos de la enzima para la catálisis y la posición estructural de la lesión del ADN dentro del nucleosoma 7,8,9,10,11,12,13 . Dado que el BER es un proceso vital de reparación del ADN, existe un interés considerable en llenar estos vacíos y al mismo tiempo establecer un punto de partida desde el cual se puedan llevar a cabo otros estudios estructurales técnicamente factibles que involucren complejos nucleosómicos relevantes.
Cryo-EM se está convirtiendo rápidamente en el método de elección para resolver la estructura tridimensional (3D) de complejos cuya preparación a gran escala de muestras homogéneas es un desafío. Aunque el diseño y la purificación de NCP complejados con un factor de reparación del ADN (NCP-DRF) probablemente requerirán una optimización personalizada, el procedimiento presentado aquí para generar y congelar un complejo NCP-DRF estable proporciona detalles sobre cómo optimizar la preparación de la rejilla crio-EM y de la muestra. Dos flujos de trabajo (no mutuamente excluyentes) que se muestran en la figura 1 y los detalles específicos del protocolo identifican los pasos críticos y proporcionan estrategias para optimizarlos. Este trabajo impulsará el campo de la cromatina y la reparación del ADN en una dirección en la que complementar los estudios bioquímicos con estudios estructurales sea técnicamente factible para comprender mejor los mecanismos moleculares de la reparación del ADN nucleosómico.
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Protocol
1. Ensamblar partículas de núcleo de nucleosomas a través de diálisis de protección salina
NOTA: La preparación de partículas nucleosómicas del núcleo utilizando proteínas histonas recombinantes para estudios estructurales ha sido ampliamente descrita en detalle por otros14,15,16. Seguir la purificación de las histonas recombinantes de X. laevis y el conjunto de octameros de histonas descrito por otros14,15, y ensamblar el sustrato nucleosómico como se describe a continuación.
- Compre tres oligonucleótidos (enumerados en la Tabla 1) en la escala indicada: UND-197mer, 161mer, 35mer.
- PAGE purifica los ecrómeros (197mer y 161mer) como se describe17.
- Cantidades aneales equimolares de oligonucleótidos en 1x tampón de recocido (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl). Por ejemplo, mezcle 40 μL de 161-mer [166.7 μM]; 8 μL de 35 meres [292,4 μM]; 16,8 μL de hebra comp de 197 mer [408,2 μM]; 10 μL de tampón recocílico 10x y 10,9 μL dedH2O.
NOTA: Es fundamental controlar la reacción de recocido con un gradiente de temperatura. Consulte la Tabla 2 para obtener detalles sobre el gradiente de temperatura.
- Cantidades aneales equimolares de oligonucleótidos en 1x tampón de recocido (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl). Por ejemplo, mezcle 40 μL de 161-mer [166.7 μM]; 8 μL de 35 meres [292,4 μM]; 16,8 μL de hebra comp de 197 mer [408,2 μM]; 10 μL de tampón recocílico 10x y 10,9 μL dedH2O.
- PAGE purifica los ecrómeros (197mer y 161mer) como se describe17.
- Realizar reconstituciones a pequeña escala (escala por un factor de 1/57 del ejemplo que se muestra a continuación para un volumen final de 50 μL) para determinar la proporción de ADN a octamer de histona (las proporciones iniciales típicas de ADN:octámero son las siguientes: 1:0.9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2; se muestra en la Figura 2A); Es fundamental determinar esta relación empíricamente con reconstituciones a pequeña escala.
- Después de determinar esta proporción, prepare una reconstitución a gran escala. Por ejemplo, mezcle 32.9 μL de ADN-197 pb [99.4 μM]; 1647,1 μL de TE (1x); 1120 μL de 5 M NaCl, y 62,3 μL de octamer de histona WT [2,56 μM].
- Hacer tampones de diálisis: RBbajo y RBalto como se describe en la Tabla 3 y Tabla 4, respectivamente; establecer las reconstituciones como se describió anteriormente14.
- Transfiera el tubo de diálisis al vaso de precipitados que contiene RBalto, y permita que la diálisis continúe, con una agitación suave, durante 16 h o hasta que se hayan transferido 2 LRB bajos al vaso de precipitados de desecho.
- Transfiera el tubo de diálisis a un vaso de precipitados de 1 L que contenga tampón RB50mM (Tabla 5) y deje que la muestra se dialice durante al menos 3 h o durante la noche.
- Evaluar la eficiencia de reconstitución en un gel no desnaturalizante de poliacrilamida al 6%, asegurando que haya menos del 10% de ADN libre y una sola banda NCP; almacenar los NCP a 4 °C. Ver Figura 2A (carril 5) y Figura 2B para obtener resultados representativos óptimos de reconstitución.
2. Preparar el complejo del factor de reparación NCP-ADN (NCP-DRF)
- Purificación por electroforesis en gel preparativo
NOTA: Este método es el más laborioso (de los dos descritos), y aunque es eficaz para eliminar especies de alto peso molecular (HMW) (Figura 6A) debido al alto factor de dilución, puede conducir a cierto desmontaje como se muestra en Figura 7A (NCP prep cell out lane), liberando ADN. Sin embargo, hasta un 25% de ADN libre sigue siendo compatible con los estudios crio-EM. Debido a la alta dilución, use este método para purificar solo el NCP, en lugar de todo el complejo.- Prepare 70 ml de solución de gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 6% en 0.2x TBE, usando solución de gel de poliacrilamida 37.5: 1, acrilamida: bisacrilamida. Vierta un gel cilíndrico con un radio exterior de 28 mm y polimerice durante la noche.
- Ensamble el aparato de gel preparativo que funciona, utilizando una membrana de diálisis con un corte de 6-8 kDa MW. Utilice 0,25x TBE como tampón de funcionamiento y 1x tampón de elución (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Pre-ejecute el gel cilíndrico a una constante de 12 W durante 1 h, y recoja las fracciones que hacen funcionar la bomba peristáltica a un caudal de aproximadamente 1 ml / min.
NOTA: Si no se dispone de un detector UV para identificar fracciones que contienen ADN, se puede realizar un experimento de cribado con 32P-NCP para identificar las fracciones de interés. Manteniendo todas las condiciones iguales, los NCP no etiquetados se pueden purificar sin un detector UV. - Concentrar los 2,8 ml de NCP a 250 μL utilizando un filtro centrífugo (corte MW 30 kDa), y cargar en el gel preparativo y electroforeso durante un total de 6 h. A las 2 h, cuando el cianol de xileno se haya quedado sin gel, comience a recolectar fracciones de 1,5 ml.
NOTA: A las 2,5 h, las fracciones estarán libres de cianol xileno; el ADN (197mer) se eluye aproximadamente a las 3-3,5 h, y se espera que el NCP se eluya a las 4,5-5 h. - Analizar fracciones de interés en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 6%. Agrupe fracciones que contengan el NCP, y concentre inmediatamente con un filtro centrífugo (corte MW 30 kDa) a 1 mg/mL. Al día siguiente, evalúe la calidad del NCP en un gel no desnaturalizante de poliacrilamida al 6% antes de crear complejos con el factor de reparación del ADN (DRF) de interés.
- Incubar el NCP y el DRF de interés en hielo durante 15 minutos utilizando un amortiguador óptimo para el complejo específico. Por ejemplo, mezclar 1.000 μL de NCP [1,2 μM]; 260 μL de tampón de unión 5x (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL de 3 M KCl y 18 μL de MBP-Pol β-APE1 [338 μM].
NOTA: La temperatura y la fuerza iónica a la que se fabrica el complejo pueden necesitar optimización para diferentes complejos. - Añadir glutaraldehído (recién abierto; EM) hasta una concentración final del 0,005%. Por lo tanto, a esta reacción, agregue 26.8 μL de glutaraldehído al 0.25% con 13.2 μL dedH2O. Mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 13 min.
- Enfriamiento con 1 M Tris-Cl, pH 7.5, hasta una concentración final de 20 mM Tris-Cl, pH 7.5. Concentrar a ~50 μL e intercambiar el tampón con 1x tampón de congelación: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7.5 usando una columna de desalinización.
PRECAUCIÓN: El glutaraldehído puede causar quemaduras graves en la piel y daño ocular; Es perjudicial si se ingiere, y es tóxico si se inhala. Use una bata de laboratorio, gafas, guantes y maneje glutaraldehído en una campana extractora y use una máscara.
NOTA: Es crítico realizar la reacción de reticulación en un gran volumen con el NCP a esta concentración más baja. Los intentos previos de reticulación, incluso a esta concentración de glutaraldehído, pero a una NCP concentrada 10 veces mayor llevaron a la agregación de la muestra y a la reticulación excesiva como lo indica SDS PAGE y la cromatografía de exclusión de tamaño. Estas rejillas no tenían partículas discernibles con solo grumos (Figura 5D, E). - Determinar las absorbancias en OD 280 y OD 260 y concentrarse aún más si es necesario para alcanzar 1.3-3 mg / ml, basado en OD 280 (la relación típica de OD260 / OD 280 = 1.7-2 produce partículas buenas). Para este pequeño volumen de 50 μL, el mejor método para reducir la pérdida de muestra es hacer un botón de diálisis con una tapa de un tubo de 1,7 ml cubierto por una membrana de diálisis (corte de 6-8 kDa MW), cortando la parte inferior del tubo y usando el borde del tubo para sellar la membrana en la parte superior de la tapa.
- Coloque el botón de diálisis que contiene la muestra sobre un lecho de polietilenglicol, con la membrana hacia abajo (verifique el progreso cada 2 minutos). Este método se prefiere cuando la concentración necesaria es menor o igual a 2,5 veces para evitar diluir o perder la muestra en el concentrador. Es fundamental preparar inmediatamente las rejillas crio-EM del complejo después de este paso.
- Purificación por cromatografía de exclusión de tamaño
- El día antes de la congelación, lavar y equilibrar una columna de exclusión de tamaño con 60 mL dedH2O, seguido de 80 mL de tampón de congelación (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) durante la noche a una velocidad de 0,4 mL/min. Usando NCP inmediatamente después de la reconstitución, prepare el mismo complejo usando cantidades 2.5 veces mayores de la siguiente manera: mezcle 2,500 μL de NCP [1.2 μM]; 650 μL de tampón de unión 5x; 45 μL de MBP-Pol β-APE1 [338 μM] y 55 μL de 3M KCl.
- Incubar la mezcla en hielo sin reticulación durante 15 min. Luego, agregue glutaraldehído a una concentración final de 0.005% como se describe en el método de gel preparativo. En este caso, sin embargo, concentrar el complejo en un filtro centrífugo preequilibrado (con tampón de congelación) a aproximadamente 120 μL.
- Analice inmediatamente las fracciones pico y concentre aquellas fracciones que contengan las histonas y MBP-Pol β-APE1 como se indicó anteriormente. Consulte la Figura 5A, B, C para obtener resultados exitosos utilizando el método de exclusión de tamaño y la Figura 7 utilizando ambos métodos.
3. Congelar complejo nucleosomal
- Después de encender el congelador de inmersión y llenar el humidificador con 50 ml de dH2O, ajuste la temperatura de la cámara a 22 °C y HR (humedad) al 98%. Coloque la taza de etano y la taza de nitrógeno líquido (que contiene una caja de rejilla etiquetada) en sus respectivos soportes de espacio.
- Cubra la taza de etano con el dispensador de tapa de etano y vierta cuidadosamente nitrógeno líquido (LN2) sobre ella, mientras también llena la taza LN 2 con LN2. Cuando el nivel de LN2 se haya estabilizado y alcance el 100% y una temperatura de -180 °C, abra con cuidado la válvula de etano y llene la copa de etano hasta que forme una burbuja en la tapa transparente. Retire el dispensador de etano.
- Coloque dos papeles de filtro en el dispositivo secante y asegúrelos con un anillo de metal. Vaya a la configuración y utilice los siguientes parámetros para la secación: 0 pre-blot, 3 s blot, 0 post-blot; seleccione A-plunge y haga clic en OK.
- En la pantalla principal, haga clic en Cargar pinzas y cárguelas con una cuadrícula con el lado de carbono / aplicación mirando hacia la izquierda (preparado como antes). Calibre las pinzas ajustando el eje Z para asegurar una mancha sólida. Haga clic en Cámara inferior y aplique 3 μL del complejo (1.3-3 mg / ml; OD280). Haga clic en Blot / A-plunge. Esto hará girar la rejilla para que se borre desde el frente y la congelará.
- Transfiera y almacene la rejilla en la caja de rejilla en la cámara LN2 . Cuando las cuatro rejillas se hayan congelado y colocado en la caja de rejilla, gire la tapa a una posición neutral, donde todas las rejillas estén cubiertas por la tapa, y apriete el tornillo. Las rejillas se pueden almacenar en LN2 hasta que se inicie la detección.
4. Cuadrículas de pantalla
- Antes de cargar las muestras en el microscopio, coloque las rejillas vitrificadas en un anillo y asegúrelas con un clip en C. Realice este proceso de recorte bajo LN2 en una habitación con humedad controlada, para evitar la contaminación del hielo.
- Al cargar el microscopio, inserte las rejillas en un casete de 12 ranuras. Inserte el casete en una cápsula nanocab y cárguelo en el cargador automático. El mecanismo robótico del cargador automático inicia el proceso.
- Transfiera la rejilla del casete a la etapa de microscopio. Ajuste el escenario a la altura eucéntrica tambaleando el escenario 10° y moviendo simultáneamente la altura Z hasta que se observe un desplazamiento plano mínimo en las imágenes.
- Una vez que se alcanza la altura eucéntrica, comience a tomar imágenes. Primero, obtenga el atlas tomando una imagen de montaje de 3 x 3 de la cuadrícula, en la que cada montaje se toma con un aumento de 62x. Elija tres cuadrados de diferentes tamaños; Tome la altura eucéntrica y luego la imagen con un aumento de 210x.
- Una vez que se toma una imagen de un cuadrado, elija un agujero desde el borde, el centro y el medio dentro de los cuadrados. Imagen de cada agujero con un aumento de 2600x.
- Antes de tomar esta imagen de gran aumento, el enfoque automático se produce en un desplazamiento del área de imagen. Tome la imagen de gran aumento desde el centro del orificio con un aumento de 36,000x y un tiempo de exposición de 7.1 s, 60 cuadros, tamaño de 1.18 píxeles y desenfoque de 3 μm. Vea imágenes representativas de la detección en la Figura 5, Figura 6 y Figura 7.
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Representative Results
Se utilizaron NCP correctamente ensamblados (Figura 2) para hacer un complejo con una proteína de fusión recombinante de MBP-Polβ-APE1 (Figura 3). Para determinar la relación de NCP a MBP-Polβ-APE1 para formar un complejo estable, realizamos ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) (Figura 4), que mostraron una banda desplazada individualmente de la NCP con un exceso molar de 5 veces de MBP-Polβ-APE1. Durante la optimización de la fabricación de este complejo, la reticulación con glutaraldehído fue fundamental para evitar que el NCP se desmorone. Inicialmente, el ensamblaje del complejo de NCP-Polβ-APE1 se realizó en un volumen más pequeño, a aproximadamente 10 μM NCP, utilizando una concentración final de glutaraldehído al 0,005%. En estas condiciones, la muestra estaba excesivamente reticulada (Figura 5D-E) y dio lugar a agregados sin complejos individuales discernibles. La reticulación a NCP diluidas de aproximadamente 10 veces (NCP de 1,2 μM) dio como resultado una agregación significativamente reducida y una mejor estabilidad de las partículas (Figura 5A-C). La Figura 6 ilustra que ambos métodos mostrados en la Figura 1 pueden combinarse con el gel preparativo mejorando la calidad de los NCP cuando el NCP contiene una cantidad significativa de agregados de alto peso molecular (HMW) (Figura 6A), seguido de la purificación del complejo a través de la exclusión de tamaño. Aunque esto mostró un gran éxito en la preparación de la muestra (Figura 5B-C) y las cuadrículas, produciendo partículas estables (Figura 6D), la formación subóptima del complejo (Figura 6A) produjo un mapa 3D del NCP solo (datos no mostrados). Estos resultados muestran que ambos métodos (exclusión de tamaño y gel preparativo) pueden ser utilizados independientemente para generar complejos estables (Figura 7A-C). De hecho, los datos se han recopilado de ambas cuadrículas y muestran clases 2D casi idénticas (Figura 7D) y mapas 3D (Figura 7E) con una resolución aproximada de 3,2 Å.
Figura 1: Flujo de trabajo de los dos métodos presentados en este protocolo para preparar y congelar un complejo NCP-Polβ-APE1 a través de 1) gel preparativo y 2) exclusión de tamaño. Aunque no se muestran aquí, estos métodos se pueden combinar (Figura 6), comenzando con (1) y purificando el complejo concentrado de (1) usando una columna de tamaño. Esto requerirá duplicar el material de partida de los PCN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Reconstituciones representativas de NCP. (A) El ADN se tituló con cantidades crecientes de octamer de histonas en proporciones de 1: 0.9, 1: 1.1, 1: 1.2, 1: 2, ADN: octámero. (B) Duplicar NCP ensamblados a gran escala (1:2, ADN:octámero). Las reconstituciones se electroforizaron en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 6%, seguido de tinción sybr green I. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esquema de Polβ-APE1 genéticamente fusionado con MBP en su N-terminal. La proteína de fusión MBP-Polβ-APE1 se caracterizó enzimáticamente para ambas actividades (datos no mostrados). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Unión MBP-Polβ-APE1 a NCPs. El sustrato nucleosómico (100 nM) se incubó con cantidades crecientes de MBP-Polβ-APE1 durante 15 min en hielo. El NCP unido y no unido se separó en un gel no desnaturalizante de poliacrilamida al 6%, seguido de tinción verde I de sybr. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de resultados de crosslinking exitosos y no exitosos. El perfil de elución del complejo se muestra en (A) con el pico de interés etiquetado. Las fracciones, denotadas por "F", recogidas de esta elución se analizaron en un gel de poliacrilamida tricina al 16% y se mostraron en (B). (C) La muestra de (B) se congeló utilizando rejillas de soporte de carbono perforadas y se obtuvo una imagen utilizando el microscopio electrónico de criotransmisión de emisión de campo de 200 kV. Los experimentos fallidos correspondientes se muestran en (D), (E) y (F). Tenga en cuenta que estos experimentos fallidos contienen la proteína de fusión sin MBP. HOc y HOD denotan octamero de histona concentrado y diluido, respectivamente; RT denota temperatura ambiente; "X" corresponde a la reticulación con glutaraldehído. Barras de escala = 100 nm (C, F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Preparación del complejo NCP-Polβ-APE1 utilizando los dos métodos en tándem. (A) No unidos y unidos (1:1, NCP- Polβ-APE1) se analizaron en gel antidesnaturalizante de poliacrilamida al 6% (nótese que en esta proporción sólo se une el 50%). (B) Perfil de elución del complejo NCP-Polβ-APE1 a partir de una columna de dimensionamiento. (C) Análisis de fracciones eluidas en un gel de poliacrilamida tricina al 16%; Las fracciones se agruparon y concentraron, como se indicó. (D) La muestra fue congelada y fotografiada como se describe en la Figura 5B. El procesamiento de datos no mostró una densidad adicional correspondiente a Polβ-APE1 (no mostrada). "X" en los carriles 5 y 6 denota reticulación con glutaraldehído como se indica en el protocolo. Barra de escala = 100 nm (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis del complejo NCP-MBP-Polβ-APE1. (A) Las muestras de los diferentes pasos en los métodos ilustrados en la Figura 1 se electroforesaron en un gel no desnaturalizante de poliacrilamida al 6%. Observe que la formación compleja es reproducible por los dos métodos. (B,C) Imágenes representativas de la rejilla de soporte de carbono tomadas con un microscopio electrónico de transmisión de 300 kV donde las cajas rojas resaltan diferentes orientaciones del complejo (algunas de las cuales corresponden a las clases 2D que se muestran en (D). (E) Los datos procesados de (C) muestran un mapa 3D a una resolución de 3,2 Å del complejo NCP-MBP-Polβ-APE1.). Barras de escala = 100 nm (B, C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre del oligonucleótido | Secuencia (5'-->3') | Escala de purificación | Método de purificación | Número de viales pedidos | ||
| Capítulo complementario de la UND | TGATGGACCCTATACGCGGCCGCCCTGGAGAAT CCCGGTGCCGAGGCCGCTCAATTGGTCGTAGA CAGCTCTAGCACCGCTTAAACGCACGTACGGCCC TGTCCCCCGCGTTTTAACCGCCAAGGGGATTAC TCCCTAGTCTCCAGGCACGTGTCAGATATCAAC ATCCTGTGCATGTATTGAACAGCGACCTTGCCG |
20 nmole | PÁGINA purificada | 6 | ||
| 161mer | /5Phos/GATATCTGACACGTGCCTGGAGACTAGG GAGTAATCCCCTTGGCGGTTAAAACGCGGGGG ACAGCGCGTACGTGCGTTTAAGCGGTGCTAGA GCTGTCTACGACCAATTGAGCGGCCTCGGCA CCGGGATTCTCCAGGGCGGCCGCGTATAGGG TCCATCA |
20 nmole | PÁGINA purificada | 4 | ||
| 35mer | CGGCAAGGTCGCTGTTCAATACATGCACAGG ATGT |
250 nmole | HPLC | 1 | ||
Tabla 1: Sustrato de ADN. Tres oligonucleótidos fueron recocidos para generar el sustrato de dsDNA. Las secciones subrayadas son 25 pb de ADN enlazador que flanquean la secuencia de posicionamiento de ADN 147 pb 601 que contiene una brecha de nucleótido único.
| Paso | Temperatura (°C) | Tiempo (min)/paso |
| 1 | 95 | 10 |
| 2-5 | 90, 85, 80, 75 | 5 |
| 6-41 | 69 disminución en 1 | 3 |
| 42 | 4 | sostener |
Tabla 2: Gradiente de temperatura de recocido. Los oligos se incubaron en un termociclador a estas temperaturas para generar el sustrato de dsDNA.
| Componentes (stock) | Volumen/importe | Concentración final |
| 3M KCl | 167 ml | 0,250 m |
| 1 M HEPES, pH 8.0 | 20 ml | 10 mM |
| EDTA de 0,5 m | 4 ml | 1 mM |
| TDT de 1 M | 2 ml | 1 mM |
| MUCHACHOS | 2 g | 1,6 mM |
| QS con dH2O para hacer 2L | ||
Tabla 3: Tampónde baja reconstitución RB . Instrucciones para hacer 2 L como se informó anteriormente14, excepto 1.6 mM CHAPS se agregó.
| Componentes (stock) | Volumen/importe | Concentración final |
| 3M KCl | 267 ml | 2 M |
| 1 M HEPES, pH 8.0 | 4 ml | 10 mM |
| EDTA de 0,5 m | 800 μL | 1 mM |
| TDT de 1 M | 400 μL | 1 mM |
| MUCHACHOS | 0,4 g | 1,6 mM |
| QS con dH2O para hacer 400 mL | ||
Tabla 4: Tampónde alta reconstitución RB . Se agregaron instrucciones para hacer 400 ml como se informó anteriormente14, excepto 1.6 mM CHAPS.
| Componentes (stock) | Volumen | Concentración final |
| 3M KCl | 16,7 ml | 50 mM |
| 1 M HEPES, pH 8.0 | 10 ml | 10 mM |
| EDTA de 0,5 m | 2 ml | 1 mM |
| TDT de 1 M | 1 ml | 1 mM |
| QS con dH2O para hacer 1L | ||
Tabla 5: Tampón de reconstitución RB50mM . Instrucciones para hacer compatible 1 L de tampón de reconstitución para congelación.
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Discussion
Un protocolo específico para purificar el factor de reparación del ADN dependerá de la enzima de interés. Sin embargo, hay algunas recomendaciones generales, incluyendo el uso de métodos recombinantes para la expresión y purificación de proteínas18; si la proteína de interés es demasiado pequeña (<50 kDa), la determinación de la estructura por crio-EM había sido casi imposible hasta más recientemente mediante el uso de sistemas de fusión19, andamios de unión a nanocuerpos20 y estrategias de optimización de imágenes21.
Es bastante común obtener rejillas de mala calidad en las etapas iniciales. Los intentos iniciales de determinar la homogeneidad y estabilidad de NCP sin ningún reticulante, utilizando acetato de uranilo y rejillas de cobre recubiertas de carbono para la tinción negativa, mostraron NCP estables y bien dispersos con una agregación mínima. Sin embargo, una vez que esta muestra fue vitrificada (a una concentración 20 veces mayor) en rejillas crio-EM, no se detectaron partículas. La optimización de muestras para evitar que los NCP se desmoronen o se agreguen fue el mayor obstáculo. Además, se describen por separado dos métodos de preparación; sin embargo, no son mutuamente excluyentes y se pueden usar consecutivamente purificando primero el NCP a través de un gel preparativo, complejando el factor de reparación y purificando el complejo con una columna de exclusión de tamaño. Esto requiere el doble de material para el paso inicial, y también requiere más tiempo, pero es útil para muestras difíciles (Figura 6).
Encontrar un punto de partida para la concentración de reticulante fue difícil debido a la falta de consistencia en los métodos de reticulación y las cantidades de reticulación utilizadas por otros22,23. Los intentos de replicar la reacción de reticulación menos controlada en la mesa de trabajo descrita por Anderson et al. no dieron resultados positivos, y el complejo fue demasiado entrecruzado. Esto es probablemente debido a la fuente de glutaraldehído (ampolla recién abierta en comparación con glutaraldehído almacenado a largo plazo). Debido a que este nivel de detalle a menudo se omite en artículos de investigación no métodos, es difícil replicar las condiciones exactas como punto de partida. Se obtuvieron resultados óptimos cuando el complejo se entrecruzó a una concentración de 1,2 μM en 150 mM de fuerza iónica KCl en comparación con la reticulación del complejo a 10 μM NCP, a la misma concentración de glutaraldehído de 0,005% durante 13 min a temperatura ambiente. Es probable que la eficiencia de reticulación también dependa del complejo que se está formando, ya que algunos factores que interactúan con la cromatina pueden inducir / requerir una mayor desestabilización que influya en el lugar donde se producirá la reticulación y el efecto general sobre la estabilidad de NCP. Por lo tanto, si bien la optimización de estas condiciones es inevitable, será fundamental encontrar pasos críticos como la concentración óptima de NCP y sal durante las reacciones de reticulación.
Otro parámetro importante fue la relación NCP:DRF que produjo suficientes moléculas en la red que contenía el DRF unido al NCP. De hecho, este parámetro también ha sido identificado por otros como uno que es crítico para optimizar para estudios estructurales16 dado que incluso para la crio-EM, la homogeneidad de la forma en que el DRF se une al NCP es importante para el mapa 3D. No optimizar esto puede producir una unión no consolidada o heterogénea, no específica. Cuando se utilizó una relación molar de 1:1, produciendo solo el 50% del NCP limitado por el DRF (Figura 6), el mapa 3D no mostró ninguna densidad adicional correspondiente al DRF. Por lo tanto, es importante determinar la relación que produce una sola banda en la misma ubicación en un EMSA y muestra un solo pico en el cromatograma de una columna de dimensionamiento, correspondiente al complejo. Varios parámetros para la congelación de las rejillas, incluido el tiempo de borrado, agregaron varias rondas de optimización.
En conjunto, este protocolo proporciona instrucciones detalladas por primera vez sobre dos métodos diferentes para preparar complejos nucleosómicos para la determinación estructural crio-EM. Los parámetros de referencia para la preparación de la cuadrícula proporcionados se pueden utilizar como punto de partida. Y aunque no un solo método funciona igual de bien para todos los complejos macromoleculares, centrarse en la optimización de los parámetros descritos en este protocolo reducirá la estrategia para la optimización personalizada de otros complejos nucleosómicos.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Mario Borgnia del núcleo crio-EM en el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental y al Dr. Joshua Strauss de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill por su tutoría y capacitación en la preparación de la red crio-EM. Juliana Mello Da Fonseca Rezende por su asistencia técnica en las etapas iniciales de este proyecto. Apreciamos la contribución clave y el apoyo del difunto Dr. Samuel H. Wilson y sus miembros de laboratorio, especialmente el Dr. Rajendra Prasad y el Dr. Joonas Jamsen para la purificación del complejo APE1-Polβ genéticamente fusionado. La investigación ha sido apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental [números de subvención Z01ES050158, Z01ES050159 y K99ES031662-01].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640--6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
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