Summary
Denne protokollen skisserer i detalj fremstillingen av nukleosomale komplekser ved hjelp av to metoder for prøvepreparering for frysing av TEM-nett.
Abstract
DNA-reparasjon i sammenheng med kromatin er dårlig forstått. Biokjemiske studier ved bruk av nukleosomkjernepartikler, den grunnleggende repeterende enheten av kromatin, viser at de fleste DNA-reparasjonsenzymer fjerner DNA-skade ved reduserte hastigheter sammenlignet med fritt DNA. De molekylære detaljene om hvordan baseeksisjonsreparasjon (BER) enzymer gjenkjenner og fjerner DNA-skade i nukleosomer har ikke blitt belyst. Imidlertid antyder biokjemiske BER-data fra nukleosomale substrater at nukleosomet presenterer forskjellige strukturelle barrierer avhengig av plasseringen av DNA-lesjonen og enzymet. Dette indikerer at mekanismene som brukes av disse enzymene for å fjerne DNA-skade i fritt DNA, kan være forskjellige fra de som brukes i nukleosomer. Gitt at flertallet av genomisk DNA er samlet inn i nukleosomer, er strukturell informasjon av disse kompleksene nødvendig. Til dags dato mangler det vitenskapelige samfunn detaljerte protokoller for å utføre teknisk gjennomførbare strukturelle studier av disse kompleksene. Her gir vi to metoder for å fremstille et kompleks av to genetisk smeltede BER-enzymer (Polymerase β og AP Endonuclease1) bundet til et enkelt-nukleotidgap nær inngang-utgangen av nukleosomet for kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) strukturell bestemmelse. Begge metodene for prøvepreparering er kompatible for å vitrifisere kvalitetsgitter via dypfrysing. Denne protokollen kan brukes som utgangspunkt for å fremstille andre nukleosomale komplekser med forskjellige BER-faktorer, pionertranskripsjonsfaktorer og kromatinmodifiserende enzymer.
Introduction
Eukaryot DNA er organisert og komprimert av histonproteiner, som danner kromatin. Nukleosomkjernepartikkelen (NCP) utgjør den grunnleggende repeterende enheten av kromatin som regulerer tilgjengeligheten til DNA-bindende proteiner for DNA-reparasjon, transkripsjon og replikasjon1. Selv om den første røntgenkrystallstrukturen til NCP først ble løst for mer enn to tiår siden2 og mange flere strukturer av NCP har blitt publisert siden 3,4,5,6, har DNA-reparasjonsmekanismer i nukleosomale substrater ennå ikke blitt avgrenset. Å avdekke de molekylære detaljene som ligger til grunn for DNA-reparasjon i kromatin vil kreve strukturell karakterisering av de deltakende komponentene for å forstå hvordan lokale strukturelle trekk ved NCP regulerer DNA-reparasjonsaktiviteter. Dette er spesielt viktig i sammenheng med baseeksisjonsreparasjon (BER), gitt at biokjemiske studier med BER-enzymer antyder unike DNA-reparasjonsmekanismer i nukleosomer som er avhengige av enzymspesifikke strukturelle krav til katalyse og strukturposisjonen til DNA-lesjonen i nukleosomet 7,8,9,10,11,12,13 . Gitt at BER er en viktig DNA-reparasjonsprosess, er det stor interesse for å fylle ut disse hullene, samtidig som det etableres et utgangspunkt hvorfra andre teknisk gjennomførbare strukturelle studier som involverer relevante nukleosomale komplekser kan utføres.
Cryo-EM er raskt i ferd med å bli den foretrukne metoden for å løse den tredimensjonale (3D) strukturen til komplekser hvis storskala fremstilling av homogen prøve er utfordrende. Selv om design og rensing av kontaktpunkter kompleksert med en DNA-reparasjonsfaktor (NCP-DRF) sannsynligvis vil kreve skreddersydd optimalisering, gir prosedyren som presenteres her for å generere og fryse et stabilt NCP-DRF-kompleks detaljer om hvordan man optimaliserer prøven og klargjøring av kryo-EM-nettet. To arbeidsflyter (ikke gjensidig utelukkende) vist i figur 1, og de spesifikke detaljene i protokollen identifiserer kritiske trinn og gir strategier for å optimalisere disse trinnene. Dette arbeidet vil drive kromatin- og DNA-reparasjonsfeltet i en retning der komplementering av biokjemiske med strukturelle studier blir teknisk mulig for bedre å forstå molekylære mekanismer for nukleosomal DNA-reparasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monter nukleosomkjernepartikler via saltgardientdialyse
MERK: Fremstillingen av nukleosomkjernepartikler ved bruk av rekombinante histonproteiner for strukturelle studier har blitt omfattende beskrevet i detalj av andre14,15,16. Følg rensingen av rekombinant X. laevis histoner og histonoktamerenhet beskrevet av andre14,15, og monter nukleosomsubstratet som beskrevet nedenfor.
- Kjøp tre oligonukleotider (oppført i tabell 1) i den angitte skalaen: UND-197mer, 161mer, 35mer.
- PAGE renser ultramerer (197mer og 161mer) som beskrevet17.
- Anneale ekvimolære mengder oligonukleotider i 1x glødebuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Bland for eksempel 40 μL 161-mer [166,7 μM]; 8 μL av 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL 197-mer komp-streng [408,2 μM]; 10 μL 10x anneal buffer og 10,9 μL dH2O.
MERK: Det er viktig å kontrollere glødereaksjonen med en temperaturgradient. Se tabell 2 for detaljer om temperaturgradienten.
- Anneale ekvimolære mengder oligonukleotider i 1x glødebuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Bland for eksempel 40 μL 161-mer [166,7 μM]; 8 μL av 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL 197-mer komp-streng [408,2 μM]; 10 μL 10x anneal buffer og 10,9 μL dH2O.
- PAGE renser ultramerer (197mer og 161mer) som beskrevet17.
- Utfør småskala rekonstitueringer (skala med en faktor på 1/57 av eksemplet vist nedenfor for et endelig volum på 50 μL) for å bestemme forholdet mellom DNA og histonoktamer (typiske startforhold for DNA:oktamer er som følger: 1:0,9, 1:1,1, 1:1,2, 1:2; vist i figur 2A); Det er avgjørende å bestemme dette forholdet empirisk med småskala rekonstitusjoner.
- Etter at dette forholdet er bestemt, utfør en storskala rekonstituering. Bland for eksempel 32,9 μL DNA-197 bp [99,4 μM]; 1647,1 μL TE (1x); 1120 μL av 5 M NaCl, og 62,3 μL WT histonoktamer [2,56 μM].
- Dialysebuffere: RBlav og RBhøy som beskrevet i henholdsvis tabell 3 og tabell 4; Sett opp rekonstitueringene som tidligere beskrevet14.
- Overfør dialyseslangen inn i begeret som inneholder RBhøyt, og la dialysen fortsette, under forsiktig omrøring, i 16 timer eller til 2 l RBlav er overført til avfallsbegeret.
- Overfør dialyseslangen til et 1 l beger inneholdende RB50 mM buffer (tabell 5) og la prøven dialysere i minst 3 timer eller over natten.
- Evaluer effektiviteten av rekonstituering på en 6 % ikke-denaturerende gel av polyakrylamid, og sørg for at det er mindre enn 10 % fritt DNA og ett enkelt NCP-bånd. lagre kontaktpunkter ved 4 °C. Se figur 2A (bane 5) og figur 2B for representative optimale rekonstitueringsresultater.
2. Forbered NCP-DNA reparasjonsfaktorkompleks (NCP-DRF)
- Rensing ved preparativ gelelektroforese
MERK: Denne metoden er den mest arbeidskrevende (av de to beskrevne), og mens den er effektiv til å fjerne høymolekylære (HMW) arter (Figur 6A) på grunn av den høye fortynningsfaktoren, kan det føre til noe demontering som vist i Figur 7A (NCP prep cell out lane), frigjør DNA. Imidlertid er opptil 25% fritt DNA fortsatt kompatibelt med kryo-EM-studier. På grunn av den høye fortynningen, bruk denne metoden til å rense kontaktpunktet, i stedet for hele komplekset.- Lag 70 ml 6% ikke-denaturerende polyakrylamidgeloppløsning i 0,2x TBE, ved bruk av polyakrylamidgeloppløsning 37,5: 1, akrylamid: bisakrylamid. Hell en sylindrisk gel med ytre radius på 28 mm og polymeriser over natten.
- Monter det preparative gelløpeapparatet ved hjelp av en dialysemembran med en 6-8 kDa MW cutoff. Bruk 0,25x TBE som løpende buffer og 1x elueringsbuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Kjør den sylindriske gelen på konstant 12 W i 1 time, og samle fraksjoner som kjører den peristaltiske pumpen med en strømningshastighet på ca. 1 ml / min.
MERK: Hvis en UV-detektor ikke er tilgjengelig for å identifisere fraksjoner som inneholder DNA, kan et screeningeksperiment med 32P-NCP utføres for å identifisere fraksjonene av interesse. Ved å holde alle forholdene like, kan umerkede NCP-er deretter renses uten UV-detektor. - Konsentrer 2,8 ml NCP til 250 μL ved hjelp av et sentrifugalfilter (MW cutoff 30 kDa), og last på den preparative gelen og elektroforesen i totalt 6 timer. Ved 2 timer, når xylencyanolen har gått tom for gelen, begynner du å samle 1,5 ml fraksjoner.
MERK: Ved 2,5 timer vil fraksjoner være klare av xylencyanol; DNA (197mer) eluerer ved ca. 3-3,5 timer, og NCP forventes å eluere ved 4,5-5 timers merke. - Analyser fraksjoner av interesse på en 6% ikke-denaturerende polyakrylamidgel. Bassengfraksjoner som inneholder NCP, og konsentreres umiddelbart med et sentrifugalfilter (MW cutoff 30 kDa) til 1 mg/ml. Neste dag, evaluer kvaliteten på NCP på en 6% polyakrylamid ikke-denaturerende gel før kompleksisering med DNA-reparasjonsfaktoren (DRF) av interesse.
- Inkuber kontaktpunktet og DRF av interesse på is i 15 minutter ved å bruke en optimal buffer for det spesifikke komplekset. Bland for eksempel 1000 μL NCP [1,2 μM]; 260 μL 5x bindingsbuffer (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL 3 M KCl og 18 μL MBP- Pol β-APE1 [338 μM].
MERK: Temperaturen og ionstyrken som komplekset er laget ved, kan trenge optimalisering for forskjellige komplekser. - Tilsett glutaraldehyd (nyåpnet; EM-klasse) til en endelig konsentrasjon på 0,005%. Derfor, til denne reaksjonen, tilsett 26,8 μL 0,25% glutaraldehyd med 13,2 μLdH2O. Bland godt, og inkuber ved romtemperatur i 13 minutter.
- Slukk med 1 M Tris-Cl, pH 7,5, til en endelig konsentrasjon på 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Konsentrer til ~50 μL og bytt bufferen med 1x frysebuffer: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 ved hjelp av en avsaltingskolonne.
FORSIKTIG: Glutaraldehyd kan forårsake alvorlige hudforbrenninger og øyeskader; Det er skadelig ved svelging, og det er giftig ved innånding. Bruk en laboratoriefrakk, vernebriller, hansker og håndter glutaraldehyd i en avtrekkshette og bruk maske.
MERK: Det er avgjørende å utføre tverrbindingsreaksjonen i et stort volum med kontaktpunktet ved denne lavere konsentrasjonen. Tidligere forsøk på kryssbinding, selv ved denne konsentrasjonen av glutaraldehyd, men ved en 10x høyere konsentrert NCP førte til aggregering av prøven og over-tverrbinding som indikert av SDS PAGE og størrelse eksklusjonskromatografi. Disse ristene hadde ingen merkbare partikler med bare klumper (figur 5D,E). - Bestem absorbansene ved OD 280 og OD 260 og konsentrer deg videre om nødvendig for å nå 1,3-3 mg / ml, basert på OD 280 (typisk forhold på OD260 / OD 280 = 1,7-2 gir gode partikler). For dette lille volumet på 50 μL er den beste metoden for å redusere prøvetap å lage en dialyseknapp med et lokk på et 1,7 ml rør dekket av en dialysemembran (6-8 kDa MW cutoff), kutte bunnen av røret og bruke kanten av røret for å forsegle membranen på toppen av lokket.
- Plasser dialyseknappen som inneholder prøven på toppen av en polyetylenglykolseng, med membranen vendt ned (sjekk fremdriften hvert 2. minutt). Denne metoden foretrekkes når den nødvendige konsentrasjonen er mindre enn eller lik 2,5 ganger for å unngå fortynning eller tap av prøven i konsentratoren. Det er viktig å umiddelbart forberede kryo-EM-rutenett av komplekset etter dette trinnet.
- Rensing etter størrelsesekskluderingskromatografi
- Dagen før frysing, vask og balanser en størrelsesekskluderingskolonne med 60 ml dH2O, etterfulgt av 80 ml frysebuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) over natten med en hastighet på 0,4 ml / min. Bruk kontaktpunkter rett etter rekonstituering til å klargjøre det samme komplekset med 2,5 ganger større mengder som følger: bland 2 500 mikrol NCP [1,2 μM]; 650 μL 5x bindingsbuffer; 45 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM] og 55 μL 3M KCl.
- Inkuber blandingen på is uten tverrbinder i 15 minutter. Deretter tilsettes glutaraldehyd til en endelig konsentrasjon på 0,005% som beskrevet i den preparative gelmetoden. I dette tilfellet konsentrerer imidlertid komplekset i et forhåndsbalansert (med frysebuffer) sentrifugalfilter til ca. 120 μL.
- Analyser umiddelbart toppfraksjonene og konsentrer de fraksjonene som inneholder histonene og MBP-Pol β-APE1 som angitt tidligere. Se figur 5A, B, C for vellykkede resultater ved bruk av størrelsesekskluderingsmetoden og figur 7 ved bruk av begge metodene.
3. Frys nukleosomalt kompleks
- Etter å ha slått på stupefryseren og fylt fukteren med 50 ml dH2O, sett kammertemperaturen til 22 °C og HR (fuktighet) til 98 %. Plasser etankoppen og koppen med flytende nitrogen (som inneholder en merket rutenettboks) i de respektive plassholderne.
- Dekk etankoppen med etanlokkdispenseren, og hell forsiktig flytende nitrogen (LN2) over den, mens du også fyller LN 2-koppen med LN2. Når LN2-nivået har stabilisert seg og når 100% og en temperatur på -180 ° C, åpner du forsiktig etanventilen og fyller etankoppen til den danner en boble på det klare lokket. Fjern etanddispenseren.
- Legg to filterpapir på blotteanordningen og fest dem med en metallring. Gå til oppsettet og bruk følgende parametere for blotting: 0 pre-blot, 3 s blot, 0 post-blot; velg A-plunge og klikk på OK.
- På hovedskjermen klikker du på Load Forceps, og laster dem med et rutenett med karbon / applikasjonssiden vendt mot venstre (forberedt som før). Kalibrer tangen som justerer Z-aksen for å sikre en solid flekk. Klikk på Nedre kammer og påfør 3 μL av komplekset (1,3-3 mg / ml; OD280). Klikk på Blot/A-stupet. Dette vil rotere rutenettet for å slette fra fronten og vil stupe fryse det.
- Overfør og lagre rutenettet i rutenettboksen i LN2-kammeret . Når alle fire ristene er frosset og plassert i gitterboksen, drei lokket til nøytral posisjon, der alle ristene er dekket av lokket, og stram skruen. Rutenett kan lagres i LN2 inntil screening er igangsatt.
4. Skjerm rutenett
- Før du legger prøvene i mikroskopet, plasser de vitrifiserte ristene på en ring og fest dem med et C-klipp. Utfør denne klippeprosessen under LN2 i et fuktighetskontrollert rom for å unngå isforurensning.
- Når du legger i mikroskopet, sett inn ristene i en 12-spors kassett. Transporter kassetten inn i en nanocabkapsel og legg den inn i autoloaderen. Autoloader-robotmekanismen starter prosessen.
- Overfør rutenettet fra kassetten til mikroskoptrinnet. Juster scenen til eusentrisk høyde ved å vingle trinnet 10° og samtidig flytte Z-høyden til minimal planforskyvning observeres i bildene.
- Når den eusentriske høyden er nådd, start avbildningen. Først får du atlaset ved å ta et 3 x 3 montasjebilde av rutenettet, der hver montasje er tatt med 62x forstørrelse. Velg tre firkanter av varierende størrelser; Ta den eusentriske høyden, og deretter bildet ved 210x forstørrelse.
- Når en firkant er avbildet, velger du ett hull hver fra kanten, midten og i mellom rutene. Avbilde hvert hull med 2600x forstørrelse.
- Før du tar dette bildet med høy forstørrelse, skjer autofokuseringen ved en forskyvning av bildeområdet. Ta bildet med høy forstørrelse fra midten av hullet ved 36 000x forstørrelse og ved 7,1 s eksponeringstid, 60 bilder, 1,18 piksler og 3 μm defokus. Se representative bilder av screening i figur 5, figur 6 og figur 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Riktig monterte kontaktpunkter (figur 2) ble brukt til å lage et kompleks med et rekombinant fusjonsprotein av MBP-Polβ-APE1 (figur 3). For å bestemme forholdet mellom NCP og MBP-Polβ-APE1 for å danne et stabilt kompleks, utførte vi elektroforetiske mobilitetsskiftanalyser (EMSA) (figur 4), som viste et enkeltskiftet bånd av NCP med 5 ganger molaroverskudd av MBP-Polβ-APE1. Under optimaliseringen av å gjøre dette komplekst var kryssbinding med glutaraldehyd avgjørende for å forhindre at kontaktpunktet falt fra hverandre. Opprinnelig ble montering av komplekset av NCP-Polβ-APE1 utført i et mindre volum, ved ca. 10 μM NCP, ved bruk av 0,005% endelig glutaraldehydkonsentrasjon. Under disse forholdene ble utvalget overbundet (figur 5D-E) og resulterte i aggregater uten merkbare individuelle komplekser. Kryssbinding ved ca. 10 ganger fortynnede NCPer (1,2 μM NCP) resulterte i signifikant redusert aggregering og forbedret partikkelstabilitet (figur 5A-C). Figur 6 illustrerer at begge metodene vist i figur 1 kan kombineres med den preparative gelen som forbedrer kvaliteten på kontaktpunktene når kontaktpunktet inneholder en signifikant mengde høymolekylære (HMW) aggregater (figur 6A), etterfulgt av rensing av komplekset via størrelsesekskludering. Selv om dette viste stor suksess i forberedelsen av prøven (figur 5B-C) og rutenett, som ga stabile partikler (figur 6D), ga den suboptimale dannelsen av komplekset (figur 6A) et 3D-kart av kontaktpunktet alene (data ikke vist). Disse resultatene viser at begge metodene (størrelsesutelukkelse og preparativ gel) kan brukes uavhengig av hverandre for å generere stabile komplekser (figur 7A-C). Faktisk er data samlet inn fra begge rutenett og viser nesten identiske 2D-klasser (figur 7D) og 3D-kart (figur 7E) med omtrent 3.2 Å oppløsning.
Figur 1: Arbeidsflyt av de to metodene presentert i denne protokollen for å forberede og fryse et NCP-Polβ-APE1-kompleks via 1) preparativ gel og 2) størrelsesekskludering. Selv om det ikke vises her, kan disse metodene kombineres (figur 6), starter med (1) og renser det konsentrerte komplekset fra (1) ved hjelp av en størrelseskolonne. Dette vil kreve en dobling av utgangsmaterialet for kontaktpunkter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative NCP-rekonstitueringer. (A) DNA ble titrert med økende mengder histonoktamer i forholdet 1:0,9, 1:1,1, 1:1,2, 1:2, DNA:oktamer. (B) Duplisere storskala monterte NCPer (1: 2, DNA: oktamer). Rekonstitusjoner ble elektroforesert i en 6% ikke-denaturerende polyakrylamidgel, etterfulgt av sybr green I-farging. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk fremstilling av genetisk smeltet Polβ-APE1 med MBP ved N-terminalen. MBP-Polβ-APE1 fusjonsprotein ble enzymatisk karakterisert for begge aktivitetene (data ikke vist). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: MBP-Polβ-APE1 binding til NCPer. Nukleosomalt substrat (100 nM) ble inkubert med økende mengder MBP-Polβ-APE1 i 15 minutter på is. Bundet og ubundet NCP ble separert i en 6% polyakrylamid ikke-denaturerende gel, etterfulgt av sybr grønn I-farging. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Analyse av vellykkede og mislykkede kryssbindingsresultater. Elusjonsprofilen til komplekset er vist i (A) med toppen av interesse merket. Fraksjoner, betegnet med "F", samlet fra denne elusjonen ble analysert i en 16% tricinpolyakrylamidgel og vist i (B). (C) Prøven fra (B) ble frosset ved hjelp av holey karbonstøttegitter og avbildet ved hjelp av 200 kV feltutslippskryo-transmisjonselektronmikroskop. Tilsvarende mislykkede eksperimenter er vist i (D), (E) og (F). Merk at disse mislykkede forsøkene inneholder fusjonsproteinet uten MBP. HOc og HOD betegner histoktamer konsentrert og fortynnet, henholdsvis; RT angir romtemperatur; "X" tilsvarer tverrbinding med glutaraldehyd. Skalastenger = 100 nm (C, F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Fremstilling av NCP-Polβ-APE1-kompleks ved bruk av de to metodene i tandem. (A) Ubundet og bundet (1: 1, NCP- Polβ-APE1) ble analysert i 6% polyakrylamid ikke-denaturerende gel (merk at i dette forholdet er bare 50% bundet). (B) Elusjonsprofil for NCP-Polβ-APE1-kompleks fra en størrelseskolonne. (C) Analyse av eluerte fraksjoner i en 16% trikanpolyakrylamidgel; Braksjonene ble samlet og konsentrert, som angitt. (D) Prøven ble frosset ned og avbildet som beskrevet i figur 5B. Databehandlingen viste ikke en tilleggstetthet tilsvarende Polβ-APE1 (ikke vist). "X" i bane 5 og 6 angir tverrbinding med glutaraldehyd som angitt i protokollen. Skala bar = 100 nm (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Analyse av NCP-MBP-Polβ-APE1-kompleks. (A) Prøver fra de forskjellige trinnene i metodene illustrert i figur 1 ble elektroforesert i en 6% polyakrylamid ikke-denaturerende gel. Legg merke til at kompleks dannelse er reproduserbar ved de to metodene. (B,C) Representative grid holey karbonstøttenettbilder tatt med et 300 kV transmisjonselektronmikroskop der de røde boksene fremhever forskjellige retninger av komplekset (hvorav noen tilsvarer 2D-klassene vist i (D). (E) Data behandlet fra (C) viser et 3D-kart med 3.2 Å oppløsning av NCP-MBP-Polβ-APE1-komplekset.). Skalastenger = 100 nm (B, C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Oligonukleotid navn | Sekvens (5'-->3') | Rensing skala | Metode for purificaiton | Antall hetteglass bestilt | ||
| UND komplementær streng | TGATGGACCCTATACGCGGCCGCCCTGGAGAAT CCCGGTGCCGAGGCCGCTCAATTGGTCGTAGA CAGCTCTAGCACCGCTTAAACGCACGTACGCGCGC TGTCCCCCGCGTTTTAACCGCCAAGGGGATTAC TCCCTAGTCTCCAGGCACGTGTCAGATATCAAC ATCCTGTGCATGTATTGAACAGCGACCTTGCCG |
20 nmol | SIDE renset | 6 | ||
| 161 | /5Phos/GATATCTGACGTGCCTGGAGACTAGG GAGTAATCCCCTTGGCGGTTAAAACGCGGGGG ACAGCGCGTACGTGCGTTTAAGCGGTGCTAGA GCTGTCTACGACCAATTGAGCGGCCTCGGCA CCGGGATTCTCCAGGGCGGCCGCGTATAGGG TCCATCA |
20 nmol | SIDE renset | 4 | ||
| 35 | CGGCAAGGTCGCTGTTCAATACATGCAGG ATGT |
250 nmol | HPLC | 1 | ||
Tabell 1: DNA-substrat. Tre oligonukleotider ble annealed for å generere dsDNA-substratet. De understrekede seksjonene er 25 bp linker-DNA som flankerer 147 bp 601 DNA-posisjoneringssekvensen som inneholder et enkelt nukleotidgap.
| Skritt | Temperatur (°C) | Tid (min)/trinn |
| 1 | 95 | 10 |
| 2-5 | 90, 85, 80, 75 | 5 |
| 6-41 | 69 nedgang med 1 | 3 |
| 42 | 4 | holde |
Tabell 2: Glødningstemperaturgradient. Oligos ble inkubert i en termosyklist ved disse temperaturene for å generere dsDNA-substratet.
| Komponenter (lager) | Volum/beløp | Endelig konsentrasjon |
| 3M KCl | 167 ml | 0,250 m |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 20 ml | 10 mM |
| 0,5 m EDTA | 4 ml | 1 mM |
| 1 m DTT | 2 ml | 1 mM |
| CHAPS | 2 g | 1,6 mM |
| QS med dH 2 O for å lage2L | ||
Tabell 3: RBlav rekonstitueringsbuffer. Instruksjoner om å lage 2 L som tidligere rapportert14, unntatt 1,6 mM CHAPS ble lagt til.
| Komponenter (lager) | Volum/beløp | Endelig konsentrasjon |
| 3M KCl | 267 ml | 2 M |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 4 ml | 10 mM |
| 0,5 m EDTA | 800 μL | 1 mM |
| 1 m DTT | 400 μL | 1 mM |
| CHAPS | 0,4 g | 1,6 mM |
| QS med dH2O for å lage 400 ml | ||
Tabell 4: RBhøy rekonstitueringsbuffer. Instruksjoner om å lage 400 ml som tidligere rapportert14, unntatt 1,6 mM CHAPS ble lagt til.
| Komponenter (lager) | Volum | Endelig konsentrasjon |
| 3M KCl | 16,7 ml | 50 mM |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 10 ml | 10 mM |
| 0,5 m EDTA | 2 ml | 1 mM |
| 1 m DTT | 1 ml | 1 mM |
| QS med dH2O for å lage 1L | ||
Tabell 5: RB50 mM rekonstitueringsbuffer. Instruksjoner for å gjøre 1 l rekonstitueringsbuffer kompatibel for frysing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En spesifikk protokoll for rensing av DNA-reparasjonsfaktoren vil være avhengig av enzymet av interesse. Imidlertid er det noen generelle anbefalinger, inkludert bruk av rekombinante metoder for proteinuttrykk og rensing18; Hvis proteinet av interesse er for lite (<50 kDa), hadde strukturbestemmelse av cryo-EM vært nesten umulig inntil nylig gjennom bruk av fusjonssystemer19, nanokroppsbindende stillas20 og optimalisering av bildestrategier21.
Det er ganske vanlig å få nett av dårlig kvalitet i begynnelsen. Innledende forsøk på å bestemme NCP-homogenitet og stabilitet uten kryssbinder, ved bruk av uranylacetat og karbonbelagte kobbergitter for negativ farging, viste stabile, pent spredte NCPer med minimal aggregering. Men når denne prøven ble vitrifisert (ved 20x høyere konsentrasjon) i kryo-EM-nett, ble det ikke detektert partikler. Prøveoptimalisering for å hindre at kontaktpunktene falt fra hverandre eller aggregerte, var den største hindringen. I tillegg er to fremstillingsmetoder beskrevet separat; De utelukker imidlertid ikke hverandre og kan brukes rygg mot rygg ved først å rense kontaktpunktet via en forberedende gel, kompleksisere det med reparasjonsfaktoren og rense komplekset med en størrelsesekskluderingskolonne. Dette krever dobbelt så mye materiale for det første trinnet, og det er også mer tidkrevende, men nyttig for vanskelige prøver (figur 6).
Å finne et utgangspunkt for konsentrasjonen av kryssbinder var vanskelig på grunn av mangel på konsistens i metoder for tverrbinding og mengden kryssbinder som ble brukt av andre22,23. Forsøk på å gjenskape den mindre kontrollerte tverrbindingsreaksjonen på benken beskrevet av Anderson et al. klarte ikke å gi positive resultater, og komplekset var altfor tverrbundet. Dette skyldes sannsynligvis kilden til glutaraldehyd (nyåpnet ampulle sammenlignet med langtidslagret glutaraldehyd). Fordi dette detaljnivået ofte utelates i ikke-metoder, forskningsartikler, er det vanskelig å gjenskape de eksakte forholdene som utgangspunkt. Optimale resultater ble oppnådd når komplekset ble kryssbundet ved en konsentrasjon på 1, 2 μM i 150 mM KCl ionstyrke sammenlignet med kryssbinding av komplekset ved 10 μM NCP, ved samme glutaraldehydkonsentrasjon på 0, 005% i 13 minutter ved romtemperatur. Tverrbindingseffektiviteten er sannsynligvis også avhengig av komplekset som dannes, da noen kromatininteragerende faktorer kan indusere/kreve større destabilisering, påvirke hvor tverrbindingen vil forekomme og den samlede effekten på NCP-stabiliteten. Derfor, mens optimalisering av disse forholdene er uunngåelig, vil det være kritisk å finne kritiske trinn som optimal NCP og saltkonsentrasjon under tverrbindingsreaksjonene.
En annen viktig parameter var forholdet mellom NCP:DRF som ga nok molekyler på rutenettet som inneholdt DRF bundet til NCP. Faktisk har denne parameteren også blitt identifisert av andre som en som er kritisk å optimalisere for strukturelle studier16 gitt at selv for kryo-EM-homogenitet av måten DRF binder seg til NCP er viktig for 3D-kartet. Hvis du ikke optimaliserer dette, kan det gi ubundet eller heterogen, uspesifikk binding. Når et 1:1 molforhold ble brukt, noe som bare ga 50% NCP bundet av DRF (figur 6), viste 3D-kartet ingen ekstra tetthet som tilsvarer DRF. Derfor er det viktig å bestemme forholdet som gir et enkelt bånd på samme sted på en EMSA og viser en enkelt topp på kromatogrammet til en størrelseskolonne, som svarer til komplekset. Flere parametere for frysing av nettene, inkludert blot-tiden, la til flere runder med optimalisering.
Samlet gir denne protokollen detaljerte instruksjoner for første gang om to forskjellige metoder for å forberede nukleosomale komplekser for kryo-EM strukturell bestemmelse. Basisparametrene for klargjøring av rutenettet kan brukes som utgangspunkt. Og selv om ikke en enkelt metode fungerer like bra for alle makromolekylære komplekser, vil fokus på optimalisering av parametrene beskrevet i denne protokollen begrense strategien for skreddersydd optimalisering av andre nukleosomale komplekser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Mario Borgnia fra kryo-EM-kjernen ved National Institute of Environmental Health Sciences og Dr. Joshua Strauss fra University of North Carolina på Chapel Hill for deres mentorskap og opplæring i cryo-EM-nettforberedelsen. Vi takker også Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende for teknisk assistanse i de innledende stadiene av dette prosjektet. Vi setter pris på nøkkelbidraget og støtten til avdøde Dr. Samuel H. Wilson og hans laboratoriemedlemmer, spesielt Dr. Rajendra Prasad og Dr. Joonas Jamsen for rensing av det genetisk smeltede APE1-Polβ-komplekset. Forskning har blitt støttet av det intramurale forskningsprogrammet til National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [tilskuddsnummer Z01ES050158, Z01ES050159 og K99ES031662-01].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640--6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S.
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. Guide to Protein Purification. 463, Academic Press. (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
