Protokollen præsenterer en kræftimmunterapimodel ved hjælp af cellebaseret tumorvaccination med Flt3L-ekspressive B16-F10 melanom. Denne protokol demonstrerer procedurerne, herunder forberedelse af dyrkede tumorceller, tumorimplantation, cellebestråling, måling af tumorvækst, isolering af intratumorale immunceller og flowcytometrianalyse.
Fms-lignende tyrosinkinase 3 ligand (Flt3L) er et hæmatopoietisk cytokin, der fremmer overlevelse og differentiering af dendritiske celler (DC’er). Det er blevet brugt i tumorvacciner til at aktivere medfødt immunitet og forbedre antitumorresponser. Denne protokol demonstrerer en terapeutisk model ved anvendelse af cellebaseret tumorvaccine bestående af Flt3L-ekspressive B16-F10 melanomceller sammen med fænotypisk og funktionel analyse af immunceller i tumormikromiljøet (TME). Procedurer for dyrkning af tumorcelleforberedelse, tumorimplantation, cellebestråling, måling af tumorstørrelse, intratumoral immuncelleisolering og flowcytometrianalyse er beskrevet. Det overordnede mål med denne protokol er at tilvejebringe en præklinisk solid tumorimmunterapimodel og en forskningsplatform til at studere forholdet mellem tumorceller og infiltrerende immunceller. Immunterapiprotokollen beskrevet her kan kombineres med andre terapeutiske modaliteter, såsom immunkontrolpunktblokade (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1 antistoffer) eller kemoterapi for at forbedre den kræftterapeutiske virkning af melanom.
Cancer immunterapi er blevet anerkendt som en lovende terapeutisk strategi baseret på dens mindre giftige bivirkninger og mere holdbare reaktioner. Der er udviklet flere typer immunterapier, herunder onkolytiske virusterapier, kræftvacciner, cytokinterapier, monoklonale antistoffer, adoptivcelleoverførsel (CAR-T-celler eller CAR-NK) og immunkontrolpunktblokade1.
For kræftvacciner er der forskellige former for terapeutiske vacciner, såsom hele cellebaserede vacciner, protein- eller peptidvacciner og RNA- eller DNA-vacciner. Vaccination er afhængig af antigenpræsenterende cellers (APC’ers) evne til at behandle tumorantigener, herunder tumorspecifikke antigener, og præsentere dem i en immunogen form for T-celler. Dendritiske celler (DC’er) har været kendt for at være de mest potente APC’er og menes at spille en vigtig rolle i antitumorimmunitet 2,3. Disse celler optager og behandler tumorantigener og migrerer derefter til de drænende lymfeknuder (dLN) for at prime og aktivere tumorspecifikke T-effektor (Teff) celler gennem engagement af T-cellereceptoren (TCR) og costimulatoriske molekyler. Dette resulterer i differentiering og udvidelse af tumorspecifikke cytotoksiske T-celler (CTL), som infiltrerer tumoren og dræber tumorceller4. Derfor repræsenterer aktivering og modning af DC’er attraktive strategier til at stimulere immunitet mod tumorantigener.
Flt3L er kendt for at fremme modning og udvidelse af funktionelt modne DC’er, der udtrykker MHC klasse II, CD11c, DEC205 og CD86 proteiner5. Intratumoral, men ikke intravenøs, administration af en adenovirusvektor, der inkorporerer Flt3L-genet (Adv-Flt3L), har vist sig at fremme immunterapeutisk aktivitet mod ortrotopiske tumorer6. Flt3L er også blevet anvendt i tumorcellebaserede vacciner bestående af bestrålede B16-F10-celler, der stabilt udtrykker retroviralt transduceret Flt3L som en måde at forbedre krydspræsentationen af tumorantigener af DC’er og dermed øge antitumorresponserne. Protokollen for B16-Flt3L tumorvaccination beskrevet her er baseret på en undersøgelse offentliggjort af Dr. James Allisons gruppe7. I dette papir rapporterede de, at en B16-Flt3L-vaccine kombineret med CTLA-4-blokade synergistisk inducerede afvisning af etableret melanom, hvilket resulterede i øget overlevelse.
Målet med denne protokol er at tilvejebringe en præklinisk immunterapimodel for melanom. Her beskrives detaljerede procedurer for, hvordan man forbereder og implanterer tumorvacciner, og hvordan man analyserer sammensætningen og funktionen af intratumorale immunceller fra fast tumor.
Protokollen beskrevet her er baseret på undersøgelsen fra Allisons gruppe. De viste, at kombinationen af B16-Flt3L-vaccine med CTLA-4-blokade viste en synergistisk effekt på overlevelsesrate og tumorvækst, mens der ikke sås nogen reduktion af tumorvækst hos mus, der fik B16-Flt3L-vaccinen eller anti-CTLA-4-antistofbehandling alene7. Nylige undersøgelser har afsløret en ny Treg-iboende CTLA4-PKCη signalvej, der spiller en vigtig obligatorisk rolle i reguleringen af den kontaktafhængige un…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Stephen Schoenberger for at have leveret B16-Flt3L-celler og personalet på LJI-dyre- og flowcytometrifaciliteterne for fremragende support.
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
DNase I | Sigma | 11284932001 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
PMA | Sigma | P1585 | |
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
TL Liberase | Roche | 477530 | |
Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
Antibodies | |||
Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |