Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering av subcellulær lokalisering av et protein i hjertet ved hjelp av kvanteprikkmediert immunmerking etterfulgt av transmisjonselektronmikroskopi

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64085
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Pathology and Translational Pathobiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport

Summary

Den nåværende protokollen beskriver en metode for immunmerking av et protein i hjertevevsseksjonene ved hjelp av kvanteprikker. Denne teknikken gir et nyttig verktøy for å visualisere ethvert proteins subcellulære lokalisering og uttrykk på ultrastrukturelt nivå.

Abstract

Den subcellulære lokaliseringen er avgjørende for å avgrense riktig funksjon og bestemme molekylære mekanismer for et bestemt protein. Flere kvalitative og kvantitative teknikker brukes til å bestemme subcellulær lokalisering av proteiner. En av de nye teknikkene for å bestemme den subcellulære lokaliseringen av et protein er kvanteprikker (QD) -mediert immunmerking av et protein etterfulgt av avbildning av dem med transmisjonselektronmikroskopi (TEM). QD er en halvleder nanokrystall med en dobbel egenskap av krystallinsk struktur og høy elektrondensitet, noe som gjør dem anvendelige for elektronmikroskopi. Denne nåværende metoden visualiserte den subcellulære lokaliseringen av Sigma 1-reseptor (Sigmar1) protein ved bruk av QD-TEM i hjertevevet på ultrastrukturelt nivå. Små kuber av hjertevevsseksjonene fra en villtype mus ble festet i 3% glutaraldehyd, deretter osmicated, farget med uranylacetat, etterfulgt av sekvensiell dehydrering med etanol og aceton. Disse dehydrerte hjertevevsseksjonene ble innebygd i epoksyharpikser med lav viskositet, kuttet i tynne seksjoner med 500 nm tykkelse, satt på rutenettet og deretter utsatt for antigenavmaskering med 5% natriummetaperiodat, etterfulgt av slukking av gjenværende aldehyder med glycin. Vevene ble blokkert, etterfulgt av sekvensiell inkubasjon i primært antistoff, biotinylert sekundært antistoff og streptavidinkonjugert QD. Disse flekkete seksjonene ble flekktørket og avbildet ved høy forstørrelse ved hjelp av TEM. QD-TEM-teknikken tillot visualisering av Sigmar1-proteinets subcellulære lokalisering på ultrastrukturelt nivå i hjertet. Disse teknikkene kan brukes til å visualisere tilstedeværelsen av noe protein og subcellulær lokalisering i et hvilket som helst organsystem.

Introduction

Menneskekroppen består av mange proteiner som er ansvarlige for mange kroppsfunksjoner. Funksjonen av proteiner er i stor grad avhengig av lokalisering i orgel og cellulære organeller. Flere teknikker, inkludert subcellulær fraksjonering, immunfluorescens og vaskemiddelmediert proteinekstraksjon, brukes ofte til å bestemme proteinets subcellulære lokalisering 1,2. Mikroskopi ved bruk av immunfluorescerende fargestoff er den mest brukte metoden blant disse teknikkene. Imidlertid er de fluorescerende fargestoffene som brukes i denne teknikken mindre stabile og utsatt for fotobleking3. Andre teknikker involverte høyoppløselig mikroskopi for å visualisere proteinet på et ultrastrukturelt nivå ved å immunmerke proteiner med elektrontette, tungmetaller (gull, ferritin) eller kvanteprikker nanokrystaller og etterfulgt av å visualisere dem ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) 4,5.

QD er en halvleder nanokrystall sammensatt av halvledermetallforbindelser med kontrollerbare fotoluminescensegenskaper som har stor betydning i biologiske systemer3. QD nanokrystaller er laget i et kjerneskallformat hvor en nanokrystall er innkapslet i dannelsen av nanokrystaller for å sikre riktig stabilitet og funksjon. Vanlig brukt kjerne-skall nanokrystaller kombinasjon er CdSe / ZnS, CdSe / CdS CdSe / ZnSe, CdTe / CdS, CdTe / ZnS og CdTe / CdS / ZnS (core / shell / shell) 3. Blant disse nanokrystallkombinasjonene studeres CdSe / ZnS og CdSe / CdS mest kraftig og brukes ofte som sekundære antistoffkonjugater 3,6. Disse QD-nanopartiklene har også fluorescerende egenskaper med forskjellige eksitasjons- og utslippsspektra enn tradisjonelle fluoroforer. QD benytter eksitering av elektroner fra bulkvalensbåndet for å vise høyere fluorescenskvanteutbytter sammenlignet med tradisjonelle fluoroforer. Nanokrystallarrangementet av halvledermetaller gjør QD-mediert merking mer stabil og motstandsdyktig mot fotobleking6. I tillegg tillater nanokrystallkjernen i QD og dens krystallinske struktur QD av forskjellige størrelser å ha et bredt spekter av absorpsjonsspektra og svært smale utslippstopper7. Videre er disse QD-partiklene store nok til å gi høy elektrondensitet, noe som gjør dem nyttige i høyoppløselige mikroskopiteknikker, inkludert transmisjonselektronmikroskopi 5,8,9. Disse QD nanokrystaller er også kommersielt tilgjengelige i flere størrelser med forskjellige fluorescensutslippsspektra og former, noe som gjør dem til en god kandidat for merking med flere antistoffer10,11.

QD-teknologi fikk stor betydning i biologisk forskning på grunn av flere funksjonelle egenskaper, inkludert bruk i levende celleavbildning, studiet av transportmekanismer i cellen, membrantransport av proteinets diffusjonsbevegelse, funksjonell heterogenitet av celler og merking av intracellulær organell 3,12,13,14,15,16 . QD er også nyttig i molekylær diagnostikk for å målrette og oppdage kreftvev, karakterisere svulstens molekylære profil og immunstatus, og visualisere glasslegeme og epiretinale membraner 3,17,18. I tillegg kan QD også brukes i medisinske terapier for å behandle tumormaligniteter via fotodynamisk terapi og oftalmiske anomalier ved å levere medisiner til øynene 3,17,18,19.

Ved hjelp av disse svært nyttige QD-nanokrystallene bestemte denne studien den subcellulære lokaliseringen av et protein som heter Sigma 1-reseptor (Sigmar1). Sigmar1 er et allestedsnærværende uttrykt multi-tasking molekylært chaperone protein. Omfattende studier med fokus på Sigmar1s subcellulære lokalisering i forskjellige vev og organer rapporterte en celle- og vevstypespesifikk subcellulær lokalisering som fremkalte molekylær funksjon20. I forskjellige celler (nevron-, fotoreseptor- og immunceller) og vev (lever og hjerne) ved hjelp av forskjellige biokjemiske tilnærminger, rapporterte studier lokalisering av Sigmar1 på endoplasmatisk retikulum (ER), mitokondrierassosiert ER-membran (MAM), nukleær konvolutt, plasmamembran, nukleoplasmisk retikulum, kjerne og mitokondrier. Til tross for alle disse studiene forble den subcellulære lokaliseringen av Sigmar1 i hjertet ukjent20. Derfor ble den subcellulære lokaliseringen av Sigmar1 i hjertevev bestemt ved hjelp av QD-mediert immunmerking etterfulgt av TEM-avbildning.

Protocol

Dyrehåndteringsprosedyrene i denne protokollen overholdt veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr (åttende utgave, National Institutes of Health, Bethesda, MD) og ble godkjent av Animal Care and Use Committee of Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport. Seks måneder gamle hannmus med FVB/N-bakgrunn ble brukt i denne studien. Musene ble hentet fra kommersielle kilder (se Tabell over materialer). Musene som ble brukt ble plassert i et godt regulert miljø i bur som tillater en 12 timers lys-mørk syklus, utstyrt med vann og en vanlig chow diett ad libitum, og ble tatt vare på i henhold til NIH Guide for the Care and Use of the Laboratory Animals. Den overordnede prosessen er illustrert i figur 1.

1. Forberedelse av dyr

  1. Bedøv musene ved hjelp av 3% isofluran. Åpne brystet ved å lage et horisontalt snitt i regionen over midten av magen og trekke huden. Gjør forsiktig et nytt snitt for å åpne brysthulen uten å punktere andre organer21,22,23.
    1. Perfuse24 hjertet gjennom toppunktet først, og deretter høyre ventrikel ved bruk av kald 3% glutaraldehyd i kardioplegisk løsning (50 mM KCl, 5% dekstrose i PBS, se tilleggsfil 1) i 2 minutter for å sikre fullstendig myokardavslapping.
  2. Perfuse hjertet ved hjelp av iskald 3% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylatbuffer (pH 7,4, trinn 2,1,1) i ytterligere 2 minutter. Bruk tyngdekraftstrykk, bruk en 25 G 5/8 "nål for å introdusere fikseringsmidlene i hjertet. Umiddelbart etter at hjertet begynner å fylles opp med fikseringsmiddelet, løft opp hjertets topp og kutt karene under ved 1-2 mm fra hjertet for å avlaste trykket og la væskene renne av.
  3. Disseker hjertet, fjern atriene24, og slipp ventriklene i iskald 3% glutaraldehyd/0,1 M natriumkakodylat i en petriskål. Lag en sommerfugl kuttet etter 30-60 min fiksering og legg den i en petriskål som inneholder 3% glutaraldehyd / kakodylat (se materialtabell). Hakk hjertet med et kirurgisk blad i små terninger på 1 mm3 mens det er i glutaraldehyd/kakodylatløsning.
  4. Fikse/dyppe det dissekerte hjertevevet i glutaraldehyd/kakodylatoppløsning i 24 timer ved 4 °C.

2. Behandling av hjertevev

  1. Etter 24 timers fiksering, vask vevet i 0,1 M natriumkakodylatbuffer i 20 minutter.
    1. Forbered 0,1 M kakodylatbuffer ved å følge trinnene nedenfor.
      1. For å fremstille 0,1 M natriumkakodylatbuffer, lag et lager av 1 M natriumkakodylatbuffer ved å oppløse natriumkakoylat (21,4 g) og av 1% kalsiumkloridoppløsning (3 ml) i 90 ml destillert vann. Volum opp løsningen til 100 ml ved å tilsette destillert vann. Rør løsningen godt og la den stå over natten for å løse opp løsemiddelet.
      2. Ta deretter 10 ml 1 M natriumkakodylatoppløsning og tilsett den til 80 ml destillert vann. Juster pH til 7,4 ved hjelp av HCl og volum den opp til 100 ml ved å tilsette destillert vann.
  2. Gjenta vasken i 0,1 M natriumkakodylatbuffer i ytterligere 20 minutter. Fjern vevet fra natriumkakodylatbuffer og senk dem i 2% osmiumtetroksidoppløsning i 4 timer ved romtemperatur. Denne prosessen kalles osmication.
    1. Forbered 2% Osmium tetroxide løsning ved å følge trinnene nedenfor.
      1. For å fremstille 2% Osmium-tetroksidoppløsning, ta 4% Osmium-tetroksidoppløsning, 4 ml (se materialtabell), 1 M natriumkakodylatløsning (0,8 ml) og destillert vann (3,2 ml) for å lage totalt 8 ml løsning.
        MERK: Hele denne prosessen og trinnene herfra må utføres i avtrekkshetten.
  3. Etter osmication, senk vevet i 2% natriumacetatoppløsning i 10 minutter ved romtemperatur.
    1. Tilbered 2% natriumacetatoppløsning ved å oppløse 4 g natriumacetat i 20 ml destillert vann.
  4. Senk deretter vevet i 2% uranylacetatoppløsning i 1 time ved romtemperatur.
    1. Forbered 2% uranylacetatoppløsning ved å oppløse 4 g uranylacetat i 20 ml destillert vann.
  5. Etter farging av uranylacetat, dehydrer vevet sekvensielt gjennom de graderte alkoholene og acetonet i den rekkefølgen som er nevnt i tilleggsfil 1.

3. Innbygging av hjertevev

  1. Bygg inn det dehydrerte vevet i epoksyharpiks med lav viskositet ved å følge trinnene nedenfor.
    1. For å lage epoksyharpiks med lav viskositet, bland 10,24 ml vinylcykloheksendioksid (ERL 4221) epoksymonomer, 6,74 ml diglycidyleter av polypropylenglykol (DER 732) og 30,05 ml nonenylsuccinsyreanhydrid (NSA) (se materialtabell) i et 50 ml rør. Rør suspensjonen godt for hånd i 2 min.
    2. Tilsett 18 dråper 2-dimetylaminoetanol (DMAE, se tabell over materialer) epoksyakselerator og rør suspensjonen for å blande komponentene grundig.
    3. Impregner vevet i epoksyharpiks i følgende sekvens av blanding.
      1. Bytt ut 100% aceton med 1: 1 harpiks: acetonsuspensjon og senk vevet i det i 1 time ved romtemperatur.
      2. Bytt ut 1: 1 harpiks: acetonsuspensjon med 6: 1 harpiks: acetonsuspensjon og senk vevet i det i 3 timer.
      3. Til slutt, erstatt 6: 1 harpiks: acetonsuspensjon med 100% harpikssuspensjon og la vev nedsenket i det over natten ved romtemperatur.
  2. Ha vevet i fersk harpiks i 8 mm mikroformer (se materialtabell) og herd det innebygde vevet ved 70 °C over natten.
    MERK: Sørg for at harpiksen er hard, men ikke sprø etter herding.

4. Vevsseksjonering ved hjelp av et ultramikrotom

  1. Trim harpiksblokkene med vevet til ikke større enn 1 mm før du monterer på ultramicrotomen (se materialtabell). Plasser formen nøyaktig som mulig i den segmenterte armen til ultramikrotomen og avanser prøveformen manuelt mot diamantkniven.
  2. Klipp seksjonene med en tykkelse på 500 nm (en halv mikron) med en Histo-kniv (se Materialtabell), og bruk EM-sløyfeverktøyet, plukk dem opp og legg dem på et glassglass.
  3. Plasser glassglasset på en kokeplate for toluidinblå flekk25 for å finne interesseområdet.
  4. Etter å ha funnet interesseområdet, bruk en Ultra 45 ° kniv (se Materialtabell) for å produsere bleke gull ultratynne seksjoner (100 nm). Plasser disse ultratynne seksjonene på den kjedelige siden av et kobbergitter med 200 nett.

5. Ultratynn hjerteseksjon farging

  1. Start fargingen ved å avmaskere antigenet ved hjelp av en etseløsning, dvs. 5% natriummetaperiodatløsning.
    1. Klargjør 500 μL 5% natriummetaperiodat (se Tabell over materialer) løsning i destillert vann.
      MERK: Forbered fersk løsning før bruk.
    2. Sett 20 μL natriummetaperiodatoppløsning på en ren parafinfilm. Plasser de helt tørkede ristene med vevsseksjoner på dråpen av etseløsningen.
      MERK: Den kjedelige siden av rutenettet med vevsseksjonen må vende mot etseløsningen.
    3. La seksjonsgitteret stå på løsningen i 30 minutter ved romtemperatur.
  2. Vask den etsede vevsseksjonen ved å plassere den på en dråpe destillert vann i 60 s.
  3. Blokker restaldehydene ved å plassere seksjonsgitterene på en dråpe på 0,05 M glycinoppløsning i 10 minutter ved romtemperatur. Fjern kantene på rutenettet på filterpapir for å fjerne den gjenværende glycinløsningen.
    1. Forbered 0,05 M glycinoppløsning (se materialtabell) ved å oppløse 3,75 mg glycin i 1 ml 1x PBS (pH 7,4).
  4. Plasser seksjonsgitterene i 10-20 μL blokkeringsløsning i 25 minutter ved romtemperatur.
    MERK: Blokkerende oppløsningssammensetning: 2 μL av 1% normalt geitserum (NGS) + 20 μL av 1% BSA (endelig konsentrasjon: 10%) + 178 μL av 1x PBS (pH 7,4) for å lage et endelig volum på 200 μL.
  5. Fjern rutenettkantene på filterpapir og plasser rutenettseksjonen på antistofffortynningsmiddel for kondisjonering ved romtemperatur i 10 minutter.
  6. Inkuber rutenettseksjonene med primært antistoff (Sigmar1 i dette tilfellet, se materialtabell; fortynnet 1:10 i antistofffortynningsmiddel) i 1 time og 30 minutter i et fuktet kammer.
  7. Tørk rutenettet og vask rutenettseksjonene med antistofffortynningsmiddel to ganger i 5 minutter hver.
  8. Inkuber rutenettseksjonene med biotinylert sekundært antistoff (i dette tilfellet biotinylert geit anti-kanin polyklonalt sekundært antistoff, se materialtabell; fortynnet 1:10 i antistofffortynningsmiddel) i 1 time i et fuktet kammer.
  9. Tørk rutenettet og vask rutenettseksjonene med antistofffortynningsmiddel to ganger i 5 minutter hver.
  10. Inkuber rutenettseksjonene i kommersielt tilgjengelig streptavidinkonjugert QD (QD655 nm, se materialtabell; fortynnet 1:10 i antistofffortynningsmiddel) i 1 time i et fuktet kammer ved romtemperatur. Forhindre eksponering for lys ved å dekke kammeret med aluminiumsfolie.
  11. Tørk gitterkantene med filterpapir og vask rutenettseksjonene ved å plassere dem på vanndråper i 2 minutter.
  12. Tørk kantene på rutenettet for å tørke.

6. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) avbildning

  1. Plasser de ultratynne seksjonene på kobbergitter i en prøvekvartettholder og klem dem i en posisjon for å tillate valg av rutenett i elektronstrålen.
  2. Sett prøveholderen i mikroskopkolonnen og koble pumpebryteren for å evakuere goniometeret, etterfulgt av full innsetting av prøveholderen i mikroskopkolonnen (se materialtabell).
  3. Still spenningen til 80 kV før du genererer strålen for bildeobservasjon.
  4. Fokuser godt på ønsket område, ta bildet med et høyhastighets digitalkamera, og lagre filen i .tif format.
    MERK: Mikroskopinnstillingen for å ta bilde i denne studien var akselererende spenning eller høyspenningsspenning på 80 kV og en forstørrelse på 20.000x.

Representative Results

Den nåværende QD-TEM-metoden visualiserte tilstedeværelsen av Sigmar1 og dens lokalisering på de subcellulære hjertekamrene ved å utføre anti-Sigmar1-målrettet QD-merking på ultratynne hjerteseksjoner for voksne mus. Elektrontett anti-Sigmar1 merket QD på mitokondrielle membraner (indre og ytre), lysosomer og endoplasmatisk retikulum / sarkoplasmatisk retikulum (ER / SR) membran-mitokondrielt grensesnitt (figur 2A, B) ble illustrert med QD-TEM-bildene. I tillegg ble hjerteseksjoner også merket med kanin IgG og QD som en isotypekontroll for anti-Sigmar1 kanin primært antistoff (figur 2C, D). Derfor fremhevet QD-TEM-avbildning lokaliseringen av endogen Sigmar1 og dens anrikning hovedsakelig på lysosomer og mitokondrielle membraner.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon som viser sekvensielle trinn og prosedyrer som brukes til å utføre QD-TEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Sigmar1 immunmerket QD i voksne mus hjertevev. (A,B) Representative TEM-bilder som viser Sigmar1 merket QD på mitokondrier (ytre og indre membran), mitokondrierassosiert endoplasmatisk retikulum (ER) / sarkoplasmatisk retikulum (SR) membraner og lysosomer. (C,D) TEM-bilde av hjerteseksjonene av isotypekontroll merket med QD og kanin IgG. Skala bar: 200 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Sammensetning av PBS og andre løsninger som brukes til dehydrering av vev. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

I denne studien ble QD-mediert immunmerking brukt for å tydelig vise subcellulær lokalisering av Sigmar1. Ved hjelp av QD ble Sigmar1s lokalisering på mitokondriell membran, spesielt den indre mitokondrielle membranen, avbildet i hjertevev. I tillegg ble Sigmar1 også funnet å være lokalisert på sarkoplasmatisk / endoplasmatisk retikulum (S / ER) og lysosomer på ultrastrukturelt nivå, som vist i figur 2A-D.

Et kritisk trinn i denne protokollen er etsnings- eller antigenavmaskeringstrinnet ved bruk av høykonsentrert natriummetaperiodatløsning for å avdekke antigenet etter glutaraldehydfiksering og osmication. Denne protokollen brukte en enkelt behandling med høy konsentrasjon (5%) natriummetaperiodat i 30 minutter ved romtemperatur. Ekstra forsiktighet er nødvendig i dette trinnet, da en lengre varighet eller høyere konsentrasjon for natriummetaperiodatinkubasjon vil resultere i aggregering av strukturer, tap av membrandefinisjon for organeller og forårsake perforeringer i seksjonen, noe som gjør det vanskelig å visualisere proteinet eller strukturen. Alternativt kan en lavere konsentrasjon av (3%) metaperiodatoppløsning i to trinn i 30 minutter også brukes i stedet for 5% metaperiodat. Studier har vist at dette alternativet viser lignende resultater som med 5% metaperiodatløsning for ett-trinns 30 min inkubasjon. Imidlertid gir en 3% metaperiodatløsning i 30 minutter inkubasjon i to ganger bedre kontroll over prosessen26,27,28. I utgangspunktet brukte denne protokollen inkubasjon av seksjonene med 10% metaperiodatløsning i 30 minutter. På grunn av for mange perforeringer opprettet i vevsseksjonen ved denne konsentrasjonen, ble imidlertid den endelige konsentrasjonen og inkubasjonsvarigheten av metaperiodatløsningen avsmalnet og optimalisert til 5% i 30 minutter.

Et annet trinn krevde optimalisering av fikseringstiden med glutaraldehyd. Suboptimal fiksering av vev resulterer i utilstrekkelig QD-merking, mens overfiksering av vev resulterer i høyere ikke-spesifikk merking. Derfor må det vurderes nøye ved bestemmelse og titrering av et optimalt nivå av vevsfiksering for riktig og spesifikk merking av proteiner. Ved bruk av hjertevev ble fikseringstiden med glutaraldehyd titrert med 24 timer og 48 timer som tidspunkter. Basert på fargebildene av seksjonene som ble fikset for begge tidspunktene, ble det funnet at seksjoner festet i 24 timer viste bedre resultater. Til dags dato er QD nanokrystaller tilgjengelige i flere størrelser, inkludert 525, 565, 585, 605, 655 og 705 nm11,29. Hver av disse QD har sine egne utslippsspektra og avgir fluorescens ved forskjellige bølgelengder. I tillegg viser disse kommersielt tilgjengelige QD-ene i forskjellige størrelser forskjellige former; for eksempel er QD 525, 565 og 585 praktisk talt sfæriske med forskjellige størrelser, mens QD 605, 655 og 705 er uregelmessig avlang formet. Av disse forskjellige QD nanokrystallene er QD 525, 565 og 655 lett å skille fra hverandre11,29. Disse forskjellene i utslippsspektra og former gjør QD til en god kandidat for multi-merking av proteiner og visualisering ved fluorescens og elektronmikroskopi. I denne studien ble en kommersielt tilgjengelig QD, QD 655, brukt til å merke Sigmar1-proteinet for å skille det fra en hvilken som helst ikke-spesifikk bakgrunn i de fargede seksjonene.

Et annet motstykke til QD for proteinmerking i høyoppløselig mikroskopi er immunogoldpartikkelen. Immunogoldpartiklene brukes tradisjonelt til å merke proteiner for høyoppløselig mikroskopi. Disse gullpartiklene er svært elektrontette og lett identifiserbare sammenlignet med QD nanokrystaller. QD viser imidlertid bedre effektivitet med bedre penetrasjon i vev, høyere stabilitet og holdbarhet, og bedre oppbevaring av ultrastrukturelle komponenter, noe som gjør dem til en bedre kandidat for proteinmerking 4,5. QD har også en unik evne til å bli oppdaget av både lys- og elektronmikroskopi, noe som legger til verdien over immunogold-merking10.

En begrensning av denne QD-medierte immunmerkingen er bruken av osmiumtetroksid under behandlingen. Osmiumtetroksid brukes til å øke elektrontettheten, ledningsevnen og kontrasten til ellers mindre elektrontette og mindre kontrasterende biologiske membranstrukturer 5,30. Imidlertid ødelegger bruken av osmiumtetroksid øyeblikkelig og irreversibelt egenskapen til prøven for å skape fluorescens når den er merket med QD6. Dette begrenser bruken av QD i fluorescensmikroskopi. En alternativ tilnærming som utelater bruken av osmiumtetroksid vil være fordelaktig for å beholde de fluorescerende egenskapene og dermed den doble anvendelsen av QD-mediert immunmerking. Noen av de nyere modellene av TEM har muligheten til å feste Energy Dispersive X-Ray Analysis (EDX) -systemet som gjør det mulig å identifisere materialets elementære sammensetning. En annen begrensning av studien er mangelen på elementær kartlegging av en prøve og bildeanalyse ved hjelp av EDX. Derfor bør fremtidige studier fokusere på EDX-analysen av QD-spektrene for å analysere elementær sammensetning.

QD-merking av proteiner har fått mye oppmerksomhet i nyere tid. QD tilbyr flere applikasjoner og fordeler i både biologisk forskning og medisinsk terapi. QD er i tillegg innpakket med polydentatligand utviser økt stabilitet som opprettholder kvanteutbyttet. Videre øker innkapslingen av QD med disse bio-gunstige midlene også biotilgjengeligheten i vev, noe som gjør den til en god kandidat for potensiell anvendelse ved påvisning av svulster, levende cellebilder, legemiddellevering og vevsavbildning 3,31,32.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health-tilskudd: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 og R01HL152723; LSUHSC-S CCDS Finish Line Award, COVID-19 Research Award og LARC Research Award til MSB; LSUHSC-S Malcolm Feist Kardiovaskulær og AHA Postdoktorstipend til CSA (20POST35210789); og LSUHSC-S Malcolm Feist Pre-doctoral Fellowship til RA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 Mesh copper grid Ted Pella G200HH
6-month-old male mice with FVB/N background Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME
Acetone 100% Fisher Chemicals A949
Antibody diluent Dako S3022
anti-Sigmar1 antibody Cell Signaling 61994S
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody Sigma Aldrich B7389
BSAc (10%) Electron Microscopy Sciences 25557
Calcium chloride Sigma Aldrich C7902
Cytoseal Xyl Thermo fisher 8312-4
DER 732C36AA10:C33 Electron Microscopy Sciences 13010
Dextrose Sigma Aldrich G7528
Diamond Knife Diatome Histo; Ultra 450
DMAE Electron Microscopy Sciences 13300
Electron microscope JEOL JEOL-1400 Flash
ERL 4221 Electron Microscopy Sciences 15004
Ethanol 100% Fisher Chemicals A405P
Glutaraldehyde 3% Electron Microscopy Sciences 16538-15
Glycine Alfa Aesar A13816
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA56
Micromolds Ted Pella 10505
Microtome Leica Microsystem EM UC7
Normal goat serum Invitrogen PCN5000
NSA Electron Microscopy Sciences 19050
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19150
Parafilm Genesse Scientific 16-101
Potassium Chloride Sigma Aldrich P5655
Potassium Phosphate monobasic Sigma Aldrich 71640
Qdot 655 Streptavidin Conjugate Invitrogen Q10121MP
Sodium Acetate Fisher Scientific BP334
Sodium Cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358
Sodium metaperiodate Sigma Aldrich 71859
Sodium Phosphate dibasic Sigma Aldrich P9541
Surgical blade (size 10) Aspen surgical 371110
TEM  image software AMT-V700 AMT TEM imaging systems
TEM imaging camera XR80 TEM series AMT TEM imaging systems
Toluidine Blue O solution (0.5%) Fisher Scientic S25612
Uranyl acetate Polysciences 21447

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lidke, D. S., Lidke, K. A. Advances in high-resolution imaging - techniques for three-dimensional imaging of cellular structures. Journal of Cell Science. 125 (11), 2571-2580 (2012).
  2. de Duve, C. Tissue fraction-past and present. The Journal of Cell Biology. 50 (1), 20 (1971).
  3. Pleskova, S., Mikheeva, E., Gornostaeva, E. Cellular and Molecular Toxicology of Nanoparticles. Saquib, Q., Faisal, M., Al-Khedhairy, A. A., Alatar, A. A. , Springer International Publishing. 323-334 (2018).
  4. Mayhew, T. M., Mühlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs. Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 191 (2), 153-170 (2009).
  5. Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. G. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Experimental Cell Research. 337 (2), 202-207 (2015).
  6. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  7. Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 52 (1), 13-18 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307 (5709), 538-544 (2005).
  9. Killingsworth, M. C., Bobryshev, Y. V. Correlative light- and electron microscopy using quantum dot nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. (114), e54307 (2016).
  10. Deerinck, T. J., Giepmans, B. N. G., Smarr, B. L., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Quantum Dots: Applications in Biology. Bruchez, M. P., Hotz, C. Z., Ellisman, M. H. , Humana Press. 43-53 (2007).
  11. Giepmans, B. N. G., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
  12. Lidke, D. S., et al. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction. Nature Biotechnology. 22 (2), 198-203 (2004).
  13. Pleskova, S. N., et al. Differences in the functional activity of human neutrophilic granulocytes in their interactions with semiconductor quantum dots. Morfologiia. 135 (3), Saint Petersburg, Russia. 47-49 (2009).
  14. Crane, J., Haggie, P., Verkman, A. Quantum dot single molecule tracking reveals a wide range of diffusive motions of membrane transport proteins. Proceedings of SPIE. 7189, (2009).
  15. Hanaki, K. -i, et al. Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker. Biochemical and Biophysical Research Communications. 302 (3), 496-501 (2003).
  16. Lim, Y. T., et al. Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging. 2, 50-64 (2003).
  17. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  18. Åkerman, M. E., Chan, W. C. W., Laakkonen, P., Bhatia, S. N., Ruoslahti, E. Nanocrystal targeting in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (20), 12617-12621 (2002).
  19. Sarwat, S. A. -O. X., Stapleton, F., Willcox, M., Roy, M. A. -O. Quantum dots in ophthalmology: A literature review. Current Eye Research. 44 (10), 1037-1046 (2019).
  20. Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Morshed, M., Remex, N. S., Bhuiyan, M. S. Sigmar1's molecular, cellular, and biological functions in regulating cellular pathophysiology. Frontiers in Physiology. 12, 705575 (2021).
  21. Bohne, B., Harding, G. Processing the mouse temporal bone for gross, cellular and subcellular evaluation poster. , (2004).
  22. Roszkowski, M. The effects of acute stress on Apold1 gene expression and blood-brain barrier permeability. , (2014).
  23. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), 3988 (2021).
  24. Jones, W. K., et al. Ablation of the murine alpha myosin heavy chain gene leads to dosage effects and functional deficits in the heart. Journal of Clinical Investigation. 98 (8), 1906-1917 (1996).
  25. Hunter, E. E. Practical Electron Microscopy: A Beginner's Illustrated Guide. , Cambridge University Press. (1993).
  26. Morris, R. E., Ciraolo, G. M. A universal post-embedding protocol for immunogold labelling of osmium-fixed, epoxy resin-embedded tissue. Journal of Electron Microscopy. 46 (4), 315-319 (1997).
  27. Brorson, S. H. Deplasticizing or etching of epoxy sections with different concentrations of sodium ethoxide to enhance the immunogold labeling. Micron. 32 (2), 101-105 (2001).
  28. Lobo, M. V. T., et al. Ultrastructural Staining with Sodium Metaperiodate and Sodium Borohydride. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (1), 11-19 (2002).
  29. Bruchez, M., Moronne, M., Gin, P., Weiss, S., Alivisatos, A. P. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science. 281 (5385), 2013-2016 (1998).
  30. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  31. Smith, A. M., Duan, H., Mohs, A. M., Nie, S. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1226-1240 (2008).
  32. Gour, A., Ramteke, S., Jain, N. K. Pharmaceutical applications of quantum dots. AAPS PharmSciTech. 22 (7), 233 (2021).

Tags

Biologi utgave 187
Visualisering av subcellulær lokalisering av et protein i hjertet ved hjelp av kvanteprikkmediert immunmerking etterfulgt av transmisjonselektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aishwarya, R., Abdullah, C. S.,… More

Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Remex, N. S., Nitu, S., Hartman, B., King, J., Bhuiyan, M. S. Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (187), e64085, doi:10.3791/64085 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter