Summary
Dit manuscript beschrijft het ontwerp en de werking van een microtensiometer / confocale microscoop om gelijktijdige metingen van interfaciale spanning en oppervlaktedilatationale reologie uit te voeren terwijl de interfaciale morfologie wordt gevisualiseerd. Dit biedt de real-time constructie van structuur-eigenschap relaties van interfaces die belangrijk zijn in technologie en fysiologie.
Abstract
Adsorptie van oppervlakte-actieve moleculen aan vloeistof-vloeistof interfaces is alomtegenwoordig in de natuur. Het karakteriseren van deze interfaces vereist het meten van adsorptiesnelheden van oppervlakteactieve stoffen, het evalueren van evenwichtsoppervlakspanningen als een functie van de bulkoppervlakteactieve stofconcentratie en het relateren van hoe oppervlaktespanning verandert met veranderingen in het interfaciale gebied na equilibratie. Gelijktijdige visualisatie van de interface met behulp van fluorescentiebeeldvorming met een snelle confocale microscoop maakt de directe evaluatie van structuur-functierelaties mogelijk. In de capillaire drukmicrotensiometer (CPM) wordt een hemisferische luchtbel aan het einde van het capillair vastgepind in een vloeistofreservoir met een volume van 1 ml. De capillaire druk over de belleninterface wordt geregeld via een commerciële microfluïdische stroomregelaar die modelgebaseerde druk, bubbelkromming of bubbelgebiedregeling mogelijk maakt op basis van de Laplace-vergelijking. In vergelijking met eerdere technieken zoals de Langmuir trog en hanger drop, zijn de meet- en regelprecisie en responstijd sterk verbeterd; capillaire drukvariaties kunnen in milliseconden worden toegepast en geregeld. De dynamische respons van de bubbelinterface wordt gevisualiseerd via een tweede optische lens terwijl de bel uitzet en samentrekt. De bubbelcontour is geschikt voor een cirkelvormig profiel om de krommingsradius van de bel, R, te bepalen, evenals eventuele afwijkingen van circulariteit die de resultaten ongeldig zouden maken. De Laplace-vergelijking wordt gebruikt om de dynamische oppervlaktespanning van de interface te bepalen. Na equilibratie kunnen kleine drukoscillaties worden opgelegd door de computergestuurde microfluïdische pomp om de bubbelradius (frequenties van 0,001-100 cycli / min) te oscilleren om de dilatatiemodulus te bepalen De totale afmetingen van het systeem zijn zo klein dat de microtensiometer onder de lens van een snelle confocale microscoop past, waardoor fluorescerend gelabelde chemische soorten kwantitatief kunnen worden gevolgd met submicron laterale resolutie.
Introduction
Lucht-water interfaces bedekt met oppervlakteactieve films zijn alomtegenwoordig in het dagelijks leven. Oppervlakteactieve waterinjecties worden gebruikt om de oliewinning uit uitgeputte velden te verbeteren en worden gebruikt als hydraulische breukoplossingen voor schaliegas en -olie. Gas-vloeistof schuimen en vloeistof-vloeistof emulsies zijn gebruikelijk voor veel industriële en wetenschappelijke processen als smeermiddelen en reinigingsmiddelen en komen veel voor in voedsel. Oppervlakteactieve stoffen en eiwitten op interfaces stabiliseren antilichaamconformaties tijdens verpakking, opslag en toediening 1,2,3,4,5, scheurfilmstabiliteit in het oog 6,7,8 en longmechanica 9,10,11,12,13,14, 15.
De studie van oppervlakteactieve stoffen of oppervlakteactieve stoffen die adsorberen aan interfaces en hun eigenschappen heeft een lange geschiedenis met veel verschillende experimentele technieken 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Een recente ontwikkeling is de capillaire drukmicrotensiometer (CPM), die het onderzoek van interfaciale eigenschappen op sterk gekromde interfaces mogelijk maakt, op veel kleinere lengteschalen, terwijl aanzienlijk minder materialen worden gebruikt dan andere gangbare methoden 9,23,24,25. Confocale fluorescentiemicroscopie (CFM) kan worden gebruikt om de morfologie van lipiden en eiwitten te bestuderen op de lucht-waterinterfaces in de CPM22 of op Langmuir-troggen 20,26,27,28,29. Hier zijn een CPM en CFM gecombineerd om morfologische verschijnselen te verbinden met dynamische en evenwichtsinterfaciale eigenschappen om structuur-functierelaties te ontwikkelen voor biologische en technologische interfaces.
Er zijn tal van parameters van belang in interfaciale oppervlakteactieve systemen die toegankelijk zijn voor de CPM-CFM. In de CPM wordt een luchtbel met een diameter van 30-200 μm vastgepind aan de punt van een glazen capillaire buis. In eerdere versies van de CPM werd het capillaire drukverschil tussen de binnen- en buitenkant van de bel geregeld via een waterkolom en een oscillerende spuitpomp 9,30 ; de hier beschreven nieuwe versie vervangt deze door een hogere precisie, computergestuurde microfluïdische pomp. De oppervlaktespanning (γ) wordt bepaald via de Laplace-vergelijking, ΔP = 2γ/R, uit de drukval over het door de pomp ingestelde interface, ΔP, en optische analyse van de kromtestraal van de bel, R. De dynamische oppervlaktespanning van de interface kan worden bepaald met een tijdresolutie van 10 ms na het genereren van een nieuwe bel in contact met een bulkvloeistof die een oplosbare oppervlakteactieve stof bevat. De adsorptiedynamiek van oppervlakteactieve stoffen kan worden beschreven met de klassieke Ward-Tordai-vergelijking10,31 om essentiële eigenschappen van de oppervlakteactieve stof te bepalen, waaronder de diffusiviteit, oppervlaktedekking en de relatie tussen bulkconcentratie en evenwichtsoppervlaktespanning. Zodra een evenwichtsoppervlaktespanning is bereikt, kan het interfaciale gebied worden geoscilleerd om de dilatatiemodulus te meten, 
door de veranderingen in oppervlaktespanning te registreren, geïnduceerd door kleine veranderingen in het beloppervlak, A32. Voor complexere interfaces die hun eigen interne structuren ontwikkelen, zoals verstrengelde polymeren of eiwitten, wordt de oppervlaktespanning, , vervangen door een meer algemene oppervlaktespanning 4,33, 
.
Longstabiliteit tijdens de ademhaling kan direct worden gekoppeld aan het handhaven van zowel een lage oppervlaktespanning als een hoge dilatatiemodulus op de alveolaire lucht-vloeistofinterface 9,10. Alle interne longoppervlakken zijn bekleed met een continue, micron dikke film van epitheliale voeringvloeistof om weefselhydratatie te behouden34. Deze epitheliale voeringvloeistof is voornamelijk water, met zouten en verschillende andere eiwitten, enzymen, suikers en longsurfactant. Zoals het geval is voor elke gebogen vloeistof-dampinterface, wordt een capillaire druk geïnduceerd met de druk hoger aan de binnenkant van de alveolus (of bel). Als de oppervlaktespanning echter overal in de longen constant was, laat de Laplace-vergelijking, ΔP = 2γ / R, zien dat kleinere longblaasjes een hogere interne druk zouden hebben ten opzichte van grotere longblaasjes, waardoor het gasgehalte van de kleinere longblaasjes naar grotere longblaasjes met lagere druk zou stromen. Dit staat bekend als "Laplace Instability"9,35. Het nettoresultaat is dat de kleinste longblaasjes zouden instorten en gevuld zouden worden met vloeistof en moeilijk opnieuw op te blazen, waardoor een deel van de long zou instorten, en andere delen zouden over-inflateren, die beide typische symptomen zijn van acute respiratory distress syndrome (ARDS). In een goed functionerende long verandert de oppervlaktespanning echter dynamisch als de lucht-epitheliale vloeistofinterface in het interfaciale gebied van alveolus uitzet en samentrekt tijdens het ademen. Als 
, of 
, neemt de Laplace-druk af met afnemende radius en neemt toe met toenemende radius om de Laplace-instabiliteit te elimineren, waardoor de long wordt gestabiliseerd9. 
Vandaar, en hoe het afhangt van frequentie, monolaag morfologie en samenstelling, en alveolaire vloeistofsamenstelling kan essentieel zijn voor de longstabiliteit. De CPM-CFM heeft ook de eerste demonstraties gegeven van de effecten van interfaciale kromming op oppervlakteactieve adsorptie25, monolaagmorfologie22 en dilatatiemodulus9. Het kleine volume (~ 1 ml) van het reservoir in de CPM maakt de snelle introductie, verwijdering of uitwisseling van de vloeibare fase mogelijk en minimaliseert de vereiste hoeveelheid dure eiwitten of oppervlakteactieve stoffen10.
Contrast in een CPM-CFM-afbeelding is te wijten aan de verdeling van kleine fracties fluorescerend gelabelde lipiden of eiwitten op de interface16,27. Tweedimensionale oppervlakteactieve monolagen vertonen vaak laterale fasescheiding als functie van oppervlaktespanning of oppervlaktedruk, 
π is het verschil tussen de oppervlaktespanning van een schone vloeistof-vloeistofinterface, γ0, en een met oppervlakteactieve stof bedekte interface, γ. π kan worden beschouwd als de 2D "druk" veroorzaakt door de interacties van oppervlakteactieve moleculen op het grensvlak dat fungeert om de zuivere vloeistofoppervlakspanning te verlagen. Bij lage oppervlaktedrukken bevinden lipide monolagen zich in een vloeistofachtige ongeorganiseerde toestand; dit staat bekend als de vloeistof geëxpandeerde (LE) fase. Naarmate de oppervlaktedruk toeneemt en het gebied per lipidemolecuul afneemt, oriënteren de lipiden zich met elkaar en kunnen ze een eerste orde fase overgang ondergaan naar de lange afstand bestelde vloeistof gecondenseerde (LC) fase 16,20,27. De LE- en LC-fasen kunnen naast elkaar bestaan bij verschillende oppervlaktedrukken en kunnen worden gevisualiseerd als fluorescerend gelabelde lipiden worden uitgesloten van de LC-fase en worden gescheiden naar de LE-fase. De LE-fase is dus helder en de LC-fase is donker wanneer deze wordt afgebeeld met CFM16.
Het doel van dit manuscript is om de stappen te beschrijven die nodig zijn om de gecombineerde confocale micro microtensiometer te bouwen en te bedienen. Dit stelt de lezer in staat om adsorptiestudies uit te voeren, oppervlaktespanning, reologisch gedrag te meten en interfaciale morfologie tegelijkertijd te onderzoeken op een lucht / water- of olie / water-interface op micronschaal. Dit omvat een bespreking van het trekken, snijden en hydrofobiëren van de vereiste haarvaten, instructies voor het gebruik van druk-, krommings- en oppervlakteregelingsmodi en interfaciale overdracht van onoplosbare oppervlakteactieve stof naar de microtensiometer gebogen interface.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van capillaire buisjes
- Plaats het capillair in een capillaire trekker en voer het gewenste trekprogramma uit om twee taps toelopende haarvaten te maken met een buitendiameter (OD) van ~ 1 μm aan de punt.
OPMERKING: De OD van het capillair voordat u gaat trekken, moet de OD zijn die is gespecificeerd om in de capillaire houder in de microtensiometercel te passen. De binnendiameter (ID) van het capillair kan variëren, maar heeft invloed op de kritische straal van het capillair na het trekken. Er wordt gekozen voor een pulling-programma, zodat de resulterende taper in eerste instantie de capillaire OD en ID snel vermindert, vervolgens een straal bereikt in de buurt van de gewenste capillaire OD en ID en vervolgens langzamer in diameter afneemt. Dit zal een grotere capillaire lengte creëren die kan worden gescoord om een bruikbaar capillair van 30-100 μm in ID op te leveren. - Scoor de punt van het capillair op de gewenste plek om een ID van 30-100 μm te verkrijgen en breek de punt af. Het capillair heeft nu een OD en ID van de gewenste straal aan de punt (figuur 1A). De haarvaten kunnen worden bewaard tot stap 2.
OPMERKING: De snijrand van het capillair moet een 90° schone breuk hebben. Elk defect in de snijrand zal leiden tot een slechte pinning van de bel aan het capillair en slechte oppervlakte-eigenschapsmetingen. Taps toelopende capillaire uiteinden zijn zeer delicaat. Ze zullen worden vernietigd als ze in contact komen met iets anders dan de oplossingen (bijv. Injectieflaconwanden, luchtmondstuk).
2. Hydrofobisatie van haarvaten
- Verzamel getrokken glazen haarvaten, zure reinigingsoplossing, plastic pincet, gedeïoniseerd (DI) water, hydrofobisatie-oplossing (2% silaan in ethanol), vacuümpomp en ethanoloplossing. Zie Materiaaltabel voor meer informatie.
LET OP: Zure reinigingsoplossing is acutly giftig, veroorzaakt huid- en oogcorrosie / irritatie, oxideert. Hydrofobisatie-oplossing is een huid/oog/ademhalingsirritant. Draag oogbescherming, laboratoriumjassen en handschoenen en werk met oplossingen in een zuurkast. - Zuur-reinig het capillair
OPMERKING: Zuurreiniging van het capillair verwijdert alle organische resten in het capillair en bereidt het glasoppervlak voor op de silanisatiereactie die het capillaire hydrofoob maakt.- Pak een capillair stevig in de buurt van het brede uiteinde met het pincet.
- Dompel de taps toelopende punt in de zure reinigingsoplossing terwijl u de slang van de vacuümpomp aan het brede uiteinde van het capillair bevestigt. Dit zuigt de oplossing in het capillair.
OPMERKING: Een pipetpunt kan aan het uiteinde van de capillaire slang worden bevestigd om een betere pasvorm met het capillaire uiteinde mogelijk te maken. - Stop wanneer de zure reinigingsoplossing ongeveer de helft van het capillair heeft gevuld.
OPMERKING: Na verwijdering van de capillaire punt uit de zure reinigingsoplossing, vormt de oplossing aan de buitenkant van het capillair vaak een kraal in de buurt van de capillaire punt. Raak het capillair voorzichtig aan in de hals van de injectieflacon met oplossing om overtollige oplossing te verwijderen. - Laat de zure reinigingsoplossing ten minste 30 minuten in de haarvaten blijven zitten en zorg ervoor dat de plug van de vloeistof aan het taps toelopende uiteinde van het capillair blijft.
- Verwijder de zure reinigingsoplossing uit het capillair door het capillair stevig vast te houden met het pincet en de vacuümslang te gebruiken om de vloeistof uit het grote uiteinde van het capillair te trekken.
- Spoel het capillair af
- Dompel het taps toelopende uiteinde van het capillair onder in DI-water en zorg ervoor dat het diep genoeg wordt ondergedompeld om elke buitenkant te bedekken die is ondergedompeld in de zure reinigingsoplossing. Terwijl de punt onder water staat, gebruikt u de vacuümslang om DI-water door het capillair te trekken. Haal het capillair uit het water en verwijder het resterende water met de vacuümslang.
- Herhaal de bovenstaande stap minstens 4x.
- Voer stap 2.3 opnieuw uit door ethanol te vervangen door DI-water.
- Zuig continu aan totdat de ethanol volledig uit de binnenkant van het capillair verdampt. Het capillair wordt troebel en koel om aan te raken als de ethanol begint te verdampen, maar zal na 30 tot 45 s verdwijnen.
- Bedek het capillair met de hydrofobisatieoplossing
- Dompel het brede uiteinde van het capillair kort in het ~ 2% silaan in ethanoloplossing. Capillaire werking zal ervoor zorgen dat de coatingoplossing in het capillair stijgt. Verwijder het capillair uit de oplossing zodra een ~1 cm grote plug in het capillair is gestegen.
- Richt het capillair zo dat de taps toelopende punt naar beneden is gericht, waardoor de coatingoplossing met de zwaartekracht naar de taps toelopende punt kan vallen.
- Laat de coatingoplossing minstens 3 min in het capillair blijven.
OPMERKING: Er mogen geen luchtbellen in de plug van de coatingoplossing zitten die in contact staat met de binnenkant van de taps toelopende punt. Als er een luchtbel is, is het capillaire binnenste waarschijnlijk niet voldoende gedroogd in stap 2.5. Om dit te verhelpen, herhaalt u stap 2.4-2.6 indien nodig.
- Spoel de haarvaten met ethanol 1x op dezelfde manier als stap 2.3.
- Plaats de hydrofobe coating op het capillair
- Plaats schone en droge scintillatieflacons in een vacuümoven op 120 °C. Plaats gecoate haarvaten in de injectieflacons (idealiter één capillair per injectieflacon) met brede uiteinden die op de basis van de injectieflacon rusten. Laat haarvaten minstens 6 uur in de oven blijven (bij voorkeur een nacht) om een permanente hechting van de hydrofobe silaanlaag aan de haarvaten te bereiken. De haarvaten kunnen worden bewaard tot stap 4.
3. Monstervoorbereiding en -opslag
- Meng en bewaar oppervlakteactieve en fluorofooroplossingen in schone, met zuur gewassen injectieflacons om besmetting te voorkomen.
OPMERKING: In de handel verkrijgbare lipiden moeten van de hoogste zuiverheid zijn en tussen gebruik bij - 20 °C worden bewaard. Oude of vervuilde lipiden zorgen er vaak voor dat de resultaten moeilijk te reproduceren zijn.
4. De microtensiometer instellen
- Stel de CPM-cel samen zoals beschreven in figuur 2.
- Plaats de grote kant van het capillair in de bovenkant van de CPM-cel totdat deze doordringt naar de onderkant van de cel.
- Draai de PEEK-plug voorzichtig vast om het capillair vast te zetten en bevestig vervolgens de buis van de microfluïdische pomp aan de grote kant van het capillair. Zorg ervoor dat u de taps toelopende capillaire punt niet aanraakt.
- Bevestig indien nodig de reservoirwissel- en/of temperatuurregelingsslangen aan de respectieve in- en uitgangen van de CPM-cel (figuur 2); sluit anders de ongebruikte in- en uitgangen aan.
- Bevestig de CPM-cel aan de confocale microscooptrap en lijn deze ruwweg uit met het CFM-objectief, de CPM-camera en de CPM-lichtbron (figuur 3).
- Open de gasstroom naar de microfluïdische pomp bij de aanbevolen bedrijfsdruk van de pomp (150 mbar voor de hier gebruikte microfluïdische pomp) en zorg ervoor dat de stroom naar het capillair open is.
- Begin met het uitvoeren van de virtuele CPM-interface (Supplemental Coding File 1: Microtensiometer Virtual Interface.vi) in de modus Drukregeling met de capillaire drukoscillatiefrequentie en amplitude ingesteld op nul (figuur 4-7). Figuur 4 toont een screenshot van de virtuele interface. Voor DI-water en een capillaire straal van ~35 μm zorgt een druk van ~20 mbar ervoor dat er geen water in het capillair komt.
- Vul de CPM-cel met water met behulp van een pipet.
- Focus op de capillaire punt met behulp van de microtensiometer camera.
- Focus op de capillaire tip met de CFM. Als het moeilijk is om het capillair te vinden, gebruikt u de CPM-camera om het CFM-objectief te vinden. Dit zal helpen bij het benaderen van de afstand tussen de CFM-doelstelling en de bubbel, waardoor de juiste werkafstand wordt bereikt.
- Nadat de annulus (groene sectorprojectie) op de bel is gecentreerd, past u de focus handmatig aan zodat de rand van de bubbel duidelijk zichtbaar is (figuur 4-3).
OPMERKING: De positie, begin- en eindhoek en binnen- en buitenradii van de annulus kunnen worden aangepast via het menu onder het weergavevenster. - Klik op Bubbel opnieuw instellen en zorg ervoor dat er een nieuwe bubbel wordt gevormd (men kan de oude bel horen knallen en de nieuwe bel kan worden waargenomen vanuit het weergavevenster van het bedieningspaneel; Figuur 4-3). Als de bel niet klapt, verhoogt u de Resetdruk of verhoogt u de Resetvertragingstijd op het tabblad Bellen opnieuw instellen onder het weergavevenster. Controleer of de oppervlaktespanning ongeveer 73 mN/m is (voor zoutoplossing of water/luchtbellen) (figuur 4-9).
- Haal het water eruit via de direct-to-cell spuit (figuur 3-13), leeg het en bevestig het opnieuw. Het monster is klaar om te worden geladen om het experiment uit te voeren.
5. Adsorptieonderzoek
- Vul de cel met het gewenste monster met behulp van een geautoclaveerde pipet die de CPM-software in de drukregelingsmodus houdt. Zorg ervoor dat de initiële oppervlaktespanning ongeveer 73 mN/m is wanneer een nieuwe belleninterface wordt gemaakt.
- Bepaal de straal van de nieuw gevormde bel en voer die waarde in het middenlijngebiedbesturingselement in (figuur 4-7) en wijzig het besturingstype in gebiedsbesturingselement door op het tabblad Gebiedsbesturingselement te klikken (figuur 4-8).
OPMERKING: Constante drukregeling kan ook worden gebruikt, maar dit zorgt ervoor dat de bubbelradius continu verandert als de oppervlaktespanning van de interface verandert. Dit veranderende gebied kan de analyse van adsorptiepercentages van oppervlakteactieve stoffen bemoeilijken en ervoor zorgen dat de bubbel tijdens het onderzoek opduikt. - Begin met het opnemen van de confocale video.
- Klik op Reset Bubble (Figuur 4-5) en klik direct op Collect Data (Figuur 4-6). Het signaallampje op de knop wordt groen.
- Pas de gegevensregistratiesnelheid aan de concentratie van het monster aan door de in figuur 4-6 weergegeven balk te schuiven. Voor langzamere adsorpties gebruikt u een langzamere opnamesnelheid. Dit kan in het midden van een run worden aangepast als een hogere opnamesnelheid vroeg gewenst is, maar een langzamere snelheid heeft de voorkeur voor lange studies om de bestandsgrootte te verkleinen.
- Sla het bestand na het einde van het experiment (wanneer een laatste oppervlaktespanningsplateau is bereikt) op door het juiste bestandspad te kiezen (figuur 4-1) en op de knop Opslaan te klikken (figuur 4-2).
- Stop en sla de opname ook op de CFM op.
6. Oscillatie/ontspanningsstudie
- Vul de cel met het monster met behulp van een geautoclaveerde pipet die de CPM-software in de drukregelingsmodus houdt. Zorg ervoor dat de oppervlaktespanning ongeveer 73 mN/m is wanneer een nieuwe belleninterface wordt gemaakt.
- Wacht tot het monster volledig is geadsorbeerd aan de interface. Dit kan direct na een adsorptieonderzoek worden uitgevoerd in plaats van opnieuw te beginnen met een nieuwe belleninterface.
- Bepaal of oscillatie een drukoscillatie, gebiedsoscillatie of krommingsoscillatie zal zijn door het juiste tabblad te selecteren (figuur 4-8) en de gewenste basislijnwaarde, oscillatie% en oscillatiefrequentie in te voeren (figuur 4-7).
OPMERKING: Zaagtand-, vierkante en driehoekige golfgebiedoscillaties zijn ook toegankelijk via het vervolgkeuzemenu op het tabblad Oscillatie in ander gebied. - Start de opname van de confocale video en klik op Gegevens verzamelen (figuur 4-6) in de CPM-software.
- Start de oscillatie. Zorg ervoor dat u ten minste zeven cycli opneemt voor de beste resultaten. Kies een data-acquisitiesnelheid (figuur 4-6) om een voldoende aantal gegevenspunten voor elke oscillatiecyclus te geven.
- Als andere oscillatieamplitudes of frequenties gewenst zijn, wijzigt u de waarden tijdens het experiment.
- Sla de resultaten op zoals in stap 5.6 en 5.7.
7. Onderzoek naar de uitwisseling van oplosmiddelen
- Vul de cel met het monster met behulp van een geautoclaveerde pipet die de CPM-software in de drukregelingsmodus houdt. Zorg ervoor dat de oppervlaktespanning ongeveer 73 mN/m is wanneer een nieuwe belleninterface wordt gemaakt.
OPMERKING: Adsorptie- en/of oscillatiestudies kunnen voorafgaand aan het oplosmiddeluitwisselingsonderzoek worden uitgevoerd. - Sluit de inlaatbuis aan op de fles met de gewenste vervangingsoplossing (figuur 3-11) op de peristaltische pomp (figuur 3-10).
- Start de opname van de video in confocale software en klik op Gegevens verzamelen (figuur 4-6) in de CPM-software.
- Stel de snelheid van de peristaltische pomp in. Dit regelt de vloeistofuitwisselingssnelheid en moet worden gekozen op basis van de vereisten voor het experiment, d.w.z. hoe snel het oplosmiddel moet worden vervangen.
- Als er meerdere vloeistoffen moeten worden uitgewisseld, stopt u de peristaltische pomp en sluit u de inlaat aan op een andere uitwisselingsoplossing.
- Nadat de uitwisseling is voltooid (~ 20 min), slaat u de resultaten op zoals in stap 5.6 en 5.7.
8. Onoplosbare adsorptie van oppervlakteactieve stoffen
OPMERKING: Als de te adsorberen oppervlakteactieve stof niet oplosbaar is in de reservoirvloeistof, kan deze methode worden gebruikt om een monolaag van de lucht/water-interface van de cel naar het bubbeloppervlak over te brengen. Veel dubbellaagvormende lipiden zijn bijna onoplosbaar in een zoutoplossing en absorberen niet spontaan in de bel wanneer ze in de reservoiroplossing worden gesuspendeerd.
- Vul de cel met het monster met behulp van een geautoclaveerde pipet die de CPM-software in de drukregelingsmodus houdt. Zorg ervoor dat de oppervlaktespanning ongeveer 73 mN/m is wanneer een nieuwe belleninterface wordt gemaakt.
- Deponeer een monolaag van onoplosbare oppervlakteactieve stof op de lucht-waterinterface van de cel van een oplossing in een vluchtige organische oplossing. Deponeer met behulp van een spuit kleine druppeltjes op het grensvlak en laat het oplosmiddel verdampen en laat het lipide achter als een dunne film.
LET OP: Chloroform wordt gebruikt als oplosmiddel voor fosfolipiden zoals fosfatidylcholines en vetzuren. Verspreidingsoplossingen zijn meestal 0,01-0,02 mg lipide per ml van het oplosmiddel. Chloroform is acuut giftig, kan huid- en oogirritatie veroorzaken en is kankerverwekkend. Draag de juiste oogbescherming, laboratoriumjas en handschoenen en maak de oplossing in een zuurkast. - Verklein het oppervlak via de middellijndrukregeling (figuur 4-7) van de bel totdat deze bijna vlak is. Dit voorkomt dat de bel knalt nadat de oppervlakteactieve stof is geadsorbeerd.
- Verwijder de reservoirvloeistof uit de cel via de direct-to-cell spuit totdat de lucht/water interface langs de punt van het capillair beweegt. Hoewel een spuitpomp kan worden gebruikt, kan deze stap worden bereikt door de spuit handmatig te gebruiken.
- Verhoog de vloeistofhoogte van het reservoir tot het oorspronkelijke niveau.
OPMERKING: Nadat de tip opnieuw is ondergedompeld, zal de bel groter zijn vanwege de oppervlakteactieve stof die nu op de interface is geadsorbeerd. De monolaag zal nu klaar zijn voor oscillatie- of oplosmiddeluitwisselingsexperimenten.
9. Opruimen
- Schakel de CFM uit.
- Schakel over naar de modus Drukregeling .
- Verwijder het monster uit de cel met een pipet. Laad de cel met DI-water en verhoog de druk tot ~ 50 mbar om ervoor te zorgen dat bubbels constant uit het capillair ontsnappen en de capillaire punt reinigen. Herhaal dit proces 2x.
- Sluit de veiligheidsklep en schakel de CPM uit door op de rode knop in de linkerbovenhoek te klikken, schakel het licht- en blauwe drukbedieningspaneel uit en sluit de drukbron af.
- Verwijder de cel uit het confocale microscoopstadium. Spoel de cel uit met ethanol en DI-water. Verwijder de capillaire buis uit de CPM-cel.
10. De cel schoonmaken
- Demonteer de cel. Poets de binnenwand met een tandenborstel tijdens het spoelen onder DI-water. Dompel de onderdelen onder in ethanol en soniceer het gedurende ~ 30 minuten.
- Spoel alle onderdelen een paar keer af met DI-water. Droog de onderdelen door ze te blazen met stikstofgas of ze te drogen in een vacuümoven.
11. Oscillatie analyse
- Voer de Dilatational_Rheology_Analysis.m-code (Supplemental Coding File 2) uit en kies het gewenste bestand dat is opgeslagen in de virtuele CPM-interface. Voorbeeldgegevens worden opgenomen in de aanvullende bestanden.
- De druk versus tijdplot wordt weergegeven zoals weergegeven in aanvullende figuur 1. Klik met de linkermuisknop op het punt waar de oscillatie begint en klik nogmaals met de linkermuisknop op de plaats waar de oscillatie eindigt. Als de gegevens meerdere oscillaties bevatten, herhaalt u dit proces voor alle oscillaties.
- Wanneer alle begin- en eindpunten met de linkermuisknop zijn geklikt, klikt u met de rechtermuisknop ergens anders op de muis. Zoals bijvoorbeeld wordt weergegeven in aanvullende figuur 1, kan men met de linkermuisknop klikken op de punten 1, 2, 3 en 4, gevolgd door een klik met de rechtermuisknop.
OPMERKING: De code berekent de dilatatiemodulus en fasehoek en de resultaten worden naar een nieuw .csv bestand op de oorspronkelijke bestandslocatie geschreven. De resultaten voor de voorbeeldgegevens zijn te zien in de coderesultaten in het aanvullende coderingsbestand 2. MATLAB zal ook verschillende grafische weergaven van de gegevens genereren, zoals weergegeven in aanvullende figuur 2.
- Wanneer alle begin- en eindpunten met de linkermuisknop zijn geklikt, klikt u met de rechtermuisknop ergens anders op de muis. Zoals bijvoorbeeld wordt weergegeven in aanvullende figuur 1, kan men met de linkermuisknop klikken op de punten 1, 2, 3 en 4, gevolgd door een klik met de rechtermuisknop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een belangrijke bron van meetfouten ontstaat door de haarvaten met defecten van het snijproces (figuur 5A, B) of het coatingproces (figuur 5D). Beide soorten defecten leiden tot fouten bij het bepalen van de vorm en grootte van de bel door het optische beeldanalysesysteem, wat leidt tot onnauwkeurige oppervlaktespanningswaarden. Het is belangrijk om elk nieuw capillair zorgvuldig te onderzoeken nadat het is getrokken en gecoat onder de optische microscoop voordat het capillair in de CPM wordt ingebracht. Een verkeerd gesneden capillair moet worden weggegooid, maar een slecht gecoat capillair kan zuur-gereinigd en opnieuw gecoat worden om de bubbelpinning aan het einde van het capillair te verbeteren (stap 2 van het protocol). Haarvaten werken het beste als de eindsnede perfect loodrecht op het capillair staat (figuur 5C) en de bellenpennen direct aan het einde van het capillair (figuur 5E). De hydrofobe coating op het capillair zal minder effectief worden bij het pinnen bij gebruik, waardoor het capillair opnieuw moet worden gereinigd en opnieuw moet worden gecoat.
Representatieve gegevens voor adsorptie van oppervlakteactieve stoffen versus tijd zijn weergegeven in figuur 6. Eerdere experimentele technieken zoals een hanger of sessiedruppels die werden gebruikt om de adsorptie van oppervlakteactieve stoffen te meten, hadden geen mechanisme om de capillaire druk dynamisch aan te passen, omdat de verandering in oppervlaktespanning ervoor zorgt dat het bubbelgebied verandert tijdens adsorptie 30,36,37. In feite zijn voor grotere bellen en druppels veranderingen in de bel- of druppelvorm (en dus het oppervlak) vereist om de oppervlaktespanning te bepalen uit de analyse van de interfacevorm, omdat de capillaire druk niet onafhankelijk wordt gemeten en de capillaire druk varieert over het druppel- of bubbeloppervlak37. Dit bemoeilijkt ook de analyse van de adsorptie omdat als oppervlakteactieve stof adsorbeert aan de interface, de oppervlaktespanning afneemt, en om aan de Laplace-vergelijking te voldoen, moet het oppervlak van de bel toenemen, waardoor extra oppervlakteactieve stof nodig is om te adsorberen om evenwicht te bereiken. In de CPM vereist een vaste capillaire druk dat de initiële bubbelradius binnen een klein bereik moet liggen voorafgaand aan adsorptie van oppervlakteactieve stoffen om te voorkomen dat de bel uit het capillair wordt uitgestoten als de oppervlaktespanning te veel afneemt. Oppervlakteactieve adsorptiedynamiek wordt vaak gemodelleerd door de klassieke Ward-Tordai-vergelijking31, die de adsorptie van oppervlakteactieve moleculen beschrijft aan een schone interface van constant interfacial gebied. Hoewel de Ward-Tordai-vergelijking kan worden aangepast om rekening te houden met het veranderende oppervlak, introduceert dit extra parameters en bemoeilijkt het de analyse38,39 aanzienlijk.
Om deze problemen op te lossen, werd een modelgebaseerde feedbacklus ontwikkeld met behulp van de Laplace-vergelijking die de kromming (en het oppervlak) van de bel constant houdt tijdens het adsorptieproces door de capillaire druk dynamisch aan te passen. Er zijn aanzienlijke verschillen in de snelheid van verandering van de oppervlaktespanning omdat het gebied van de bel niet voortdurend toeneemt. De veranderingen in het bubbelgebied tijdens adsorptie zijn niet constant met de tijd, omdat de oppervlaktespanning eerst langzaam verandert en vervolgens snel versnelt voorafgaand aan equilibratie. Een extra complicatie is dat de fractionele verandering in het gebied afhankelijk is van de initiële bubbelradius. Een bijkomend voordeel van een constante bubbelradius is dat het in beeld brengen van de interface wordt vereenvoudigd omdat het bubbeloppervlak vast blijft, wat het scherpstellen van de CFM vereenvoudigt. Tijdens het adsorptieproces, terwijl oppervlakteactieve stof adsorbeert aan de interface (video 1), neemt het fluorescerende signaal van de interface toe. Als de oppervlakteactieve stof oppervlaktedomeinen vormt, kunnen deze domeinen worden waargenomen die zich vormen en groeien22.
De veranderingen in oppervlaktespanning tijdens gebiedsoscillaties zijn weergegeven in figuur 7. In eerdere versies van de CPM werden oscillaties gemaakt in de bubbel capillaire druk; het genereren van een sinusgolf in capillaire druk vertaalt zich echter niet direct in een sinusgolf in oppervlakte, omdat de twee gerelateerd zijn via de Laplace-vergelijking. Door gebruik te maken van een modelgebaseerde feedbacklus met behulp van de Laplace-vergelijking, worden oscillaties in het gebied gecreëerd in plaats van in capillaire druk, wat leidt tot gegevens die gemakkelijker te analyseren en te verzamelen zijn over een groter bereik van amplitudes. Als gevolg hiervan kunnen de oppervlaktespannings- versus oppervlaktegegevens die met deze methode worden verzameld, worden gebruikt om de interfaciale dilatatiemodulus van de oppervlakteactieve laag direct te berekenen: 
(Figuur 8), waarbij 
de totale spanning van het systeem en τ-spanningniet-isotroop deviatorisch is, vaak afwezig in eenvoudige oppervlakteactieve oplossingen 4,33. Dus, voor een eenvoudig oppervlakteactieve stofsysteem, 
. Voor interfaces waar elastische netwerken kunnen worden gevormd, zoals oppervlakteactieve eiwitten, zijn vaak extra spanningen aanwezig en moeten dus rekening worden gehouden bij het definiëren van de dilatatiemodulus. Video 2 toont een CFM-video van de beweging van zwarte LC-domeinen in een continu gekleurde LE-fasematrix in fosfolipide monolagen. De verschillende LC-domeinen op de interface reorganiseren in een vertakkingsnetwerk dat de interface bedekt wanneer oscillaties plaatsvinden op de gebogen bel22,40. Het tabblad Andere gebiedsoscillaties kan worden gebruikt om zaagtand-, vierkante en driehoekige golven te maken, zoals te zien is in aanvullende figuur 3 en het tabblad Compressie maakt compressie en uitbreiding van het gebied met constante snelheid mogelijk.
Voor solventuitwisselingsstudies wordt eerst een oppervlakteactieve stof toegestaan om aan de interface te adsorberen en vervolgens wordt de reservoirvloeistof uitgewisseld om een tweede oppervlakteactieve soort in staat te stellen contact te maken met die interface. Het is mogelijk om de verandering in oppervlaktespanning te onderzoeken, omdat de tweede oppervlakteactieve stof concurreert met de oorspronkelijke oppervlakteactieve stof op het grensvlak. De oppervlaktedilatatiemodulus is vaak een gevoeligere sonde van de oppervlakteactieve stofuitwisseling samen met de oppervlaktemorfologie via CFM. Figuur 9 toont de verandering in oppervlaktespanning, oppervlaktedilatatiemodulus en oppervlaktemorfologie als een dergelijke oplosmiddeluitwisseling plaatsvindt. Hoewel de specifieke kenmerken van een dergelijke uitwisseling kunnen variëren, kan een wijziging in een van de drie eigenschappen wijzen op integratie van de tweede component in de monolaag of oplossing van de primaire component in de bulk. Een tweede fluorescerende tag kan aan de secundaire soort worden bevestigd om de interactie met de interface van de CFM-beelden te observeren.
Figuur 1: Capillaire behandeling. (A) Afbeelding met de score van het capillair. Het glaskaramiek wordt in een klem gehouden om het stabiel te houden. (B) Zuurreiniging van het capillair. De zure reinigingsoplossing wordt met de vacuümpomp in het capillair getrokken. (C) Hydrofobisatie van het capillair. Silaanoplossingsplug in het capillair Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Celconstructie. (1) Grote aluminium celhouder, (2) Fluorelastomeer pakking (vier in totaal), (3) glazen schuif (twee in totaal), (4) PEEK-cel en (5) kleine aluminium celhouder. Bij montage wordt aan weerszijden van elke glasplaat een fluorelastomeerpakking geplaatst. De cel wordt bij elkaar gehouden met schroeven en bouten. De ingezoomde afbeelding van de PEEK-cel toont de locaties van de verschillende poorten: (6) capillaire poort, (7) inlaat van oplosmiddeluitwisseling, (8) oplosmiddeluitwisselingsuitgang en (9,10) in- en uitlaat van de temperatuurregelaarmantel. Een PEEK-plug kan worden gebruikt om de slang of het capillair aan de cel te bevestigen. Poorten die niet worden gebruikt, kunnen volledig worden afgesloten door stekkers zonder kanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schema van CPM/CFM, niet op schaal. (1) de CPM-cel, (2) de capillaire buis met een bel aan de punt, (3) confocale microscoop objectief, (4) microscoop camera objectief met filter, (5) CPM lichtbron, (6) microfluïdische pomp, (7) veiligheidsklep, (8) vloeistofuitwisseling inlaat, (9) vloeistofuitwisseling uitlaat, (10) peristaltische pomp, (11) uitwisseling vloeistof reservoir, (12) vloeistofuitwisseling afval, (13) direct naar cel spuit, (14) in- en uitlaat van de temperatuurregelaarmantel en (15) temperatuurgeregeld reservoir en pomp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: CPM virtuele interface. (1) het bestandspad waar de gegevens worden opgeslagen; (2) systeemparameters, opmerkingen en de knop Opslaan. Alle velden in dit gebied worden opgeslagen in het uiteindelijke gegevensbestand; (3) het beeld van de CPM-camera; (4) instellingen die de beeldanalyse, annulusmeting, bellenreset en frames per seconde volgen regelen; (5) de Bubble Reset-knop; (6) de knop Gegevens verzamelen, snelheidsregeling voor gegevensregistratie en indicatoren voor gegevensverzameling; (7) bedieningselementen voor alle bedrijfsmodus centerline-waarden, oscillatieamplitude en oscillatiefrequentie; (8) bedrijfsmodusschakelaar: als u op elk tabblad klikt, wordt de besturingsmodus gewijzigd. Elke modus toont het druksignaal dat naar de pomp wordt gestuurd in de grafiek "Druksignaal" en enkele extra bedieningselementen; (9) gegevens over de spanning van het woonoppervlak; (10) gegevens over de druk onder spanning; (11) live straal van krommingsgegevens; (12) gegevens over de oppervlakte van levende dieren; en (13) gegevens over de spanning en het oppervlak van het levende oppervlak, die kunnen worden gebruikt om ruwweg de fasehoek tijdens een oscillatiestudie te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Capillaire defecten. (A) en (B) Verkeerd gesneden haarvaten; (C) correct gesneden capillair, (D) capillair met slechte pinning als gevolg van slechte of afgebroken coating, en (E) goed gepind capillair. De rode pijlen in D en E geven aan waar de bubbels zijn vastgemaakt. Voor het beste resultaat zal de bubbel zich vastpinnen op de capillaire punt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Adsorptiestudie microtensiometerresultaten voor zowel adsorpties met constante druk (oranje) als met constant gebied (blauw). Het bubbeloppervlak voor de adsorptie van het constante gebied neemt gedurende het onderzoek aanzienlijk toe en zorgt ervoor dat de adsorptie langer duurt om dezelfde oppervlaktespanning te bereiken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Typische oppervlakteregeling oscillatie. (A) Druk, (B) kromming en (C) oppervlaktegegevens. De oppervlaktegegevens zijn een sinusoïde, terwijl de druk- en krommingsgegevens dat niet zijn, zoals blijkt uit het feit dat de middellijnwaarden zich niet in het middelpunt van de oscillatie bevinden. De wiskundige relatie tussen de drie waarden betekent dat slechts één een echte sinusoïde kan zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Monster reologische resultaten na analyse. Dilatatiemodulus van Lyso PC (1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfocholine) als functie van de frequentie voor het verhogen van de concentraties van Lyso PC voor ~45 μm radius bubbels. Concentraties >0,1 mM Lyso PC die gepaard gaan met ontsteking verlagen de dilatatiemodulus over het bereik van normale ventilatie/ ademhalingssnelheden (geel) om 2ε−γ < 0 te maken, wat de crossoverwaarde is voor het induceren van de Laplace-instabiliteit (gestippelde rode lijn). Lage concentraties Lyso PC ≤0,01 mM, die in normale longen kunnen voorkomen, veroorzaken geen instabiliteit. Bij frequenties >10 rad/sec liggen alle Lyso PC-concentraties boven de crossover en zouden ze niet gevoelig zijn voor de Laplace-instabiliteit. Effen rode lijnen zijn aanvallen van theorie op de gegevens. Figuur weergegeven uit referentie9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: CFM- en CPM-resultaten voor een oplosmiddeluitwisselingsstudie voor longoppervlakteactieve stof uitgewisseld met DI-water en vervolgens Lyso PC. (A) laat zien hoe oppervlaktespanning en oppervlaktedilatatiemodulus gedurende het onderzoek veranderen. De grafiek is onderverdeeld in vier gebieden: wanneer de longsurfactant wordt geadsorbeerd aan de interface (blauw), wanneer de LS wordt uitgewisseld met DI-water (groen), wanneer de uitwisselingsoplossing wordt overgeschakeld naar een Lyso PC-oplossing (rood) en wanneer de cel wordt gevuld met de Lyso PC-oplossing (oranje). De eigenschappen kunnen worden gezien als veranderend in de verschillende uitwisselingen, wat aangeeft dat de interface verandert. (B) toont een confocale afbeelding van de longsurfactant die vóór uitwisseling aan de interface is geadsorbeerd en (C) toont hetzelfde oppervlak nadat de uitwisseling met de Lyso PC-oplossing is voltooid. In beide gevallen geeft de witte stippelcirkel de binnenrand van het capillair aan. De structuur van de domeinen op de monolaag verandert drastisch na de oplosmiddeluitwisseling, wat de CPM-resultaten bevestigt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Confocale video van adsorptiestudie met constante druk voor longsurfactant. De valse kleur toont de afstand in de z-richting met de kleurenbalk aan de linkerkant van de video, waarbij paars de bel bij het capillair aangeeft en groen de bovenkant van de bel is. De interface is in eerste instantie zwak verlicht omdat slechts een klein deel van de fluorescerende oppervlakteactieve stof wordt geadsorbeerd. Naarmate meer en meer oppervlakteactieve stoffen adsorberen, begint de bel te groeien naarmate de kleur meer naar groen verschuift en de interface wordt bevolkt door zwarte LC-domeinen die over de interface kunnen bewegen. Aggregaten van oppervlakteactieve stof in de oplossing kunnen in de oplossing zweven als heldere amorfe vormen en verschillende nestelen zich op de bubbelinterface, desintegreren en deponeren hun oppervlakteactieve stof op de interface. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Confocale video van oscillatiestudie voor longsurfactant. De false-color toont de afstand in de z-richting met de kleurenbalk aan de linkerkant van de video. Het oppervlak wordt blootgesteld aan verschillende oscillatiefrequenties en de donkere LC-domeinen op de interface kunnen gedurende de oscillaties worden gezien. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende figuur 1: Voorbeeld van een tussenstap in de code om de dilatatiereologie te bepalen. Wanneer dit scherm wordt weergegeven, moet de gebruiker met de linkermuisknop op de meest linkse rand van de oscillatie klikken om te analyseren en vervolgens met de linkermuisknop op de meest rechtse rand klikken. Meerdere oscillaties kunnen worden geanalyseerd, zodat de gebruiker met de linkermuisknop op 1, 2, 3 en 4 kan klikken en vervolgens met de rechtermuisknop kan klikken om die twee oscillaties te analyseren. De getoonde oscillaties zijn van verschillende amplitudes en frequenties. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Voorbeeld van de grafische resultaten van de dilatationale reologiecode. Dit toont de pasvormen van sinusoïden op de oscillaties in druk, straal, oppervlakte en oppervlaktespanning, evenals de Fouriertransformatie van elke oscillatie. Idealiter zou de tweede harmonische in de Fouriertransformatie minder dan 10% van de eerste harmonische moeten zijn voor het oppervlak en de oppervlaktespanning. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Alternatieve bedrijfsmodi. (A) Sinusgolf, (B) Zaagtandgolf, (C) Blokgolf, (D) Driehoeksgolf, (E) Constante snelheidsuitbreiding en (F) Constante snelheidscompressie. De compressie- en expansieve modi maken het mogelijk om isothermen van het Langmuir-type te creëren voor onoplosbare oppervlakteactieve stoffen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 1: Microtensiometer Virtual Interface.vi. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende coderingsbestand 2: Dilatational_Rheology_Analysis uur Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gecombineerde CPM/CFM is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van interfaciale dynamica, evenwichten en morfologie. Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het verkrijgen van gegevens met CPM/CFM.
Figuur 2 toont het celontwerp met kanalen voor het capillair, oplosmiddel en warmte-uitwisseling aangegeven. De inlaat voor oplosmiddeluitwisseling moet zich aan de onderkant van de cel bevinden, terwijl de uitlaat zich aan de bovenkant moet bevinden, zodat de cel niet overloopt tijdens de uitwisseling. In de praktijk kunnen de inlaat- en uitlaatdebieten voor dezelfde peristaltische pomp enigszins verschillen. Een veel voorkomend probleem met dit celontwerp is het lekken uit de cel. Dit wordt meestal veroorzaakt door een slechte verbinding tussen de cel en een van de verbindingen, maar als alle verbindingen droog zijn en niet lekken, kan dit te wijten zijn aan een scheur in de glasschuif van de cel als gevolg van het te veel aandraaien van de bouten rond de cel.
Figuur 3 toont de verbindingen tussen de verschillende pompen en de cel en de uitlijning van de cel met de CFM- en CPM-doelstellingen. De CPM-camera (4) wordt gebruikt om de bubbelvorm tijdens het gebruik in beeld te brengen. De CPM-camera moet zijn uitgerust met een optisch filter dat voorkomt dat het CFM-opwindend laserlicht de CPM-camera binnendringt. Anders maakt de CFM-laser beelden in de CPM-camera buitengewoon luidruchtig en moeilijk te monteren met behulp van beeldanalyse. Een veiligheidsklep verbindt het capillair en de microfluïdische pomp (7) en maakt het mogelijk wijzigingen aan te brengen in de pomp en de luchtdrukbron, zonder het risico van terugstroom uit de cel die de pomp bereikt. Een tweede klep (13) biedt toegang tot een spuit om directe injectie van vloeistof in en uit het reservoir mogelijk te maken. In geval van een lek moet mogelijk vloeistof aan het reservoir worden toegevoegd en moet deze mogelijk worden verwijderd voor stap 8 van het protocol (onoplosbare adsorptie van oppervlakteactieve stoffen) of om bubbels te verwijderen die uit het capillair zijn gespoeld als ze aan het confocale doel zijn gehecht.
Tijdens elk experiment moeten verschillende belangrijke stappen zorgvuldig worden uitgevoerd. De meeste problemen die zich voordoen zodra het instrument draait, hebben betrekking op het capillair zelf. Als zodanig kan zorgvuldig snijden en coaten problemen minimaliseren. Het snijden van het capillair tot de gewenste diameter is een moeilijk proces met een lage opbrengst. Elke chip of oneffenheden in de punt van het capillair zullen leiden tot slechte metingen van de bubbelradius. Bovendien, als de hydrofobe coating niet correct wordt aangebracht, of als deze na verloop van tijd en gebruik afbreekt, zal de bel niet goed vastmaken aan de punt van het capillair. Dit kan worden aangegeven door de bel die in het capillair lijkt te zijn vastgepind of langs de binnenkant van het capillair glijdt tijdens een oscillerend onderzoek. Een capillair dat goed wordt gesneden maar niet goed pint, kan opnieuw worden gereinigd en hydrofobisch worden behandeld.
Een andere belangrijke stap en mogelijke bron van fouten is het reinigen van het celreservoir, de slang en het capillair tussen verschillende materialen of verschillende concentraties van hetzelfde materiaal. Er zijn veel kleine spleten in het reservoir en de oppervlakteactieve stof kan de metingen op latere tijdstippen adsorberen en wijzigen als deze niet goed worden gereinigd. Volledige demontage en het weken van de cel zijn vaak vereist om ervoor te zorgen dat overtollig oppervlakteactief materiaal wordt verwijderd. Het is beter om te beginnen met het gebruik van de laagste concentratie als een reeks concentraties van dezelfde oppervlakteactieve stof moet worden bestudeerd.
Soms kan het moeilijk zijn om de capillaire buis uit te lijnen met het confocale doel. De microtensiometercamera kan worden gebruikt om het confocale doel uit te lijnen, maar voor een grote werkafstand van het CFM-doel is dit misschien niet nuttig. Als de confocale microscoop voorbij de punt van het capillair is gericht, kan de capillaire doorsnede, een gebied zonder fluorescerend materiaal, ook worden gebruikt om het doel te helpen oriënteren. Als de capillaire bel niet uitwerpt, kan er een probleem zijn met de druk die aan het capillair wordt geleverd (die bij normaal bedrijf 150 mbar zou moeten zijn). Dit kan worden gecontroleerd door de drukregelingsmodus in te schakelen en de druk op een hoge waarde in te stellen. Als de druk de ingestelde druk niet bereikt, is er waarschijnlijk een lek in de slang van de microfluïdische pomp of ontvangt de pomp niet voldoende gasdruk. Zoals bij veel studies met oppervlaktewetenschap, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat er op geen enkel moment vervuilende materialen in de oplossingen worden geïntroduceerd. Als de metingen niet zijn zoals verwacht (de oppervlaktespanning begint te laag of neemt te snel af), is het maken van een nieuw monster of het gebruik van een goed bestudeerd monster of pure vloeistof ook een goede vroege stap in het oplossen van problemen.
Er kunnen verschillende wijzigingen aan het apparaat worden aangebracht om andere experimentele doelen te bereiken. Olie of water kan aan het capillair worden toegevoegd, waardoor olie-water kan worden bestudeerd in plaats van lucht-water interfaces39. Dit verhoogt het risico op terugstroom in de pomp, dus extra zorg moet worden genomen, mogelijk kan zelfs het toevoegen van een olievanger aan de slang tussen de pomp en het capillair nodig zijn.
Er zijn verschillende beperkingen aan de CPM/CFM. De CPM heeft een beperkt werkingsbereik van capillaire grootte, 20-300 μm voor de capillaire OD voor de pomp en optica in het systeem. Hoewel het mogelijk is om onoplosbare oppervlakteactieve stof aan de interface toe te voegen met behulp van oplosmiddeluitwisseling41 of de hier beschreven methode, kan de oppervlakteconcentratie alleen worden afgeleid uit het doen van oppervlaktespanning versus gebiedsisothermen en het vergelijken met die verkregen uit een Langmuir-trog. CFM kan alleen fluorescerende materialen detecteren, dus niet-fluorescerende of niet-fluorescerend gelabelde materialen kunnen niet worden gevisualiseerd. Veel oppervlakteactieve stoffen zijn kleine moleculen en het taggen ervan kan mogelijk hun eigenschappen veranderen, hoewel dit minder een probleem zou moeten zijn voor grotere oppervlakteactieve moleculen zoals eiwitten of polymeren26,27.
Deze methode heeft verschillende belangrijke voordelen ten opzichte van eerdere CPM- en CFM-analyses van interfaces met oppervlakteactieve stoffen. Het belangrijkste is dat het hybride instrument visualisatie van de interface mogelijk maakt terwijl verschillende dynamische en evenwichtsoppervlakeigenschappen worden gemeten. Veranderingen in de morfologie van de interface kunnen direct worden gekoppeld aan de interfaciale dynamica en reologische eigenschappen. Eerdere CFM van met oppervlakteactieve stoffen beladen interfaces werd gedaan met behulp van een vlakke Langmuir-trog 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47, terwijl de hier beschreven methode kan worden uitgevoerd op sterk gebogen interfaces 22 . Bovendien kan de hele interface in één keer worden afgebeeld, waardoor een real-time traceerbare verandering van specifieke domeinen wordt getoond, terwijl oppervlaktestromen op de Langmuir-trog ertoe leidden dat domeinen in en uit het confocale visuele venster stroomden. Oppervlaktecompressies op dit apparaat zijn ook isotroop, terwijl de barrières op Langmuir-troggen bepaalde compressierichtingen hebben. De CPM zorgt voor veel snellere gebiedsoscillaties dan mogelijk zou zijn op een Langmuir-trog.
De nieuwe kromming en gebiedsgerichte controle in deze studie heeft grote voordelen ten opzichte van eerdere versies van de CPM30. Meestal werd de bubbelgrootte geregeld door een vaste capillaire druk in te stellen; voor dilatatiemodulatiemetingen werd de capillaire druk gesoscilleerd. Wanneer de capillaire druk constant wordt gehouden, terwijl oppervlakteactieve stof adsorbeert aan het raakvlak, neemt de oppervlaktespanning van de bel af. Om te voldoen aan de Laplace-vergelijking, ΔP = 2γ/R, moet de kromtestraal afnemen naarmate de oppervlaktespanning afneemt. Voor de hemisferische bel in de CPM verhoogt het verkleinen van de kromtestraal van de bubbel het bubbeloppervlak 9,48:
waarin Rcde capillaire straal is en R de bollenstraal van kromming. De veranderende straal van de bel verandert het gebied van de interface tijdens adsorptie, wat de analyse van de adsorptie met behulp van de Ward-Tordai-vergelijkingenbemoeilijkt 10,38 Bovendien, als de oppervlaktespanning van de bel voldoende wordt verlaagd, wordt de straal van de bubbel kleiner dan de capillaire straal en wordt de bel uitgeworpen. De feedbacklus in deze nieuwere CPM /CFM houdt het bubbelgebied constant gedurende de adsorptie, wat betekent dat de oorspronkelijke Ward-Tordai-vergelijking kan worden gebruikt, er geen risico is op het uitwerpen van bellen en adsorptie sneller gebeurt omdat het oppervlak niet toeneemt in het gebied. Voor oscillerende studies produceert het produceren van een sinusgolf in de druk geen sinusgolf in het oppervlak48. Eerdere CPM-methoden vertrouwden op het klein houden van oscillaties om de gebiedsverandering veroorzaakt door de drukaangedreven oscillatie een sinusgolf48 te benaderen. De beschreven methode regelt direct het gebied van de bel en kan worden gebruikt om echte sinusoscillaties in het interfaciale gebied te creëren. Het is mogelijk om de spanning (verandering in oppervlaktespanning) direct te relateren aan de interfaciale spanning (verandering in oppervlakte) om de dilatatiemodulus te berekenen.
Om te helpen bij de implementatie van dit protocol, wordt hier een korte beschrijving beschreven van de code die de microtensiometer bestuurt. De code bestaat uit drie segmenten in een lus: één die opdrachten geeft aan de microfluïdische pomp, één die het resetmechanisme van de bel regelt en één die de straal van de bel meet en de berekende waarden opslaat. De pompregelaar heeft drie hoofdbedrijfsmodi: drukregeling, krommingsregeling en gebiedsregeling. Bij drukregeling voert de gebruiker direct een instelpunt in voor de druk die door de pomp wordt gecreëerd. Deze modus is belangrijk omdat het geen feedbacklus vereist en als zodanig de meest stabiele van de modi is. Krommingsregeling gebruikt de eerder gemeten oppervlaktedruk en de Laplace-vergelijking om te berekenen welke druk nodig is om een interface van een bepaalde kromming te creëren. De oppervlakteregelingsmodus bouwt hierop voort door te berekenen welke kromming nodig is om een bepaald oppervlak te creëren op basis van de geometrie van de bolvormige dop, die ook een nauwkeurige meting van de capillaire straal vereist. Deze twee modi zijn vooral handig voor adsorptie- en oscillatiestudies, maar vereisen een gestage stroom van consistente oppervlaktedrukgegevens. Als zodanig moet de invoer in deze twee controllers mogelijk worden gladgestreken uit de onbewerkte gegevens voor een betere werking. Wanneer de oplossing niet duidelijk genoeg is, vaak als gevolg van een zeer troebel monster, zal deze modus niet goed werken omdat het niet mogelijk is om een goed beeld van de bubbelinterface te krijgen. De bedieningselementen voor de oscillatie zijn ook opgenomen in dit gedeelte van de code. Het middelste segment van de code maakt het mogelijk om de bubbel uit het capillair te verwijderen. Hier wordt de ingestelde druk van het capillair ingesteld op een hoge waarde en daar gedurende een bepaalde tijd vastgehouden, waardoor de bubbel kan knallen en een nieuwe interface kan worden gemaakt. Het laatste gedeelte van de code maakt gebruik van vision acquisition software om de rand van de bel te volgen en de straal te meten. Deze straal wordt vervolgens gebruikt met de Laplace-vergelijking om de oppervlaktespanning te berekenen, die vervolgens naar het eerste deel van de lus wordt gevoerd.
Deze hybride CPM/CFM-techniek heeft bewezen zeer gunstig te zijn voor onze studies van model- en klinische longsurfactanten op lucht-waterinterfaces. De bubbelafmetingen benaderen die in de longblaasjes in de menselijke long en de effecten van interfaciale kromming op de morfologie en dynamiek van longsurfactant monolagen kunnen worden waargenomen 9,10,22. Het hybride instrument zal ook belangrijk zijn voor studies van andere oppervlakteactieve materialen die alomtegenwoordig zijn met toepassingen variërend van petrochemische tot huishoudelijke chemicaliën, van scheurfilms tot antilichaamstabilisatie. De gecombineerde CPM/CFM stelt ons in staat om dynamische interfaciale eigenschappen te onderzoeken op de schaal van fasegescheiden domeinen en de morfologieën op het oppervlak te visualiseren als externe omstandigheden veranderen. Deze methode is vooral nuttig in toepassingen waar dure materialen het gebruik van monsters van minimale grootte vereisen. De gelijktijdige waarneming van de interfaciale dynamica en monolaagmorfologie is bijna onmogelijk met een andere techniek, waardoor het breed toepasbaar is op het gebied van interfaciale wetenschap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Alle confocale microscopiebeelden zijn verkregen met behulp van de Nikon A1RHD Multiphoton rechtopstaande confocale microscoop. We erkennen de begeleiding en hulp van het ondersteunend personeel, met name Guillermo Marques, in het University Imaging Center aan de Universiteit van Minnesota. Dit werk werd ondersteund door NIH Grant HL51177. SI werd ondersteund door een Ruth L. Kirschstein NRSA Institutional Research Training Grant F32 HL151128.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 O.D. Tygon tubing | Fischer Scientific | Tubing | |
| A1RHD Multiphoton upright confocal microscope | Nikon | Confocal Microscope | |
| Acid Cleaning Solution | Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting | ||
| Alnochromix | Alconox | 2510 | Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution |
| Ceramic glass cutter | Sutter Instruments | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650471 | HPLC Plus |
| Curosurf | Chiesi | Lung Surfactant | |
| Di Water | 18.5 MΩ - cm | ||
| Ethanol | any | 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning | |
| Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator | Dolan-Jenner Industries Inc. | 281900100 | Light source; other light sources should work as well |
| Flow EZ F69 mbar w/Link Module | Fluigent | LU-FEZ-0069 | Microfluidic Pump |
| Fluigent SDK VIs | Fluigent | Required for CPM virtual Interface | |
| Fluoroelastomer gaskets | Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3 | ||
| Gas filter | Norgren | F07-100-A3TG | Put between microfluidic pump and pressure regulator |
| Gas regulator | Norgren | 10R0400R | Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi |
| Glass Capilary | Sutter Instruments | B150-86-10 | Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm |
| Glass Slide | any | 75 mm x 25 mm | |
| Glass Syringe | Hamilton | 84878 | 25 μL glass syringe |
| Hydrophobizing Agent | Sigma-Aldrich | 667420 | 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted |
| Insoluble surfactant | Avanti | 850355C-200mg | 16:0 DPPC in chloroform |
| LabVIEW Software | National Instruments | 2017 | |
| Longpass Filter | ThorLabs | FEL0650 | 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence |
| Lyso-PC | Avanti | 855675P | 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine |
| Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/ Easy-Load II pump head | Masterflex | HV-77916-20 | Peristaltic Pump |
| MATLAB | Mathworks | R2019 | |
| Micropipette Puller P-1000 | Sutter Instruments | Capillary Puller | |
| Microtensiometer Cell and Holder | Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4 | ||
| Microtensiometer Objective | Nikon | Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm | |
| NI Vision Development Module | National Instruments | Required for CPM virtual Interface | |
| PEEK finger tight fittings | IDEX | F-120x | 10-32 Coned Ports |
| PEEK plug | IDEX | P-551 | 10-31 Coned Ports |
| pippette tips | Eppendorf | 22492225 | 100 μL - 1000 μL, Autoclaved |
| Plastic Forceps | Thermo Scientific | 6320-0010 | |
| Plastic Syringe | Fischer Scientific | 14-955-459 | 10 mL |
| Plumbing parts | Fischer Scientific | 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing. | |
| Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL | Eppendorf | 3123000063 | Micro pipetter |
| Sulfuric Acid | any | Used for acid cleaning solution | |
| T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm | Nikon | Confocal Microscope Objective | |
| Texas Red DHPE triethylammonim salt | Thermo Fischer Scientific | 1395MP | Fluorophore |
| Vaccum Pump | Gast | DOA-P704-AA |
References
- Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Interfacial rheology of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface: Comparison of shear and dilatation deformation. Journal of Physical Chemistry B. 108 (12), 3835-3844 (2004).
- Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Shear and dilatational relaxation mechanisms of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface. Langmuir. 20 (23), 10159-10167 (2004).
- Kannan, A., Shieh, I. C., Fuller, G. G. Linking aggregation and interfacial properties in monoclonal antibody-surfactant formulations. Journal of Colloid and Interface Science. 550, 128-138 (2019).
- Kannan, A., Shieh, I. C., Leiske, D. L., Fuller, G. G. Monoclonal antibody interfaces: Dilatation mechanics and bubble coalescence. Langmuir. 34 (2), 630-638 (2018).
- Li, J. J., et al. Interfacial stress in the development of biologics: Fundamental understanding, current practice, and future perspective. The AAPS Journal. 21 (3), 44 (2019).
- Bhamla, M. S., Giacomin, C. E., Balemans, C., Fuller, G. G. Influence of interfacial rheology on drainage from curved surfaces. Soft Matter. 10 (36), 6917-6925 (2014).
- Fuller, G. G., Vermant, J. Complex fluid-fluid interfaces: Rheology and structure. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 3, 519-543 (2012).
- Rosenfeld, L., et al. Structural and rheological properties of meibomian lipid. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 2720-2732 (2013).
- Barman, S., Davidson, M. L., Walker, L. M., Anna, S. L., Zasadzinski, J. A. Inflammation product effects on dilatational mechanics can trigger the Laplace instability and acute respiratory distress syndrome. Soft Matter. 16 (29), 6890-6901 (2020).
- Barman, S., et al. Recent Advances in Rheology: Theory, Biorheology, Suspension and Interfacial Rheology. Ramachadran, A., et al. , chap. 7 (2022).
- Alonso, C., Zasadzinski, J. A. A brief review of the relationship between monolayer viscosity, phase behavior, surface pressure and temperature using a simple monolayer viscometer. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (44), 22185-22191 (2006).
- Alonso, C., et al. More than a monolayer: Relating lung surfactant structure and mechanics to composition. Biophysical Journal. 87 (6), 4188-4202 (2004).
- Alonso, C., Bringezu, F., Brezesinski, G., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Modifying calf lung surfactant by hexadecanol. Langmuir. 21 (3), 1028-1035 (2005).
- Alonso, C., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: Protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophysical Journal. 89 (1), 266-273 (2005).
- Zasadzinski, J. A., et al. Inhibition of pulmonary surfactant adsorption by serum and the mechanisms of reversal by hydrophilic polymers: Theory. Biophysical Journal. 89 (3), 1621-1629 (2005).
- McConnell, H. M. Structures and transitions in lipid monolayers at the air-water-interface. Annual Reviews of Physical Chemistry. 42, 171-195 (1991).
- McConnell, H. M., Moy, V. T. Shapes of finite two-dimensional lipid domains. Journal of Physical Chemistry. 92 (15), 4520-4525 (1988).
- Zasadzinski, J. A., Stenger, P., Shieh, I., Dhar, P. Overcoming rapid inactivation of lung surfactant: analogies between competitive adsorption and colloid stability. Biochemica et Biophysica Acta. 1798 (4), 801-828 (2010).
- Zasadzinski, J. A., et al. Surfactant Progress. Nag, K. , New York. (2008).
- Valtierrez-Gaytan, C., et al. Spontaneous evolution of equilibrium morphology in phospholipid-cholesterol monolayers. Science Advances. 8 (14), (2022).
- Williams, I., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial rheology and direct imaging reveal domain-templated network formation in phospholipid monolayers penetrated by fibrinogen. Soft Matter. 15 (44), 9076-9084 (2019).
- Sachan, A. K., Zasadzinski, J. A. Interfacial curvature effects on the monolayer morphology and dynamics of a clinical lung surfactant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 134-143 (2018).
- Alvarez, N. J., Anna, S. L., Saigal, T., Tilton, R. D., Walker, L. M. Intefacial dynamics and rheology of polymer grafter nanoparticles at air-water and xylene-water interfaces. Langmuir. 28 (21), 8052-8063 (2012).
- Alvarez, N. J., Vogus, D. R., Walker, L. M., Anna, S. L. Using bulk convection in a microtensiometer to approach kinetic-limited surfactant dynamics at fluid-fluid interfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 372 (1), 183-191 (2012).
- Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. Diffusion-limited adsorption to a spherical geometry: The impact of curvature and competitive time scales. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82, 011604 (2010).
- Shieh, I., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Visualizing the analogy between competitive adsorption and colloid stability to restore lung surfactant function. Biophysical Journal. 102 (4), 777-786 (2012).
- Shieh, I., Zasadzinski, J. A. Visualizing monolayers with a water-soluble fluorophore to quantify adsorption, desorption and the double-layer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 826-835 (2015).
- Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Takamoto, D. Y., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Coexistence of buckled and flat monolayers. Physical Review Letters. 81, 1650-1653 (1998).
- Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Fluorescence, polarized fluorescence, and Brewster angle microscopy of palmitic acid and lung surfactant protein B monolayers. Biophysical Journal. 72 (6), 2783-2804 (1997).
- Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. A microtensiometer to probe the effect of radius of curvature on surfactant transport to a spherical interface. Langmuir. 26 (16), 13310-13319 (2010).
- Ward, A. F. H., Tordai, L. Time dependents of boundary tensions of solutions. 1. The role of diffusion in time-effects. Journal of Chemical Physics. 14, 453-461 (1946).
- Lucassen, J., Vanden Tempel, M. Dynamic measurements of dilatational properties of a liquid interface. Chemical Engineering Science. 27 (6), 1283-1291 (1972).
- Lin, G. L., et al. Interfacial dilatational deformation accelerates particle formation in monoclonal antibody solutions. Soft Matter. 12 (14), 3293-3302 (2016).
- Bastacky, J., et al. Alveolar lining layer is thin and continuous: low temperature scanning electron microscopy of rat lung. Journal of Applied Physiology. 79 (5), 1615-1628 (1995).
- Adamson, A. W., Gast, A. P. Physical Chemistry of Surfaces, Sixth ed. , Wiley-Interscience. New York. 784 (1997).
- del Rio, O. I., Kwok, D. Y., Wu, R., Alvarez, J. M., Neumann, A. W. Contact angle measurements by axisymmetric drop shape analysis and an automated polynomial fit program. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects. 143 (2-3), 197-210 (1998).
- Kanthe, A., et al. No ordinary proteins: Adsorption and molecular orientation of monoclonal antibodies. Science Advances. 7 (5), 14 (2021).
- Manikantan, H., Squires, T. M. Surfactant dynamics: hidden variables controlling fluid flows. Journal of Fluid Mechanics. 892, 115 (2020).
- Narayan, S., et al. Dilatational rheology of water-in-diesel fuel interfaces: effect of surfactant concentration and bulk-to-interface exchange. Soft Matter. 17 (18), 4751-4765 (2021).
- Meng, G. N., Paulose, J., Nelson, D. R., Manoharan, V. N. Elastic instability of a crystal growing on a curved surface. Science. 343 (6171), 634-637 (2014).
- Kotula, A. P., Anna, S. L. Insoluble layer deposition and dilatational rheology at a microscale spherical cap interface. Soft Matter. 12 (33), 7038-7055 (2016).
- Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Phase and morphology changes in lipid monolayers induced by SP-B protein and its amino-terminal peptide. Science. 273 (5279), 1196-1199 (1996).
- Pocivavsek, L., et al. Stress and fold localization in thin elastic membranes. Science. 320 (5878), 912-916 (2008).
- Pocivavsek, L., et al. Lateral stress relaxation and collapse in lipid monolayers. Soft Matter. 4 (10), 2019-2029 (2008).
- Kim, K., Choi, S. Q., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Cholesterol nanodomains: their effect on monolayer morphology and dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 3054-3060 (2013).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Nonlinear chiral rheology of phospholipid monolayers. Soft Matter. 14 (13), 2476-2483 (2018).
- Kotula, A. P., Anna, S. L. Regular perturbation analysis of small amplitude oscillatory dilatation of an interface in a capillary pressure tensiometer. Journal of Rheology. 59, 85-117 (2015).
