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Engineering

Mikrotensiometer zur konfokalen Mikroskopie Visualisierung dynamischer Grenzflächen

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64110
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Minnesota, 2Department of Chemical Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

Dieses Manuskript beschreibt das Design und den Betrieb eines Mikrotensiometers / Konfokalmikroskops zur gleichzeitigen Messung der Grenzflächenspannung und der Oberflächendilatationsrheologie bei gleichzeitiger Visualisierung der Grenzflächenmorphologie. Dies ermöglicht die Echtzeitkonstruktion von Struktur-Eigenschafts-Beziehungen von Schnittstellen, die für Technologie und Physiologie wichtig sind.

Abstract

Die Adsorption von oberflächenaktiven Molekülen an Fluid-Fluid-Grenzflächen ist in der Natur allgegenwärtig. Die Charakterisierung dieser Grenzflächen erfordert die Messung der Adsorptionsraten von Tensiden, die Bewertung der Gleichgewichtsoberflächenspannungen als Funktion der Massentensidkonzentration und die Beziehung, wie sich die Oberflächenspannung mit Änderungen im Grenzflächenbereich nach dem Gleichgewicht ändert. Die gleichzeitige Visualisierung der Grenzfläche mittels Fluoreszenzbildgebung mit einem Hochgeschwindigkeits-Konfokalmikroskop ermöglicht die direkte Auswertung von Struktur-Funktions-Beziehungen. Im Kapillardruck-Mikrotensiometer (CPM) wird eine halbkugelförmige Luftblase am Ende der Kapillare in einem 1 ml Volumenflüssigkeitsreservoir eingeklemmt. Der Kapillardruck über die Blasengrenzfläche wird über einen kommerziellen mikrofluidischen Durchflussregler gesteuert, der eine modellbasierte Druck-, Blasenkrümmungs- oder Blasenflächensteuerung auf der Grundlage der Laplace-Gleichung ermöglicht. Im Vergleich zu früheren Techniken wie dem Langmuir-Trog und dem Pendelfall werden die Mess- und Regelpräzision und die Reaktionszeit erheblich verbessert. Kapillardruckschwankungen können in Millisekunden angelegt und gesteuert werden. Die dynamische Reaktion der Blasenschnittstelle wird über eine zweite optische Linse visualisiert, wenn sich die Blase ausdehnt und zusammenzieht. Die Blasenkontur ist an ein kreisförmiges Profil angepasst, um den Blasenkrümmungsradius R sowie Abweichungen von der Zirkularität zu bestimmen, die die Ergebnisse ungültig machen würden. Die Laplace-Gleichung wird verwendet, um die dynamische Oberflächenspannung der Grenzfläche zu bestimmen. Nach dem Ausgleich können kleine Druckschwingungen von der computergesteuerten mikrofluidischen Pumpe auferlegt werden, um den Blasenradius (Frequenzen von 0,001-100 Zyklen/min) zu schwingen, um den Dilatationsmodul zu bestimmen Die Gesamtabmessungen des Systems sind so klein, dass das Mikrotensiometer unter die Linse eines konfokalen Hochgeschwindigkeitsmikroskops passt, so dass fluoreszierend markierte chemische Spezies quantitativ mit einer lateralen Auflösung von Submikrometern verfolgt werden können.

Introduction

Luft-Wasser-Grenzflächen, die von Tensidfilmen bedeckt werden, sind im täglichen Leben allgegenwärtig. Tensid-Wasser-Injektionen werden verwendet, um die Ölgewinnung aus erschöpften Feldern zu verbessern und werden als hydraulische Fracturing-Lösungen für Schiefergas und -öl verwendet. Gas-Flüssig-Schäume und Flüssig-Flüssig-Emulsionen sind in vielen industriellen und wissenschaftlichen Prozessen als Schmier- und Reinigungsmittel üblich und in Lebensmitteln üblich. Tenside und Proteine an Grenzflächen stabilisieren Antikörperkonformationen während der Verpackung, Lagerung und Verabreichung 1,2,3,4,5, Tränenfilmstabilität im Auge 6,7,8 und Lungenmechanik 9,10,11,12,13,14, 15.

Die Untersuchung von grenzflächenaktiven Wirkstoffen oder grenzflächenadsorbierenden Tensiden und deren Eigenschaften hat eine lange Geschichte mit vielen verschiedenen experimentellen Techniken 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Eine neuere Entwicklung ist das Kapillardruck-Mikrotensiometer (CPM), das die Untersuchung von Grenzflächeneigenschaften an stark gekrümmten Grenzflächen auf viel kleineren Längenskalen ermöglicht, während deutlich weniger Materialien verwendet werden als andere gängige Methoden 9,23,24,25. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie (CFM) kann verwendet werden, um die Morphologie von Lipiden und Proteinen an den Luft-Wasser-Grenzflächen im CPM22 oder an Langmuir-Trögen20,26,27,28,29 zu untersuchen. Hier wurden CPM und CFM kombiniert, um morphologische Phänomene mit dynamischen und Gleichgewichtsgrenzflächeneigenschaften zu verbinden, um Struktur-Funktions-Beziehungen für biologische und technologische Grenzflächen zu entwickeln.

Es gibt zahlreiche wichtige Parameter in Grenzflächen-Tensidsystemen, die dem CPM-CFM zugänglich sind. Im CPM wird eine Luftblase mit einem Durchmesser von 30-200 μm an die Spitze eines Glaskapillarrohrs geheftet. In früheren Versionen des CPM wurde die Kapillardruckdifferenz zwischen der Innen- und Außenseite der Blase über eine Wassersäule und eine oszillierende Spritzenpumpegesteuert 9,30 ; Die hier beschriebene neue Version ersetzt diese durch eine präzisere, computergesteuerte Mikrofluidikpumpe. Die Oberflächenspannung (γ) wird über die Laplace-Gleichung, ΔP = 2γ/R, aus dem Druckabfall über die von der Pumpe, ΔP, eingestellte Grenzfläche und der optischen Analyse des Krümmungsradius der Blase, R, bestimmt. Die dynamische Oberflächenspannung der Grenzfläche kann mit einer Zeitauflösung von 10 ms nach der Erzeugung einer neuen Blase in Kontakt mit einer Schüttflüssigkeit, die ein lösliches Tensid enthält, bestimmt werden. Die Adsorptionsdynamik des Tensids kann durch die klassische Ward-Tordai-Gleichung10,31 beschrieben werden, um wesentliche Eigenschaften des Tensids zu bestimmen, einschließlich der Diffusivität, der Oberflächenbedeckung und der Beziehung zwischen Massenkonzentration und Gleichgewichtsoberflächenspannung. Sobald eine Gleichgewichtsoberflächenspannung erreicht ist, kann der Grenzflächenbereich oszilliert werden, um den Dilatationsmodul zu messen, indem die Änderungen der Oberflächenspannung aufgezeichnet werden, die durch kleine Änderungen der Blasenoberfläche induziert werden, Equation 1A32. Für komplexere Grenzflächen, die eigene innere Strukturen wie verschränkte Polymere oder Proteine entwickeln, wird die Oberflächenspannung, , durch eine allgemeinere Oberflächenspannungersetzt 4,33,Equation 2 .

Die Lungenstabilität während der Atmung kann direkt an die Aufrechterhaltung einer niedrigen Oberflächenspannung und eines hohen Dilatationsmoduls an der alveolären Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche 9,10 gebunden sein. Alle inneren Lungenoberflächen sind mit einem kontinuierlichen, mikrometerdicken Film aus Epithelauskleidungsflüssigkeit ausgekleidet, um die Hydratation des Gewebesaufrechtzuerhalten 34. Diese Epithelauskleidungsflüssigkeit besteht hauptsächlich aus Wasser, mit Salzen und verschiedenen anderen Proteinen, Enzymen, Zuckern und Lungentensid. Wie bei jeder gekrümmten Flüssigkeits-Dampf-Grenzfläche wird ein Kapillardruck induziert, wobei der Druck auf der Innenseite der Alveole (oder Blase) höher ist. Wenn die Oberflächenspannung jedoch überall in der Lunge konstant war, zeigt die Laplace-Gleichung, ΔP = 2γ / R, dass kleinere Alveolen einen höheren Innendruck im Vergleich zu größeren Alveolen haben würden, wodurch der Gasgehalt der kleineren Alveolen gezwungen würde, zu größeren, niedrigeren Druckalveolen zu fließen. Dies wird als "Laplace-Instabilität" bezeichnet9,35. Das Endergebnis ist, dass die kleinsten Alveolen kollabieren und mit Flüssigkeit gefüllt werden und schwer wieder aufzublasen sind, was dazu führt, dass ein Teil der Lunge kollabiert, und andere Teile würden sich überblähen, was beides typische Symptome des akuten Atemnotsyndroms (ARDS) sind. In einer gut funktionierenden Lunge ändert sich die Oberflächenspannung jedoch dynamisch, da sich die Luft-Epithel-Flüssigkeitsgrenzfläche im Grenzflächenbereich der Alveolus während der Atmung ausdehnt und zusammenzieht. Wenn Equation 3, oder Equation 4, nimmt der Laplace-Druck mit abnehmendem Radius ab und nimmt mit zunehmendem Radius zu, um die Laplace-Instabilität zu beseitigen und dadurch die Lunge zu stabilisieren9. Equation 5Daher und wie es von der Frequenz, der Monolayer-Morphologie und -Zusammensetzung und der Zusammensetzung der Alveolarflüssigkeit abhängt, kann für die Lungenstabilität unerlässlich sein. Das CPM-CFM hat auch die ersten Demonstrationen der Auswirkungen der Grenzflächenkrümmung auf die Tensidadsorption25, die Monolayer-Morphologie22 und den Dilatationsmodul9 geliefert. Das geringe Volumen (~1 ml) des Reservoirs im CPM ermöglicht die schnelle Einführung, Entfernung oder den Austausch der flüssigen Phase und minimiert die erforderliche Menge an teuren Proteinen oder Tensiden10.

Der Kontrast in einem CPM-CFM-Bild ist auf die Verteilung kleiner Fraktionen fluoreszierend markierter Lipide oder Proteine an der Grenzfläche 16,27 zurückzuführen. Zweidimensionale Tensid-Monoschichten weisen häufig eine laterale Phasentrennung als Funktion der Oberflächenspannung oder des Oberflächendrucks auf, π die Differenz zwischen der Oberflächenspannung einer sauberen Fluid-Fluid-Grenzfläche, γ 0, und einer mit Tensiden bedeckten Grenzfläche, Equation 6 γ. π kann als der 2D-"Druck" angesehen werden, der durch die Wechselwirkungen von Tensidmolekülen an der Grenzfläche verursacht wird, die die Oberflächenspannung der reinen Flüssigkeit senken. Bei niedrigen Oberflächendrücken befinden sich Lipidmonoschichten in einem flüssigkeitsähnlichen, unorganisierten Zustand; Dies wird als flüssig expandierte (LE) Phase bezeichnet. Wenn der Oberflächendruck zunimmt und die Fläche pro Lipidmolekül abnimmt, orientieren sich die Lipide aneinander und können einen Phasenübergang erster Ordnung in die langreichweitig geordnete flüssig kondensierte (LC) Phase 16,20,27 durchlaufen. Die LE- und LC-Phasen können bei verschiedenen Oberflächendrücken koexistieren und können visualisiert werden, da fluoreszierend markierte Lipide aus der LC-Phase ausgeschlossen sind und sich in die LE-Phase trennen. Somit ist die LE-Phase hell und die LC-Phase ist dunkel, wenn sie mit CFM16 abgebildet wird.

Das Ziel dieses Manuskripts ist es, die Schritte zu beschreiben, die notwendig sind, um das kombinierte konfokale Mikroskop-Mikrotensiometer zu bauen und zu betreiben. Dies ermöglicht es dem Leser, Adsorptionsstudien durchzuführen, die Oberflächenspannung und das rheologische Verhalten zu messen und gleichzeitig die Grenzflächenmorphologie an einer Luft-Wasser- oder Öl-Wasser-Grenzfläche im Mikrometerbereich zu untersuchen. Dazu gehört eine Diskussion darüber, wie die erforderlichen Kapillaren gezogen, geschnitten und hydrophobiziert werden können, Anweisungen für die Verwendung von Druck-, Krümmungs- und Oberflächensteuerungsmodi sowie die Grenzflächenübertragung von unlöslichem Tensid auf die gekrümmte Mikrotensiometergrenzfläche.

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Protocol

1. Vorbereitung der Kapillarröhrchen

  1. Legen Sie die Kapillare in einen Kapillarzieher und führen Sie das gewünschte Zugprogramm aus, um zwei sich verjüngende Kapillaren mit einem Außendurchmesser (OD) von ~ 1 μm an der Spitze herzustellen.
    HINWEIS: Das OD der Kapillare vor dem Ziehen muss das OD sein, das angegeben wurde, um in den Kapillarhalter in der Mikrotensiometerzelle zu passen. Der Innendurchmesser (ID) der Kapillare kann variieren, beeinflusst aber den kritischen Radius der Kapillare nach dem Ziehen. Ein Zugprogramm wird so gewählt, dass die resultierende Verjüngung zunächst die Kapillar-OD und -ID schnell reduziert, dann einen Radius in der Nähe der gewünschten Kapillar-OD und ID erreicht und dann langsamer im Durchmesser abnimmt. Dadurch entsteht eine größere Kapillarlänge, die zu einer nutzbaren Kapillare von 30-100 μm in ID bewertet werden kann.
  2. Ritzen Sie die Spitze der Kapillare an der gewünschten Stelle ab, um eine ID von 30-100 μm zu erhalten, und brechen Sie die Spitze ab. Die Kapillare hat nun eine OD und ID des gewünschten Radius an der Spitze (Abbildung 1A). Die Kapillaren können bis Schritt 2 gelagert werden.
    HINWEIS: Die Schnittkante der Kapillare muss ein 90° sauberer Bruch sein. Jeder Defekt in der Schnittkante führt zu einem schlechten Pinning der Blase an die Kapillare und zu schlechten Oberflächeneigenschaftsmessungen. Verjüngte Kapillarspitzen sind sehr empfindlich. Sie werden zerstört, wenn sie mit etwas anderem als den Lösungen in Berührung kommen (z. B. Durchstechflaschenwände, Luftdüse).

2. Hydrophobierung von Kapillaren

  1. Sammeln Sie gezogene Glaskapillaren, saure Reinigungslösung, Kunststoffpinzetten, deionisiertes (DI) Wasser, Hydrophobierungslösung (2% Silan in Ethanol), Vakuumpumpe und Ethanollösung. Weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle .
    ACHTUNG: Säurereinigungslösung ist akut giftig, verursacht Haut- und Augenkorrosion / -reizung, oxidiert. Hydrophobierungslösung ist ein Haut-/Augen-/Atemwegsreizmittel. Tragen Sie Augenschutz, Laborkittel und Handschuhe und arbeiten Sie mit Lösungen in einem Abzug.
  2. Reinigen Sie die Kapillare mit Säure
    HINWEIS: Die Säurereinigung der Kapillare entfernt alle organischen Rückstände in der Kapillare und bereitet die Glasoberfläche auf die Silanisierungsreaktion vor, die die Kapillare hydrophob macht.
    1. Greifen Sie eine Kapillare fest in der Nähe ihres breiten Endes mit der Pinzette.
    2. Tauchen Sie die konische Spitze in die saure Reinigungslösung, während Sie den Schlauch von der Vakuumpumpe am breiten Ende der Kapillare befestigen. Dies saugt die Lösung in die Kapillare.
      HINWEIS: Eine Pipettenspitze kann am Ende des Kapillarschlauchs befestigt werden, um eine bessere Passform mit dem Kapillarende zu ermöglichen.
    3. Stoppen Sie, wenn die saure Reinigungslösung etwa die Hälfte der Kapillare gefüllt hat.
      HINWEIS: Nach dem Entfernen der Kapillarspitze aus der sauren Reinigungslösung bildet die Lösung an der Außenseite der Kapillare oft eine Perle in der Nähe der Kapillarspitze. Berühren Sie vorsichtig die Kapillare am Hals der Durchstechflasche der Lösung, um überschüssige Lösung zu entfernen.
    4. Lassen Sie die saure Reinigungslösung mindestens 30 Minuten in den Kapillaren verbleiben, um sicherzustellen, dass der Pfropfen der Flüssigkeit am sich verjüngenden Ende der Kapillare verbleibt.
    5. Entfernen Sie die saure Reinigungslösung aus der Kapillare, indem Sie die Kapillare mit der Pinzette fest halten und mit dem Vakuumschlauch die Flüssigkeit aus dem großen Ende der Kapillare herausziehen.
  3. Spülen Sie die Kapillare aus
    1. Tauchen Sie das sich verjüngende Ende der Kapillare in DI-Wasser, um sicherzustellen, dass es tief genug eingetaucht ist, um jedes Äußere abzudecken, das in die saure Reinigungslösung eingetaucht wurde. Während die Spitze untergetaucht ist, ziehen Sie mit dem Vakuumschlauch DI-Wasser durch die Kapillare. Entfernen Sie die Kapillare aus dem Wasser und entfernen Sie das restliche Wasser mit dem Vakuumschlauch.
    2. Wiederholen Sie den obigen Schritt mindestens 4x.
  4. Führen Sie Schritt 2.3 erneut aus, indem Sie DI-Wasser durch Ethanol ersetzen.
  5. Saugen Sie kontinuierlich an, bis das Ethanol vollständig aus dem Inneren der Kapillare verdampft. Die Kapillare wird trüber und kühl zu berühren, wenn das Ethanol zu verdampfen beginnt, sich aber nach 30 bis 45 s auflöst.
  6. Beschichten Sie die Kapillare mit der Hydrophobierungslösung
    1. Tauchen Sie kurz das breite Ende der Kapillare in das ~ 2% ige Silan in Ethanollösung. Die Kapillarwirkung führt dazu, dass die Beschichtungslösung innerhalb der Kapillare ansteigt. Entfernen Sie die Kapillare aus der Lösung, sobald ein ~ 1 cm großer Stecker in der Kapillare aufgestiegen ist.
    2. Richten Sie die Kapillare so aus, dass die sich verjüngende Spitze nach unten zeigt, so dass die Beschichtungslösung mit Schwerkraft auf die sich verjüngende Spitze fallen kann.
    3. Lassen Sie die Beschichtungslösung mindestens 3 min in der Kapillare verbleiben.
      HINWEIS: Es dürfen keine Luftblasen im Plug der Beschichtungslösung vorhanden sein, die mit dem Inneren der sich verjüngenden Spitze in Berührung kommt. Wenn es eine Luftblase gibt, wurde das Kapillarinnere in Schritt 2.5 wahrscheinlich nicht ausreichend getrocknet. Um dieses Problem zu beheben, wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.6 nach Bedarf.
  7. Spülen Sie die Kapillaren mit Ethanol 1x auf die gleiche Weise wie Schritt 2.3.
  8. Stellen Sie die hydrophobe Beschichtung auf die Kapillare ein
    1. Legen Sie saubere und trockene Szintillationsfläschchen in einen auf 120 °C eingestellten Vakuumofen. Legen Sie beschichtete Kapillaren in die Durchstechflaschen (idealerweise eine Kapillare pro Durchstechflasche), wobei breite Enden auf der Basis der Durchstechflasche ruhen. Lassen Sie die Kapillaren mindestens 6 h im Ofen verbleiben (über Nacht bevorzugt), um eine dauerhafte Bindung der hydrophoben Silanschicht an die Kapillaren zu erreichen. Die Kapillaren können bis Schritt 4 gelagert werden.

3. Probenvorbereitung und -lagerung

  1. Mischen und lagern Sie Tensid- und Fluorophorlösungen in sauberen, säuregewaschenen Durchstechflaschen, um eine Kontamination zu vermeiden.
    HINWEIS: Kommerziell erhältliche Lipide müssen von höchster Reinheit sein und zwischen den Anwendungen bei - 20 °C gelagert werden. Alte oder kontaminierte Lipide führen oft dazu, dass die Ergebnisse schwer zu reproduzieren sind.

4. Einrichten des Mikrotensiometers

  1. Setzen Sie die CPM-Zelle wie in Abbildung 2 beschrieben zusammen.
    1. Legen Sie die große Seite der Kapillare in die Oberseite der CPM-Zelle, bis sie sich bis zur Unterseite der Zelle durchdrückt.
    2. Ziehen Sie den PEEK-Stecker vorsichtig an, um die Kapillare zu befestigen, und befestigen Sie dann den Schlauch von der Mikrofluidikpumpe an der großen Seite der Kapillare. Achten Sie darauf, die sich verjüngende Kapillarspitze nicht zu berühren.
  2. Befestigen Sie bei Bedarf die Behälteraustausch- und/oder Temperaturregelschläuche an den jeweiligen Ein- und Auslässen der CPM-Zelle (Abbildung 2); Andernfalls schließen Sie die nicht verwendeten Ein- und Ausgänge an.
  3. Befestigen Sie die CPM-Zelle an der konfokalen Mikroskopstufe und richten Sie sie grob auf das CFM-Objektiv, die CPM-Kamera und die CPM-Lichtquelle aus (Abbildung 3).
  4. Öffnen Sie den Gasstrom zur Mikrofluidikpumpe bei dem empfohlenen Betriebsdruck der Pumpe (150 mbar für die hier verwendete Mikrofluidikpumpe) und stellen Sie sicher, dass der Durchfluss zur Kapillare offen ist.
  5. Starten Sie die Ausführung der virtuellen CPM-Schnittstelle (Supplemental Coding File 1: Microtensiometer Virtual Interface.vi) im Druckregelungsmodus, wobei die Kapillardruckschwingungsfrequenz und -amplitude auf Null eingestellt ist (Abbildung 4-7). Abbildung 4 zeigt einen Screenshot der virtuellen Benutzeroberfläche. Bei DI-Wasser und einem Kapillarradius von ~35 μm sorgt ein Druck von ~20 mbar dafür, dass kein Wasser in die Kapillare gelangt.
  6. Füllen Sie die CPM-Zelle mit einer Pipette mit Wasser.
  7. Konzentrieren Sie sich mit der Mikrotensiometerkamera auf die Kapillarspitze.
  8. Konzentrieren Sie sich beim CFM auf die Kapillarspitze. Wenn es schwierig ist, die Kapillare zu finden, verwenden Sie die CPM-Kamera, um das CFM-Objektiv zu finden. Dies hilft, den Abstand zwischen dem CFM-Ziel und der Blase anzunähern und den richtigen Arbeitsabstand zu erreichen.
  9. Nachdem der Ring (grüne Sektorprojektion) auf der Blase zentriert ist, passen Sie den Fokus manuell an, so dass die Blasenkante deutlich zu sehen ist (Abbildung 4-3).
    HINWEIS: Position, Start- und Endwinkel sowie Innen- und Außenradien des Rings können über das Menü unterhalb des Ansichtsfensters eingestellt werden.
  10. Klicken Sie auf Blase zurücksetzen und stellen Sie sicher, dass eine neue Blase gebildet wird (man kann die alte Blase platzen hören, und die neue Blase wird aus dem Anzeigefenster des Bedienfelds beobachtbar sein; Abbildung 4-3). Wenn die Blase nicht platzt, erhöhen Sie den Reset-Druck oder erhöhen Sie die Reset-Verzögerungszeit auf der Registerkarte Bubble Reset unter dem Anzeigefenster. Prüfen Sie, ob die Oberflächenspannung bei etwa 73 mN/m liegt (bei Salz- oder Wasser-/Luftblasen) (Abbildung 4-9).
  11. Nehmen Sie das Wasser über die Direct-to-Cell-Spritze heraus (Abbildung 3-13), entleeren Sie es und bringen Sie es wieder an. Das Beispiel kann geladen werden, um das Experiment auszuführen.

5. Adsorptionsstudie

  1. Füllen Sie die Zelle mit der gewünschten Probe mit einer autoklavierten Pipette, die die CPM-Software im Druckregelmodus hält. Stellen Sie sicher, dass die anfängliche Oberflächenspannung bei etwa 73 mN/m liegt, wenn eine neue Blasenschnittstelle erstellt wird.
  2. Bestimmen Sie den Radius der neu gebildeten Blase, geben Sie diesen Wert in die Mittellinienbereichssteuerung ein (Abbildung 4-7), und ändern Sie den Steuerelementtyp in Bereichssteuerung, indem Sie auf die Registerkarte Bereichssteuerung klicken (Abbildung 4-8).
    HINWEIS: Es kann auch eine konstante Druckregelung verwendet werden, die jedoch dazu führt, dass sich der Blasenradius kontinuierlich ändert, wenn sich die Oberflächenspannung der Grenzfläche ändert. Dieser sich ändernde Bereich kann die Analyse der Tensidadsorptionsraten erschweren und dazu führen, dass die Blase während der Studie platzt.
  3. Starten Sie die Aufnahme des konfokalen Videos.
  4. Klicken Sie auf Reset Bubble (Abbildung 4-5) und dann sofort auf Collect Data (Abbildung 4-6). Die Signalleuchte auf der Taste leuchtet grün.
  5. Passen Sie die Datenaufzeichnungsrate entsprechend der Konzentration der Probe an, indem Sie den Balken in Abbildung 4-6 verschieben. Verwenden Sie für langsamere Adsorptions eine langsamere Aufzeichnungsrate. Dies kann mitten in einem Durchlauf angepasst werden, wenn eine höhere Aufzeichnungsrate früh gewünscht wird, aber eine langsamere Rate für lange Studien vorzuziehen ist, um die Dateigröße zu reduzieren.
  6. Speichern Sie die Datei nach dem Ende des Experiments (wenn ein endgültiges Oberflächenspannungsplateau erreicht wurde), indem Sie den richtigen Dateipfad auswählen (Abbildung 4-1) und auf die Schaltfläche Speichern klicken (Abbildung 4-2).
  7. Stoppen und speichern Sie die Aufnahme auch auf dem CFM.

6. Oszillations-/Entspannungsstudie

  1. Füllen Sie die Zelle mit der Probe mit einer autoklavierten Pipette, wobei die CPM-Software im Druckregelungsmodus bleibt. Stellen Sie sicher, dass die Oberflächenspannung bei etwa 73 mN/m liegt, wenn eine neue Blasenschnittstelle erstellt wird.
  2. Warten Sie, bis die Probe vollständig an die Grenzfläche adsorbiert ist. Dies kann direkt nach einer Adsorptionsstudie durchgeführt werden, anstatt mit einer neuen Blasenschnittstelle von vorne zu beginnen.
  3. Entscheiden Sie, ob es sich bei der Oszillation um eine Druckschwingung, eine Flächenschwingung oder eine Krümmungsoszillation handelt, indem Sie die entsprechende Registerkarte auswählen (Abbildung 4-8) und den gewünschten Basiswert, Oszillations% und die Schwingungsfrequenz eingeben (Abbildung 4-7).
    HINWEIS: Auf Sägezahn-, Quadrat- und Dreieckswellenflächenschwingungen kann auch über das Dropdown-Menü auf der Registerkarte Andere Bereichsschwingungen zugegriffen werden.
  4. Starten Sie die Aufzeichnung des konfokalen Videos und klicken Sie in der CPM-Software auf Daten sammeln (Abbildung 4-6).
  5. Starten Sie die Oszillation. Stellen Sie sicher, dass Sie mindestens sieben Zyklen aufzeichnen, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Wählen Sie eine Datenerfassungsrate (Abbildung 4-6), um eine angemessene Anzahl von Datenpunkten für jeden Schwingungszyklus anzugeben.
  6. Wenn andere Schwingungsamplituden oder Frequenzen gewünscht werden, ändern Sie die Werte während des Experiments.
  7. Speichern Sie die Ergebnisse wie in den Schritten 5.6 und 5.7.

7. Studie zum Austausch von Lösungsmitteln

  1. Füllen Sie die Zelle mit der Probe mit einer autoklavierten Pipette, die die CPM-Software im Druckregelmodus hält. Stellen Sie sicher, dass die Oberflächenspannung bei etwa 73 mN/m liegt, wenn eine neue Blasenschnittstelle erstellt wird.
    HINWEIS: Adsorptions- und/oder Oszillationsstudien können vor der Lösungsmittelaustauschstudie durchgeführt werden.
  2. Schließen Sie das Einlassrohr mit der Flasche der gewünschten Austauschlösung (Abbildung 3-11) an die Peristaltikpumpe an (Abbildung 3-10).
  3. Starten Sie die Aufzeichnung des Videos in konfokaler Software und klicken Sie in der CPM-Software auf Daten sammeln (Abbildung 4-6).
  4. Stellen Sie die peristaltische Pumpendrehzahl ein. Dies steuert die Flüssigkeitsaustauschrate und muss basierend auf den Anforderungen für das Experiment ausgewählt werden, d.h. wie schnell das Lösungsmittel ausgetauscht werden muss.
  5. Wenn mehrere Flüssigkeiten ausgetauscht werden müssen, stoppen Sie die Peristaltikpumpe und schließen Sie den Einlass an eine andere Austauschlösung an.
  6. Nachdem der Austausch beendet ist (~20 min), speichern Sie die Ergebnisse wie in Schritt 5.6 und 5.7.

8. Adsorption von unlöslichen Tensiden

HINWEIS: Wenn das zu adsorbierende Tensid in der Reservoirflüssigkeit nicht löslich ist, kann diese Methode verwendet werden, um eine Monoschicht von der Luft/Wasser-Grenzfläche der Zelle auf die Blasenoberfläche zu übertragen. Viele zweischichtbildende Lipide sind in Salzlösung fast unlöslich und absorbieren nicht spontan in die Blase, wenn sie in der Reservoirlösung suspendiert sind.

  1. Füllen Sie die Zelle mit der Probe mit einer autoklavierten Pipette, wobei die CPM-Software im Druckregelungsmodus bleibt. Stellen Sie sicher, dass die Oberflächenspannung bei etwa 73 mN/m liegt, wenn eine neue Blasenschnittstelle erstellt wird.
  2. Deponieren Sie eine Monoschicht aus unlöslichem Tensid auf der Luft-Wasser-Grenzfläche der Zelle aus einer Lösung in einer flüchtigen organischen Lösung. Mit einer Spritze kleine Tröpfchen an der Grenzfläche abscheiden und das Lösungsmittel verdampfen lassen, wobei das Lipid als dünner Film zurückbleibt.
    ACHTUNG: Chloroform wird als Lösungsmittel für Phospholipide wie Phosphatidylcholine und Fettsäuren verwendet. Streulösungen sind in der Regel 0,01-0,02 mg Lipid pro ml des Lösungsmittels. Chloroform ist akut toxisch, kann Haut- und Augenreizungen verursachen und ist krebserregend. Tragen Sie geeigneten Augenschutz, Laborkittel und Handschuhe und machen Sie die Lösung in einem Abzug.
  3. Verringern Sie die Oberfläche über die Mittelliniendruckregelung (Abbildung 4-7) der Blase, bis sie fast flach ist. Dies verhindert, dass die Blase platzt, nachdem das Tensid adsorbiert wurde.
  4. Entfernen Sie die Reservoirflüssigkeit über die Direct-to-Cell-Spritze aus der Zelle, bis sich die Luft-Wasser-Grenzfläche an der Spitze der Kapillare vorbeibewegt. Während eine Spritzenpumpe verwendet werden kann, kann dieser Schritt durch manuelle Verwendung der Spritze erreicht werden.
  5. Erhöhen Sie die Höhe der Reservoirflüssigkeit auf ihr Ausgangsniveau.
    HINWEIS: Nachdem die Spitze wieder eingetaucht wurde, ist die Blase aufgrund des Tensids, das jetzt an der Grenzfläche adsorbiert wird, größer. Die Monoschicht ist nun bereit für Oszillations- oder Lösungsmittelaustauschexperimente.

9. Aufräumen

  1. Schalten Sie das CFM aus.
  2. Wechseln Sie in den Druckregelungsmodus .
  3. Entfernen Sie die Probe mit einer Pipette aus der Zelle. Laden Sie die Zelle mit DI-Wasser und erhöhen Sie den Druck auf ~ 50 mbar, damit Blasen ständig aus der Kapillare entweichen und die Kapillarspitze reinigen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2x.
  4. Schließen Sie das Sicherheitsventil und schalten Sie das CPM aus, indem Sie auf die rote Schaltfläche in der oberen linken Ecke klicken, das helle und blaue Druckbedienfeld ausschalten und die Druckquelle schließen.
  5. Entfernen Sie die Zelle aus dem konfokalen Mikroskoptisch. Spülen Sie die Zelle mit Ethanol und DI-Wasser aus. Entfernen Sie den Kapillarschlauch aus der CPM-Zelle.

10. Reinigen der Zelle

  1. Zerlegen Sie die Zelle. Bürsten Sie die Innenwand mit einer Zahnbürste, während Sie unter DI-Wasser spülen. Tauchen Sie die Teile in Ethanol und beschallen Sie es für ~ 30 min.
  2. Spülen Sie alle Teile einige Male mit DI-Wasser ab. Trocknen Sie die Teile, indem Sie sie entweder mit Stickstoffgas blasen oder in einem Vakuumofen trocknen.

11. Oszillationsanalyse

  1. Führen Sie den Dilatational_Rheology_Analysis.m-Code (Supplemental Coding File 2) aus und wählen Sie die gewünschte Datei aus, die in der virtuellen CPM-Schnittstelle gespeichert ist. Beispieldaten sind in den ergänzenden Dateien enthalten.
  2. Das Druck-Zeit-Diagramm wird wie in Ergänzender Abbildung 1 dargestellt angezeigt. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Punkt, an dem die Oszillation beginnt, und klicken Sie erneut mit der linken Maustaste auf die Stelle, an der die Oszillation endet. Wenn die Daten mehrere Schwingungen enthalten, wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Schwingungen.
    1. Wenn mit der linken Maustaste auf alle Start- und Endpunkte geklickt wurde, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine beliebige Stelle. Zum Beispiel, wie in Ergänzende Abbildung 1 gezeigt, kann man mit der linken Maustaste auf die Punkte 1, 2, 3 und 4 klicken, gefolgt von einem Rechtsklick.
      HINWEIS: Der Code berechnet den Dilatationsmodul und den Phasenwinkel und die Ergebnisse werden in eine neue .csv Datei am ursprünglichen Dateispeicherort geschrieben. Die Ergebnisse für die Beispieldaten sind den Codeergebnissen in der Supplemental Coding File 2 zu entnehmen. MATLAB wird auch mehrere grafische Darstellungen der Daten generieren, wie in Ergänzende Abbildung 2 gezeigt.

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Representative Results

Eine Hauptquelle für Messfehler ergibt sich aus den Kapillaren, die entweder Defekte aus dem Schneidprozess (Abbildung 5A, B) oder dem Beschichtungsprozess (Abbildung 5D) aufweisen. Beide Arten von Defekten führen zu Fehlern bei der Bestimmung der Blasenform und -größe durch das optische Bildanalysesystem, was zu ungenauen Oberflächenspannungswerten führt. Es ist wichtig, jede neue Kapillare sorgfältig zu untersuchen, nachdem sie gezogen und unter dem optischen Mikroskop beschichtet wurde, bevor die Kapillare in das CPM eingeführt wird. Eine falsch geschnittene Kapillare muss verworfen werden, aber eine schlecht beschichtete Kapillare kann mit Säure gereinigt und neu beschichtet werden, um das Blasenpinnen am Ende der Kapillare zu verbessern (Schritt 2 des Protokolls). Kapillaren funktionieren am besten, wenn der Endschnitt perfekt senkrecht zur Kapillare steht (Abbildung 5C) und die Blasenstifte direkt am Ende der Kapillare (Abbildung 5E). Die hydrophobe Beschichtung der Kapillare wird beim Anheften mit dem Gebrauch weniger effektiv, so dass die Kapillare erneut gereinigt und neu beschichtet werden muss.

Repräsentative Daten für die Tensidadsorption im Vergleich zur Zeit sind in Abbildung 6 dargestellt. Frühere experimentelle Techniken wie ein Pendant oder sessile Tropfen, die zur Messung der Tensidadsorption verwendet wurden, hatten keinen Mechanismus, um den Kapillardruck dynamisch anzupassen, da die Änderung der Oberflächenspannung dazu führt, dass sich der Blasenbereich während der Adsorption30,36,37 ändert. Tatsächlich sind bei größeren Blasen und Tropfen Änderungen der Blasen- oder Tropfenform (und damit der Oberfläche) erforderlich, um die Oberflächenspannung aus der Analyse der Grenzflächenform zu bestimmen, da der Kapillardruck nicht unabhängig gemessen wird und der Kapillardruck über die Tropfen- oder Blasenoberflächevariiert 37. Dies erschwert auch die Analyse der Adsorption, da mit der Adsorption des Tensids an die Grenzfläche die Oberflächenspannung abnimmt und um die Laplace-Gleichung zu erfüllen, die Oberfläche der Blase zunehmen muss, so dass zusätzliches Tensid adsorbiert werden muss, um ein Gleichgewicht zu erreichen. Im CPM erfordert ein fester Kapillardruck, dass der anfängliche Blasenradius vor der Adsorption des Tensids in einem kleinen Bereich liegen muss, um zu verhindern, dass die Blase aus der Kapillare austritt, wenn die Oberflächenspannung zu stark abnimmt. Die Dynamik der Tensidadsorption wird oft durch die klassische Ward-Tordai-Gleichung31 modelliert, die die Adsorption von Tensidmolekülen an eine saubere Grenzfläche konstanter Grenzflächenfläche beschreibt. Während die Ward-Tordai-Gleichung geändert werden kann, um die sich ändernde Oberfläche zu berücksichtigen, führt dies zusätzliche Parameter ein und erschwert die Analyseerheblich 38,39.

Um diese Probleme zu überwinden, wurde eine modellbasierte Rückkopplungsschleife unter Verwendung der Laplace-Gleichung entwickelt, die die Krümmung (und Oberfläche) der Blase während des gesamten Adsorptionsprozesses konstant hält, indem der Kapillardruck dynamisch angepasst wird. Es gibt signifikante Unterschiede in der Änderungsrate der Oberflächenspannung, da die Fläche der Blase nicht ständig zunimmt. Die Veränderungen im Blasenbereich während der Adsorption sind mit der Zeit nicht konstant, da sich die Oberflächenspannung zunächst langsam ändert und sich dann vor dem Ausgleich schnell beschleunigt. Eine zusätzliche Komplikation besteht darin, dass die Bruchänderung in der Fläche vom anfänglichen Blasenradius abhängt. Ein zusätzlicher Vorteil des konstanten Blasenradius besteht darin, dass die Abbildung der Schnittstelle vereinfacht wird, da die Blasenoberfläche fest bleibt, was die Fokussierung des CFM vereinfacht. Während des Adsorptionsprozesses, wenn das Tensid an die Grenzfläche adsorbiert (Video 1), erhöht sich das Fluoreszenzsignal von der Grenzfläche. Wenn das Tensid Oberflächendomänen bildet, kann beobachtet werden, wie sich diese Domänen bilden und wachsen22.

Die Änderungen der Oberflächenspannung während der Flächenschwingungen sind in Abbildung 7 dargestellt. In früheren Versionen des CPM wurden Schwingungen im Blasenkapillardruck vorgenommen; Die Erzeugung einer Sinuswelle im Kapillardruck übersetzt sich jedoch nicht direkt in eine Sinuswelle an der Oberfläche, da die beiden über die Laplace-Gleichung miteinander verbunden sind. Durch die Nutzung einer modellbasierten Rückkopplungsschleife unter Verwendung der Laplace-Gleichung werden Schwingungen im Bereich und nicht im Kapillardruck erzeugt, was zu Daten führt, die über einen größeren Amplitudenbereich leichter zu analysieren und zu sammeln sind. Infolgedessen können die mit dieser Methode gesammelten Oberflächenspannungs- und Flächendaten verwendet werden, um den Grenzflächendilatationsmodul der Tensidschicht direkt zu berechnen: Equation 7 (Abbildung 8), wobei Equation 8 die Gesamtspannung des Systems und die τ-Spannungdienicht-isotrope abweichende Spannung ist, die in einfachen Tensidlösungen häufig fehlt 4,33. Für ein einfaches Tensidsystem, Equation 9. Für Grenzflächen, an denen elastische Netzwerke gebildet werden können, wie z.B. oberflächenaktive Proteine, sind häufig zusätzliche Spannungen vorhanden, die daher bei der Definition des Dilatationsmoduls berücksichtigt werden müssen. Video 2 zeigt ein CFM-Video der Bewegung schwarzer LC-Domänen in einer kontinuierlichen farbigen LE-Phasenmatrix in Phospholipid-Monoschichten. Die verschiedenen LC-Domänen auf der Schnittstelle reorganisieren sich zu einem verzweigten Netzwerk, das die Schnittstelle abdeckt, wenn Schwingungen auf der gekrümmten Blase22,40 stattfinden. Die Registerkarte Andere Bereichsschwingungen kann verwendet werden, um Sägezahn-, Quadrat- und Dreieckswellen zu erzeugen, wie in Ergänzender Abbildung 3 dargestellt, und die Registerkarte Komprimierung ermöglicht die Komprimierung und Erweiterung von Bereichen mit konstanter Rate.

Für Lösungsmittelaustauschstudien wird zuerst zugelassen, dass ein Tensid an die Grenzfläche adsorbiert, und dann wird die Reservoirflüssigkeit ausgetauscht, damit eine zweite oberflächenaktive Spezies diese Grenzfläche berühren kann. Es ist möglich, die Änderung der Oberflächenspannung zu untersuchen, da das zweite Tensid mit dem ursprünglichen Tensid an der Grenzfläche konkurriert. Der Oberflächendilatationsmodul ist oft eine empfindlichere Sonde des Tensidaustauschs zusammen mit der Oberflächenmorphologie über CFM. Abbildung 9 zeigt die Änderung der Oberflächenspannung, des Oberflächendilatationsmoduls und der Oberflächenmorphologie, wenn ein solcher Lösungsmittelaustausch stattfindet. Während die Besonderheiten eines solchen Austauschs variieren können, könnte eine Änderung einer der drei Eigenschaften auf die Integration der zweiten Komponente in die Monoschicht oder eine Solvatation der Primärkomponente in das Volumen hinweisen. Ein zweites fluoreszierendes Tag könnte an der sekundären Spezies angebracht werden, um ihre Interaktion mit der Grenzfläche aus den CFM-Bildern zu beobachten.

Figure 1
Abbildung 1: Kapillarbehandlung. (A) Bild, das die Bewertung der Kapillare zeigt. Die Glasritzkeramik wird in einer Klemme gehalten, um sie stabil zu halten. (B) Säurereinigung der Kapillare. Die saure Reinigungslösung wird mit der Vakuumpumpe in die Kapillare gezogen. (C) Hydrophobisierung der Kapillare. Silanlösungsstecker in der Kapillare Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Zellkonstruktion. (1) Großer Aluminiumzellenhalter, (2) Fluorelastomerdichtung (insgesamt vier), (3) Glasobjektträger (zwei insgesamt), (4) PEEK-Zelle und (5) kleiner Aluminiumzellenhalter. Bei der Montage wird auf beiden Seiten jedes Glasobjektträgers eine Fluorelastomerdichtung angebracht. Die Zelle wird mit Schrauben und Bolzen zusammengehalten. Das vergrößerte Bild der PEEK-Zelle zeigt die Positionen der verschiedenen Anschlüsse: (6) Kapillarport, (7) Lösungsmittelaustauscheinlass, (8) Lösungsmittelaustauschauslass und (9,10) Temperaturkontrollmanteleinlass und -auslass. Ein PEEK-Stecker kann verwendet werden, um den Schlauch oder die Kapillare an der Zelle zu befestigen. Ports, die nicht verwendet werden, können durch Stecker ohne Kanäle vollständig geschlossen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Darstellung von CPM/CFM, nicht skalierbar. (1) die CPM-Zelle, (2) das Kapillarröhrchen mit einer Blase an der Spitze, (3) konfokales Mikroskopobjektiv, (4) Mikroskop-Kameraobjektiv mit Filter, (5) CPM-Lichtquelle, (6) Mikrofluidikpumpe, (7) Sicherheitsventil, (8) Flüssigkeitsaustauscheinlass, (9) Flüssigkeitsaustauschauslass, (10) Peristaltikpumpe, (11) Austauschflüssigkeitsreservoir, (12) Flüssigkeitsaustauschabfall, (13) direkt zur Zellspritze, (14) Ein- und Auslass des Temperaturregelmantels und (15) temperaturgesteuerter Behälter und Pumpe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Virtuelle CPM-Schnittstelle. (1) der Dateipfad, in dem die Daten gespeichert werden; (2) Systemparameter, Kommentare und die Schaltfläche Speichern. Alle Felder in diesem Bereich werden in der endgültigen Datendatei gespeichert; (3) das CPM-Kamerabild; (4) Einstellungen, die die Bildanalyse, die Rauschmessung, das Zurücksetzen der Blase und die Nachverfolgung von Bildern pro Sekunde steuern; (5) die Bubble Reset-Taste; (6) die Schaltfläche "Daten sammeln", die Kontrolle der Datenaufzeichnungsrate und die Datenerfassungsindikatoren; (7) steuert alle Mittellinienwerte der Betriebsart, die Schwingungsamplitude und die Schwingungsfrequenz; (8) Betriebsartenschalter: Durch Klicken auf jede Registerkarte wird dieser Steuerungsmodus geändert. Jeder Modus zeigt das Drucksignal, das an die Pumpe gesendet wird, in der Grafik "Drucksignal" sowie einige zusätzliche Steuerungen; (9) Daten über lebende Oberflächenspannungen; (10) Live-Druckdaten; (11) Live-Radius der Krümmungsdaten; (12) Live-Oberflächendaten; und (13) Live-Oberflächenspannungs- und Oberflächenflächendaten, die verwendet werden können, um den Phasenwinkel während einer Schwingungsstudie grob zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Kapillardefekte. (A) und (B) Kapillaren falsch geschnitten; (C) Kapillare richtig schneiden, (D) Kapillare mit schlechtem Stiften aufgrund schlechter oder verschlechterter Beschichtung und (E) richtig gepinnte Kapillare. Die roten Pfeile in D und E zeigen an, wo die Blasen angeheftet sind. Für die besten Ergebnisse wird die Blase an der Kapillarspitze pinnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Ergebnisse des Mikrotensiometers der Adsorptionsstudie sowohl für Adsorptions mit konstantem Druck (orange) als auch für Adsorptions mit konstanter Fläche (blau). Die Blasenoberfläche für die Adsorption mit konstanter Fläche nimmt während der gesamten Studie signifikant zu und führt dazu, dass die Adsorption länger braucht, um die gleiche Oberflächenspannung zu erreichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Typische Schwingung der Oberflächensteuerung . (A) Druck, (B) Krümmung und (C) Oberflächendaten. Die Oberflächendaten sind ein Sinus, während die Druck- und Krümmungsdaten dies nicht sind, wie die Mittellinienwerte zeigen, die sich nicht in der Mitte der Schwingung befinden. Die mathematische Beziehung zwischen den drei Werten bedeutet, dass nur einer ein echter Sinusname sein kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Rheologische Probenergebnisse nach der Analyse. Dilatationsmodul von Lyso PC (1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholin) als Funktion der Frequenz für steigende Konzentrationen von Lyso PC für Blasen mit einem Radius von ~ 45 μm. Entzündungsbegleitende Konzentrationen >0,1 mM Lyso PC verringern den Dilatationsmodul über den Bereich der normalen Beatmungs-/Atemfrequenzen (gelb) und bilden 2ε−γ < 0, was der Übergangswert für die Induktion der Laplace-Instabilität ist (gepunktete rote Linie). Niedrige Konzentrationen von Lyso PC ≤0,01 mM, die in normalen Lungen auftreten können, induzieren keine Instabilität. Bei Frequenzen >10 rad/sec liegen alle Lyso-PC-Konzentrationen über dem Crossover und wären nicht anfällig für die Laplace-Instabilität. Durchgezogene rote Linien passen theoretisch zu den Daten. Abbildung aus Referenz9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 9
Abbildung 9: CFM- und CPM-Ergebnisse für eine Lösungsmittelaustauschstudie für Lungentensid, das mit DI-Wasser und dann mit Lyso PC ausgetauscht wurde . (A) zeigt, wie sich die Oberflächenspannung und der Oberflächendilatationsmodul während der gesamten Studie ändern. Der Graph ist in vier Bereiche unterteilt: wenn das Lungentensid an die Grenzfläche adsorbiert wird (blau), wenn das LS mit DI-Wasser ausgetauscht wird (grün), wenn die Austauschlösung auf eine Lyso PC-Lösung umgeschaltet wird (rot) und wenn die Zelle mit der Lyso PC-Lösung gefüllt ist (orange). Es ist zu sehen, dass sich die Eigenschaften während der verschiedenen Börsen ändern, was darauf hindeutet, dass sich die Schnittstelle ändert. (B) zeigt ein konfokales Bild des Lungentensids, das vor dem Austausch an die Grenzfläche adsorbiert wurde, und (C) zeigt die gleiche Oberfläche, nachdem der Austausch mit der Lyso-PC-Lösung abgeschlossen ist. In beiden Fällen zeigt der weiß gestrichelte Kreis den inneren Rand der Kapillare an. Die Struktur der Domänen auf der Monoschicht ändert sich nach dem Lösungsmittelaustausch drastisch, was die CPM-Ergebnisse bestätigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Video 1: Konfokales Video einer Adsorptionsstudie mit konstantem Druck für Lungentensid. Die Falschfarbe zeigt den Abstand in Z-Richtung mit der Farbleiste auf der linken Seite des Videos an, wobei Lila die Blase in der Nähe der Kapillare anzeigt und Grün die Oberseite der Blase ist. Die Grenzfläche wird zunächst schwach beleuchtet, da nur ein kleiner Teil des fluoreszierenden Tensids adsorbiert wird. Wenn immer mehr Tensid adsorbiert, beginnt die Blase zu wachsen, wenn sich die Farbe mehr zu Grün verschiebt und die Grenzfläche von schwarzen LC-Domänen gefüllt wird, die sich über die Schnittstelle bewegen können. Aggregate von Tensid in der Lösung können in der Lösung als helle amorphe Formen schwimmend gesehen werden, und mehrere setzen sich auf der Blasengrenzfläche ab, zerfallen und deponieren ihr Tensid auf der Grenzfläche. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Konfokales Video der Oszillationsstudie für Lungentensid. Die Falschfarbe zeigt den Abstand in Z-Richtung mit dem Farbbalken auf der linken Seite des Videos an. Die Oberfläche ist mehreren verschiedenen Schwingungsfrequenzen ausgesetzt, und die dunklen LC-Domänen auf der Grenzfläche ändern sich während der Schwingungen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Beispiel für einen Zwischenschritt im Code zur Bestimmung der dilatatorischen Rheologie. Wenn dieser Bildschirm angezeigt wird, sollte der Benutzer mit der linken Maustaste auf den äußersten linken Rand der Oszillation klicken, um zu analysieren, und dann mit der linken Maustaste auf den rechten Rand klicken. Mehrere Schwingungen können analysiert werden, so dass der Benutzer mit der linken Maustaste auf 1, 2, 3 und 4 klicken und dann mit der rechten Maustaste klicken kann, um diese beiden Schwingungen zu analysieren. Die gezeigten Schwingungen haben unterschiedliche Amplituden und Frequenzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Beispiel für die grafischen Ergebnisse, die durch den dilatatorischen Rheologiecode erzeugt werden. Dies zeigt die Anpassungen von Sinusoiden an die Schwingungen in Druck, Radius, Oberfläche und Oberflächenspannung sowie die Fourier-Transformation jeder Schwingung. Idealerweise sollte die zweite Harmonische in der Fourier-Transformation weniger als 10% der ersten Harmonischen für die Oberfläche und Oberflächenspannung betragen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Alternative Betriebsarten. (A) Sinuswelle, (B) Sägezahnwelle, (C) Rechteckwelle, (D) Dreieckswelle, (E) Expansion mit konstanter Rate und (F) Kompression mit konstanter Rate. Die Kompressions- und Ausdehnungsmodi ermöglichen die Herstellung von Langmuir-Isothermen für unlösliche Tenside. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 1: Mikrotensiometer Virtuelles Interface.vi. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 2: Dilatational_Rheology_Analysis.m. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Das kombinierte CPM/CFM ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Grenzflächendynamik, Gleichgewichten und Morphologie. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die zum Abrufen von Daten mit CPM/CFM erforderlich sind.

Abbildung 2 zeigt das Zelldesign mit Kanälen für den angegebenen Kapillar-, Lösungsmittel- und Wärmeaustausch. Der Einlass für den Lösungsmittelaustausch sollte sich an der Unterseite der Zelle befinden, während sich der Auslass oben befinden sollte, damit die Zelle während des Austauschs nicht überläuft. In der Praxis können die Ein- und Auslassdurchflussraten für dieselbe Peristaltikpumpe leicht unterschiedlich sein. Ein häufiges Problem bei diesem Zelldesign ist das Austreten aus der Zelle. Dies wird meistens durch eine schlechte Verbindung zwischen der Zelle und einer der Verbindungen verursacht, aber wenn alle Verbindungen trocken und nicht undicht sind, kann dies auf einen Riss im Glasobjektträger der Zelle aufgrund einer Überanziehung der Schrauben, die die Zelle umgeben, zurückzuführen sein.

Abbildung 3 zeigt die Verbindungen zwischen den verschiedenen Pumpen und der Zelle sowie die Ausrichtung der Zelle auf die CFM- und CPM-Objektive. Die CPM-Kamera (4) wird verwendet, um die Blasenform während des Betriebs abzubilden. Die CPM-Kamera muss mit einem optischen Filter ausgestattet sein, der verhindert, dass das CFM-Anregungslaserlicht in die CPM-Kamera eindringt. Andernfalls macht der CFM-Laser Bilder in der CPM-Kamera äußerst verrauscht und ist mit Hilfe der Bildanalyse schwer anzupassen. Ein Sicherheitsventil verbindet die Kapillare und die Mikrofluidikpumpe (7) und ermöglicht Änderungen an der Pumpe und der Luftdruckquelle, ohne dass das Risiko eines Rückflusses von der Zelle besteht, der die Pumpe erreicht. Ein zweites Ventil (13) bietet Zugang zu einer Spritze, die eine direkte Einspritzung von Flüssigkeit in und aus dem Reservoir ermöglicht. Im Falle eines Lecks muss möglicherweise Flüssigkeit in das Reservoir gegeben werden und muss möglicherweise für Schritt 8 des Protokolls (Adsorption mit unlöslichem Tensid) entfernt werden oder um Blasen zu entfernen, die aus der Kapillare gespült werden, wenn sie am konfokalen Ziel befestigt sind.

Während jedes Experiments müssen mehrere wichtige Schritte sorgfältig ausgeführt werden. Die meisten Probleme, die auftreten, sobald das Instrument läuft, betreffen die Kapillare selbst. Daher kann ein sorgfältiges Schneiden und Beschichten die Schwierigkeiten minimieren. Das Schneiden der Kapillare auf den gewünschten Durchmesser ist ein schwieriger und ertragsarmer Prozess. Jeder Chip oder Unebenheiten in der Spitze der Kapillare führt zu schlechten Messwerten des Blasenradius. Wenn die hydrophobe Beschichtung nicht richtig aufgetragen wird oder wenn sie sich im Laufe der Zeit und des Gebrauchs verschlechtert, wird die Blase an der Spitze der Kapillare nicht richtig eingeklemmt. Dies kann durch die Blase angezeigt werden, die in der Kapillare eingeklemmt zu sein scheint oder während einer oszillierenden Studie entlang der Innenseite der Kapillare gleitet. Eine Kapillare, die gut geschnitten, aber nicht richtig gepinnt ist, kann wieder gereinigt und hydrophob behandelt werden.

Ein weiterer wichtiger Schritt und eine mögliche Fehlerquelle ist die Reinigung des Zellreservoirs, der Schläuche und der Kapillare zwischen verschiedenen Materialien oder unterschiedlichen Konzentrationen desselben Materials. Es gibt viele kleine Spalten im Reservoir und das Tensid kann Messungen, die zu späteren Zeiten durchgeführt werden, adsorbieren und verändern, wenn es nicht richtig gereinigt wird. Eine vollständige Demontage und das Einweichen der Zelle sind häufig erforderlich, um die Entfernung von überschüssigem oberflächenaktivem Material zu gewährleisten. Es ist besser, mit der niedrigsten Konzentration zu beginnen, wenn eine Reihe von Konzentrationen desselben Tensids untersucht werden soll.

Manchmal kann es schwierig sein, die Kapillarröhre mit dem konfokalen Objektiv auszurichten. Die Mikrotensiometer-Kamera kann verwendet werden, um das konfokale Objektiv auszurichten, aber für einen großen Arbeitsabstand des CFM-Objektivs ist dies möglicherweise nicht hilfreich. Wenn das konfokale Mikroskop über die Spitze der Kapillare hinaus fokussiert wird, kann auch der Kapillarquerschnitt, ein Bereich ohne fluoreszierendes Material, zur Orientierung des Objektivs verwendet werden. Wenn die Kapillarblase nicht ausstößt, kann es zu einem Problem mit dem Druck kommen, der der Kapillare zugeführt wird (der im Normalbetrieb 150 mbar betragen soll). Dies kann überprüft werden, indem Sie in den Druckregelmodus wechseln und den Druck auf einen hohen Wert einstellen. Wenn der Druck den eingestellten Druck nicht erreicht, liegt wahrscheinlich ein Leck im Schlauch der Mikrofluidikpumpe vor oder die Pumpe erhält keinen ausreichenden Gasdruck. Wie bei vielen Studien mit Oberflächenwissenschaften ist es wichtig sicherzustellen, dass an keiner Stelle kontaminierende Materialien in die Lösungen eingebracht werden. Wenn die Messwerte nicht wie erwartet sind (die Oberflächenspannung beginnt zu niedrig oder nimmt zu schnell ab), ist die Herstellung einer neuen Probe oder die Verwendung einer gut untersuchten Probe oder einer reinen Flüssigkeit ebenfalls ein guter früher Schritt bei der Fehlerbehebung.

Mehrere Modifikationen können an der Vorrichtung vorgenommen werden, um andere experimentelle Ziele zu erreichen. Öl oder Wasser kann in die Kapillare gegeben werden, was die Untersuchung von Öl-Wasser-Schnittstellen anstelle von Luft-Wasser-Schnittstellenermöglicht 39. Dies erhöht das Risiko eines Rückflusses in die Pumpe, so dass zusätzliche Vorsicht geboten ist, möglicherweise ist sogar das Hinzufügen einer Ölfalle zum Schlauch zwischen Pumpe und Kapillare erforderlich.

Es gibt mehrere Einschränkungen für das CPM/CFM. Das CPM hat einen begrenzten Arbeitsbereich der Kapillargröße, 20-300 μm für die Kapillar-OD für die Pumpe und die Optik im System. Während es möglich ist, der Grenzfläche mittels Lösungsmittelaustausch41 oder dem hier beschriebenen Verfahren unlösliches Tensid zuzusetzen, kann die Oberflächenkonzentration nur aus Oberflächenspannungs- vs. Flächenisothermen und im Vergleich zu denen, die aus einem Langmuir-Trog gewonnen werden, abgeleitet werden. CFM kann nur fluoreszierende Materialien erkennen, so dass nicht fluoreszierende oder nicht fluoreszierend markierte Materialien nicht visualisiert werden können. Viele Tenside sind kleine Moleküle, und ihre Markierung kann möglicherweise ihre Eigenschaften ändern, obwohl dies für größere oberflächenaktive Moleküle wie Proteine oder Polymere weniger ein Problem seinsollte 26,27.

Diese Methode hat mehrere entscheidende Vorteile gegenüber früheren CPM- und CFM-Analysen von Tensid-beladenen Schnittstellen. Das Wichtigste ist, dass das Hybridinstrument die Visualisierung der Grenzfläche ermöglicht, während verschiedene dynamische und Gleichgewichtsoberflächeneigenschaften gemessen werden. Änderungen in der Morphologie der Grenzfläche können direkt mit der Grenzflächendynamik und den rheologischen Eigenschaften in Verbindung gebracht werden. Frühere CFM von Tensid-beladenen Grenzflächen wurden unter Verwendung einer flachen Langmuir-Mulde 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47 durchgeführt, während die hier beschriebene Methode an stark gekrümmten Grenzflächen durchgeführt werden kann 22 . Darüber hinaus kann die gesamte Schnittstelle auf einmal abgebildet werden, was eine in Echtzeit verfolgbare Änderung bestimmter Domänen zeigt, während Oberflächenflüsse auf dem Langmuir-Trog dazu führten, dass Domänen in das konfokale visuelle Fenster ein- und ausströmten. Oberflächenkompressionen an dieser Vorrichtung sind ebenfalls isotrop, während die Barrieren an Langmuir-Trögen besondere Kompressionsrichtungen haben. Der CPM ermöglicht viel schnellere Flächenschwingungen, als dies auf einem Langmuir-Trog möglich wäre.

Die neue Krümmungs- und flächenbasierte Kontrolle in dieser Studie hat große Vorteile gegenüber früheren Versionen des CPM30. Typischerweise wurde die Blasengröße durch Einstellen eines festen Kapillardrucks gesteuert; Für dilatatorische Modulimessungen wurde der Kapillardruck oszilliert. Wenn der Kapillardruck konstant gehalten wird, nimmt die Oberflächenspannung der Blase ab, da das Tensid an die Grenzfläche adsorbiert. Um die Laplace-Gleichung ΔP = 2γ/R zu erfüllen, muss der Krümmungsradius mit abnehmender Oberflächenspannung abnehmen. Für die halbkugelförmige Blase im CPM erhöht die Verringerung des Blasenradius der Krümmung die Blasenfläche 9,48:

Equation 10

wobei R cder Kapillarradius und R der Blasenradius der Krümmung ist. Der sich ändernde Radius der Blase ändert die Fläche der Grenzfläche während der Adsorption, was die Analyse der Adsorption unter Verwendung der Ward-Tordai-Gleichungen10,38 erschwert. Die Rückkopplungsschleife in diesem neueren CPM/CFM hält die Blasenfläche während der gesamten Adsorption konstant, was bedeutet, dass die ursprüngliche Ward-Tordai-Gleichung verwendet werden kann, kein Risiko eines Blasenauswurfs besteht und die Adsorption schneller erfolgt, da die Oberfläche in dem Bereich nicht zunimmt. Für oszillierende Studien erzeugt die Erzeugung einer Sinuswelle im Druck keine Sinuswelle im Bereich48. Frühere CPM-Methoden beruhten darauf, Schwingungen klein zu halten, damit sich die durch die druckgetriebene Schwingung verursachte Flächenänderung einer Sinuswelleannähert 48. Die beschriebene Methode steuert direkt die Fläche der Blase und kann verwendet werden, um echte Sinusschwingungen im Grenzflächenbereich zu erzeugen. Es ist möglich, die Spannung (Änderung der Oberflächenspannung) direkt mit der Grenzflächendehnung (Änderung der Oberfläche) in Beziehung zu setzen, um den Dilatationsmodul zu berechnen.

Um bei der Implementierung dieses Protokolls zu helfen, wird hier eine kurze Beschreibung des Codes beschrieben, der das Mikrotensiometer steuert. Der Code besteht aus drei Segmenten in einer Schleife: eines, das Befehle an die mikrofluidische Pumpe ausgibt, eines, das den Reset-Mechanismus der Blase steuert, und eines, das den Radius der Blase misst und die berechneten Werte speichert. Die Pumpensteuerung verfügt über drei Hauptbetriebsmodi: Druckregelung, Krümmungsregelung und Flächensteuerung. Bei der Druckregelung gibt der Anwender direkt einen Sollwert für den von der Pumpe erzeugten Druck ein. Dieser Modus ist wichtig, da er keine Rückkopplungsschleife erfordert und als solcher der stabilste der Modi ist. Die Krümmungsregelung verwendet die zuvor gemessene Oberflächentemperatur und die Laplace-Gleichung, um zu berechnen, welcher Druck erforderlich ist, um eine Grenzfläche einer gegebenen Krümmung zu erzeugen. Der Oberflächensteuerungsmodus baut darauf auf, indem berechnet wird, welche Krümmung erforderlich ist, um eine bestimmte Oberfläche basierend auf der Geometrie der sphärischen Kappe zu erzeugen, was auch eine genaue Messung des Kapillarradius erfordert. Diese beiden Modi sind besonders nützlich für Adsorptions- und Oszillationsstudien, erfordern jedoch einen stetigen Strom konsistenter Oberflächendruckdaten. Daher muss die Einspeisung in diese beiden Controller möglicherweise aus den Rohdaten geglättet werden, um eine bessere Funktion zu ermöglichen. Wenn die Lösung nicht klar genug ist, oft aufgrund einer stark trüben Probe, funktioniert dieser Modus nicht ordnungsgemäß, da es nicht möglich ist, ein gutes Bild der Blasenschnittstelle zu erhalten. Die Steuerelemente für die Oszillation sind ebenfalls in diesem Abschnitt des Codes enthalten. Das mittlere Segment des Codes ermöglicht es, die Blase aus der Kapillare zu entfernen. Hier wird der eingestellte Druck der Kapillare auf einen hohen Wert eingestellt und dort für eine bestimmte Zeit gehalten, so dass die Blase platzen und eine neue Schnittstelle erstellt werden kann. Der letzte Abschnitt des Codes verwendet Vision-Erfassungssoftware, um den Rand der Blase zu verfolgen und ihren Radius zu messen. Dieser Radius wird dann mit der Laplace-Gleichung verwendet, um die Oberflächenspannung zu berechnen, die dann dem ersten Teil der Schleife zugeführt wird.

Diese hybride CPM/CFM-Technik hat sich für unsere Studien zu Modell- und klinischen Lungentensiden an Luft-Wasser-Grenzflächen als sehr vorteilhaft erwiesen. Die Blasenabmessungen nähern sich denen in den Alveolen in der menschlichen Lunge an, und die Auswirkungen der Grenzflächenkrümmung auf die Morphologie und Dynamik von Lungentensid-Monoschichten können beobachtetwerden 9,10,22. Das Hybridinstrument wird auch für die Untersuchung anderer oberflächenaktiver Materialien von Bedeutung sein, die mit Anwendungen von der Petrochemie bis zur Haushaltschemie, von Tränenfilmen bis zur Antikörperstabilisierung allgegenwärtig sind. Das kombinierte CPM/CFM ermöglicht es uns, dynamische Grenzflächeneigenschaften auf der Skala phasengetrennter Domänen zu untersuchen und die Morphologien auf der Oberfläche zu visualisieren, wenn sich die äußeren Bedingungen ändern. Diese Methode ist besonders nützlich in Anwendungen, bei denen teure Materialien die Verwendung von Proben minimaler Größe erfordern. Die gleichzeitige Beobachtung der Grenzflächendynamik und Monoschichtmorphologie ist mit keiner anderen Technik möglich, was sie auf dem Gebiet der Grenzflächenforschung breit anwendbar macht.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Alle konfokalen Mikroskopiebilder wurden mit dem konfokalen Nikon-Multiphotonenmikroskop A1RHD aufgenommen. Wir danken den Hilfskräften, insbesondere Guillermo Marques, am University Imaging Center der University of Minnesota. Diese Arbeit wurde durch den NIH Grant HL51177 unterstützt. SI wurde durch ein Ruth L. Kirschstein NRSA Institutional Research Training Grant F32 HL151128 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 O.D. Tygon tubing Fischer Scientific Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope Nikon Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix Alconox 2510 Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter Sutter Instruments
Chloroform Sigma-Aldrich 650471 HPLC Plus
Curosurf Chiesi  Lung Surfactant
Di Water 18.5 MΩ - cm
Ethanol any 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator Dolan-Jenner Industries Inc. 281900100 Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module Fluigent LU-FEZ-0069 Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs Fluigent Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter Norgren F07-100-A3TG Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator Norgren 10R0400R Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary Sutter Instruments B150-86-10 Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide any 75 mm x 25 mm
Glass Syringe Hamilton 84878 25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent Sigma-Aldrich 667420 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant Avanti 850355C-200mg 16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software National Instruments 2017
Longpass Filter ThorLabs FEL0650 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC Avanti 855675P 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head Masterflex HV-77916-20 Peristaltic Pump
MATLAB Mathworks R2019
Micropipette Puller P-1000 Sutter Instruments Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective Nikon Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module National Instruments Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings IDEX F-120x 10-32 Coned Ports
PEEK plug IDEX P-551 10-31 Coned Ports
pippette tips Eppendorf 22492225 100 μL - 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps Thermo Scientific 6320-0010
Plastic Syringe Fischer Scientific 14-955-459 10 mL
Plumbing parts Fischer Scientific 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL Eppendorf 3123000063 Micro pipetter
Sulfuric Acid any Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm Nikon Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt Thermo Fischer Scientific 1395MP Fluorophore
Vaccum Pump Gast DOA-P704-AA

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References

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Engineering Ausgabe 187 Kapillardruck-Mikrotensiometer Grenzflächenrheologie Lungentensid konfokale Mikroskopie Oberflächenmorphologie Mikrofluidik
Mikrotensiometer zur konfokalen Mikroskopie Visualisierung dynamischer Grenzflächen
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Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, C., Huang, B., Davidson, M. L., Zasadzinski, J. A. Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces. J. Vis. Exp. (187), e64110, doi:10.3791/64110 (2022).

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